CN103705920A

CN103705920A - 胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

Info

Publication number: CN103705920A
Application number: CN201310593368.9A
Authority: CN
Inventors: 袁邦清; 陈羽建; 沈汗超; 林立; 吴贤群
Original assignee: 467 HOSPITAL FUZHOU GENERAL HOSPITAL OF NANJING MILITARY REGION PLA
Current assignee: 467 HOSPITAL FUZHOU GENERAL HOSPITAL OF NANJING MILITARY REGION PLA
Priority date: 2013-11-23
Filing date: 2013-11-23
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-11-23
Also published as: CN103705920B

Abstract

本发明公开了一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用，该疫苗为ISCOM-DNA复合物，其制备方法包括胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆，肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆，重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建，pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建，CPEB4的诱导表达，ISCOM-DNA复合物的制备。该疫苗在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。本发明具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物。

Description

胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

技术领域

本发明涉及胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的免疫增强型疫苗，还涉及该疫苗的制备方法和用途。

背景技术

脑胶质瘤是人体中枢神经系统最常见的肿瘤，尽管采取了多种方法进行积极治疗，但是预后仍不够理想。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白( cytoplasmic polyadenylation element-binding proteins，CPEBs) 是一组介导mRNA 胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA 结合蛋白。近年来，人们发现其在大多数肿瘤细胞中有异常表达现象。随着CPEBs 与肿瘤关系的研究开展，国外已有研究报道CPEB4 在胶质母细胞瘤中呈阳性表达，并且其阳性率与肿瘤恶性程度的呈正相关。因此，CPEB4有望成为胶质瘤的一个新的治疗靶点。

BAFF 是B 细胞存活与成熟的必需因子,也被称为肿瘤坏死因子和凋亡配体相关的白细胞表达配体,为TNF 家族成员,是Ⅱ型跨膜蛋白,N 末端在胞内无信号肽,C 末端为胞外区,其中47～73 位氨基酸为跨膜区,74～285 位氨基酸为胞外区,133～285 位氨基酸为其发挥功能的主要区域,128～285 位氨基酸残基区域含有与受体结合的结构域。BAFF 有膜结合蛋白和可溶性配体(hsBAFF) 两种形式存在。hsBAFF 能够增强B 细胞、CD4 T 细胞、N K 细胞的活性, 使机体的免疫应答增强。BAFF 不仅是B 细胞的存活因子,还对T 细胞激活有共刺激作用。T 细胞和树突状细胞表达的BAFF 可作为T 细胞激活的共刺激因子,人重组或内源BAFF 刺激T 细胞分泌IFN-γ和IL-2 ,上调CD25 ( IL22 受体α链) 表达,并以IL-2 依赖方式促进T 细胞增生。

免疫刺激复合物( ISCOM) 是一种新型的蛋白质疫苗佐剂,可增强蛋白质抗原诱导体液和细胞免疫应答,包括抗体的产生、迟发性超敏反应、细胞毒性T 细胞的激活等。ISCOM 与裸DNA 混合制备DNA 疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力，明显高于单独使用裸DNA ,说明ISCOM 还具有增强DNA 疫苗免疫效果的作用。可能的机制是经ISCOM 包裹的DNA 能免受体内核酸酶的降解, 从而保证DNA 疫苗在鸡体内的持续表达。另外, ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内,有利于APC 吞噬ISCOM-DNA 复合物。ISCOM 具有制备简单、价格低廉等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备方法，以及基于此疫苗的应用，为胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗为ISCOM-DNA 复合物，每毫升中含有0. 1mg胆固醇、0. 1mg 卵磷脂、1mg QuilA和0. 5mg 质粒pStar-CPEB4 /BAFF。

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆

从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg -3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆

提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

（3）重组载体pStar-CPEB4 /BAFF的构建

将CPEB4 全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。

（4）pStar-CPEB4 /BAFF工程菌的构建

将CPEB4 原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4 工程菌。

（5）CPEB4 的诱导表达

用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的CPEB4。

纯化的方法为：培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）透析脱盐，再用琼脂糖凝胶（Q-Sepharose）柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4 的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶（Sephdex G-25）柱脱盐。

