CN103173440A

CN103173440A - 一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、载体和工程菌及载体和工程菌的制备方法

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Publication number: CN103173440A
Application number: CN2012105805582A
Authority: CN
Inventors: 张博学; 张军; 李庆春; 杜研; 鞠蒙蒙
Original assignee: JILIN XIUZHENG PHARMACEUTICAL NEW MEDICINE DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: JILIN XIUZHENG PHARMACEUTICAL NEW MEDICINE DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2013-06-26

Abstract

一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、载体和工程菌及载体和工程菌的制备方法，属于医药生物工程技术领域。本发明的操纵子，包括大肠杆菌色氨酸启动子、经过优化改造的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列和重组人生长激素的编码序列。本发明的表达载体是：将序列表中操纵子和重组人生长激素的编码序列依次通过EcoRI和XbaI、XbaI和BamHI克隆至pBR322中得到的表达质粒，命名为pTPS-hGH。本发明提供的工程菌是：用含有病发明操纵子的表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为TPS-hGH。本发明的有益效果是能够使重组人生长激素在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，可获得较高的重组人生长激素产量，利于工业规模的生产和加工。

Description

一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、载体和工程菌及载体和工程菌的制备方法

技术领域

本发明属于医药生物工程领域，具体涉及一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、载体和工程菌。

背景技术

人生长激素（human growth hormone,hGH）是由脑垂体前叶嗜酸性粒细胞分泌的肽类激素，由191个氨基酸构成，分量约22kD，无糖基化，链内有四个Cys，形成两对二硫键(C54一C165，C182一C189)，正常成年人血浆hGH水平约为1-5ng/ml，半衰期约为15-20分钟。

生长激素能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖类及脂肪的代谢，对人体新陈代谢等各种生理功能有广泛的调节功能。

(1)人生长激素最明显的作用是促进骨骼、软骨组织的生长。它刺激蛋白质和胶原蛋自的合成，加速组织对循环系统中游离氨基酸的摄取和利用。

(2)促蛋白质合成。

hGH能促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质合成，减少尿素、肌酸和氮的排出。在蛋白质合成中，hGH可增加tRNA的合成，增强对机体氨基酸的摄取能力。

(3)促代谢作用

hGH能够促进三大营养物质的代谢。hGH对糖和脂肪的作用主要体现在两方面:一方面是胰岛素样作用，即增加葡萄糖的摄取和氧化以及抵抗脂肪分解的作用;另一方面，hGH具有明显抗胰岛素的作用。hGH还使脂肪的分解加快，血液中自由脂肪酸含量增加。

(4)免疫调节作用

hGH通过促进骨髓细胞成熟刺激吞噬细胞迁移，触发吞噬细胞产生超氧阴离子和细胞因子以及提高调理素的活力，在刺激B细胞产生免疫球蛋白等方面起重要作用，增强免疫防御功能。

在临床上，生长激素己经应用于因内源性生长激素缺乏所引起的儿童生长缓慢、性早熟治疗、重度烧伤治疗等等。目前，由于生长激素具有加速新陈代谢、修复受损组织、抗衰老、提高机体免疫力等作用，生长激素的应用又进入了倍受女性喜爱的美容领域并倍受美容界的青睐。

大肠杆菌作为目前最为方便简易的重组蛋白表达系统，结构复杂的异源蛋白在其胞质中表达时常形成包涵体而失去活性，在纯化提取时需要经过变性复性步骤，不仅条件难于控制，目的产物的活性和收率也损失很大，从而对实际生产应用形成了制约。而分泌型基因重组人生长激素的氨基酸含量、一级结构及空间构象与人体自身分泌的生长激素完全相同，具有与人体内源生长激素同等的作用。因此，利用合适的信号肽将异源蛋白引导至大肠杆菌的周质腔中的分泌表达方式是解决此问题的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、含有前述操纵子序列的表达载体、和含有上述操纵子的表达质粒转化得到的分泌表达重组人生长激素的工程菌，最终实现重组人生长激素在大肠杆菌中的高效分泌表达，克服现有技术存在的上述不足。

本发明提供的高效分泌表达重组人生长激素的大肠杆菌操纵子，包括：大肠杆菌色氨酸启动子（SEQ1）、经过优化改造的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列（SEQ2）和重组人生长激素的编码序列（SEQ3），其序列如下：

Figure DEST_PATH_421292DEST_PATH_IMAGE001

本发明提供的含有上述操纵子序列的表达载体是：将序列表中SEQ1和SEQ4依次通过EcoRI和XbaI、XbaI和BamHI克隆至pBR322中得到的表达质粒，命名为pTPS-hGH。

本发明提供的分泌表达重组人生长激素的工程菌是：用含有上述操纵子的表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为TPS-hGH。

