CN103505725B - 一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103505725B CN103505725B CN201310460890.XA CN201310460890A CN103505725B CN 103505725 B CN103505725 B CN 103505725B CN 201310460890 A CN201310460890 A CN 201310460890A CN 103505725 B CN103505725 B CN 103505725B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- influenza
- virus
- vaccine
- influenza virus
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 94
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 94
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 33
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 32
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 claims description 18
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 claims description 16
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 32
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 78
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 56
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 22
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 241000710914 Totivirus Species 0.000 description 14
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 14
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 13
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 9
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001506018 H1N1 swine influenza virus Species 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001482592 Oreamnos americanus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100028999 High mobility group protein HMGI-C Human genes 0.000 description 1
- 101000986379 Homo sapiens High mobility group protein HMGI-C Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N alpha-D-glucopyranose Natural products OCC1OC(O)C(O)C(O)C1O WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。本发明公开的具有交叉保护作用的流感病毒疫苗，由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成。本发明公开的以gp96作为天然佐剂的流感病毒通用疫苗具有以下功能特征和效果：1、流感病毒通用疫苗可有效激活流感病毒特异性CTL和Th1型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。2、流感病毒通用疫苗引发抗病毒的T细胞免疫应答对异型流感病毒具有交叉保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。
背景技术
流感病毒的抗原性易发生变异并且可跨种间传播，其中以甲型流感病毒最为重要。由于病毒毒株变异快，一旦有新的流感病毒亚型出现，人群普遍对其缺乏免疫力，容易引起大流行。流感引起的大流行发病率和死亡率很高，尤其是对儿童和老年人。目前唯一可行的预防措施是疫苗接种，市场上应用的疫苗主要是全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，这些疫苗主要针对血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸（neuraminic acid,NA）产生特异性抗体。但是流感病毒血清型众多，现有疫苗在各个血清型之间的交叉保护能力较差，致使流感疫苗缺乏对新型流感疫苗的交叉保护功能，新型流感病毒的出现容易引起大面积的人群感染甚至社会恐慌，因此每年人群都需要接种流感疫苗。
甲型H1N1流感病毒裂解疫苗为全病毒裂解苗，其T细胞免疫活性很低，因此开发具有交叉保护能力的流感病毒通用疫苗具有重要的科学价值和社会意义。
热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）存在于细胞浆和内质网膜内，由HSP60，HSP70，HSP90和gp96等多个成员组成。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。
本发明所提供的一种具有交叉保护作用的流感疫苗，由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成。
所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为1:4—1:400。
所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为3：400。
所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
所述流感疫苗中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。
所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为未含有热休克蛋白gp96的流感疫苗。
所述流感疫苗中，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒。
