CN103705920B - 胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用，该疫苗为ISCOM-DNA复合物，其制备方法包括胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆，肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆，重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建，pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建，CPEB4的诱导表达，ISCOM-DNA复合物的制备。该疫苗在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。本发明具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物。

Description

胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

技术领域

本发明涉及胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的免疫增强型疫苗，还涉及该疫苗的制备方法和用途。

背景技术

脑胶质瘤是人体中枢神经系统最常见的肿瘤，尽管采取了多种方法进行积极治疗，但是预后仍不够理想。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白(cytoplasmicpolyadenylationelement-bindingproteins，CPEBs)是一组介导mRNA胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA结合蛋白。近年来，人们发现其在大多数肿瘤细胞中有异常表达现象。随着CPEBs与肿瘤关系的研究开展，国外已有研究报道CPEB4在胶质母细胞瘤中呈阳性表达，并且其阳性率与肿瘤恶性程度的呈正相关。因此，CPEB4有望成为胶质瘤的一个新的治疗靶点。

BAFF是B细胞存活与成熟的必需因子,也被称为肿瘤坏死因子和凋亡配体相关的白细胞表达配体,为TNF家族成员,是Ⅱ型跨膜蛋白,N末端在胞内无信号肽,C末端为胞外区,其中47～73位氨基酸为跨膜区,74～285位氨基酸为胞外区,133～285位氨基酸为其发挥功能的主要区域,128～285位氨基酸残基区域含有与受体结合的结构域。BAFF有膜结合蛋白和可溶性配体(hsBAFF)两种形式存在。hsBAFF能够增强B细胞、CD4T细胞、NK细胞的活性,使机体的免疫应答增强。BAFF不仅是B细胞的存活因子,还对T细胞激活有共刺激作用。T细胞和树突状细胞表达的BAFF可作为T细胞激活的共刺激因子,人重组或内源BAFF刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-2,上调CD25(IL22受体α链)表达,并以IL-2依赖方式促进T细胞增生。

免疫刺激复合物(ISCOM)是一种新型的蛋白质疫苗佐剂,可增强蛋白质抗原诱导体液和细胞免疫应答,包括抗体的产生、迟发性超敏反应、细胞毒性T细胞的激活等。ISCOM与裸DNA混合制备DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力，明显高于单独使用裸DNA,说明ISCOM还具有增强DNA疫苗免疫效果的作用。可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解,从而保证DNA疫苗在鸡体内的持续表达。另外,ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内,有利于APC吞噬ISCOM-DNA复合物。ISCOM具有制备简单、价格低廉等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备方法，以及基于此疫苗的应用，为胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗为ISCOM-DNA复合物，每毫升中含有0.1mg胆固醇、0.1mg卵磷脂、1mgQuilA和0.5mg质粒pStar-CPEB4/BAFF。

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆

从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg-3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆

提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

（3）重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建

将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。

（4）pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建

将CPEB4原核表达载体pStar-CPEB4/BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4工程菌。

（5）CPEB4的诱导表达

用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的CPEB4。

纯化的方法为：培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）透析脱盐，再用琼脂糖凝胶（Q-Sepharose）柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶（SephdexG-25）柱脱盐。

（6）ISCOM-DNA复合物的制备

0.1mg/ml胆固醇、0.1mg/ml卵磷脂、1mg/mlQuilA和0.5mg/ml质粒pStar-CPEB4/BAFF,反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰,混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA复合物。

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。

本发明将CPEB4与BAFF重组真核表达载体有效地包封在脂质体中形成纳米级颗粒，来发挥抗肿瘤的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物，在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为PCR扩增CPEB4基因的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为PCR扩增BAFF基因的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为蛋白免疫印迹（WesternBlot）鉴定CPEB4。

图4为酶联免疫斑点（ELISPOT）法检测激发T分泌IFN-γ的能力，其中，实验组为：ISCOM复合物，空白对照组为：含有空白质粒的复合物，阴性对照组为：PBS。

图5为⁵¹Cr释放法检测激发T细胞对胶质瘤细胞U251的特异性杀伤效应，其中，实验组为：ISCOM复合物，空白对照组为：含有空白质粒的复合物，阴性对照组为：PBS。

具体实施方式

实施例1

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，见分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、CPEB4全长cDNA的克隆

根据GenBank登录号为NM_030627的CPEB4基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的CPEB4cDNA全长：F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg-3’（SEQIDNo.1），下划线部分为PstⅠ酶切位点；R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’（SEQIDNo.2），下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。

分离手术后患者的胶质瘤细胞，用RPMI1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×10⁷个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与p-TEasy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了CPEB4cDNA全长序列（SEQIDNo.3）的阳性克隆质粒命名为pT-CPEB4。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约2000bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

2、BAFF全长cDNA的克隆

按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’（SEQIDNo.4，下划线部分为BamHⅠ酶切位点）和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’（SEQIDNo.5，下划线部分为SalⅠ酶切位点）为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，PCR反应体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-BAFF。

