CN105101992A - 用于呼吸道合胞体病毒和流感的组合疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开要求保护用于提高免疫响应的组合物和方法，所述免疫响应是针对流感和呼吸道合胞体病毒的，所述方法是通过施用同时针对两种病毒的组合免疫原性组合物进行的。所述组合组合物含有RSV组分和1、2、3、4个或多个流感组分。组合组合物提供了比分开地施用RSV和流感组分更大的免疫响应。

Description

用于呼吸道合胞体病毒和流感的组合疫苗

对相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请Nos.61/763,309(申请日2013年2月11日)和61/875,327(申请日2013年9月9日)的优先权，其各自以其整体并入用于所有目的。

如下申请所公开的内容以其整体并入了本申请用于所有目的：13/269,107(申请日2012年9月27日)、61/015,440(申请日2007年12月20日)、11/582,540(申请日2006年10月18日)(美国专利申请公开No.2007/0184526)、60/727,513(申请日2005年10月18日)；60/780,847(申请日2006年3月10日)；60/800,006(申请日2006年5月15日)；60/831,196(申请日2006年7月17日)；60/832,116(申请日2006年7月21日)、60/845,495(申请日2006年9月19日)、10/617,569(申请日2003年7月11日)(美国专利申请公开No.2005/0009008)、12/340,186(申请日2008年12月19日)(美国专利申请公开No.2010/0129401)和12/689,826(申请日2010年1月19日)(美国专利申请公开No.2010/0184192)。

对序列表的交叉引用

随函电子提交的文本文件的内容在此通过提述以其整体并入：计算机可读形式的序列表副本(文件名：NOVV_53_Seq_List.txt，数据记录于2014年2月11日；文件大小：74千字节)。

技术领域

本公开主要涉及免疫原性组合物，如疫苗，其用于治疗和/或预防通过RSV和通过流感病毒的感染。

发明背景

呼吸道合胞体病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的肺病毒属(Pneumovirus)的成员。人RSV(HRSV)是儿童中严重下呼吸道疾病的主要病因，并且是人中相当大的发病和死亡的原因。RSV也被公认为是免疫受损的成人中和老年人中疾病的重要致病原。由于天然感染后受感染的宿主中对RSV的不完全抗性，RSV可能在童年和成年期间感染多次。

这种病毒具有由单链负链RNA组成的基因组，所述RNA与病毒蛋白紧密结合形成核壳。病毒包膜由来源于脂双层的质膜组成，所述脂双层包含病毒编码的结构蛋白。病毒聚合酶伴随病毒粒子包装并将基因组RNA转录为mRNA。RSV基因组编码三个跨膜结构蛋白：F、G和SH，两个基质蛋白：M和M2，三个核壳蛋白：N、P和L，以及两个非结构蛋白：NS1和NS2。

人们认为HRSV和细胞膜的融合发生在细胞表面处，并且是感染早期过程中将病毒核糖核蛋白转运到细胞质中的必需步骤。这个过程是由融合物(F)蛋白介导的，其还促进受感染细胞的膜与邻近细胞膜的融合，从而形成特征性的合胞体，这既是一种突出的细胞病变效应也是一种病毒传播的额外机制。因而，对于融合活性的中和在宿主免疫性中十分重要。的确，针对F蛋白开发的单克隆抗体已显示出中和病毒感染性并抑制膜融合(Calder等,2000,Virology271:122-131)。

RSV的F蛋白与其他副粘病毒的F糖蛋白具有结构特征同一性和有限但显著的氨基酸序列同一性。它被合成为无活性的574个氨基酸的前体(F0)，其在内质网中随着翻译而在天冬酰胺处被糖基化，它在内质网中组装为同源寡聚体。在到达细胞表面之前，F0前体被蛋白酶切割为始于N端的F2和始于C端的F1。F2和F1链保持通过一个或多个二硫键共价地连接。

已发现，免疫亲和性纯化的全长F蛋白以胶束(micelles)形式(也表征为玫瑰型(rosettes))聚集，这与对其他全长病毒膜糖蛋白所观察到的相似(Wrigley等,1986,inElectronMicroscopyofProteins,Vol5,p.103-163,AcademicPress,London)。在电子显微镜下，玫瑰型中的分子或是表现为倒锥形棒状(～70％)或棒棒糖形状(～30％)结构，其较宽的末端从玫瑰型的中心向外伸出。棒状构象状态与F糖蛋白在融合前无活性状态中的F糖蛋白有关，而棒棒糖状构象状态与融合后的活性状态的F糖蛋白有关。

电子显微镜可用于区分融合前和融合后(或称为膜融合前的和膜融合的)构象，如Calder等,2000,Virology271:122-131所示。融合构象也可以通过脂质体关联分析与膜融合的(融合后)构象区分开来。此外，融合前和膜融合的构象可以用抗体(例如单克隆抗体)来区分开，所述抗体识别存在于一个或另一个融合前或膜融合形式的RSVF蛋白上的构象表位，但不识别另一种形式。这些构象表位可以是由于分子表面上的抗原决定簇的优先暴露而成的。或者，构象表位可以是由线性多肽中非连续氨基酸的并排而引起的。

此前已显示F前体在两个位点(在残基109之后的位点I和在残基136之后的位点II)处被切割，两个位点都位于弗林样(furin-like)蛋白酶所识别的基序之前。位置II与融合肽邻近，并且F蛋白在两个位点处的切割都是膜融合所需要的(Gonzalez-Reyes等,2001,PNAS98(17):9859-9864)。当在两个位点处都完成切割时，人们相信锥形转换成了棒棒糖形棒条。

发明概述

此处提供的是含有RSVF组分和至少一个流感组分的免疫原性组合物。RSVF和流感组分一起可用于在动物(如人)中刺激免疫响应，所述免疫响应保护免受组合物中所包含的RSV和流感株的感染。

组合RSVF和流感VLP疫苗在小鼠中耐受良好且具有免疫原性。出人意料的是，组分的组合导致了组合与分开施用组分相比针对病毒抗原升高的免疫响应。不受理论的束缚，免疫原性数据显示流感抗原(可能是HA部分)增强了RSVF响应，并且RSV组分相反地增加了HA响应，这可能是由于RSV缓冲液，例如比流感缓冲液低的pH，或是由于组氨酸的存在。‘

附图简述

图1显示了在施用患者前制备公开的组合组合物，所述制备是通过组合RSV组分和流感组分而进行的。

图2描述了由公开的组合组合物诱导的对比由RSVF和流感组分诱导的针对RSV的具体抗体。

图3描述了由公开的组合组合物诱导的对比由RSVF和流感组分诱导的针对RSV的中和抗体。

图4描述了由公开的组合组合物诱导的对比由RSVF和流感组分诱导的针对RSV的帕利珠单抗竞争性抗体。

图5显示了由针对A-California株的免疫作用所诱导的凝血抑制响应。数据比较了由RSV/三价流感组合物诱导的响应对比RSV和三价流感组合物单独诱导的响应。

图6显示了通过针对A/Victoria株的免疫诱导的凝血抑制响应。数据比较了由RSV/三价流感组合物诱导的响应对比RSV和三价流感组合物单独诱导的响应。

图7显示了通过针对B/Wisconsin株的免疫诱导的凝血抑制响应。数据比较了由RSV/三价流感组合物诱导的响应对比RSV和三价流感组合物单独诱导的响应。

图8显示了通过针对RSVF组分的免疫诱导的抗-RSVFIgG响应。数据比较了存在或不存在磷酸铝佐剂时，在不同RSV抗原治疗水平处序贯施用RSV/TIV(三价流感疫苗)组合组合物所诱导的响应。

图9显示了帕利珠单抗样抗体的估计水平，其通过竞争性ELISA测得。数据比较了存在或不存在磷酸铝佐剂时，在不同RSV抗原治疗水平处序贯施用RSV和TIV流感组合组合物所诱导的响应，并证明了诱导的免疫响应没有遭受抗原干扰。

图10显示了结合至抗原位点II(AgsiteII)的IgG。数据比较了存在或不存在磷酸铝佐剂时，在不同RSV抗原治疗水平处序贯施用RSV/TIV流感组合物所诱导的响应，并证明了组合物诱导不受抗原干扰的免疫响应。

图11A-B显示了小鼠研究中的抗-RSVIgG响应。图11A显示了响应于RSV-F组合物、四价流感组合物、和含有所述RSV-F和四价组合物的组合疫苗的抗-RSVIgG的GMT。图11B以表格形式提供了数据。在第0天和第21天用四价流感VLP(Q-Flu)+RSVF组合疫苗、单独RSVF或Q-FluVLP疫苗免疫小鼠(n＝10)。在第35天从所有组获取血清，以按照方法第3.2节中所述、通过ELISA来确定RSVFIgG响应。用SoftMax专业版软件(MolecularDevices)来分析数据。调整四参数逻辑(PL)曲线以适应于数据，并依照导致OD450为1.0的血清稀释的倒数值来确定滴度(titer)。每组的几何平均滴度(GMT)用柱状图表示于图上。*与RSVF单疫苗相比p<0.05。

图12A-B显示了小鼠研究中的帕利珠单抗竞争性抗体(PCA)响应。图12A显示了针对RSV-F组合物、四价流感组合物、和含有RSV-F和四价组合物的组合疫苗的抗-RSVIgG响应的PCA(μg/ml)。图12B以表格形式提供了数据。在第0天和第21天用四价流感VLP(Q-Flu)+RSVF组合疫苗、单独RSVF或Q-FluVLP疫苗免疫小鼠(n＝10)。在第35天从所有组获取血清，以确定帕利珠单抗竞争性抗体滴度(PCA)。PCA滴度以血清稀释的倒数值来报告，所述血清稀释导致帕利珠单克隆抗体与重组RSVF结合的50％抑制。当未获得50％抑制时，则报告该样品的滴度<20。对每组的PCA的GMT以μg/ml表示，用柱状图显示于图上。*与RSVF单疫苗相比p<0.01，+与RSVF单疫苗相比p<0.05。

图13A-B显示了小鼠研究中的RSV中和抗体响应。图13A显示了针对RSV-F组合物、四价流感组合物、和含有RSV-F和四价组合物的组合疫苗的抗-RSV抗体响应的GMT。图13B以表格形式提供了数据。在第0天和第21天用四价流感VLP(Q-Flu)+RSVF组合疫苗、单独RSVF或Q-FluVLP疫苗免疫小鼠(n＝10)。从免疫后35获得的血清用于如实施例10和11所述的微量中和滴定测定。对各组确定了提供对CPE(细胞病变效应)的100％抑制的针对RSVA2的RSV中和滴度，用柱状图显示于图上。GMT已示出。*与RSVF单疫苗相比p<0.01。