所述流感疫苗中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗、甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗或甲型H1N1人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的全病毒灭活疫苗。
所述流感疫苗中，所述交叉保护作用是指该疫苗既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
所述流感疫苗中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种：人、猪和禽。
本发明所提供的制备具有交叉保护作用的流感疫苗的方法，包括如下步骤：将普通流感疫苗和热休克蛋白gp96混合，得到具有交叉保护作用的流感疫苗。
所述制备方法中，所述的交叉保护作用是指疫苗既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，又能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种：人、猪和禽。
所述制备方法中，普通流感疫苗与热休克蛋白gp96的质量比为1:4—1:400，具体可为3：400。
所述制备方法中，所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
所述制备方法中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。
所述制备方法中，所述普通流感疫苗为未含有热休克蛋白gp96的流感疫苗。
所述制备方法中，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒。
所述制备方法中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
所述制备方法中，所述普通流感疫苗为猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗、甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗或甲型H1N1人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的全病毒灭活疫苗。
所述的流感疫苗在制备具有交叉保护作用的预防和/或治疗流感的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述交叉保护作用是指该产品既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，又能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
上述应用中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种：人、猪和禽。
上述应用中，所述流感是由流感病毒引起的。
上述应用中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
上述应用中，所述人流感病毒为甲型H1N1人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)，所述猪流感病毒为甲型H1N1猪流感病毒A/California/7/2009(H1N1)，所述禽流感病毒为甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)。
热休克蛋白gp96在制备提高流感疫苗的交叉保护性能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述提高流感疫苗的交叉保护性能是指使流感疫苗不但能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
上述应用中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种：人、猪和禽。
上述应用中，所述流感疫苗是用流感病毒制成的疫苗。
上述应用中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。
上述应用中，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒。
上述应用中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
上述任一所述技术方案中，热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述热休克蛋白gp96在实施例中为带有His标签的gp96蛋白，His标签不影响疫苗活性。
本发明所提供的以gp96作为天然佐剂的流感病毒通用疫苗具有以下功能特征和效果：
1、流感病毒通用疫苗可有效激活流感病毒特异性CTL和Th1型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。
2、流感病毒通用疫苗引发抗病毒的T细胞免疫应答对异型流感病毒具有交叉保护作用。
附图说明
图1为人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE和western blot鉴定结果。
图2为基因工程制备的gp96蛋白的SDS-PAGE和western blot鉴定结果。
图3为流式细胞术检测T淋巴细胞早期活化水平结果。
图4为免疫后小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。
图5为免疫后小鼠血清血凝抑制抗体水平检测结果。
图6为免疫后小鼠血清中和抗体水平检测结果。
图7为免疫后小鼠血清抗体水平检测结果。
图8为通用疫苗交叉保护结果。
图9为攻毒后小鼠肺脏内病毒滴度。
图10为通用疫苗诱导小鼠产生针对流感病毒保守序列特异性T细胞结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的PBS溶液（pH为7.4）配方如下：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.63g，KH2PO40.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加ddH2O定容至1L，常温保存备用。
下述实施例中使用的实验材料及其来源如下：
一、热休克蛋白gp96，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
该热休克蛋白gp96可以按照如下两种方法进行制备：
（一）天然纯化方法
1、组织匀浆
匀浆缓冲液配方：在pH7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF（苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S）至终浓度1mM（置于冰上的烧杯中配制：PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜）。