（6）ISCOM-DNA 复合物的制备

0.1mg/ml胆固醇、0.1mg/ml 卵磷脂、1mg/ml QuilA和0.5mg/ml 质粒pStar-CPEB4 /BAFF ,反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰, 混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA 复合物。

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。

本发明将CPEB4与BAFF重组真核表达载体有效地包封在脂质体中形成纳米级颗粒，来发挥抗肿瘤的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物，在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为PCR扩增CPEB4 基因的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为PCR扩增BAFF基因的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为蛋白免疫印迹（Western Blot）鉴定CPEB4。

图4为酶联免疫斑点（ELISPOT）法检测激发T分泌IFN-γ的能力，其中，实验组为：ISCOM复合物，空白对照组为：含有空白质粒的复合物，阴性对照组为：PBS。

图5为⁵¹Cr释放法检测激发T细胞对胶质瘤细胞U251的特异性杀伤效应，其中，实验组为：ISCOM复合物，空白对照组为：含有空白质粒的复合物，阴性对照组为：PBS。

具体实施方式

实施例1

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，见分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、CPEB4 全长cDNA的克隆

根据GenBank登录号为NM_030627的CPEB4 基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的CPEB4 cDNA全长：F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg -3’（SEQ ID No.1），下划线部分为PstⅠ酶切位点；R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’（SEQ ID No.2），下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。

分离手术后患者的胶质瘤细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×10⁷个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与p-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了CPEB4 cDNA全长序列（SEQ ID No.3）的阳性克隆质粒命名为pT-CPEB4 。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约2000bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

2、BAFF全长cDNA的克隆

按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacaga aagg-3’（SEQ ID No.4，下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点）和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’（SEQ ID No.5，下划线部分为SalⅠ酶切位点）为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，PCR反应体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-BAFF。

琼脂糖凝胶电泳结果见图2，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物。结果显示PCR产物在约800bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列与GenBank登录号为NM_006573的BAFF全长cDNA序列一致（SEQ ID No.6）。

3、重组载体pStar-CPEB4 /BAFF的构建

根据CPEB4 和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将CPEB4 全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将pT-CPEB4 载体用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PstⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4 ；再将pT-BAFF载体用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的pStar-CPEB4 载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4 -IRES-BAFF。

4、 pStar-CPEB4 /BAFF工程菌的构建

将CPEB4 原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3~4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于YPD平板（1%酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2%琼脂粉）、MD和MM平板，30℃培养3~6天（每天向MM平板中添加甲醇100μL），挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母单菌落为高拷贝CPEB4 工程菌。

5、CPEB4 的诱导表达

将高拷贝CPEB4 工程菌于30℃培养至OD600为2，按10%接种量接入BMGY培养基（pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L）中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基（pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L）中，30℃诱导表达3天（每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5%），4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）透析脱盐，再用琼脂糖凝胶（Q-Sepharose）柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4 的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶（Sephdex G-25）柱脱盐，即得纯化的CPEB4。

Western Blot鉴定：取纯化的CPEB4 ，加入上样缓冲液，100℃加热3~5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人CPEB4 单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照（不加入纯化的CPEB4 ）。

结果见图3，其中1泳道为纯化的CPEB4 ，2泳道为阴性对照，可见1泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

6、免疫刺激复合物( ISCOM-DNA)的制备

每毫升ISCOM-DNA 复合物中含有0. 1mg胆固醇、0. 1mg 卵磷脂、1mg QuilA和0. 5mg 质粒pStar-CPEB4 /BAFF反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰, 混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA 复合物, 并进行无菌检验和物理性状检验。