本发明的有益效果是：选择使用大肠杆菌色氨酸启动子调控下游基因转录，可通过培养基中色氨酸的含量严格调控；同时，优化改造了大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构,使其更利于引导人生长激素（SEQ3.1）的分泌表达。以上述启动子、信号肽组合作为表达调控元件，能够使重组人生长激素在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，优选所得的工程菌在AP5培养基中摇瓶培养（37℃，12-16小时）可获得较高的重组人生长激素产量（重组人生长激素含量可达总蛋白的20%），利于工业规模的生产和加工，本发明提供的表达重组人生长激素的载体和工程菌在生长激素的生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：表达载体pTPS-hGH质粒图谱。

图2：表达载体pTPS-hGH酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果照片。

图3：工程菌TPS-hGH摇瓶实验SDS-PAGE电泳结果照片。

图4：工程菌TPS-hGH 10L发酵实验SDS-PAGE电泳结果照片。

图5：工程菌TPS-hGH表达的重组人生长激素的HPLC鉴定图谱（对照品）。

图6：工程菌TPS-hGH表达的重组人生长激素的HPLC鉴定图谱（样品）。

具体实施方式

下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

下列实施例中的百分含量，如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1

构建重组人生长激素分泌表达质粒pTPS-hGH

（1）设计并合成大肠杆菌色氨酸启动子，如SEQ1所示，同时在大肠杆菌色氨酸启动子序列的5’端和3’端分别引入了EcoRI和XbaI限制酶切位点。

（2）设计大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列。

天然大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列为：

Figure DEST_PATH_276115DEST_PATH_IMAGE002

根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构和氨基酸残基的疏水性对信号肽引导分泌能力的影响，将C端第二个氨基酸突变为Met。设计寡核苷酸序列如SEQ2所示。

（3）设计重组人生长激素的编码序列

根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计人生长激素的编码序列，如SEQ3所示。

最终人工合成得到包含大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽和重组人生长激素的编码序列，分别在 5’端引入XbaI和NdeI克隆位点，3’端引入BamHI克隆位点。其序列如SEQ4所示。

（4）构建重组人生长激素分泌表达质粒pTPS-hGH

用限制性内切酶EcoRI和XbaI处理质粒pBR322，与同样经过EcoRI和XbaI处理的大肠杆菌色氨酸启动子片段用T4 DNA Ligase连接，将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用EcoRI和XbaI鉴定筛选连接正确的克隆，得到带有大肠杆菌碱性色氨酸启动子的中间载体pS1346。

用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切处理含有大肠杆菌色氨酸启动子的质粒pS1346及合成的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽和重组人生长激素的编码序列，回收目的片段并通过T4 DNA Ligase连接，将连接反应转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用XbaI和BamHI鉴定筛选连接正确的克隆（图2），L1泳道为XbaI+BamHI酶切后pTPS-hGH的琼脂糖凝胶电泳结果；L2泳道为λDNA HindIII digest Marker，最终得到重组人生长激素分泌表达质粒，将该质粒命名为pTPS-hGH（图1）。

实施例2

制备重组人生长激素分泌表达工程菌TPS-hGH。

用质粒pTPS-hGH转化大肠杆菌空宿主W3110，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，将得到的转化子接种于AP5培养基中，37℃摇瓶培养过夜（12-16小时），SDS-PAGE电泳鉴定表达结果，优选得到高效分泌表达重组人生长激素的工程菌TPS-hGH。电泳结果如图3所示，泳道设计：1、Marker；2、诱导前；3、诱导后。

AP5培养基成分：

0.15% 葡萄糖

1.1% 酸水解酪蛋白

0.06% 酵母抽提物

0.019% MgSO₄

0.107% NH₄Cl

0.373% KCl

0.12% NaCl

0.12mol/ L 三乙醇胺 pH7.4

利用工程菌TPS-hGH发酵表达重组人生长激素

（1）培养基：

种子培养基（LB）：

1%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%NaCl

发酵培养基 (4L)：

蛋白胨 40g

酵母粉 20g

葡萄糖 10g

KH₂PO₄ 15g

NH₄Cl 5g

Na₂HPO₄·12H₂O 30g

(NH4)₂SO₄ 22g

MgSO₄·7H₂O 10g

FeSO₄·7H₂O 2.1g

MnSO₄·H₂O 0.05g

CaCl₂0.015g

补料培养基1:

750g葡萄糖，溶于1.5L水

补料培养基2:

酸水解酪蛋白200g，溶于1.5 L水

（2）种子培养：取冻存的TPS-hGH甘油菌，按1/1000比例接种于500ml LB培养基中，37℃摇瓶培养过夜。

（3）发酵培养：将500ml种子培养液转接至4L发酵培养基中通气搅拌培养，发酵恒定在37℃进行，发酵pH控制在7.0，溶氧控制为饱和溶氧的40%。当发酵培养基中营养成份消耗将尽时，溶氧值迅速上升，此时开始流加补料培养基诱导培养，通过补料流速控制溶氧值维持在20%-40%之间，诱导培养时间为16小时。