取烧杯至于冰上，将小鼠肝脏组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液。将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上。匀浆液倒入离心管，50,000g离心60min，取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5，200mM NaCl)，用于步骤2的ConA-Sepharose层析。
2、ConA-Sepharose亲和层析
载体为ConA-Sepharose（购自GE公司，产品号为17-0440-01），按“1ml载体/4g
组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm。
将步骤1得到的上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS（pH7.5，200mM NaCl）中加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液甲，用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱（0.5ml/min），以去除未结合蛋白。在PBS（pH7.5，200mM NaCl）中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度10%（10mg/ml），加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液乙，用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过柱层析（0.25ml/min），收集洗脱液。
3、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析
载体为HiTrap-Q Sepharose（层析柱为HiTrap Q HP，购自GE公司，产品号为17-1153-01）。层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。
将载体装柱后，先用5ml PBS（pH7.5，200mM NaCl）清洗（1ml/min）。将步骤2得到的洗脱液上样（1ml/min），然后将5ml PBS（pH7.5，200mM NaCl）过层析柱（1ml/min），以去除未结合蛋白。然后将10ml PBS（pH7.5，300mM NaCl）过层析柱（1ml/min），以去除未结合蛋白。然后将3ml PBS（pH7.5，600mM NaCl）过层析柱（1ml/min），收集洗脱液，即为gp96提取物。
将gp96提取物进行10%SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。
将gp96提取物进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体（购自santa cruz，产品号为sc-56339），二抗为HRP标记山羊抗大鼠IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为ZB-2307）。
除了小鼠肝脏，也可用如下组织制备gp96提取物：小鼠黑色素瘤（B16）、猪肝脏、人肝癌细胞系HepG2培养细胞、临床手术切除的人肿瘤组织（乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌）和人胎盘，提取方法参照小鼠肝脏的提取。
用人胎盘组织制备的gp96提取物鉴定结果见图1。
图1中，1：分子量标准；2：用人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE电泳图；3：western blot鉴定图。
（二）基因工程方法
1、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建
①提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。
②以步骤①的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR引物如下：
Fp：5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3'；
Rp：5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3'。
（下划线所示序列为酶切识别位点）
③用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
④用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。
⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列。
⑥在重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段，LEU2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。BamHI酶切位点插入α-淀粉酶报告系统，该系统的序列如SEQ IDNo.4所示，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。
2、gp96蛋白的表达
①采用电转化法将步骤1得到的重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母（购自ATCC，产品号为MYA-335）细胞，得到重组菌。
②将重组菌接种于5mL SD液体培养基（购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7），37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基（购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1），30℃培养48h，得到种子培养液。
③将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5%左右，同时控制溶氧在20%以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生（补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8%左右），诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。
3、gp96蛋白的分离纯化
将步骤2得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。