7、ISCOM-DNA的免疫

（1）体外诱导特异性的CTL

采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞（PBMC）。将PBMC用RPMI 1640培养基在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞［主要为淋巴细胞（PBL）］和贴壁细胞［树突状细胞（DC）］。将DC按细胞密度为2×10⁶/3ml加入含有浓度为800IU/ml的集落刺激因子（GM-CSF）、浓度为1000 IU/ml的白介素4（IL-4）以及浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为10ng/ml的肿瘤坏死因子（TNF-α），第7天获得成熟DC。向成熟DC中加入终浓度为10M的ISCOM，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，30Gy放射性处理，获得负载肽的DC。按PBL与DC的数量比为3:1~6:1向PBL中加入负载肽的DC，再按PBL细胞密度为1.5×10⁶/2ml加入含有浓度为10ng/ml的白介素7（IL-7）以及浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，第11天加入负载肽的DC再次刺激培养的PBL，24~48小时后向细胞培养液中加入浓度为10IU/ml的白介素2（IL-2）并补充IL-7至终浓度为10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培养的PBL，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

（2）特异性CTL对靶细胞的体外杀伤能力检测

将1×10⁶个神经胶质瘤细胞U251转移至离心管中，用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基洗涤1次，吸除大部分上清液，剩余约0.1ml培养基于管底，重悬细胞，加入相应量的51Cr溶液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养2小时，获得51Cr标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比（E/T）为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与上述51Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放孔［用含有浓度为10%（w/w）的FCS的RPMI1640培养基替代效应细胞］。将96孔板1200r/min离心30秒，温度37℃孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为2%（w/w）的Triton X-100并吹打混匀，孵育l0分钟，再将96孔板1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。

结果如图4所示，可见实验组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明ISCOM复合物能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。

（3）特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测

采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：调整效应细胞密度至1×10⁶/ml，取100μl铺板，加入终浓度为10M的肽（按实验分组加入相应肽），刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。

结果如图5所示，可见实验组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明ISCOM复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院四七六医院

<120> 胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

<130> 2013

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatctgcaga tgggggatta cgg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacgaattcg ctggaactaa 20

<210> 3

<211> 2190

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggggatt acgggtttgg agtgctagtg caaagcaata ctgggaataa atctgctttt 60

