CN103509814B

CN103509814B - 一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法

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Publication number: CN103509814B
Application number: CN201310285117.4A
Authority: CN
Inventors: 周红; 陈丹燕; 张安英
Original assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Current assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN102998457A; CN103509814A; CN102998457B

Abstract

本发明涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）蛋白重组表达及纯化技术。本发明提出草鱼肿瘤坏死因子α的原核重组表达方法，利用克隆技术得到草鱼肿瘤坏死因子α基因的cDNA全序列，并将草鱼肿瘤坏死因子α基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选得到高效表达草鱼肿瘤坏死因子α的原核表达体系，并以IPTG诱导重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的表达，利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得高纯度体外表达重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白。通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，一方面用于淡水鱼类免疫机制的理论研究；另一方面用于鱼类免疫增强剂、病害防治药物等生产应用。

Description

一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及草鱼（Ctenopharyngodonidella）肿瘤坏死因子α（ΤΝF-α)基因的克隆、重组表达、表达产物的分离纯化与活性鉴定等技术。

背景技术

肿瘤坏死因子alpha（tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α）是一种重要的细胞因子。早在30多年前，Carswell等人发现了一种存在于血清中，能抑制和杀伤某些肿瘤细胞，并使体内肿瘤发生出血坏死的蛋白物质，被命名为肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)。Shalaby等人把由活化的单核细胞、巨噬细胞和T细胞分泌的肿瘤坏死因子，命名为TNF-α；而把由活化的T淋巴细胞和NK细胞分泌的淋巴毒素，命名为TNF-β。TNF-α前体是Ⅱ型跨膜蛋白，经TNF-α转换酶(TNF-αconvertingenzyme,TACE)裂解后，形成释放到胞外的可溶性成熟分子。在生理条件下，TNF-α以非共价三聚体结构与细胞表面的两种特异性跨膜受体TNFR1和TNFR2结合，启动下游的信号转导通路，从而参与和调控机体的免疫功能和炎症反应，发挥促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。自从牙鲆中克隆出第一个TNF-α基因的全长cDNA序列开始,肿瘤坏死因子α在鱼类中的研究开始受到重视。目前在多种鱼中已有肿瘤坏死因子α基因克隆，其中包括：河豚（Savan2005）、虹鳟（Laing2001）、金头鲷（Garcia-Castillo2002）、鳜鱼（Xiao2007）、斑马鱼（Savan）、鲤鱼（Saeij2003）、金鱼（Grayfer2008）等。重组金鱼肿瘤坏死因子能诱导巨噬细胞的趋化反应、吞噬作用、呼吸爆发反应（Grayfer2008）。重组虹鳟肿瘤坏死因子α能增强白细胞的迁移和吞噬作用，并能上调IL-1β、IL-8、TNF-αCOX-2等基因的表达（Zou2003）。但是，重组乌颊鱼TNF-α和大菱鲆TNF-α不能激活吞噬细胞的呼吸爆发（Roca2008，Orda′s2007），而且重组乌颊鱼TNF-α只能轻微上调IL-1β和TNF-α的表达（Roca2008）。这些鱼类TNF-α表现出的功能差异说明其功能具有种属特异性，因此有必要获得重组草鱼TNF-α用于其在草鱼中的功能检测和应用。

草鱼（Ctenopharyngodonidellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根（东北）、混子、黑青鱼等。英文名：Grasscarp。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。由于肿瘤坏死因子α在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，因此检测肿瘤坏死因子α在草鱼中的功能对草鱼免疫系统的研究以及鱼类疾病的治疗密切相关。同时，由于鱼类肿瘤坏死因子α与哺乳动物和两栖动物的肿瘤坏死因子α分子在结构和功能方面存在较大差距，不能用其他种族的肿瘤坏死因子α蛋白蛋白和抗体代替鱼类肿瘤坏死因子α进行研究，加之鱼类肿瘤坏死因子α抗体的缺乏使对肿瘤坏死因子α功能地位的研究陷入瓶颈。

本发明的有益效果：通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白。重组草鱼肿瘤坏死因子α不仅可用于制备相应鱼类肿瘤坏死因子α抗体和其它鱼类免疫机制的理论研究，也可用于制作饲料添加剂、疫苗免疫增强剂以及病害防治药物以及其它医药产品等应用研究；同时，草鱼肿瘤坏死因子α能诱导草鱼其它细胞因子的表达，如白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α自身，从而增强草鱼趋化能力，提高草鱼免疫保护能力。