将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司（Invitrogen Corporation）的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS（含20mM咪唑）平衡柱子2h。将浓缩液用PBS（含20mM咪唑）稀释后上样，用PBS（含20mM咪唑）冲洗柱子至OD值<0.01，用PBS（含200mM咪唑）洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4℃下进行，流速为0.5mL/min。
每升步骤2得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90%以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为：200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mM NaCl的PBS液洗杂质，800mM NaCl的PBS液洗脱目的蛋白。
将步骤2的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10%SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体（购自santa cruz，产品号为sc-56399），二抗为HRP标记山羊抗大鼠IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为ZB-2307）。结果见图2。
图2中，1：分子量标准；2：步骤2的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：western blot鉴定图。
图2显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。
该gp96蛋白带有His标签蛋白，该标签蛋白不影响疫苗活性。
以下实施例中用到的gp96蛋白为基因工程方法制备的gp96蛋白。
抗CD4的抗体购自BioLegend，产品目录号为100407。
抗CD8的抗体购自BioLegend，产品目录号为100705。
TMB显色液购自江苏碧云天公司，产品号为P0209。
HRP标记山羊抗小鼠的IgG抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG1抗体、HRP标记的山羊抗小鼠的IgG2a抗体均购自SEROTEC公司，产品号分别为STAR117P，STAR132P，STAR133P。
BABL/c小鼠和鸡胚购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
IL-4的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7044。
TNF-α的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7324。
IL-6的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7064。
IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7314。
二、猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗
猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗购自北京科兴生物制品股份有限公司，商品名为盼尔来福.1(PANFLU.1)，批准文号：国药准字S20090012、国药准字S20090013、国药准字S20090014。甲型H1N1流感病毒裂解疫苗本身不含有任何佐剂。
三、甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗
甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗的制备方法如下：
（一）病毒增殖
取9日龄的SPF鸡胚，用照蛋器照蛋，除掉无精蛋、碎蛋和终止蛋。将气室端朝上放在蛋盘里，在照蛋器下面画出其气室和胚胎位置，在气室边缘上端3-5mm处做一标记作为接种部位。用70%酒精消毒鸡胚，在气室上方打孔，用1ml注射器将处理后的A/WSN/1/1933(H1N1)病毒标本沿小孔（避开鸡胚）在尿囊腔内注射0.1ml。将注射器放入安全地方，用蜡封孔。37℃培养72小时后收获。鸡胚放在4℃条件下冷却4h或过夜，用70%酒精消毒鸡胚，用灭菌的镊子击碎气室上方的蛋壳，另外用一把灭菌的镊子压住尿囊膜。用10ml吸管吸取尿囊液并放在标记好的塑料管内。挑破尿囊膜，尽可能的收取更多的尿囊液。在3000rpm/min，离心5min收获的液体，以除去血和细胞。收获的尿囊液用血凝试验检测有无病毒，并做无菌检测后贮存在-80℃条件下。
（二）病毒灭活疫苗的制备
在病毒中加入终浓度不高于0.2mg/ml的甲醛，置2-8℃将病毒灭活7-10天。病毒灭活到期后，取样进行病毒灭活验证试验，并进行细菌内毒素含量测定。超滤浓缩灭活的单价病毒合并液，浓缩后的病毒液血凝效价应不低于1:10240。超滤浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心法进行纯化，由高到低依次加入30%、45%和60%的蔗糖溶液。缓慢加入待纯化的病毒液，1.1×105g，超速离心2.5小时。取30%和45%蔗糖溶液之间的病毒溶液，1.1×105g，超速离心3小时后取沉淀，溶解在PBS溶液中。纯化后的病毒液经除菌过滤，即为单价原液，可作为免疫用疫苗。实施例中简称为WSN全病毒灭活苗。
四、甲型H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的全病毒灭活疫苗
甲型H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的全病毒灭活疫苗制备方法与上述甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗的制备方法相同，实验中将甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)替换为甲型H1N1人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)。实施例中简称为PR8全病毒灭活苗。
五、实施例中的攻毒实验使用的病毒株
1、人流感病毒PR8：甲型H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)；
2、禽流感病毒WSN：甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)；
3、猪流感病毒：甲型H1N1猪流感病毒A/California/7/2009(H1N1)。
以上三种病毒均购自ATCC。
实施例1、猪流感病毒通用疫苗及其功能验证
一、猪流感病毒通用疫苗的组成
由猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗和热休克蛋白gp96组成，猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗和热休克蛋白gp96的质量比为0.15微克：20微克。
二、猪流感病毒通用疫苗的功能验证
（一）免疫方法
6周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠分成3组，每组15只，每组免疫两次，间隔14天分别进行免疫，免疫方式为腹腔注射。
第一组（gp96＋PANFLU.1）：每只小鼠每次免疫0.15微克PANFLU.1和20微克gp96（用PBS稀释至500微升）。
第二组（PANFLU.1）：每只小鼠每次免疫0.15微克PANFLU.1（用PBS稀释至500微升）。
第三组（PBS，空白对照）：每只小鼠每次免疫500微升PBS。
（二）结果
1、细胞免疫
最后一次免疫后一周处死小鼠并在无菌条件下分离脾细胞，计数后稀释至所需浓度待用。
T细胞活化因子CD69比例分析：分离小鼠脾脏的T细胞，流式细胞术（FACS）检测T细胞活化因子CD69的表达水平。小鼠T细胞活化因子CD69检测试剂盒购自eBioscience公司，货号为12-0691-81，实验按照说明书操作。CD69是T淋巴细胞早期活化的标志，CD69流式检测数据分析结果见图3。
图3中，A：CD69+的CD4+T细胞占CD4+T细胞的比例；B：CD69+的CD8+T细胞占CD8+T细胞的比例。
图3A显示，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）：CD69+的CD4+T细胞占CD4+T细胞数的比例为9.31±0.33％；第二组(疫苗组：PANFLU.1)CD69+的CD4+T细胞占CD4+T细胞数的比例为6.07±0.51％，第一组比第二组CD69活化升高50％。
图3B显示，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）CD69+的CD8+T细胞占CD8+T细胞数的比例为5.06±0.86％；第二组(疫苗组：PANFLU.1)CD69+的CD8+T细胞占CD8+T细胞数的比例为4.66±0.24，第一组比第二组CD69活化升高8.5％。
免疫后小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子的检测结果见图4。
图4中，A：IL-6水平的检测；B：IL-4水平的检测；C：TNF-α水平的检测；D：IFN-γ水平的检测。
图4显示，与第二组(疫苗组：PANFLU.1)相比，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）的TNF-α、IL-6、IFN-γ水平分别升高到第二组的1.3倍、1.5倍和2倍，说明gp96可以激活Th1型细胞，并刺激细胞分泌细胞因子。
上述实验数据表明，科兴公司生产的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗T细胞免疫活性很低。gp96作为天然佐剂能有效激活流感病毒特异性CTL和Th1型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。
2、体液免疫
第一次免疫2周后以及第二次免疫2周后，在小鼠尾部取血，于4℃静置3-4小时，1000g离心3min后取上清，用于抗体水平检测。
取小鼠血清进行血凝抑制试验，操作如下：取一干净的塑料板，标明测定血清标本。每孔加入25ul生理盐水。于第一孔和最后一孔中各加入25ul经RDE处理过的血清，从第一孔起作倍比稀释至倒数第二孔，弃掉25ul。将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉25ul。于最后一孔加入25ul生理盐水，其余各孔一律加入25ul四个凝集单位抗原，轻轻摇匀，置室温60min。各孔加入25ul1%的红细胞悬液，摇匀置室温30-60min后观察结果。以能完全抑制红细胞凝集（简称血抑）的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价即终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。结果见图5。
图5显示，免疫小鼠14天后，与第二组(疫苗组：PANFLU.1)相比，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）可提高血凝抑制抗体水平到第二组的1.9倍。
取小鼠血清进行中和抗体检测，采用空斑减少法，操作如下：100PFU的病毒与倍比稀释的血清等量混合，于37℃放置l小时，每瓶细胞接种0.2ml，每个稀释度接种3个形成单层MDCK细胞的细胞瓶，37℃吸附1小时后，加入44℃预热的营养琼脂，平放1小时，凝固后放入CO2培养箱，孵育7天，检查细胞培养物的血细胞吸附作用，使空斑减少50%的血清稀释度就是该血清的中和价。结果见图6。
图6显示，免疫小鼠14天后，与第二组(疫苗组：PANFLU.1)相比，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）可提高中和抗体水平到第一组的2.5倍。免疫小鼠28天后，与第二组(疫苗组：PANFLU.1)相比，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）可提高中和抗体水平到第一组的2倍。
取小鼠血清进行ELISA检测，操作如下：每孔包被10ug HA，4℃孵育过夜，然后再以PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。将血清稀释，每孔加入100ul，共加3孔，分别检测IgG、IgG1、IgG2a。37℃孵育2h，再以PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。分别加入HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgG1抗体、HRP标记的IgG2a抗体，37℃孵育1h。再以PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。每孔加入100ulTMB显色液，37℃放置15min后加入50ul2M硫酸终止反应，在酶标仪上以波长490nm检测。结果见图7。
图7中，A：IgG的检测；B：IgG2a的检测；C：IgG1的检测；D：IgG2a/IgG1。
一般用IgG2a/IgG1来评价疫苗诱导的免疫应答是偏向于Th1还是Th2型（因为Th细胞的两个分化方向，Th1可以分泌多种细胞因子如干扰素促进CTL反应即所谓的细胞免疫倾向，而Th2则可以分泌细胞因子IL-4促进抗体产生即所谓的体液免疫倾向）在小鼠体内，Th1型会产生IgG2a型抗体，Th2型则会产生IgG1型抗体。
图7D显示，与第二组(疫苗组：PANFLU.1)相比，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）IgG2a的表达量显著升高，说明gp96诱导T细胞应答偏向于激活细胞免疫。
3、交叉保护实验