图14显示了用于进行凝血抑制(HAI)抗体测定的试剂。

图15A-H显示了在施用RSV-F组合物、四价流感组合物、和含有RSV-F和四价组合物的组合疫苗后诱导的抗-HA响应。所述四价组合物含有VLP，所述VLP具有来自四个株的HA和NA蛋白，所述4个株为：A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08和B/Massachusetts/2/12。图15A显示了针对A/California/04/09(H1N1)流感株HA蛋白的响应的HAI分析。图15B以表格形式提供了A/California/04/09流感株HA蛋白HAI数据。图15C显示了针对A/Victoria/361/11(H3N2)流感株HA蛋白的响应的HAI分析。图15D以表格形式提供了A/Victoria/361/11流感株HA蛋白HAI数据。图15E显示了针对B/Brisbane/60/08流感株HA蛋白的响应的HAI分析。图15F以表格形式提供了B/Brisbane/60/08流感株HA蛋白HAI数据。图15G显示了针对B/Massachusetts/2/12流感株HA蛋白的响应的HAI分析。图15H以表格形式提供了B/Massachusetts/2/12流感株HA蛋白HAI数据。在第0天和第21天用四价流感VLP(Q-Flu)+RSVF组合疫苗、单独RSVF或Q-FluVLP疫苗免疫小鼠(n＝10)。第35天的血清用于确定针对A/California、A/Victoria、B/Brisbane和B/Massachusetts的HAI滴度。每组的几何平均数(GMT)已示出。

图16-19显示了来自小鼠研究的第35天的HAI滴度数据概要，所述数据是对于以下株的：A/California(图16)、A/Victoria(图17)、B/Brisbane/60/08(图18)、和B/Massachusetts/2/12(图19)。

图20显示了小鼠研究中第21天RSVIgG滴度的数据。

图21显示了小鼠研究中第35天RSVIgG滴度的数据。

图22显示了小鼠研究中第35天竞争性帕利珠单抗抗体滴度的数据。

图23显示了小鼠研究中第35天微量中和滴度的数据。

发明详述

定义

如本文所用的，术语“佐剂”是指这样的化合物，当其与特定的免疫原在制剂中组合使用时，增大或以其它方式改变或修饰所得的免疫响应。免疫响应的修饰包括抗体免疫响应和细胞免疫响应之一或二者的强度增大或特异性增宽。免疫响应的修饰还可以意味着某些的抗原特异性免疫响应的降低或抑制。

如本文所用的，术语“抗原性制剂”或“抗原性组合物”是指在施用于脊椎动物(特别是鸟类或哺乳动物)时会诱导免疫响应的制备物。

如本文所用的，“约”意指所示值的±10％。

如本文所用的，术语“禽流感病毒”是指主要见于鸟类中，但也可感染人类或其它动物的流感病毒。在一些情况下，禽流感病毒可以从一个人传播或扩散至另一个人。感染人的禽流感病毒具有导致流感大流行，即导致人类中的发病和死亡的潜力。当出现新的流感病毒株(人对其不具有天然免疫力的病毒)，其扩散经过各个地点并可能遍及全球，同时感染很多人时，即出现大流行。

如本文所用的，“有效剂量”一般指足以诱导免疫力、预防和/或改善感染或减轻感染或疾病的至少一个症状的本文公开的组合物的量。有效剂量还可以是足以增强受试者(例如人)自己针对与感染原或疾病随后接触的免疫响应的量。免疫力的水平可以通过例如测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来进行监测，所述测量例如通过噬斑中和(plaqueneutralization)、补体结合(complementfixation)、酶联免疫吸附、或微量中和(microneutralization)测定来进行，或通过测量细胞响应来监测，所述细胞响应例如但不限于细胞毒性T细胞、抗原递呈细胞、辅助T细胞、树突细胞和/或其他细胞响应。T细胞响应可以例如通过测量例如存在的CD4⁺和CD8⁺细胞的量来进行监测，所述测量是用特异性标记物通过荧光流式细胞术或T细胞测定来进行的，所述T细胞测定例如但不限于T细胞增殖测定、T细胞细胞毒性测定、TETRAMER测定、和/或ELISPOT测定。在疫苗的情况下，“有效剂量”是预防疾病和/或降低症状严重程度的剂量。

如本文所用的，术语“有效量”是指实现想要的生物学效应所必需的或足以实现想要的生物学效应的本文公开的组合物的量。组合物的有效量是实现所选结果的量，并且该量可以由本领域技术人员确定为常规实验事项。例如，用于预防、治疗和/或改善感染的有效量可以是引起免疫系统活化所必需的量，其导致抗原特异性免疫响应的进展。该术语也是“足够量”的同义词。

如本文所用的，术语“表达“指的是这样的过程，通过所属过程多核酸被转录为mRNA并翻译成肽、多肽、或蛋白。如果多核酸来源于基因组DNA，表达可以包括mRNA的剪接，如果选择了合适的真核宿主细胞或生物体的话。在本公开上下文中，术语还涵盖RSVF基因mRNA和RSVF蛋白在其表达后所获得的产量。

如本文所用的，术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”是指具有RSV融合蛋白多肽完全或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。类似地，术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有RSV附接(Attachment)蛋白多肽完全或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。已描述了许多RSV融合蛋白或附接蛋白，并且是本领域技术人员已知的。WO/2008/114149陈述了示例性的F和G蛋白变体(例如天然形成的变体)，其在此处通过提述以其整体并入。

如本文所用的，术语“免疫原”或“抗原”是指是指能够诱发免疫响应的物质，如蛋白、多肽、和核酸。两个术语均包含表位，并可互换地使用。

如本文所用的，术语“免疫刺激物”是指通过身体自身的化学信使(细胞因子)增强免疫响应的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、免疫强化和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF))；及其它免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子，Flt3配体，B7.1；B7.2等。免疫刺激物分子可以与本文公开的VLP在同一制剂中施用，或者可以分开地施用。可以施用蛋白或者编码该蛋白的表达载体来产生免疫刺激效应。

如本文所用的，术语“免疫原性制剂”是指在施用于脊椎动物(例如哺乳动物)时会诱导免疫响应的制备物。

如本文所用的，术语“感染原(infectiousagent)”是指在脊椎动物中引起感染的微生物。通常，所述微生物是病毒、细菌、寄生虫、原生动物和/或真菌。

如本文所用的，术语“突变的”、“经修饰的”、“突变”、或“修饰”表示对核酸和/或多肽的导致核酸或多肽改变的任何修饰。突变包括例如多核苷酸中的点突变、单个或多个残基的缺失或插入，其包括在基因的蛋白编码区中出现的改变以及蛋白编码序列外区域中的改变，例如但不限于调控序列或启动子序列。遗传改变可以是任何类型的突变。例如，突变可以构成部分或全部基因的点突变、移码突变、插入、或缺失。在一些实施方案中，突变是天然形成的。在其他实施方案中，突变是由于人工突变压力造成的、在又一些实施方案中，RSVF蛋白中的突变是遗传工程造成的。

如本文所用的，术语“多价”是指的具有针对多种或多株感染原或疾病的一个或多个抗原性蛋白/肽或免疫原的组合物。

如本文所用的，术语“制药上可接受的疫苗”是指这样的制剂，所述制剂以能施用于脊椎动物并诱导保护性免疫响应的形式存在，所述保护性免疫响应足以诱导免疫力以预防和/或减轻感染或疾病，和/或降低感染或疾病的至少一个症状。通常，所述疫苗包含常规盐水或缓冲液体溶液介质，本公开的组合物悬浮于其中或溶解于其中。以这种形式，本公开的组合物能方便地用于预防、改善或以其他方式治疗感染。在将疫苗引入宿主时，所述疫苗能引发免疫响应，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞和/或其他细胞响应的激活。

如本文所用的，术语“保护性免疫响应”或“保护性响应”是指脊椎动物(例如人)展现出的由针对感染原或疾病的抗体所介导的免疫响应，其阻止或改善感染或减少至少一个其疾病症状。本文公开的组合物可以刺激抗体的产生，所述抗体例如中和(neutralize)感染原、阻止感染原进入细胞、阻止感染原的复制、和/或保护宿主细胞免受感染和破坏。

如本文所用的，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”是指指脊索动物亚门(subphylumcordata)的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩和其它猿类(apes)和猴物种(monkeyspecies)。家畜(farmanimal)(如牛、绵羊、猪、山羊和马)；家养哺乳动物(domesticmammal)(如狗和猫)；实验动物，包括啮齿动物，如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠；鸟类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡及其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅等也是非限制性的例子。该定义中包括术语“哺乳动物”和“动物”。意图涵盖成体和新生个体两者。具体而言，对于针对流感和RSV的免疫而言，婴儿(infant)或幼儿(youngchildren)是合适的受试者或患者。

如本文所用的，术语“病毒样颗粒”(VLP)是指在至少一种属性上与病毒类似但是已经证明其没有感染性的结构。依照本公开的病毒样颗粒不携带编码所述病毒样颗粒的蛋白质的遗传信息。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，并且因此是非感染性的。另外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达来大量生产，而且可以容易地纯化。

如本文所用的，术语“嵌合VLP”是指含有来自至少两种不同感染原的蛋白(异源蛋白)或其部分的VLP。通常，所述蛋白质之一来源于可以驱动来自宿主细胞的VLP形成的病毒。出于说明目的的例子是BRSVM蛋白和/或HRSVG或F蛋白。

如本文所用的，术语“疫苗”指含有一个或多个病毒抗原的组合物，所述病毒抗原用于诱导针对所述病毒的保护性免疫响应。

组合物

本文描述的组合组合物提供针对RSV和多种流感病毒的稳固的(robust)免疫响应。提供针对多种病原体的响应是在许多方面都是有利的。例如，其降低了作为免疫程序一部分的疫苗施用的相关成本，并且提高了患者依从性，这是因为通过单次注射实现了多重免疫。

本文所述的组合物含有RSV组分和一个或多个流感组分。RSV组分诱导针对RSV的免疫响应。流感组分诱导针对流感株的免疫响应。

RSVF组分

在本公开的一个方面，RSVF组分含有RSVF蛋白。合适的RSVF蛋白和用于其生产的方法在美国专利申请No.13/269,107中描述。

RSVF蛋白可以包含与野生型RSVF蛋白(例如SEQIDNO:2中所示例的，GenBank登录号AAB59858)相比经修饰的或突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)的位置P102对应的氨基酸处含有修饰或突变。在另一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)的位置I379对应的氨基酸处含有修饰或突变。在另一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)的位置M447对应的氨基酸处含有修饰或突变。在另一个实施方案中，RSVF蛋白在与如上所述位置对应的氨基酸处含有两个或更多修饰或突变。在另一个实施方案中，RSVF蛋白在与如上所述位置对应的氨基酸处含有三个修饰或突变。

在一个实施方案中，位置102处的脯氨酸替换为丙氨酸。在另一个实施方案中，位置379处的异亮氨酸替换为缬氨酸。在又一个实施方案中，位置447处的甲硫氨酸替换为缬氨酸。在一些实施方案中，RSVF蛋白在与如这些具体实施方案所述位置对应的氨基酸处含有两个或更多修饰或突变。在一些其他实施方案中，RSVF蛋白在与如这些具体实施方案所述位置对应的氨基酸处含有三个修饰或突变。在一个示例性的实施方案中，RSV蛋白具有SEQIDNO:4中所述的氨基酸序列。

在一个实施方案中，进一步优化RSVF蛋白的编码序列以增强其在合适的宿主细胞中的表达。在一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在示例性的实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。

在一个实施方案中，经密码子优化的RSVF基因的编码序列是SEQIDNO:3。在另一个实施方案中，经密码子优化的RSVF蛋白具有SEQIDNO:4中所述的氨基酸序列。

在一个实施方案中，RSVF蛋白还包含至少一个在F2的隐藏多聚(A)位点处的修饰。在另一个实施方案中，RSVF蛋白还包含一级切割位点(CS)处的一个或多个氨基酸突变。在一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)或经密码子优化的RSVF蛋白(SEQIDNO:4)的位置R133对应的氨基酸处含有修饰或突变。在另一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)或经密码子优化的RSVF蛋白(SEQIDNO:4)的位置R135对应的氨基酸处含有修饰或突变。在又一个实施方案中，RSVF蛋白在与野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)或经密码子优化的RSVF蛋白(SEQIDNO:4)的位置R136对应的氨基酸处含有修饰或突变。