发明内容

肿瘤坏死因子α在机体免疫调节等方面起着非常重要的作用，但是由于机体自身分泌肿瘤坏死因子α存在产量低、半衰期短等不足，本发明针对这些问题根据草鱼肿瘤坏死因子α基因，采用克隆重组技术，构建草鱼肿瘤坏死因子α体外重组质粒，通过大肠杆菌表达载体，经诱导在体外大量表达重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，并对其进行分离纯化和鉴定，提供草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的重组表达方法，为草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的产业化应用提供可能性。同时，本发明也为制备相应鱼类肿瘤坏死因子α抗体和相关鱼类免疫机制的理论研究奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

1）重组表达载体的构建与筛选：根据GenBank中草鱼肿瘤坏死因子α基因序列(HQ696609)，设计合成一对特异性引物TNF-αeF5’-CGGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAAAAGC-3’和TNF-αeR5’-CCGCTCGAGTTACAGAGCAAACACCCCAAAA-3’，粗体部分为引入的酶切位点，TNF-αeF为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI；TNF-αeR为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI；采用PCR方法扩增出草鱼肿瘤坏死因子α的成熟肽的基因片段，将其克隆到pET30a(+)表达载体上，从而构建了重组表达质粒pET30a(+)-gcTNF-α。

2）转化与筛选：将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行PCR双向筛选鉴定；阳性克隆进行质粒纯化、限制性内切酶消化验证；最后再经过测序验证后获得的阳性克隆作为工程菌株。

3）表达产物的分离纯化：将筛选所得的工程菌株，以诱导剂进行诱导表达；然后，菌液经超声裂解和离心得到融合表达的裂解液，用镍离子亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，采用SDS-PAGE和Westernblotting方法鉴定。

附图说明

图1是重组草鱼肿瘤坏死因子α的SDS–PAGE和Westernblotting验证。

图2重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白活性鉴定结果。

具体实施方式

下面，结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本实施例中，草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法，利用克隆技术克隆得到草鱼肿瘤坏死因子α基因的cDNA全序列，利用草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白；其具体步骤为：

步骤1重组表达载体的构建与筛选：根据GenBank中草鱼肿瘤坏死因子α基因序列(HQ696609)，设计合成一对特异性引物r肿瘤坏死因子TNF-αF5’-CGGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAAAAGC-3’和TNF-αeR5’-CCGCTCGAGTTACAGAGCAAACACCCCAAAA-3’。在成熟肽基因序列的两端引入BamHI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽基因序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，完成原核表达载体的构建；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株。pET30a(+)是购自Novagen公司的商品化原核表达载体，通过公共的商业途径获取。

本步骤的PCR反应体系如下：

加水补到总体积为20μL(微升)。

本步骤的PCR反应条件：l个循环：98℃30sec;35个循环：98℃10sec，57℃30sec,72℃20sec;1个循环：72℃10min,4℃保存。

本步骤的限制性内切酶消化体系如下：

加水补到总体积为25μL(微升)。

将上述限制性内切酶消化体系，于37℃孵育3小时，1%琼脂糖电泳，紫外灯检测。

步骤2：转化和筛选：

将PCR酶切产物和质粒酶切产物按摩尔比3:1混合纯化后连接。连接体系为：

总体积为10μL(微升)。

充分混匀后，放入16℃空气浴中连接15小时，然后将其均匀涂于LB/Kan+平板上，用菌落PCR的方法挑选LB平板上的阳性克隆分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选。筛选出的阳性克隆，并经序列测定鉴定后所作为工程菌株。

步骤3：重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化：

将筛选所得的工程菌株，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6×His镍离子亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子蛋白。本步骤的具体实施方案如下：

将筛选所得的阳性重组菌BL21(DE3)/pET30a-gc肿瘤坏死因子α单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡培养16h。然后按5％比例转接到新鲜LB培养基中，37℃继续培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入1mMIPTG在30℃诱导6h后，收集菌体，向菌体中加入10mL缓冲液（20mmol/LNa₂HPO₄，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，1mg/mL溶菌酶,pH=7.4）。超声波（200W，超声5秒,间隔10秒）破菌2分钟，4℃10000rpm离心30分钟取上清。可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的30％以上。从而完成诱导表达。