（1）最后一针免疫10天后的小鼠用人流感病毒PR8以及禽流感病毒WSN分别感染：乙醚麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注107PFU的流感病毒，每天监测小鼠存活状况，监测期为14天。结果见图8，图中的Gp96组代表第一组。
图8中，A：免疫后的小鼠用人流感病毒PR8感染后的存活率；B：免疫后的小鼠用禽流感病毒WSN感染后的存活率。
图8A显示，第14天时，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）免疫小鼠能抵抗人流感病毒PR8的攻击，保护率均为100%。而第二组(疫苗组：PANFLU.1)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天小鼠出现死亡，14天后全部死亡。第三组（空白对照组）小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第4天小鼠出现死亡，14天后全部死亡。
图8B显示，第14天时，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）免疫小鼠能抵抗禽流感病毒WSN的攻击，保护率均为100%。而第二组(疫苗组：PANFLU.1)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天小鼠出现死亡，14天后存活率为20%。第三组（空白对照组）小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天后小鼠出现死亡，14天后全部死亡。
（2）最后一针免疫10天后的小鼠用人流感病毒PR8以及禽流感病毒WSN分别感染，四天后取小鼠肺脏进行病毒滴度测定。攻毒4天后小鼠拉颈处死后，在无菌状态下取出肺脏，称重后在研磨钵中研磨，按照1g肺脏组织：10ml PBS的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5ml Ep管中，2000g离心10分钟，取上清，测PFU。结果见图9。
图9中，A：免疫后的小鼠用人流感病毒PR8感染后肺脏病毒滴度测定；B：免疫后的小鼠用禽流感病毒WSN感染后肺脏病毒滴度测定。
图9A显示，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）和第二组(疫苗组：PANFLU.1)小鼠感染人流感病毒PR84天后肺部病毒的平均滴度是3.1x104PFU/ml和1.4x106PFU/ml，第三组（空白对照组）肺部病毒的平均滴度是3.1x106PFU/ml。
图9B显示，第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）和第二组(疫苗组：PANFLU.1)小鼠感染禽流感病毒WSN4天后肺部病毒的平均滴度是4.6x103PFU/ml和8.7x105PFU/ml，第三组（空白对照组）肺部病毒的平均滴度是1.1x106PFU/ml。
以上数据表明，与单独用流感病毒疫苗免疫相比，用流感病毒疫苗联合gp96免疫后再给于高剂量的病毒感染小鼠，小鼠肺部病毒滴度明显降低。
4、T细胞免疫应答对流感病毒感染的交叉保护作用
NP是保守蛋白，是甲型流感病毒CTL识别的主要抗原之一，甲流感NP可以诱发针对异型流感病毒的CTL反应，因此本实施例中应用ELISPOT方法，选用核心蛋白（NP）H-2d限制性CTL表位（NP147-155）用于刺激免疫的BALB/c(H-2d)小鼠T细胞，用含有浓度为10μg/mLHA的疫苗液（猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗）刺激免疫的BALB/c(H-2d)小鼠T细胞，同时选用PR8全病毒灭活苗刺激免疫的BALB/c(H-2d)小鼠T细胞，检测gp96作为佐剂的流感疫苗对异型流感病毒的交叉反应。结果见图10。
图10显示，NP147-155可以明显的刺激第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）的T细胞分泌IFN-γ，猪甲型H1N1流感病毒裂解疫苗和PR8全病毒灭活苗同样能刺激第一组（gp96佐剂组：gp96＋PANFLU.1）的T细胞分泌IFN-γ。这三种刺激源均不能刺激第二组(疫苗组：PANFLU.1)的T淋巴细胞分泌IFN-γ。这说明gp96作为佐剂的流感疫苗之所以能产生对异型流感病毒产生交叉保护作用是由于其能诱发流感病毒内部保守蛋白特异性的CTL。
科兴公司生产的甲型H1N1流感疫苗为全病毒裂解疫苗，T细胞免疫活性很低，实验结果显示gp96作为天然佐剂能有效激活流感病毒特异性CTL和Th1型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。用甲型H1N1流感病毒裂解疫苗与gp96联合免疫小鼠可以对甲流感病毒不同毒株产生很好的交叉保护能力。
当本发明疫苗中新型H1N1猪流感病毒的裂解苗和热休克蛋白gp96的质量比为1:4、1:40或1:400时，本发明疫苗的实验效果与上述结果无显著差异。
实施例2、人流感病毒通用疫苗及其功能验证
一、人流感病毒通用疫苗的组成
人流感病毒通用疫苗由甲型H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96组成，甲型H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)和热休克蛋白gp96的配比为0.15微克：20微克。
二、人流感病毒通用疫苗的功能验证
（一）免疫方法
6周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠分成3组，每组10只，每组免疫两次，间隔14天分别进行免疫，免疫方式为腹腔注射。
第一组（gp96＋PR8全病毒灭活苗）：每只小鼠每次免疫0.15微克PR8全病毒灭活苗和20微克gp96（用PBS稀释至500微升）；
第二组（PR8全病毒灭活苗）：每只小鼠每次免疫0.15微克PR8全病毒灭活苗（用PBS稀释至500微升）；
第三组（PBS，空白对照）：每只小鼠每次免疫500微升PBS。
（二）交叉保护实验
1、最后一针免疫10天后的小鼠用禽流感病毒WSN以及猪流感病毒分别感染，乙醚麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注107PFU的流感病毒，每天监测小鼠的存活状况,监测期为14天。结果见表1。
2、最后一针免疫10天后的小鼠用禽流感病毒WSN以及猪流感病毒分别感染，四天后取小鼠肺脏进行病毒滴度测定。攻毒4天后小鼠拉颈处死后，无菌状态下取出肺脏，称重后与研磨钵中研磨，按照1g肺脏组织：10ml PBS的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5ml Ep管中，2000g离心10分钟，取上清，测PFU。结果见表1。
表1 攻毒后疫苗对小鼠保护情况以及攻毒4天后小鼠肺脏病毒滴度
当本发明疫苗中人流感病毒PR8全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96的质量比为1:4、1:40或1:400时，本发明疫苗的实验效果与上述结果无显著差异。