ccagtcagat tccatccaca tctgcagcct ccacaccatc accaaaatgc cacccccagc 120

cctgctgctt ttataaataa taacacagct gccaatggca gcagtgctgg gtcagcttgg 180

ctttttcctg ctccagctac ccataacatt caggatgaga tcttggggtc agaaaaagca 240

aaaagtcagc aacaggaaca gcaagacccc ttagaaaagc agcagctttc cccaagtcca 300

ggtcaggaag ctggaatact gcctgaaaca gagaaggcaa aatcagaaga aaatcaaggg 360

gacaattctt cggaaaatgg caatgggaag gagaaaataa ggatcgaatc tccagtgttg 420

acagggtttg attatcaaga agccactggg ctaggtactt caacccaacc cttgacatct 480

agcgcatcgt ctcttactgg tttcagtaac tggtcagcag cgatagcgcc ttcctcctct 540

acaataatca atgaagatgc aagtttcttt caccagggag gggtccctgc tgcttcggct 600

aataacggtg ctctgttgtt tcaaaatttc ccccatcatg tcagccctgg ctttggaggc 660

agcttctctc ctcagatcgg gcctctctca cagcaccacc cacatcaccc tcatttccag 720

catcatcaca gccagcatca gcagcaaagg aggtctcctg ccagtcccca tcccccaccc 780

ttcacacata gaaatgctgc ttttaaccag ctgcctcatt tggcgaataa tcttaacaaa 840

cccccctctc cgtggagcag ctaccagagt ccgtcaccaa caccctcctc ttcctggagc 900

ccgggcggtg gtggatatgg tggctgggga ggttcccaag gccgagatca ccgcagaggg 960

ctgaatggtg gaataacgcc cctgaactcc atctcgcctt tgaagaaaaa ttttgcaagc 1020

aatcatattc agctccagaa gtatgctcgc cccagctctg cctttgcacc taaatcctgg 1080

atggaagata gcttgaacag ggctgacaac atttttcctt ttccggatcg ccccaggaca 1140

ttcgacatgc actcactgga gagttcactc attgacataa tgagagctga aaatgatacc 1200

attaaaggtc gtctaaacta ttcatatcca ggatccgata gctctctgct tattaatgca 1260

aggacatatg ggcgaaggag aggtcagtct tcactgtttc caatggaaga tggattcttg 1320

gatgatggcc gtggggatca gcctcttcat agtggcctgg gttcacctca ctgcttcagt 1380

caccagaatg gggaaagagt ggaacgatat tctcgaaagg tgtttgtagg cggattgcct 1440

ccagacattg atgaagatga gatcacagct agttttcgtc gctttggccc tctgattgtg 1500

gattggcctc ataaagctga gagcaaatcc tattttcctc ctaaaggcta tgcattcctg 1560

ctgtttcaag atgaaagctc tgtgcaggct ctcattgatg catgcattga agaagatgga 1620

aaactctacc tttgtgtatc aagtcccact atcaaggata agccagtcca gattcggcct 1680

tggaatctca gtgacagtga ctttgtgatg gatggttcac agccacttga cccacgaaaa 1740

actatatttg ttggtggtgt tcctcgacca ttacgagctg tggagcttgc gatgataatg 1800

gatcggctat atggaggtgt gtgctacgct gggattgata ccgaccctga gctaaaatac 1860

ccaaaaggag ctgggagagt tgcgttctct aatcaacaga gttacatagc tgctatcagt 1920

gcccgctttg ttcagctgca gcatggagag atagataaac gggtggaagt taagccatat 1980

gtcttggatg atcagctgtg tgatgaatgt cagggggccc gttgtggggg gaaatttgct 2040

ccatttttct gtgctaatgt tacctgtctg cagtattact gtgaatattg ctgggctgct 2100

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cctcggcata tttcattccg ctggaactaa 2190

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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atggatgact ccacagaaag ggagcagtca cgccttactt cttgccttaa gaaaagagaa 60

gaaatgaaac tgaaggagtg tgtttccatc ctcccacgga aggaaagccc ctctgtccga 120

tcctccaaag acggaaagct gctggctgca accttgctgc tggcactgct gtcttgctgc 180

ctcacggtgg tgtctttcta ccaggtggcc gccctgcaag gggacctggc cagcctccgg 240

gcagagctgc agggccacca cgcggagaag ctgccagcag gagcaggagc ccccaaggcc 300

ggcctggagg aagctccagc tgtcaccgcg ggactgaaaa tctttgaacc accagctcca 360

ggagaaggca actccagtca gaacagcaga aataagcgtg ccgttcaggg tccagaagaa 420

acagtcactc aagactgctt gcaactgatt gcagacagtg aaacaccaac tatacaaaaa 480

ggatcttaca catttgttcc atggcttctc agctttaaaa ggggaagtgc cctagaagaa 540

aaagagaata aaatattggt caaagaaact ggttactttt ttatatatgg tcaggtttta 600

tatactgata agacctacgc catgggacat ctaattcaga ggaagaaggt ccatgtcttt 660

ggggatgaat tgagtctggt gactttgttt cgatgtattc aaaatatgcc tgaaacacta 720

cccaataatt cctgctattc agctggcatt gcaaaactgg aagaaggaga tgaactccaa 780

cttgcaatac caagagaaaa tgcacaaata tcactggatg gagatgtcac attttttggt 840

gcattgaaac tgctgtga 858

Claims

1.一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗，其特征在于：该疫苗为ISCOM-DNA 复合物，每毫升中含有0. 1mg胆固醇、0. 1mg 卵磷脂、1mg QuilA和0. 5mg 质粒pStar-CPEB4 /BAFF。

2.一种如权利要求1所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆；

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆；

（3）重组载体pStar-CPEB4 /BAFF的构建：将CPEB4 全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游；

（4）pStar-CPEB4 /BAFF工程菌的构建：将CPEB4 原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4 工程菌；

（5）CPEB4 的诱导表达：用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的CPEB4；

（6）ISCOM-DNA 复合物的制备。

3.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg -3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

4.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacaga aagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

5.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（5）纯化的方法为：培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液透析脱盐，再用琼脂糖凝胶Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4 的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶Sephdex G-25柱脱盐。

6.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（6）0.1mg/ml胆固醇、0.1mg/ml 卵磷脂、1mg/ml QuilA和0.5mg/ml 质粒pStar-CPEB4 /BAFF ,反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰, 混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA 复合物。

7.一种如权利要求1~6所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。