在一个实施方案中，位置133处的精氨酸替换为谷氨酰胺。在另一个实施方案中，位置135处的精氨酸替换为谷氨酰胺。在又一个实施方案中，位置136处的精氨酸替换为谷氨酰胺。在一些实施方案中，RSVF蛋白在与如这些具体实施方案所述位置对应的氨基酸处含有2、3或更多个修饰或突变。在一个示例性的实施方案中，RSV蛋白具有SEQIDNO:6中所述的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，RSVF蛋白还包含在融合结构域的N末端那一半中的缺失，所述缺失对应于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、和SEQIDNO:6的氨基酸137-146。在一个例示性的实施方案中，RSVF蛋白具有SEQIDNO:8中所述的氨基酸序列。在另一个实施方案中，RSVF蛋白具有SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列。

RSVF蛋白可以来自于各种人病毒株，包括A株和B株和非人病毒株，包括但不限于牛RSV株和禽RSV株。

RSVF蛋白可在病毒样颗粒(VLP)中。在一些实施方案中，VLP还包含一种或多种额外的蛋白。RSVF组分可以含有额外的蛋白。例如，在一个实施方案中，VLP还包含基质(M)蛋白。在一个实施方案中，M蛋白来源于人RSV株。在另一个实施方案中，M蛋白来源于牛RSV株。在其他实施方案中，基质蛋白可为来自流感病毒株的M1蛋白。在一个实施方案中，流感病毒株是禽流感病毒株。在其他实施方案中，M蛋白可以来源于新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)株。

在另外的实施例中，VLP还包含RSV糖蛋白G。在另一个实施方案中，VLP还包含RSV糖蛋白SH。在又一个实施方案中，VLP还包含RSV核壳(nucleocapsid)N蛋白。

经修饰的或突变的RSVF蛋白可用于预防和/或治疗RSV感染。因此，在另一个实施方案中，公开了用于诱发针对RSV的免疫响应的方法。方法涉及对受试者施用免疫学上有效量的含有经修饰的或突变的RSVF蛋白的组合物，所述受试者例如人或动物受试者。

提供了分离的编码RSV-F蛋白的核酸序列。在一个示例性的实施方案中，分离的编码经修饰的或突变的RSV-F蛋白的核酸选自下组：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、或SEQIDNO:9。除RSVF之外，还可以包括其他RSV蛋白。例如，RSV组分还可包含一种或多种额外的RSV蛋白，如M、N、G、和SH。

流感组合物

如本文所用的，“流感组分”意指含有至少一个能诱导针对流感株的响应的抗原的分子。在一个方面，所述分子是蛋白或糖蛋白。在其他方面，所述分子是流感VLP。例如，在实施例1里讨论的试验中，施用的疫苗组合物含有三个流感组分，每个组分是含有来源于A-PerthH3N2S205株、A-CalH1N1株、和B-Wisconsin株的HA和NA蛋白的VLP。三个VLP中的每一个都含有来源于同一株(A/Indonesia/5/05)的M1蛋白。

用于制备和生产合适的流感组分的组合物和方法见于如上通过提述并入的申请中。流感VLP可含有一种或多种流感基质(M1)蛋白、HA蛋白、和NA蛋白。在一些方面，流感VLP含有所有三种蛋白。还可以包含额外的流感蛋白。流感M2可以包含在VLP中，然而优选的是至少一个流感VLP不包含流感M2蛋白。更优选的是，流感VLP都不含M2蛋白。

可从任何合适的流感株获得流感蛋白。在一些方面，流感蛋白可全部来自相同的株。在其他方面，每种蛋白来自不同的株。在另一些其他方面，M1蛋白来自一个株，而HA和NA蛋白来自另一株，其是与M1蛋白流感株不同的株。在又一些其他方面，M1蛋白，以及NA或HA蛋白之一但不是两者，是来自相同的株。在一些方面，M1蛋白来自禽类株。在其他方面，M1蛋白来自季节性(seasonal)的株。

示例性的株包括但不限于具有如下HA和NA蛋白的那些。HA蛋白可以选自下组：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、和H16。NA蛋白可以选自下组：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在一个具体的方面，HA和NA蛋白分别是H5和N1。在另一个方面，HA和NA蛋白分别是H9和N2。在又一个方面，HA和NA蛋白分别是H7和N9。HA蛋白可展示出凝血活性。NA蛋白可展示出神经氨酸酶活性。

在一些方面，四价流感组合物可以用于组合组合物中。四价流感组合物包含四种流感VLP类型，每种都含有来源于不同流感株的HA蛋白和NA蛋白。在一些方面，VLP各含有来自A/Indonesia/5/05流感株的M1蛋白。在一些方面，HA和NA蛋白来源于季节性流感株，其被FDA鉴定为有用于预防流感感染。在其他方面，可使用含有仅与三个季节性流感株相关的VLP的三价组合物。

剂量

公开的组合物可如此施用以提供有效剂量。例如，递送的每种流感组分的上限可为约：1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、或20μg。递送的每种流感组分的下限可为约：0.5μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、或15μg。在一些方面，流感组分剂量范围是约1μg至约3μg。在一些方面，流感组分剂量范围是约3μg至约9μg。递送的RSV组分的上限可为约：1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、或20μg。递送的RSVF组分的下限可为约：1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、或20μg。在一些方面，RSV组分剂量范围是约1μg至约3μg。在一些方面，RSV组分剂量范围是约3μg至约9μg。

在一些方面，每种流感组分可以较高的量存在。例如，上限可为约：50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、91μg、92μg、93μg、94μg、95μg、96μg、97μg、98μg、99μg、100μg、101μg、102μg、103μg、104μg、105μg、106μg、107μg、108μg、109μg、110μg、111μg、112μg、113μg、114μg、115μg、116μg、117μg、118μg、119μg、120μg、121μg、122μg、123μg、124μg、125μg、126μg、127μg、128μg、129μg、130μg131μg、132μg、133μg、134μg、135μg、136μg、137μg、138μg、139μg、140μg、141μg、142μg、143μg、144μg、145μg、146μg、147μg、148μg、149μg、或150μg。每个流感组分的下限可为约：20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、29μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、或60μg。

在其他实施方案(例如对人类施用的)中，递送的RSV组分的上限可为约：50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、91μg、92μg、93μg、94μg、95μg、96μg、97μg、98μg、99μg、100μg、101μg、102μg、103μg、104μg、105μg、106μg、107μg、108μg、109μg、110μg、111μg、112μg、113μg、114μg、115μg、116μg、117μg、118μg、119μg、120μg、121μg、122μg、123μg、124μg、125μg、126μg、127μg、128μg、129μg、130μg131g、132g、133g、134g、135g、136g、137g、138g、139g、140g、141g、142g、143g、144g、145g、146g、147g、148g、149g、或150g。在一些实施方案(例如对人类施用的)中，递送的RSV组分的下限可为约：20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、26μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、或60μg。在一些方面，RSV组分剂量范围是约40μg至约120μg。在一些方面，RSV组分剂量范围是约60μg至约90μg。

佐剂

本领域已熟知，特定的组合物的免疫原性可以通过使用非特异性的免疫响应刺激物来增强，称为佐剂。佐剂在实验上用于促进针对未知抗原的免疫力普遍增加(例如美国专利No.4,877,611)。多年来免疫实验方案已使用佐剂来刺激响应，而同样的，佐剂也是本领域普通技术人员所熟知的。一些佐剂影响抗原呈递的方式。例如，当通过基于铝的佐剂(Alum)沉淀蛋白抗原时，免疫响应增强。抗原的乳化液延长了抗原呈递的持续期。对“ACompendiumofVaccineAdjuvantsandExcipients(第2版)”中所述任何佐剂的包含在此通过提述以其整体并入用于任何目的，其被认为是在本申请的范围内的。

本文公开的组合物可与药学上可接受的佐剂进行组合。药学上可接受的佐剂包括但不限于基于铝的佐剂、矿物盐佐剂、张力活性(tensoactive)佐剂、细菌来源的佐剂、乳化佐剂、脂质体佐剂、细胞因子佐剂、糖类佐剂、和DNA和RNA寡聚体佐剂及其他(参见Petrovsky和Aguilar2004,immunologyandCellbiology82,488-496)。

示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有灭活结核分枝杆菌的非特异性免疫响应刺激物)、和不完全弗氏佐剂。其他佐剂包括GMCSP、BCG、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A、和单磷酰脂质A(MPL)、MF-59、RIBI(其含有三个提取自细菌的组分)、MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、2％鲨烯/吐温乳剂中的细胞壁骨架(CWS)、AS01、AS03(鲨烯/生育酚乳剂)、AS04、AF3(鲨烯水包油(o/w)乳剂)、吡喃葡萄糖基脂质佐剂稳定乳剂(GLA-SE)、组合疫苗(CoVaccine)、鞭毛蛋白(Flagellin)、和IC31(曾用名dI:dC–TLR9)。

在一些实施方案中，基于铝的佐剂(Alum)可为磷酸铝或氢氧化铝。在一些方面，使用了2％铝胶(Al(OH)₃)。在一些实施方案中，铝佐剂施用的上限是200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、1100μg、1200μg、1300μg、1400μg、1500μg、1600μg、1700μg、1800μg、1900μg、2000μg。在一些实施方案中，铝佐剂施用的下限是10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg。在一些实施方案中，施用的铝佐剂的量的范围是约200μg至约800μg。

优选的佐剂包括基于皂素的佐剂，具体而言是特定皂素级分以ISCOM或Matrix形式的组合。在ISCOM形式中，将抗原并入佐剂笼样(cage-like)结构中。在Matrix形式中，首先制备佐剂然后将其与本文所述的抗原性组合物组合以提供想要的制剂。特别适合的Matrix佐剂包括Matrix-M^TM(-100,IsconovaAB,Uppsala,Sweden)，一种Matrix-A^TM和Matrix–C^TM以约85:15比例的混合物。简言之，Matrix-A^TM和Matrix–C^TM制备自分别纯化的皂树(Quillajasaponaria)级分，随后用胆固醇和磷脂配制成Matrix微粒，然后与抗原组合。参见Reimer等,“Matrix-M^TMAdjuvantInducesLocalRecruitment,ActivationandMaturationofCentralImmuneCellsinAbsenceofAntigen,”PLoSONE7(7):e41451.doi:10.1371/journal.pone.0041451；还可参见美国申请公开No.2006/0121065。这些级分还可使用其他比例；例如，Matrix佐剂组合物中Matrix-A比Matrix-C的比例可为约：86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、或96:4。通常，范围为约85-95MatrixA比约15-5MatrixC。在一些方面，可使用皂素级分QS-7和QS-21来替代MatrixA和MatrixC级分。例示性的QS-7和QS-21级分及其使用在美国专利Nos.5,057,540；6,231,859；6,352,697；6,524,584；6,846,489；7,776,343；和8,173,141中描述。