实施例3、禽流感病毒通用疫苗及其功能验证
一、禽流感病毒通用疫苗的组成
禽流感病毒通用疫苗由甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96组成，甲型H1N1禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96的配比为0.15微克：20微克。
二、禽流感病毒通用疫苗的功能验证
（一）免疫方法
6周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠分成3组，每组10只，每组免疫两次，间隔14天分别进行免疫，免疫方式为腹腔注射。
第一组（gp96＋WSN全病毒灭活苗）：每只小鼠每次免疫0.15微克WSN全病毒灭活苗和20微克gp96（用PBS稀释至500微升）；
第二组（WSN全病毒灭活苗）：每只小鼠每次免疫0.15微克WSN全病毒灭活苗（用PBS稀释至500微升）；
第三组（PBS，空白对照）：每只小鼠每次免疫500微升PBS。
（二）交叉保护试验
1、最后一针免疫10天后用人流感病毒PR8以及猪流感病毒分别感染，乙醚麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注107PFU的流感病毒，每天监测小鼠的存活状况，监测期为14天。结果见表2。
2、最后一针免疫10天后用人流感病毒PR8以及猪流感病毒分别感染，四天后取小鼠肺脏进行病毒滴度测定。攻毒后4天后小鼠拉颈处死后，无菌状态下取出肺脏，称重后与研磨钵中研磨，按照1g肺脏组织：10ml PBS的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5mlEp管中，2000g离心10分钟，取上清，测PFU。结果见表2。
表2 攻毒后疫苗对小鼠保护情况以及攻毒4天后小鼠肺脏病毒滴度
当本发明疫苗中的禽流感病毒WSN的全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96的质量比为1:4、1:40或1:400时，本发明疫苗的实验效果与上述结果无显著差异。
Claims (5)
1.一种流感疫苗在制备具有交叉保护作用的预防和/或治疗流感的产品中的应用；
所述流感疫苗由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成；
所述热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为1:4—1:400。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为3：400。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒；
和/或，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
5.热休克蛋白gp96在制备提高流感疫苗的交叉保护性能的产品中的应用；
所述提高流感疫苗的交叉保护性能是指使流感疫苗不但能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B选自如下中的至少一种：人、猪和禽。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310460890.XA CN103505725B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310460890.XA CN103505725B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103505725A CN103505725A (zh) | 2014-01-15 |
| CN103505725B true CN103505725B (zh) | 2015-06-24 |
Family
ID=49889496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310460890.XA Active CN103505725B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103505725B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105194668B (zh) * | 2015-10-22 | 2019-03-26 | 中国科学院微生物研究所 | 一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718243A (zh) * | 2004-07-07 | 2006-01-11 | 中国科学院微生物研究所 | 一类免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物制备中的应用 |
-
2013
- 2013-09-30 CN CN201310460890.XA patent/CN103505725B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718243A (zh) * | 2004-07-07 | 2006-01-11 | 中国科学院微生物研究所 | 一类免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物制备中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Generation of Murine CTL by a Hepatitis B Virus-Specific Peptide and Evaluation of the Adjuvant Effect of Heat Shock Protein Glycoprotein 96 and Its Terminal Fragments;Hongtao Li et al;《The Journal of Immunology》;20051231;第174卷;第195-204页 * |
| GP96蛋白的免疫学及其临床应用研究进展;陈才伟等;《生物工程学报》;20111231;第27卷(第5期);全文 * |
| Identification and structural definition of H5-specific CTL epitopes restricted by HLA-A*0201 derived from the H5N1 subtype of influenza A viruses;Yeping Sun et al;《Journal of General Virology》;20101231;第91卷;第919-930页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103505725A (zh) | 2014-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111018995A (zh) | 一种非洲猪瘟b、t细胞表位串联融合疫苗 | |