（4）从补料前1小时开始，每2小时取样一次，SDS-PAGE电泳检测。电泳结果见图4，泳道设计：1菌种诱导前； 2诱导后2h ； 3 诱导后4h ； 4诱导后6h ；

5诱导后8 h； 6 MARKER； 7诱导后10h； 8 诱导后12h； 9 诱导后14h；

10诱导后16h。

重组人生长激素的纯化

（1）菌体与20mMPB pH8.0缓冲液比例为1:10进行溶解，即1kg菌体加入10L 20mMPB pH8.0缓冲液，温和搅拌溶解2小时后进行离心，收集离心上清，70%饱和度进行盐析，离心后收集沉淀，沉淀溶解后离心，收集离心上清。

（2）20mMPB pH8.0缓冲液平衡G-25层析柱5个柱床体积，电导率在2.4±0.2ms/cm，出口端与平衡液pH和电导率一致即平衡好，收集离心上清过G-25层析进行脱盐处理，收集目标蛋白峰，获得较高纯度的目的蛋白质。

重组人生长激素的HPLC鉴定

以人生长激素标准品作为对照，用HPLC鉴定实施例4中获得的纯化产物。

鉴别条件：

柱子：ZORBAX EClipse XDB- C8 150mm×4.6mm

流动相：以0.1%三氟乙酸溶液为流动相A，0.1%三氟乙酸的90%乙腈溶液为流动相B

流速：1.0ml/min

柱温：35°C

检测波长：214nm

上样量：100μl

所得HPLC图谱见图5、图6。

Claims

1.一种高效分泌表达重组人生长激素的大肠杆菌操纵子，包括：大肠杆菌色氨酸启动子（SEQ1）、经过优化改造的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列（SEQ2）和重组人生长激素的编码序列（SEQ3），其序列如下：

。

2.含有权利要求1所述操纵子序列的表达载体，其特征是：将序列表中SEQ1和SEQ4依次通过EcoRI和XbaI、XbaI和BamHI克隆至pBR322中得到的表达质粒，命名为pTPS-hGH。

3.一种分泌表达重组人生长激素的工程菌，其特征是：利用权利要求2所述的表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为TPS-hGH。

4.一种权利要求2所述操纵子序列的表达载体pTPS-hGH的构建方法，其特征是：将序列表中SEQ1和SEQ4依次通过EcoRI和XbaI、XbaI和BamHI克隆至pBR322中制得。

5.一种权利要求3所述的分泌表达重组人生长激素的工程菌TPS-hGH的制备方法，其特征是：利用权利要求2所述的表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株即得。

6.根据权利要求4所述的表达载体pTPS-hGH的构建方法，其特征是包括如下步骤：

（1）设计并合成大肠杆菌色氨酸启动子，

序列为（SEQ1）：

同时在大肠杆菌色氨酸启动子序列的5’端和3’端分别引入了EcoRI和XbaI限制酶切位点；

（2）设计大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列，

天然大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的编码序列为：

根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构和氨基酸残基的疏水性对信号肽引导分泌能力的影响，将C端第二个氨基酸突变为Met，

设计寡核苷酸序列为（SEQ2）：

（3）设计重组人生长激素的编码序列

根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计人生长激素的编码序列（ SEQ3）

最终人工合成得到包含大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽和重组人生长激素的编码序列，分别在 5’端引入XbaI和NdeI克隆位点，3’端引入BamHI克隆位点，其序列为（SEQ4）；

（4）构建重组人生长激素分泌表达质粒pTPS-hGH

用限制性内切酶EcoRI和XbaI处理质粒pBR322，与同样经过EcoRI和XbaI处理的大肠杆菌色氨酸启动子片段用T4 DNA Ligase连接，将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用EcoRI和XbaI鉴定筛选连接正确的克隆，得到带有大肠杆菌碱性色氨酸启动子的中间载体pS1346，

用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切处理含有大肠杆菌色氨酸启动子的质粒pS1346及合成的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽和重组人生长激素的编码序列，回收目的片段并通过T4 DNA Ligase连接，将连接反应转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用XbaI和BamHI鉴定筛选连接正确的克隆，最终得到重组人生长激素分泌表达质粒，将该质粒命名为pTPS-hGH。

7.根据权利要求5的分泌表达重组人生长激素的工程菌TPS-hGH的制备方法，其特征是：用质粒pTPS-hGH转化大肠杆菌空宿主W3110，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，将得到的转化子接种于AP5培养基中，37℃摇瓶培养12-16小时，SDS-PAGE电泳鉴定表达结果，优选得到高效分泌表达重组人生长激素的工程菌TPS-hGH。