在本公开的一些实施方案中，佐剂是具有约2-10个双层的少层脂质囊泡(paucilamellarlipidvesicle)，所述双层排列成基本是球壳的形式，其由水层分开，并由大的无脂质双层的无定形中央腔环绕。少层脂质囊泡还可通过一些方式起作用来刺激免疫响应，所述方式是其作为非特异性刺激物、作为抗原的载剂(carrier)、作为额外佐剂的载剂，以及其组合。当例如通过将抗原与预成型的囊泡混合(从而使抗原保持在囊泡外)来制备疫苗时，少层脂质囊泡充当非特异性免疫刺激物。通过将抗原囊封到囊泡的中央腔中，囊泡既充当免疫刺激物，还充当抗原的载剂。在另一个实施方案中，囊泡主要是由非磷脂囊泡制成的。在另一些实施方案中，囊泡是是范围从约100nm至约500nm的少层非磷脂囊泡。它们包含Brij72、胆固醇、油酸和鲨烯。已显示Novasomes对于流感抗原是有效的佐剂(参见美国专利5,629,021、6,387,373、和4,911,928，在此通过提述以其整体并入用于所有目的)。

免疫刺激物

本公开的组合物还可与“免疫刺激物”配制在一起。这些是身体自身的增加免疫系统响应的化学信使(细胞因子)。免疫刺激物包括但不限于具有免疫刺激、免疫强化和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF))；及其它免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子，Flt3配体，B7.1；B7.2等。免疫刺激性分子可在与本公开的组合相同的制剂中施用，或是分开地施用。可施用蛋白或编码蛋白的表达载体以产生免疫刺激效果。因此，在一个实施方案中，本公开包括了包含佐剂和/或免疫刺激物的抗原性制剂和疫苗制剂。

免疫响应

除了组合物之外，本公开还提供了诱导针对RSV和多种流感株的免疫响应的方法。当施用于脊椎动物时，本文公开的组合物能在脊椎动物(例如人)中诱导基本的免疫力。因此，在一个实施方案中，本公开提供了诱导针对RSV病毒感染和流感感染、或针对受试者中各疾病的至少一个症状的基本的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的RSV组分和流感组分。在另一个实施方案中，本公开提供了针对RSV来免疫哺乳动物的方法，包括对哺乳动物施用保护-诱导量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVVLP，与一个或多个VLP和/或一个或多个分离的流感蛋白组合。

在一些方面，免疫响应包括中和抗体。中和抗体的滴度可具有约80、90、100、125、150、175、200、225、或250的上限。中和抗体的滴度可具有约70、80、90、100、125、150、175、200、或225的下限。在一些方面，滴度的范围是约80至约250、约100至约200、或约150至约225。中和抗体滴度可以通过ELISA测定来测量。

当施用多个抗原时，可降低对一个或多个的免疫响应。这种现象被称为抗原干扰。优选的是，本文公开的组合物诱导这样的免疫响应，所述免疫响应与分开施用各种抗原时获得的免疫响应没有显著的不同。因此，在优选的方面，组合物不诱导抗原干扰。在其他方面，组合组合物对每个抗原的免疫响应至少是单独使用各抗原所获得的免疫响应的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

有利的是，与单独施用RSV组分相比，本文公开的组合组合物增强针对RSV的免疫响应的属性。例如，免疫响应可包括抗-IgG响应、中和抗-RSV响应、以及帕利珠单抗竞争性抗体响应。在一些方面，抗-IgG响应增强了约1.1倍、1.4倍、约1.6倍、约1.8倍、约2.0倍、约2.2倍、约2.4倍、约2.6倍、约2.8倍、约3.0倍、约3.2倍、约3.4倍、约3.6倍、约3.8倍、约4.0倍、约4.5倍、或约5.0倍。在一些方面，抗-RSVIgG响应增加的倍数是约2.0至约3.0。在其他方面，抗-RSVIgG响应增加的倍数是约1.4至约2.8。在一些方面，增强的响应是在施用后21天测得的；在其他方面，增强的响应是在施用后35天测得的。

与单独施用RSV组分相比，中和抗-RSV响应也可得到增强。在一些方面，中和抗-RSV响应增强了约1.1倍、1.4倍、约1.6倍、约1.8倍、约2.0倍、约2.2倍、约2.4倍、约2.6倍、约2.8倍、约3.0倍、约3.2倍、约3.4倍、约3.6倍、约3.8倍、约4.0倍、约4.5倍、或约5.0倍。在一些方面，中和抗-RSV响应增加的倍数是1.1至约2.0。在其他方面，中和抗-RSV响应增加的倍数是约2.3至约2.8。在一些方面，增强的响应是在施用后21天测得的；在其他方面，增强的响应是在施用后35天测得的。

相比于单独施用RSV组分，帕利珠单抗竞争性抗体响应也可得到增强。在一些方面，帕利珠单抗竞争性抗体响应增强了约2.0倍、约2.2倍、约2.4倍、约2.6倍、约2.8倍、约3.0倍、约3.2倍、约3.4倍、约3.6倍、约3.8倍、约4.0倍、约4.5倍、或约5.0倍。在一些方面，帕利珠单抗竞争性抗体响应的倍数增加是约2.0至约3.0。在其他方面，帕利珠单抗竞争性抗体响应的倍数增加是约2.3至约2.8。在一些方面，增强的响应是在施用后21天测得的；在其他方面，增强的响应是在施用后35天测得的。

蛋白和变体的鉴定与克隆

本公开还涵盖在VLP之上或之中表达的蛋白的变体。所述变体可含有组成蛋白的氨基酸序列的改变。相对于蛋白质的术语“变体”是指相对于参考序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守的”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸来替代亮氨酸。或者，变体可具有“非保守的”变化，例如用色氨酸来替代甘氨酸。类似的(analogous)小变异还可包括氨基酸缺失或插入，或二者。对于确定哪些氨基酸能够取代、插入或缺失而不丧失生物活性或免疫活性的指导可用本领域所熟知的计算机程序来发现，例如DNASTAR软件。

天然变体可因蛋白质中的突变产生。这些突变可导致各感染原(例如流感)群中抗原的变异性。因此，感染了例如流感株的人生成针对这种病毒的抗体，当出现更新的病毒株时，针对原有株的抗体不再识别更新的病毒，并发生再次感染。本公开涵盖来自感染原的蛋白的所有抗原和遗传变异性，用于制造VLP。

描述适用于本公开的分子生物学技术(如克隆、突变、细胞培养等等)的一般文本包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology，卷152，AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(Berger)；Sambrook等,MolecularCloning--ALaboratoryManual(第3版),Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,2000(“Sambrook”)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等编,CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.联合出版,(“Ausubel”)。这些文本描述了诱变、载体的使用、启动子等许多与克隆和突变RSV的F和/或G分子相关的主题，等等。因此，本公开还涵盖使用已知的蛋白质工程方法和重组DNA技术来改进或改变在本公开的VLP之上或之中表达的蛋白的特性。多种类型的诱变可用于生产和/或分离编码本公开的VLP之上或之中表达的蛋白分子的变体核酸，和/或进一步修饰/突变本公开的VLP之上或之中表达的蛋白。它们包括但不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有缺口的双螺旋DNA的诱变，等等。另外的合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷的宿主株的诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过总基因合成的诱变、双链断裂修复，等等。诱变(例如涉及嵌合构建体的)也包括在本公开内。在一个实施方案中，诱变可通过天然形成分子或改变的或突变的天然形成分子的已知信息来指导进行，所述信息例如序列、序列比对、生理学特性、晶体结构等等。

本公开还包括显示出基本的生物学活性的蛋白变体，所述生物学活性例如当在本公开的VLP之上或之中表达时能引发有效的抗体响应。这些变体包括缺失、插入、倒位、重复、和取代，其根据而本领域已知的一般规则选出，从而对活性几乎没有影响。

克隆蛋白的方法是本领域已知的。例如，编码具体的RSV蛋白的基因可通过RT-PCR从多聚腺苷酸化的mRNA分离出来，所述mRNA提取自已感染RSV病毒的细胞。所得的产物基因可作为DNA插入物克隆入到载体中。术语“载体”是指一种手段，通过该手段能使核酸在生物体、细胞、或细胞组分之间传播和/或转运。载体包括自主复制的或能整合至宿主细胞染色体中的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体还可为不自主复制的净RNA寡核苷酸、净DNA寡核苷酸、由DNA和RNA在同一条链内组成的寡核苷酸、多聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的NDA等。在许多但非所有普通实施方案中，本公开的载体是质粒或杆粒(bacmids)。

因此，本公开包括编码蛋白的核酸，包括嵌合分子，所述核酸克隆至能在细胞中表达的表达载体中，所述细胞诱导本公开的VLP的形成。“表达载体”是这样的载体，例如能促进整合到其中的核酸的复制以及表达的质粒。通常，要表达的核酸是“可操作地连接(operablylinked)”至启动子和/或增强子的，并且受到启动子和/或增强子的转录调控。在一个实施方案中，核苷酸编码经修饰的或突变的RSVF蛋白(如上所述)。在另一个实施方案中，载体还包含编码M和/或GRSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，载体还包含编码M和/或NRSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，载体还包含编码M、N和/或GRSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，载体还包含编码BRSVM蛋白和/或NRSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，载体还包含编码BRSVM蛋白和/或GRSV蛋白、或流感HA和/或NA蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，核苷酸编码带有HA和/或NA蛋白的经修饰的或突变的RSVF和/或RSVG蛋白。在另一个实施方案中，表达载体是杆状病毒载体。

此外，可对核苷酸进行测序以确保克隆了正确的编码区且不含任何不想要的突变。可将核苷酸亚克隆至表达载体(例如杆状病毒)中用于任何细胞中的表达。以上仅是如何克隆RSV表达蛋白的一个例子。本领域技术人员了解其他的方法也可以使用且是可能的。

本公开还提供包含编码RSV结构基因的RSV核苷酸的构建体和/或载体，所述RSV结构基因包括F、M、G、N、SH或其部分，和/或任何如上所述的嵌合分子。载体可为例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。包含RSV结构基因(包括F、M、G、N、SH或其部分)的构建体和/或载体和/或以上所述的嵌合分子应当可操作地连接至合适的启动子，如AcMNPV多角体蛋白(polyhedrin)启动子(或其他杆状病毒)、噬菌体λPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆转录病毒LTRs的启动子都是非限制性的例子。根据想要的表达率和/或宿主细胞，本领域技术人员知晓其他合适的启动子。表达构建体还含有用于转录起始、终止的位点、以及在已转录的区域中用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的转录本的编码部分优选为在所要翻译的多肽开端处包含翻译起始密码子，以及在所要翻译的多肽末端处合适位置包含终止密码子。

表达载体优选为包含至少一个可选择的标记物。此类标记物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。载体中优选的是病毒载体、如杆状病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipoxvirus)、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒(fowlpoxvirus)、浣熊痘病毒、猪痘病毒，等等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒、和逆转录病毒。可以用于本公开的其他载体包括用于在细菌中的载体，其包括pQE70、pQE60和pQE-9，pBluescript载体，Phagescript载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体包括pFastBac1pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。本领域技术人员容易明显地获知其他合适的载体。在一个实施方案中，包含编码RSV基因的核酸的载体是pFastBac，所述RSV基因包括经修饰的或突变的RSVF基因，以及M、G、N、SH或其部分的基因，和/或如上所述的任何嵌合分子。