| CN105906721B (zh) | 一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白、基因工程亚单位疫苗及制备方法 | |
| CN111018996A (zh) | 一种非洲猪瘟中和表位亚单位疫苗 | |
| CN105934441A (zh) | 新型sars免疫原性组合物 | |
| CN103282023A (zh) | 狂犬病糖蛋白病毒样颗粒(vlp) | |
| CN113666990B (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
| CN105101992A (zh) | 用于呼吸道合胞体病毒和流感的组合疫苗 | |
| Sumirtanurdin et al. | Coronavirus disease 2019 vaccine development: an overview | |
| EA011557B1 (ru) | Конструкции нуклеиновых кислот | |
| CN103384531A (zh) | 经修饰流感血凝素蛋白及其用途 | |
| TW202203967A (zh) | 不活化ＳＡＲＳ—ＣｏＶ—２病毒疫苗 | |
| WO2023023940A1 (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
| JP2023052092A (ja) | 免疫原性組成物 | |
| Wang et al. | Vaccination with a single consensus envelope protein ectodomain sequence administered in a heterologous regimen induces tetravalent immune responses and protection against dengue viruses in mice | |
| Keshavarz et al. | Induction of protective immune response to intranasal administration of influenza virus‐like particles in a mouse model | |
| WO2023207717A1 (zh) | H5n8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 | |
| CN103505725B (zh) | 一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法 | |
| CN102337289A (zh) | 肠道病毒71型vp1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗 | |
| CN107970444A (zh) | 复合佐剂及含有该复合佐剂的疫苗 | |
| CN110229219A (zh) | 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途 | |
| CN108503697A (zh) | 一种果蝇细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗 | |
| CN106913863A (zh) | Nup188蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用 | |
| CN102199217A (zh) | 乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN102813920A (zh) | 一种疫苗佐剂 | |
| CN107973849B (zh) | 一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANTONG BIOLOGICAL SCIENCE PARK DEVELOPMENT INVEST Free format text: FORMER OWNER: ZHONGKE MICROORGANISM IMMUNE AGENTS ENGINEERING CENTER NANTONG CO., LTD. Effective date: 20150717 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150717 Address after: 226005, six floor, 118 Nantong Road, Gangzha District, Jiangsu, China Patentee after: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Address before: 226006 No. 499 Renmin West Road, Jiangsu, Nantong Patentee before: Nantong company limited of microorganism immune formulation engineering center of middle section |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20161019 Address after: 226005 Jiangsu city of Nantong province Gangzha Xingtai Road Development Zone No. 18 Patentee after: Nantong Biao Yuan Bioisystech Co., Ltd Address before: 226005, six floor, 118 Nantong Road, Gangzha District, Jiangsu, China Patentee before: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20191008 Address after: 100018 Beijing Chaoyang District Chaoxin Jiayuan Dongli District 8 Building (become the future incubator 0310) Patentee after: Beijing thermal biological technology Co., Ltd. Address before: 226005 Jiangsu city of Nantong province Gangzha Xingtai Road Development Zone No. 18 Patentee before: Nantong Biao Yuan Bioisystech Co., Ltd |
|
| TR01 | Transfer of patent right |