琼脂糖凝胶电泳结果见图2，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物。结果显示PCR产物在约800bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列与GenBank登录号为NM_006573的BAFF全长cDNA序列一致（SEQIDNo.6）。

3、重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建

根据CPEB4和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将pT-CPEB4载体用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PstⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4；再将pT-BAFF载体用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的pStar-CPEB4载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4-IRES-BAFF。

4、pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建

将CPEB4原核表达载体pStar-CPEB4/BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3~4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于YPD平板（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉）、MD和MM平板，30℃培养3~6天（每天向MM平板中添加甲醇100μL），挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母单菌落为高拷贝CPEB4工程菌。

5、CPEB4的诱导表达

将高拷贝CPEB4工程菌于30℃培养至OD600为2，按10%接种量接入BMGY培养基（pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L）中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基（pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L）中，30℃诱导表达3天（每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5%），4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）透析脱盐，再用琼脂糖凝胶（Q-Sepharose）柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶（SephdexG-25）柱脱盐，即得纯化的CPEB4。

WesternBlot鉴定：取纯化的CPEB4，加入上样缓冲液，100℃加热3~5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人CPEB4单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照（不加入纯化的CPEB4）。

结果见图3，其中1泳道为纯化的CPEB4，2泳道为阴性对照，可见1泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

6、免疫刺激复合物(ISCOM-DNA)的制备

每毫升ISCOM-DNA复合物中含有0.1mg胆固醇、0.1mg卵磷脂、1mgQuilA和0.5mg质粒pStar-CPEB4/BAFF反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰,混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA复合物,并进行无菌检验和物理性状检验。

7、ISCOM-DNA的免疫

（1）体外诱导特异性的CTL

采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞（PBMC）。将PBMC用RPMI1640培养基在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞［主要为淋巴细胞（PBL）］和贴壁细胞［树突状细胞（DC）］。将DC按细胞密度为2×10⁶/3ml加入含有浓度为800IU/ml的集落刺激因子（GM-CSF）、浓度为1000IU/ml的白介素4（IL-4）以及浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为10ng/ml的肿瘤坏死因子（TNF-α），第7天获得成熟DC。向成熟DC中加入终浓度为10M的ISCOM，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，30Gy放射性处理，获得负载肽的DC。按PBL与DC的数量比为3:1~6:1向PBL中加入负载肽的DC，再按PBL细胞密度为1.5×10⁶/2ml加入含有浓度为10ng/ml的白介素7（IL-7）以及浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，第11天加入负载肽的DC再次刺激培养的PBL，24~48小时后向细胞培养液中加入浓度为10IU/ml的白介素2（IL-2）并补充IL-7至终浓度为10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培养的PBL，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

（2）特异性CTL对靶细胞的体外杀伤能力检测

将1×10⁶个神经胶质瘤细胞U251转移至离心管中，用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基洗涤1次，吸除大部分上清液，剩余约0.1ml培养基于管底，重悬细胞，加入相应量的51Cr溶液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养2小时，获得51Cr标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比（E/T）为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与上述51Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放孔［用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基替代效应细胞］。将96孔板1200r/min离心30秒，温度37℃孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为2%（w/w）的TritonX-100并吹打混匀，孵育l0分钟，再将96孔板1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。

结果如图4所示，可见实验组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明ISCOM复合物能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。

（3）特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测

采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：调整效应细胞密度至1×10⁶/ml，取100μl铺板，加入终浓度为10M的肽（按实验分组加入相应肽），刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。

结果如图5所示，可见实验组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明ISCOM复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

SEQUENCELISTING

<110>中国人民解放军南京军区福州总医院四七六医院

<120>胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

<130>2013

<160>6

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Claims (2)

1.一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗，其特征在于：该疫苗为ISCOM-DNA复合物，每毫升中含有0.1mg胆固醇、0.1mg卵磷脂、1mgQuilA和0.5mg质粒pStar-CPEB4/BAFF；所述的质粒pStar-CPEB4/BAFF制备方法为：

1）按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，PCR反应体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-BAFF；

2）根据CPEB4和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游；具体方法为：先将pT-CPEB4载体用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PstⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4；再将pT-BAFF载体用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的pStar-CPEB4载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。

2.一种如权利要求1所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆；

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆；

（3）重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建：将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES

上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游；

（4）pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建：将CPEB4原核表达载体pStar-CPEB4/BAFF用

SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4工程菌；

（5）CPEB4的诱导表达：用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度

的CPEB4；

（6）ISCOM-DNA复合物的制备；

所述的步骤（1）从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg-3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；

所述的步骤（2）提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃

变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；

所述的步骤（5）纯化的方法为：培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液透析脱盐，再用琼脂糖凝胶Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶SephdexG-25柱脱盐；

所述的步骤（6）0.1mg/ml胆固醇、0.1mg/ml卵磷脂、1mg/mlQuilA和0.5mg/ml质粒pStar-CPEB4/BAFF，反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰，混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA复合物。