上述的重组构建体可用于转染、感染或转化，并且能表达RSV蛋白，包括经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个免疫原。在一个实施方案中，重组构建体包含经修饰的或突变的RSVF、M、G、N、SH、或其部分，和/或任何上述的分子，在真核细胞和/或原核细胞中。因此，本公开提供包含载体(或多个载体)的宿主细胞，所述载体含有编码RSV结构基因(包括经修饰的或突变的RSVF)的核酸；以及至少一个免疫原，例如但不限于RSVG、N和SH，或其部分，和/或任何上述的分子，并允许基因在能形成VLP的条件下于宿主细胞中表达，所述基因包括RSVF、G、N、M、或SH或其部分，和/或任何上述的分子。

真核宿主细胞包括酵母、昆虫、鸟类、植物、秀丽线虫(C.elegans)或线虫类(nematode)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子是草地夜蛾(Spodopterafrugiperda,Sf)细胞、例如Sf9、Sf21，粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞、例如HighFive细胞，和果蝇(Drosophila)S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的例子是酿酒酵母(S.cerevisiae)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis,K.lactis)，假丝酵母属(Candida)菌种、包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假丝酵母(C.glabrata)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,S.pombe)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。哺乳动物细胞的例子是COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、和非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细胞。还可使用非洲爪蟾卵母细胞、或其他两栖来源的细胞。原核宿主细胞的例子包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和分枝杆菌(mycobacteria)。

可根据本领域所熟知的方法将载体(例如包含编码本文所述蛋白的多核苷酸的载体)转染至宿主细胞中。例如，将核酸引入真核细胞能通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、和采用聚胺转染试剂的转染来进行。在一个实施方案中，载体是重组杆状病毒。在另一个实施方案中，重组杆状病毒被转染至真核细胞中。在一个优选的实施方案中，细胞是昆虫细胞。在另一个实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。

本公开还提供增加VLP生产效率的构建体和方法。例如，添加蛋白的前导序列能提高蛋白在细胞中运输的效率。例如，可将不同的信号序列(如来源于昆虫细胞基因的那些)与蛋白融合。在一个实施方案中，信号肽是几丁质酶信号序列，其在杆状病毒表达系统中有效地起作用。

另一个增加VLP生产效率的方法是对编码RSV蛋白的核酸进行密码子优化。对核酸进行密码子优化以在Sf9细胞中表达的例子，请参见SEQIDNos:3、5、7、9、13、17、19、和25。

本公开还提供生产VLP的方法。在一些方面，该方法包括在允许VLP形成的条件下表达RSV基因，包括经修饰的或突变的RSVF蛋白，和至少一个额外的蛋白，包括但不限于RSVM、G、N、SH，或其部分，和/或任何如上所述的嵌合或异源分子。在其他方面，提供了用于产生流感VLP的方法。其他针对流感VLP的公开见于美国专利申请公开号2005/0009008、2010/0129401和2010/0184192中，其在此通过提述并入用于所有目的。取决于所选择的表达系统和宿主细胞，通过在表达重组蛋白且形成VLP的条件下培养由表达载体转化的宿主细胞从而生产VLP。在一个实施方案中，本公开包括生产VLP的方法，包括将编码至少一个经修饰的或突变的RSVF蛋白的载体转染至合适的宿主细胞中，并在允许VLP形成的条件下表达经修饰的或突变的RSVF蛋白。在另一个实施方案中，真核细胞选自下组：酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或哺乳动物细胞。对于合适的生长条件的选择是本领域技术内的或本领域普通技术人员所掌握范围内的。

培养细胞(所述细胞经工程改造以生产本公开的VLP)的方法包括但不限于分批细胞培养、分批补料(batch-fed)细胞培养、连续细胞培养、和灌注细胞培养技术。细胞培养意指使细胞在生物反应器(发酵室)中生长和增殖，细胞在其中增殖并表达蛋白(例如重组蛋白)用于纯化和分离。通常，细胞培养是在无菌、控温和通气条件下于生物反应器中进行的。生物反应器是用于培养细胞的室，其中环境条件如温度、通气、搅拌和/或pH可被监控。在一个实施方案中，生物反应器是不锈钢室。在另一个实施方案中，生物反应器是预先灭菌的塑料袋(例如WaveBiotech,Bridgewater,NJ)。在其他实施方案中，所述预先灭菌的塑料袋为约50L至约1000L的袋子。

VLP是用保存其完整性的方法来分离的，如通过梯度离心，例如氯化铯、蔗糖和碘克沙醇，以及标准纯化技术，包括例如离子交换和凝胶过滤层析。

以下是如何制造、分离和纯化本公开的VLP的例子。通常VLP是从重组细胞系产生的，所述重组细胞系经工程改造以在细胞在细胞培养物种生长时产生VLP(参见上文)。本领域技术人员理解存在额外的方法，其可被利用来制造和纯化本公开的VLP，因此本公开不限于所述的方法。

本公开的VLP的生产可始于将Sf9细胞(未感染的)接种至摇瓶中，其允许细胞随细胞生长和繁殖而扩张和规模增大(例如从125-ml摇瓶至50L摇袋(Wavebag))。对于合适的细胞系配制合适的用于培养细胞的培养基(优选为无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420,JRH)。然后，用重组杆状病毒以效率最高的感染倍数来感染细胞(例如每个细胞约1至约3噬斑形成单位)。一旦感染发生，经修饰的或突变的RSVF蛋白，M、G、N、SH，或其部分，和/或任何上述的嵌合或异源分子，从病毒基因组表达，自我装配至VLP中，并在感染后约24至72小时从细胞分泌出来。通常，当细胞在对数生长中期时感染是最有效的(4-8×10⁶细胞/ml)，并且至少约90％是存活的。

本公开的VLP可在转染后约48至96小时收获，此时细胞培养基中的VLP水平接近最大值但尚未出现大量细胞裂解。在收获之时的Sf9细胞密度和存活率可以是约0.5×10⁶细胞/ml至约1.5×10⁶细胞/ml，存活率为至少20％，如染色排除测定所示。然后移除培养基并使其澄清。可向培养基添加NaCl至约0.4至约1.0M的浓度，优选为约0.5M，以避免VLP聚集。从含有本公开的VLP的细胞培养基去除细胞和细胞碎片，可通过切向流过滤技术(TFF)用一次性的、预先灭菌的中空纤维0.5或1.00μm滤芯或类似装置来完成。

然后，可使用一次性的预先灭菌的分子量截留为500,000的中空纤维滤芯，通过超滤将澄清培养基中的VLP进行浓缩。可将浓缩的VLP相对于10倍体积的pH7.0-8.0的含0.5MNaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透析过滤，以去除残留的培养基组分。

浓缩的、经透析过滤的VLP可进一步进行纯化，所述纯化是在pH7.2PBS缓冲液中的20％-60％不连续蔗糖梯度上用0.5MNaCl通过在6,500×g于约4℃至约10℃离心18小时来进行的。通常VLP在约30％至约40％蔗糖或在交界处(在20％和60％不连续梯度中)会形成独特的可见条带，其能从梯度收集并储存。可稀释该产物以在制备物中包含200mM的NaCl为纯化过程中的下一步做准备。该产物含有VLP，且可含有完整的杆状病毒颗粒。

对VLP进一步的纯化可通过阴离子交换层析或44％等密度蔗糖垫(cushion)离心来实现。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度(参见上文)的样品加载到含有阴离子的介质(例如MatrixFractogelEMDTMAE)中并通过能将VLP从其他污染物(例如杆状病毒和DNA/RNA)分离的盐梯度(从约0.2MNaCl至约1.0MNaCl)洗脱。在蔗糖垫方法中，将包含VLP的样品添加至44％蔗糖垫并于30,000g离心约18小时。VLP在44％蔗糖的顶部形成条带，而杆状病毒沉淀于底部，并且其他污染蛋白留在顶部的0％蔗糖层中。收集VLP峰或条带。

如果需要的话，可将完整的杆状病毒灭活。灭活可通过化学方法来完成，例如福尔马林或β-丙内酯(BPL)。完整的杆状病毒的去除和/或灭活也可主要通过本领域已知的选择性沉淀和层析方法来完成，如上文所示。灭活的方法包括在0.2％的BPL中将含有VLP的样品于约25℃至约27℃温育3小时。还可通过在0.05％BPL中将含有VLP的样品于4℃温育3天，然后37℃温育1小时，来灭活杆状病毒。

灭活/去除步骤之后，可使包含的VLP产物通过另一个透析过滤步骤，以去除任何来自灭活步骤的试剂和/或任何残余的蔗糖，以及将VLP置入想要的缓冲液(例如PBS)中。可通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)来将包含VLP的溶液灭菌，并储存于冰箱或冻库中。

上述技术可在各种规模实施。例如，T烧瓶、摇瓶、转瓶、直至工业规模的生物反应器。生物反应器可包含不锈钢罐或预先灭菌的塑料袋(例如WaveBiotech,Bridgewater,NJ所售的系统)。本领域技术人员知晓什么是他们最想要的目的。

可以在昆虫细胞(例如前述的Sf9昆虫细胞)中完成杆状病毒表达载体的扩增和生产，以及用重组杆状病毒对细胞的感染，以生成重组VLP。在一个实施方案中，所述细胞是感染了重组杆状病毒的SF9，所述重组杆状病毒经工程改造以生成VLP。

药物或疫苗制剂及施用

此处有用的药物组合物含有药学上可接受的载剂，包括任何合适的稀释剂或赋形剂。如本文所用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府监管机构批准或美国药典、欧洲药典或其他公认的药典列出，用于在哺乳动物中使用，更具体而言是在人中使用的。这些组合物可用作疫苗和/或抗原性组合物，用于在脊椎动物中诱导保护性免疫响应。所述组合物含有RSV组分和至少一个流感组分。

本公开包括药学上可接受的包含VLP的疫苗组合物，所述VLP包含RSVF蛋白，和至少一个额外的蛋白，其包括但不限于RSVM、G、N、SH，或其部分，和/或任何上述的嵌合或异源分子，其与至少一个流感抗原组合。在一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一个RSVF蛋白和至少一个额外的免疫原。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一个RSVF蛋白和至少一个RSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一个RSVF蛋白和至少一个BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一个RSVF蛋白和至少一个流感M1蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一个经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个禽流感VLP。

在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVG蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽类RSVG蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVN蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽类RSVN蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVSH蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽类RSVSH蛋白。

在另一个实施方案中，本公开包括药学上可接受的疫苗组合物，其包含VLP，如包含BRSVM和经修饰的或突变的RSVF蛋白和/或来自RSV的G、H、或SH蛋白和任选地来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP，其中所述HA或NA蛋白融合至跨膜域和RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区。

本公开还涵盖药学上可接受的疫苗组合物，其包含如上所述的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。

在一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个额外的蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVM蛋白，例如但不限于BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVG蛋白，例如但不限于HRSVG蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVN蛋白，例如但不限于HRSV、BRSV或禽类BRSVN蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP还包含RSVSH蛋白，例如但不限于HRSV、BRSV或禽类BRSVSH蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含来自HRSV组A的F和/或G蛋白和BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含来自HRSV组B的F和/或G蛋白和BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，本公开涵盖药学上可接受的疫苗组合物，其包含嵌合的VLP，如包含来自BRSV的嵌合M蛋白和任选的来源于流感病毒的HA蛋白的VLP，其中所述M蛋白与流感HA蛋白融合。在另一个实施方案中，本公开涵盖药学上可接受的疫苗组合物，其包含嵌合的VLP，如包含BRSVM和来自RSV的嵌合的F和/或G蛋白以及任选的来源于流感病毒的HA蛋白的VLP，其中所述嵌合的流感HA蛋白与RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，本公开涵盖药学上可接受的疫苗组合物，其包含嵌合的VLP，如包含BRSVM和来自RSV的嵌合的F和/或G蛋白以及任选的来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP，其中所述HA或NA蛋白与RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。