按照上述的蛋白表达条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，破碎后离心收集上清，利用GE公司HisTrapHP柱进行亲和层析，用结合缓冲液（20mmol/LNa₂HPO₄，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH=7.4）平衡，将裂解液以0.45μm滤膜过滤后引流到平衡好的柱中，上样完毕后用洗脱缓冲液A（20mmol/LNa₂HPO₄，0.5mol/LNaCl，50mmol/L咪唑，pH=7.4）、洗脱缓冲液B（20mmol/LNa₂HPO₄，0.5mol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH=7.4）依次洗涤，收集洗脱峰组分。为进一步纯化并脱盐，利用GE公司Superdex75进行纯化，以缓冲液（20mmol/LNa₂HPO₄，pH=7.4）洗脱，收集主峰，并经SDS-PAGE鉴定。从而完成蛋白质纯化。如图1A所示，图为重组草鱼肿瘤坏死因子的SDS–PAGE。M为Mark，1为诱导表达后的工程菌总蛋白，2为纯化后的蛋白，由图片可知，经诱导表达后所得的工程菌株大量表达分子量为23KDa（千道尔顿）的重组蛋白，经纯化后得到高纯度的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白（简称rgc肿瘤坏死因子α）。同时，SDS-PAGE电泳结果还显示一条分子量约为46kDa弱的带，正好接近预测的rgcTNF-α融合蛋白二聚体的分子量大小。事实上，在自然条件下重组的鱼类TNF-α蛋白有多聚体的现象在其他鱼类中也有报道，例如在虹鳟（Zou2003）、金头鲷（Garcia-Castillo2004）等鱼类中。这说明我们获得了高纯度的rgcTNF-α融合蛋白。为了进一步验证rgcTNF-α融合蛋白，利用鼠抗6xHis-Tag进行Western-blotting验证，结果显示纯化的rgcTNF-α融合蛋白能被6xHis-Tag特异性识别，且同时具有单体和二聚体（如图1B所示）,进一步说明rgcTNF-α融合蛋白纯化成功。

经过上述步骤，从而完成草鱼肿瘤坏死因子蛋白的重组表达。

步骤4：对获得的重组草鱼肿瘤坏死因子蛋白进行活性鉴定：

分离得到草鱼头肾淋巴细胞（HKL），按6×10⁵/孔接种到24孔板中，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液于27℃，5%CO2浓度下培养过夜。草鱼HKL过夜培养后，每孔加入重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，其终浓度分别为：1ng/mlrgcTNF-α、5ng/mlrgcTNF-α、50ng/mlrgcTNF-α和150ng/mlrgcTNF-α，我们还将在90℃的沸水中加热30分钟后失活的重组草鱼肿瘤坏死因子α(150ng/ml)处理细胞，另外未加任何蛋白处理的组作为空白对照。继续培养1小时后提取HKL总RNA，反转录后用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检验草鱼IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。同时，我们也检验了不同时间条件下重组草鱼肿瘤坏死因子α对草鱼HKL中草鱼IL-1β和TNF-αmRNA表达水平的影响。待草鱼HKL稳定培养过夜后，每孔中加重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，其终浓度为150ng/ml，同时以90℃沸水中加热30分钟后失活的rgcTNF-(150ng/ml)为阴性对照。药物刺激1、3、6、12和24小时后，提取HKL总RNA，反转录后用real-timePCR检测草鱼TNF-α、IL-1βmRNA的表达。

Real-timePCR反应体系如此时的PCR体系为：

补水至系统总体积为20μL。

检测草鱼IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平如图2所示，由图可知TNF-α能够呈时间和剂量依赖性显著上调HKL中草鱼IL-1β和TNF-αmRNA的表达。这些结果不仅验证了我们所获得的重组草鱼gcTNF-α蛋白的活性，而且证明了草鱼gcTNF-α具有刺激细胞因子TNF-α和IL-1β表达的重要生物学功能（见附图2）。

通过上述实施例获得的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白具有以下应用前景：

1．重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白作为一种重要的细胞因子，可将其发展为药物来治疗草鱼出血病、肠炎等疾病引发的炎症反应。

2．重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白用于鱼类免疫机制的研究。直接使用重组草鱼肿瘤坏死因子蛋白或该蛋白制备的单克隆抗体或多克隆抗体，进行鱼类及其它动物免疫机制的研究，以及研究其对其它细胞因子的调控作用。

3.工业化生产重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，运用于制作饲料添加剂、疫苗免疫增强剂以及病害防治药物以及其它医药产品等应用研究

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的应用，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围。