本公开还涵盖包含嵌合VLP的药学上可接受的疫苗组合物，所述嵌合VLP包含至少一个RSV蛋白。在一个实施方案中，药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个来自异源感染原或得病细胞的免疫原。在另一个实施方案中，来自异源感染原的免疫原是病毒蛋白。在另一个实施方案中，来自异源感染原的病毒蛋白是包膜相关的蛋白。在另一个实施方案中，来自异源感染原的病毒蛋白在VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白包含在脊椎动物中产生保护性免疫响应的表位。

本公开还涵盖用于免疫脊椎动物(如人受试者)的试剂盒，其包含VLP，所述VLP包含至少一个RSV蛋白。在一个实施方案中，试剂盒包含VLP，所述VLP包含经修饰的或突变的RSVF蛋白。在一个实施方案中，试剂盒还包含RSVM蛋白如BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，试剂盒还包含RSVG蛋白。在另一个实施方案中，本公开涵盖包含VLP的试剂盒，所述VLP包含来自BRSV的嵌合M蛋白和任选的来源于流感病毒的HA蛋白，其中所述M蛋白与BRSVM融合。在另一个实施方案中，本公开涵盖包含VLP的试剂盒，所述VLP包含来自BRSV的嵌合M蛋白、RSVF和/或G蛋白、和来自异源感染原的免疫原。在另一个实施方案中，本公开涵盖包含VLP的试剂盒，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白、嵌合RSVF和/或G蛋白、和任选的来源于流感病毒的HA蛋白，其中所述HA蛋白与RSVF或G的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，本公开涵盖包含VLP的试剂盒，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白、嵌合的RSVF和/或G蛋白、和任选来源于流感病毒的HA或NA蛋白，其中所述HA或NA蛋白与RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。

在一个实施方案中，本公开包括免疫原性制剂，其包含至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白。在另一个实施方案中，本公开包括免疫原性制剂，其包含至少一个有效剂量RSVF胶束，所述RSVF胶束包含经修饰的或突变的RSVF蛋白。在又一个实施方案中，本公开包括免疫原性制剂，其包含至少一个有效剂量的VLP，所述VLP包含如上所述的经修饰的或突变的RSVF蛋白。

本文公开的组合物可与药学上可接受的载剂或赋形剂组合。药学上可接受的载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗含水缓冲液，及其组合。关于药学上可接受的载剂、稀释剂和其他赋形剂的深入讨论记载于Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.N.J.通行版)中。制剂应适于施用模式。在一个优选的实施方案中，制剂适合对人类施用，优选为无菌的、非微粒状的和/或非高热的(non-pyrogenic)。

如果需要的话，组合物还可含有小量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是固体的形式(如适合补水恢复的冻干粉)、液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、或粉剂。口服制剂可以包括标准载剂，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。

本公开还提供药物包或试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种疫苗制剂的容器。在一个优选的实施方案中，试剂盒包含两个容器，一个含有纳米颗粒形式的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP，作为RSV组分，而另一个容器含有流感组分，如流感VLP。每个组分都可与佐剂配制在一起，或是与不同的缓冲剂配制在一起。与所述容器相关的可为由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府部门规定的形式的注意说明，所述注意说明反映了该部门对于人类施用剂的制造、使用或销售的批准。

在一些方面，组合物在分开的容器(如小瓶)中提供，并在即将施用前合并于单个容器中。在其他方面，组合物是分开地制备的，合并，然后在使用前储存于同相同容器中。

本公开还提供，试剂包装于指示了组合物的量的密封容器，如安瓿或小袋中。在一个实施方案中，组合物以液体提供，另一个实施方案中，组合物以密封容器中的干燥无菌的冻干粉或无水浓缩物提供，并可用例如水或盐水来复原(reconstitute)至适于对受试者施用的浓度。

在另一个实施方案中，组合物是以指示了组合物的量和浓度的密封容器中的液体形式提供的。优选的是，液体形式的组合物是在密封容器中以至少50μg/ml，更优选为至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml或至少1mg/ml提供的。

作为例子，本公开的包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的嵌合RSVVLP是以足以刺激免疫响应的有效量或数量(如上文定义)来施用的，每个响应针对一个或多个RSV的株。本公开的修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或VLP的施用引发针对RSV的免疫力。通常，剂量可以在基于年龄、生理条件、体重、性别、饮食、施用时间、和其他临床因素的这个范围内进行调整。预防性疫苗制剂是全身施用的，例如用针和注射器或无针注射装置通过皮下或肌内注射施用。或者，疫苗制剂是鼻内施用的，其通过滴剂、大颗粒气雾剂(大于约10微米)、或喷雾至上呼吸道中来施用。当任何上述递送途径导致免疫反应时，鼻内施用为在许多病毒(包括RSV和流感)进入位点处引发粘膜免疫力带来了增加的益处。

因此，本公开还包括配制疫苗或抗原性组合物的方法，所述疫苗或抗原性组合物诱发针对哺乳动物的感染或其至少两个疾病症状的免疫力，所述方法包括向制剂添加有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在一个实施方案中，感染是RSV感染。

当用单剂量可能实现免疫刺激时，可以通过相同或不同的途径施用额外的剂量，以达到想要的效果。在新生儿和婴幼儿中，可能需要多重施用来引发足够水平的免疫力。可以在幼年时期以持续间隔进行施用，作为维持足够的针对感染(例如RSV感染)的保护水平所必要的。类似地，特别易于反复或严重感染的成人，例如医护人员、日托所员工、少儿的家庭成员、老年人、以及心肺功能受损的个人可能需要多重免疫接种以建立和/或维持保护性免疫响应。可例如通过测量中和分泌性的抗体或血清抗体的量和为了引发和维持想要的保护水平而必要的调整的剂量或重复的疫苗接种来进行监测诱发的免疫力的水平。

施用组合物

施用本文公开的组合组合物的方法包括但不限于肠道外施用(例如皮内、肌内、静脉内和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如、鼻内和经口或肺途径或通过栓剂)。优选的施用是肌内施用。组合物可以通过方便的途径来施用，例如通过输注或团注(bolusinjection)，通过经上皮或内皮肤黏膜(例如口腔粘膜，结肠，结膜，鼻咽，口咽，阴道，尿道，膀胱和肠粘膜等)的吸收来施用，并可以与其他生物活性剂一起施用。在一些实施方案中，本公开的组合物的鼻内或其他粘膜施用途径可以诱发抗体或其他免疫响应，所述响应基本比其他施用途径高。施用可为全身的或局部的。

在一些实施方案中，多个组合物可以经相同的针同时施用(即共同施用)，其中RSVF和流感组分已经混合在一起。在其他实施方案中，流感和RSVF组分可以序贯地施用(即对各组分在短时间内分开施用)；例如组合物可间隔约1分钟、间隔约2分钟、或间隔约5分钟施用。在一些实施方案中，施用可间隔一整天进行。在一些实施方案中，RSV和流感组分可以序贯地施用于不同的身体部位，例如可以序贯地将组分施用于相对侧的手臂，一条手臂和半侧臀部、或不同侧的臀部上。

在又一个实施方案中，疫苗和/或免疫原性制剂是以这样的方式施用的，从而靶向粘膜组织，以在免疫的部位引发免疫响应。例如，可通过用组合物的口腔施用来靶向粘膜组织如肠道相关淋巴样组织(GALT)用于免疫，所述组合物含有具有特定的粘膜靶向特性的佐剂。还可靶向其他粘膜组织，如鼻咽部淋巴样组织(NALT)和支气管相关淋巴样组织(BALT)。

本公开的疫苗和/或免疫原性制剂还可按照剂量安排来施用，例如疫苗组合物的初始施用和随后的加量施用。在具体的实施方案中，自初始施用后2周至1年中任何地方，优选为从约1、约2、约3、约4、约5至约6个月施用第二剂量的组合物。此外，可在第二剂量后以及从初始施用后约3个月至约2年、或更长，优选为约4、约5或约6个月、或约7个月至约1年，施用第三剂量。当第二剂量后在受试者的血清和/或尿或粘膜分泌物中未检测到特异性的免疫球蛋白或检测到低水平的免疫球蛋白，可以任选地施用第三剂量。在一个优选的实施方案中，第二剂量是在第一次施用后约1个月施用的，而第三剂量是在第一次施用后约6个月施用的。在另一个实施方案中，第二剂量是在第一次施用后约6个月施用的。在另一个实施方案中，本公开的组合物可作为组合治疗的一部分来施用。例如，本公开的组合物可与其他免疫原性组合物、抗病毒剂和/或抗生素配制在一起。

技术人员可容易地确定药物组合物的剂量，例如通过鉴定有效引发预防性或治疗性免疫响应的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清滴度或通过测量血清样品、或尿样品、或粘膜分泌物中抗体的抑制比。可从动物研究确定剂量。用于研究疫苗效力的动物的非限制性的列表包括豚鼠、仓鼠、雪貂、灰鼠、小鼠和棉鼠。大多数动物不是感染原的天然宿主，但同样能在疾病各种方面的研究中使用。例如，可用疫苗候选物(例如经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或本公开的VLP)对任何上述动物进行给药，以部分地表征所诱发的免疫响应，和/或确定是否产生了任何中和抗体。例如，已经在小鼠模型中进行了许多研究，因为小鼠的体型小和低成本允许研究者进行较大规模的研究。

此外，技术人员可进行人的临床研究以确定对于人的优选的有效剂量。此类临床研究是本领域所熟知的并且是例行手段。所采用的精确剂量还取决于施用的途径。可以从来源于体外或动物测试系统的剂量响应曲线推导出有效剂量。

在一些方面，RSV和流感组合物可施用于少年儿童、年轻的成人、育龄女性、和老年人。在一些实施方案中，老年患者可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或105岁。在一些实施方案中，老年患者为50-100岁。在一些实施方案中，老年患者为约65至约85岁。

刺激免疫响应的方法

经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、和本公开的RSV和流感VLP，对于制备刺激免疫响应的组合物是有用的，所述免疫响应带来针对感染原的免疫力或基本的免疫力。粘膜和细胞免疫力都可有助于针对感染原和病毒的免疫力。在上呼吸道中局部分泌的抗体是抵抗天然感染的主要因素。分泌性的免疫球蛋白A(sIgA)涉及对上呼吸道的保护，而血清IgG涉及对下呼吸道的保护。由感染诱导的免疫响应防御由相同病毒或抗原性相似的病毒株引起的再感染。例如，RSV经历频繁且不可预测的变化，因此，在天然感染后，宿主免疫力提供的保护有效期针对群落(community)中循环的新病毒株可能仅有效数年。

因此，本公开涵盖在受试者中诱导针对感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个额外蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVM蛋白，例如BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVN蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVG蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVSH蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含来自HRSV组A和/或组B的F和/或G蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白和嵌合的RSVF和/或G蛋白或MMTV包膜蛋白，例如来源于流感病毒的HA或NA蛋白，其中HA和/或NA与RSVF和/或G蛋白或MMTV包膜蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白和嵌合的RSVF和/或G蛋白和任选的来源于流感病毒的HA或NA蛋白，其中HA和/或NA与RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，RSVVLP与佐剂或免疫刺激物配制在一起。

在一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白。在另一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束。在又一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的RSVVLP，其中所述VLP包含经修饰的或突变的RSVF蛋白、M、G、SH、和/或N蛋白。在另一个实施方案中，在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的RSVVLP，其中所述VLP基本由BRSVM(包括嵌合的M)和RSVF、G和/或N蛋白组成。VLP可包含可忽略浓度的额外的RSV蛋白和/或蛋白污染物。在另一个实施方案中，在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的RSVVLP，其中所述VLP由BRSVM(包括嵌合的M)、RSVG和/或F组成。在另一个实施方案中，在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的包含RSV蛋白的RSVVLP，所述RSV蛋白由BRSVM(包括嵌合的M)、F、G和/或N蛋白(包括嵌合的F、G和/或N蛋白)组成。这些VLP含有BRSVM(包括嵌合的M)、RSVF、G和/或N蛋白，并可含有额外的细胞成分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、糖类等，但不含额外的RSV蛋白(除BRSVM(包括嵌合的M)、BRSV/RSVFF、G和/或N蛋白的片段外)。在另一个实施方案中，受试者是脊椎动物。在一个实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中，所述方法包括通过施用一个剂量的制剂来诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力。在另一个实施方案中，所述方法包括通过施用多个剂量的制剂来诱导针对RSV感染或其至少一个疾病症状的免疫力。

本公开还涵盖在受试者中诱导针对由感染原引起的感染或其至少一个症状的免疫力，包括至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个来自异源感染原的蛋白。在一个实施方案中，所述方法施用VLP，所述VLP包含经修饰的或突变的RSVF蛋白和至少一个来自相同感染原或异源感染原的蛋白。在另一个实施方案中，来自异源感染原的蛋白是病毒蛋白。在另一个实施方案中，来自异源感染原的蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，来自异源感染原的蛋白在VLP表面上表达。另一个实施方案中，来自异源感染原的蛋白包含在脊椎动物中产生保护性免疫响应的表位。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白可与RSVM(如BRSVM蛋白)、RSVF、G和/或N蛋白相连。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白融合至RSV蛋白，如BRSVM蛋白、RSVF、G和/或N蛋白。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的仅一部分融合至RSV蛋白，如BRSVM蛋白、RSVF、G和/或N蛋白。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的仅一部分融合至RSV蛋白(如BRSVM蛋白、RSVF、G和/或N蛋白)的一部分。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的与RSV蛋白融合的部分是在VLP的表面上表达的。在其他实施方案中，与来自感染原的蛋白融合的RSV蛋白或其部分与RSVM蛋白相连。在其他实施方案中，RSV蛋白或其部分来源于RSVF、G、N和/或P。在另一个实施方案中，嵌合VLP还包含来自RSV的N和/或P蛋白。在另一个实施方案中，嵌合VLP包含多于一个的来自相同感染原和/或异源感染原的蛋白。在另一个实施方案中，嵌合VLP包含多于一个感染原蛋白，因而产生了多价VLP。

当施用于脊椎动物时，本公开的组合物能在脊椎动物(例如人)中诱导基本的免疫力。基本的免疫力是由针对本公开的组合物的免疫响应引起的，其在脊椎动物中防护或改善感染或至少降低了感染的症状。在一些例子中，如果脊椎动物受到感染，感染是无症状的。响应可不是完全的保护性响应。在这种情况下，如果脊椎动物受到感染原的感染，脊椎动物会经历与未免疫脊椎动物相比降低的症状或更短的症状持续期。

在一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV表达感染或至少一个疾病症状的基本的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在另一个实施方案中，本公开包括为哺乳动物接种针对RSV的疫苗的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用诱导保护的量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVM蛋白，如BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括施用VLP，所述VLP包含RSVG蛋白，例如HRSVG蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括施用VLP，所述VLP包含来自HRSV组A的N蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括施用VLP，所述VLP包含来自HRSV组B的N蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的嵌合M蛋白和来源于RSV的F和/或G蛋白，其中F和/或G蛋白与M蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白和嵌合的RSVF和/或G蛋白，其中F和/或G蛋白与流感HA和/或NA蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白和嵌合的RSVF和/或G蛋白以及任选的流感HA和/或NA蛋白，其中F和/或G蛋白与HA蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。在另一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP包含来自BRSV的M蛋白和嵌合的RSVF和/或G蛋白，和任选的流感HA和/或NA蛋白，其中HA和/或NA蛋白与RSVF和/或G蛋白的细胞质尾区和跨膜域融合。

本公开还涵盖在受试者中诱导针对由感染原引起的感染或至少一个疾病症状的基本的免疫力的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含RSVM蛋白，如BRSVM，以及至少一个来自另一感染原的蛋白。在一个实施方案中，所述方法包括施用VLP，所述VLP还包含BSVM蛋白和至少一个来自相同感染原或异源感染原的蛋白。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白是病毒蛋白。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白在VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白包含在脊椎动物中产生保护性免疫响应的表位。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白可与RSVM蛋白相连。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白可与BRSVM蛋白相连。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白与RSVM蛋白融合。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的仅一部分与RSV蛋白融合。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的仅一部分与RSV蛋白的一部分融合。在另一个实施方案中，来自感染原的蛋白的与RSV蛋白的部分在VLP的表面上表达。在其他实施方案中，与来自感染原的蛋白融合的RSV蛋白或其部分与RSVM相连。在其他实施方案中，与来自感染原的蛋白融合的RSV蛋白或其部分与BRSVM相连。在其他实施方案中，RSV蛋白或其部分来源于RSVF、G、N和/或P。在另一个实施方案中，VLP还包含来自RSV的N和/或P蛋白。在另一个实施方案中，VLP包含多于一个来自感染原的蛋白。在另一个实施方案中，VLP包含多于一个感染原蛋白，因而产生了多价VLP。

在另一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对感染或其至少一个症状的保护性抗体响应的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的如上所述的经修饰的或突变的RSVF蛋白、包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束、或包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的VLP。

本文所用的“抗体”是一种蛋白，其包含一个或多个基本地或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球基因片段所编码的多肽。公认的免疫球蛋白包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为或是κ或是λ。重链被归类为γ、μ、α、δ、或是ε，其反过来定义了免疫球蛋白分类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个完全相同的多肽链对组成，每个对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N末端定义约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。抗体以完整的免疫球蛋白存在或以一些极具特点的片段存在，所述片段通过多种肽酶消化而成。

在一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或流感感染或每种疾病至少一个症状的保护性细胞响应的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的经修饰的或突变的RSVF蛋白和流感组分。在另一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或至少一个疾病症状的保护性细胞响应的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的包含经修饰的或突变的RSVF蛋白的RSVF胶束。在又一个实施方案中，本公开包括在受试者中诱导针对RSV感染或至少一个疾病症状的保护性细胞响应的方法，所述方法包括施用至少一个有效剂量的VLP，其中所述VLP包含如上所述的经修饰的或突变的RSVF蛋白。细胞介导的免疫也在从RSV感染的恢复中起作用，并可能预防RSV相关的并发症。已在受感染患者的血液中和下呼吸道分泌物中检测到了RSV特异性的细胞淋巴细胞。RSV感染的细胞的细胞裂解是由CTL与RSV特异性的抗体和补体协作介导的。在受感染的或接受免疫的个体中6-14天后于血液中可检测到主要的(primary)细胞毒性响应，并于第21天前消失(Ennis等,1981)。细胞介导的免疫还可在从RSV感染的恢复中起作用，并可能预防RSV相关的并发症。已在受感染患者的血液中和下呼吸道分泌物中检测到了RSV特异性的细胞淋巴细胞。

如上文所述，本公开的免疫原性组合物在受试者中预防或降低RSV感染的至少一个症状。RSV的症状是本领域所熟知的。它们包括鼻漏(rhinorrhea)、咽喉痛、头痛、声音嘶哑、咳嗽、咳痰、发热、啰音、哮鸣和呼吸困难。因此，本公开的方法包括对至少一个与RSV感染相关的症状的预防或降低。症状的降低可主观地或客观地确定，例如由受试者自我评估，由医师评估或是通过进行适当的测定法或测量(例如体温)，包括例如生活质量评估、RSV感染或额外症状的进展放缓、RSV症状的严重程度降低或合适的测定法(例如抗体滴度和/或T细胞激活测定)。客观评估包括动物和人的评估。

本公开进一步通过如下实施例来进行阐述，所述实施例不应理解为限制性的。本申请全文中引用的所有引用文献、专利和出版的专利申请、以及附图和序列表的内容，在此通过提述并入用于所有目的。

实施例

实施例1：小鼠研究

用候选疫苗按照表1中所述的实验方案来注射6-8周龄的80Balb/c小鼠。

表1.对于采用三价流感组分和RSVF组分的小鼠试验的研究设计

缓冲液1“Flu缓冲液”含有25mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，500mM，氯化钠，0.3mMCaCl₂和0.01％w/vPS80。缓冲液2“RSV缓冲液”含有25mM磷酸盐，0.15MNaCl，0.01％(W/V)PS80，(w/v)组氨酸pH6.2。

用含有三个流感组分的三价组合物来刺激抗流感响应。所述三价组合物含有三个如下株的VLP：A-PerthH3N2S205(Victoria)、A-CalH1N1、和B-Wisconsin。每个VLP均含有来自所记载的株的HA和NA蛋白。所有三株的M1蛋白都来源于A/Indonesia/5/05。批号：75511013、75511008A、5511009。流感组分为0.25％BPL处理的、0.2μm过滤的SingleRadialImmunoDiffusion(SRID)。HA水平分别为354、626、280μgHA/ml。组分在2-8℃的温度储存于成分如下的缓冲液中：25mM磷酸盐，pH7.2/0.5MNaCl/0.01％PS-80/300μMCaCl₂。RSVF组分(SEQIDNO:8；如美国系列号13/269,107中所述制备与纯化；批号：683.15p)在2-8℃的温度储存于成分如下的缓冲液中：25mM磷酸钠，0.15MNaCl，0.01％(W/V)PS-80，1％(W/V)组氨酸pH6.2。

RSV和三价流感组分各在缓冲液1“Flu”缓冲液和缓冲液2“RSV”缓冲液中施用。缓冲液1含有25mM磷酸钠缓冲液，pH7.2、500mM氯化钠、0.3mMCaCl₂和0.01％w/vPS80。缓冲液2“RSV缓冲液”含有25mM磷酸盐、0.15MNaCl、0.01％(W/V)PS80、(w/v)组氨酸pH6.2。在第0天和第21天注射小鼠。在第0、21和35天从小鼠采集血样。对于表1中的组1和组2，RSV和三价流感组分在注射前进行合并。

实施例2：RSVF抗体的表征

如实施例1中所述对小鼠施用组合组合物。图2显示如通过ELISA测定法测量获得的抗RSVF响应。第0天滴度<100(未显示)。正如预期，单独流感组分不诱导抗RSVF响应。单独施用RSV组分导致稳固的抗RSVF响应。在第35天(D35)和第21天(D21)以3μg和9μg的剂量用缓冲液1和缓冲液2都获得了稳固的响应。第35天滴度较高。引人注目的是，当三价流感组分与RSV组分组合时，实现了升高的抗-RSVF响应。

当评估免疫响应以确定中和抗体的产生时，得到了相似的数据。图3显示了在实施例1中所述试验中得到的中和抗体。在第35天测量各样品中的中和抗体。第0天血清样品滴度<20(未显示)。中和抗RSV响应范围为95-226。