草鱼肿瘤坏死因子αcDNA序列：（参见序列表中SEQIDNO.1）

1AACACAACAGTGACAGACCGACCAAGCAAAGCACTGAAGTGATAAACTGCACTGAGGACA

61CTTTACAGAACCTTTTAAAAAGCATTTTGACAGCATCTGCATTTTTACATATAGTTTAAC

121TTAAGCTTTCAGAGGACAAACACACAGTAATGATGGAGCATGCCAGTCAGGTAGTGTTGG

181ATCTTGAAAAAGTAACGCTGCCCTTGCCGAGGGTGATGGTGTCGAGGAGGAAGGCTGGCA

241CTTCAAAGTCAGGCGTATGGCGGGTGTGTGGGGCTCTTCTGGCTGTGGCCCTGTGTGCTG

301CCGCTGCTGTCTGCTTCACGCTCAACAAGTCTCAGAGTAATCAGGAAAGTGCAACTGGGC

361TCAAGCTTACAATGAGAGATCATTTTTCAAAAGCAAATTTCACTTCCAAGGCTGCCATCC

421ATTTAACAGGTGCATACGACCCTGAAGTCTCTAATAAAACCCTAGATTGGAGAGTGAACC

481AGGACCAGGCTTTCTCTTCAGGCGGCTTGAAATTAGTAAACAGGGAGATCATCATTCCTG

541ATGACGGCATTTACTTCGTCTACAGCCAGGTCTCTTTCCACATCTGCTGCGCGTCTGACA

601GGGGCGCGGACCAAGACATTGTGCATATGAGCCACGCAGTTATGCGCATTTCCGATTCCT

661ATGGAGGCAAAAAGGCGCTTTTCAGCGCTATCCGCTCCGCCTGCGTGCACGCGTCTGACA

721GTGACGATTTGTCGTACAACACAATTTATCTCGGTGCGGCCTTCCAATTACAAGCTGGAG

781ACAAACTGCTCACCGAGACGACGCCACTACTCCTGCCCCGCGTCGAAAATGAAAACGGAA

841AGACCTTTTTTGGGGTGTTTGCTCTGTAAGCATAGATGGACATCAAGCAAAACTTGAAAA

901GTAAGGAAAGAATGGAAACCTGTGGAGAGGAAAGAAATTTCCTGAGCTTCCACTGCAGTC

961ACACACACAAAAAGAAACTAAACTGACTTCTAGCCAACGTTTTATATTAAAACAGGTCAA

1021AATTATAACTCTATTTAATGGATCAGAAGGATCCAGATATGATGTTATGTGGGTGAAAAC

1081ATGGGCATTTTGTATTCAGCTGTAAAGCTATCAAAGTTATTTATATATGTTTGTTAAAAT

1141GTTAATGTTATGTGTATTTATTGTGTAATTAATTTATTGTACTATTTATTCACCTATTTA

1201TTAAAAGAATATCTACTGCACTGCAACTGTAACGAAATTCAAATTTTAATAAATCTAAAA

1261CCAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAA

序列特征：

长度：1285碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

来源：草鱼（Ctenopharyngodonidellus）

草鱼肿瘤坏死因子α编码蛋白的氨基酸序列：（见序列表中ΣΕΘΙΔΝΟ.2）

1MMEHASQVVLDLEKVTLPLPRVMVSRRKAGTSKSGVWRVCGALLAVALCAAAAVCFTLNK

61SQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGL

121KLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSA

181IRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL

序列特征：

长度：239个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

来源：草鱼（Ctenopharyngodonidellus）。

Claims

1.一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法，其特征在于，利用草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼肿瘤坏死因子α的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白；其具体步骤为：

步骤1重组表达载体的构建：根据GenBank中登录号为HQ696609的草鱼肿瘤坏死因子α基因序列，设计合成一对特异性引物TNF-αeF5’-CGGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAAAAGC-3’和TNF-αeR5’-CCGCTCGAGTTACAGAGCAAACACCCCAAAA-3’，TNF-αeF为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI；TNF-αeR为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI；采用PCR方法扩增出草鱼肿瘤坏死因子α的成熟肽的基因片段，将其克隆到pET30a(+)表达载体上，从而构建了重组表达质粒pET30a(+)-gcTNF-α；

步骤2转化与筛选：将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行PCR双向筛选鉴定；阳性克隆进行质粒纯化、限制性内切酶消化验证；最后再经过测序验证后获得的阳性克隆作为工程菌株；

步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化：将筛选所得的工程菌株，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；然后菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用镍离子亲和层析再以凝胶层析纯化，经SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，获得有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白；获得的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白为二聚体形式。