实施例3：RSVF帕利珠单抗竞争性抗体的表征

帕利珠单抗(Synagis^TM)是一种在人中结合并中和RSV病毒的单克隆抗体。帕利珠单抗结合至RSVF上的表位(SEQIDNO:35)。有利的是，RSV组分刺激针对同一表位的免疫响应。图4是RSVF帕利珠单抗竞争性ELISA，其显示通过组合组合物诱导的抗体响应结合至与帕利珠单抗所识别的相同的表位。第0天血清滴度<20(未显示)。在第21天和第35天以3μg和9μg的剂量用缓冲液1和缓冲液2获得了针对所述表位的稳固的响应。当共同施用三个流感组分和RSV组分时获得了相似的响应。

实施例4：抗流感响应的表征

如实施例1所述对小鼠施用疫苗组合物。进行了凝血抑制测定法来确定每个流感组分的凝血抑制。如图5-7所示，全部三株都实现了基本抑制。图5显示了A-California株的结果。图6显示了A/Victoria株的结果。图7显示了B/Wisconsin株的结果。在第0天血清滴度<20(未显示)。在第35天以3μg和9μg的剂量用缓冲液1和缓冲液2获得了稳固的凝血抑制滴度。含有三价流感组分(三个流感组分都是VLP的形式)和RSV组分的组合组合物诱导了比单独三价流感组合物更好的响应。

实施例5：人体研究

用流感免疫原性组合物在老年人群中进行了RSVF序贯施用的临床试验。为了进行这项试验，将220名人受试者随机化接受一个剂量的60或90μg的RSVF蛋白，其含有或不含1200μg的AlPO₄佐剂；或安慰剂。所有受试者还接受流感疫苗(TIV)，以对使用中可能出现的序贯施用进行模拟。施用是以通过对同一受试者对侧手臂不同的RSVF和TIV肌肉注射剂量的序贯施用来进行的。实验方案和研究文档由适当组建的机构审查委员会批准；所有受试者提交了知情同意书。实验设计是随机的、年龄分层的、和观察者不知情的。测定法的操作者对于受试者处理是不知情的。实验处理的概述可见下文：

表2.人受试者人口统计和实验处理

组	E	A	B	C	D
						RSV F	0(安慰剂)	60ug	60ug	90ug	90ug
AlPO4	无	有	无	有	无
						N	60	40	40	40	40
年龄(岁)
						平均值	69.1	69.1	67.7	68.0	68.7
中值	68.0	68.0	67.0	68.0	68.0
						％≥75	15	15	15	15	15
男性/女性	37/63％	45/55％	40/60％	53/47％	42/58％
						平均BMI	27.4	28.5	27.7	29.6	27.6

进行了凝血抑制测定法来确定每个流感组分的凝血抑制。基本在确立的世界卫生组织(WorldHealthOrganization)方法之后于Novavax进行流感凝血抑制(HAI)测定法。如通过免疫后HAI血清转化和GMT测量的TIV响应完全没有受到RSVF序贯施用的影响。

实施例6：人体研究中RSVF抗体的表征

如实施例5中所述对人受试者序贯施用RSVF和TIV组合物。图8显示使用(FalseyAR等,Vaccine2013；31:524)中所述实验方案如通过ELISA测定法测量获得的抗RSVF响应。如预期的，安慰剂单独处理不诱导抗RSVF响应。施用RSVF组分导致稳固的抗RSVF响应。血清抗-FIgG的水平增加3.1至5.6倍，受体中的最佳响应是90μg+Al处理。Al-佐剂组中的血清响应率为89-92％。

实施例7：人体研究中RSVF帕利珠单抗竞争性抗体的表征

帕利珠单抗(Synagis^TM)是一种在人中结合并中和RSV病毒的单克隆抗体。帕利珠单抗结合至RSVF上的表位(SEQIDNO:35)。有利的是，RSV组分刺激针对同一表位的免疫响应。图9包含了帕利珠单抗竞争性ELISA的结果，其显示由序贯施用诱导的抗体响应结合至与帕利珠单抗所识别的相同的表位。在第28天和第56天，使用或不使用铝(Alum)以60ug和90ug处理都获得了针对表位的稳固响应。实验性RSV处理中，与帕利珠单抗竞争的抗体在第0天从不可测升高到85-185mg/ml；不使用Al响应率为74-78％，使用佐剂的响应率为97.4％。

实施例8：人体研究中针对抗原性位点的抗体的表征

如实施例5中所述对人受试者序贯地施用RSVF和TIV组合物。如图10所示，所有非安慰剂处理都达到了针对抗原性位点II的基本免疫原性响应。与抗原性位点II肽反应的IgG滴度升高5.3至12.5倍，最高滴度属于90ug+Al处理。这些结果证明所述组合物诱导不遭受抗原干扰的免疫响应。

实施例9：人RSVF和TIV研究的关键安全性结果

如实施例5中所述对人受试者序贯地施用RSVF和TIV组合物。用反应原性日志、安全性实验室测试、和关于健康变化的开放式查询来评估安全性。治疗组的平均年龄为67.7-69.1岁；15％≥75岁。受试者大部分是白种人，男性占总数的43％；99％的受试者贯穿第56天提供数据。安慰剂接受者中有70％报告了至少一例不良事件(AE)，相比之下各种组中有58-75％的活性疫苗。活性疫苗中瞬时注射部位疼痛频度高出15-20％，但在其他方面疫苗安全性概貌与安慰剂差别极小；安慰剂组中发生了1例严重AE。结果概述提供如下：

表3.人体试验，安全性结果数据

组	E	A	B	C	D
						RSV F	0(安慰剂)	60ug	60ug	90ug	90ug
AlPO4	无	有	无	有	无
						N	60	40	40	40	40
完全的D56	59	40	39	40	40
						不良事件*
任何	42(70％)	30(75％)	25(63％)	27(68％)	23(58％)
						征集的(Solicited)AE	28(47％)	22(55％)	12(30％)	21(53％)	19(48％)
局部征集的AE	14(23％)	17(43％)	9(23％)	17(43％)	15(38％)
						全身征集的AE	22(37％)	12(30％)	6(15％)	16(40％)	10(25％)
严重的(severe)征集的AE	1(2％)	1(3％)	0	0	0

非征集的AE	31(52％)	18(45％)	19(48％)	16(40％)	16(40％)
						严重的和相关的AE	2(3％)	0	0	0	0
危急的(serious)AE	1(2％)	0	0	0	0

这些结果证明RSVF疫苗与TIV序贯施用是相容的，老年人耐受良好，并且引起潜在具有保护性特异性的抗体增加。在所有磷酸铝佐剂实验处理中都见到了增加的免疫原性响应。

实施例10：对于四价流感(Q-Flu)和RSVF组合疫苗的小鼠研究

总共90只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10只)被用于这项研究中。所有动物在第0天和21天接受两次IM疫苗接种，所述接种使用6.0、1.5或0.5μg剂量的RSVF或四价季节性流感VLP疫苗，或是如表1所述的组合的RSVF和流感VLP疫苗。四价流感疫苗每株含有1.5、0.375或0.125μg(每株25％)

在第0、21和35天采血用于免疫原性评估。

表4：研究设计

表5.四价流感组合物中的RSVF和流感株

药物物质	来源	货号#	浓度(HAμg/mL)
				RSV	PD	B13D001	538.5
A/Cal/04/09-H1N1	PD	X13I001B	741.0
				A/Victoria/361/11-H3N2	PD	X13G002	479.1
B/Brisbane/60/08	PD	X13H003	350.5
				B/Mass/2/12	PD	X13H001	412.7

将第1、2和3组制备于RSVF缓冲液中：25mM磷酸盐，pH6.2，0.15MNaCl，0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，1％(w/v)组氨酸。将第4、5和6组制备于流感缓冲液中：25mM磷酸钠，pH7.2，0.3MNaCl，300μMCaCl₂和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80。将第7、8和9组制备于50％流感-50％RSV混合缓冲液中。

免疫学方法

a)抗-RSVFIgGEISA

通过收集于第0、21和35天的血清中的酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估RSVF特异性的抗体滴度。简言之，用2μg/ml的RSVF蛋白涂覆NUNCMaxiSorp微量滴定板并于2-8℃温育过夜。用起始封闭剂(Piercebiological)将未反应的表面室温封闭1小时。制备一式两份的连续稀释(5倍，1:100-1:390,625)的小鼠血清，并将其添加至RSVF蛋白涂覆的平板，室温温育2小时，并用含吐温的磷酸盐缓冲盐水(PBS-T(QualityBiologicals))洗涤。添加缀合了羊抗小鼠IgG(SouthernBiotech)的辣根过氧化物酶后，温育微量滴定板1小时，用含吐温的磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，并向平板添加过氧化物酶底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(Sigma)以检测蛋白结合的抗RSVF小鼠IgG抗体。允许显色进行约5-6分钟。在添加TMB终止缓冲液(ScyTekLaboratories)后，在SpectraMaxPlus平板阅读器(MolecularDevices)中于450nm处读取平板。用SoftMax专业版软件(MolecularDevices)分析数据。将4PL曲线拟合至数据，并测定导致OD450为1.0的血清稀释的倒数值作为滴度。阳性RSVF小鼠血清用作对照。预先取血的滴度<100的小鼠血清充当阴性对照。

b)帕利珠单抗竞争性ELISA

RSVF小鼠血清和生物素标志的帕利珠单抗(MedImmuneLLC)对RSVF抗原的竞争性结合在96孔微量滴定板中进行。依照制造商说明书用生物素标志试剂盒(Pierce)对帕利珠单抗(10mg/ml)进行生物素化。用2μg/mlRSV-F抗原涂覆NuncMaxiSorb微量滴定板，并于2-8℃温育过夜。然后用1％牛奶在室温将未反应的位点封闭1小时。制备两倍连续稀释(从1:20至1:1280)的小鼠血清一式两份，并加入120ng/ml的生物素化的帕利珠单抗。于室温将平板温育2小时，并用含吐温的磷酸盐缓冲盐水(QualityBiologicals)洗涤。在添加链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶后，将(e-Bioscience)微量滴定板短暂(temp)温育1小时。用含吐温的磷酸盐缓冲盐水洗涤三次后，向平板添加过氧化物酶底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(Sigma)，以检测抗原结合的生物素化的帕利珠单抗。在添加TMB终止缓冲液(ScyTekLaboratories)后，在SpectraMaxPlus平板阅读器(MolecularDevices)中于450nm处读取平板。含有缓冲液中的生物素化的帕利珠单抗的孔代表未发生竞争的，而仅含PBS且不含任何生物素标志的帕利珠单抗的孔在测定中用作阴性对照。阳性RSVF小鼠血清和预先免疫的小鼠血清用作测定对照。用SoftMax专业版软件(MolecularDevices)分析数据。竞争的结合滴度表示为50％抑制滴度。用下式计算每个血清稀释的百分比抑制滴度：(OD_{帕利珠单抗}-OD_样品/OD_{帕利珠单抗})x100％。

将4PL曲线拟合至数据，并测定导致对生物素化的帕利珠单抗结合的50％抑制的血清稀释的倒数值作为滴度。阳性RSVF小鼠血清用作对照。预先取血的滴度<100的小鼠血清充当阴性对照。在无法得到50％抑制的情况下，则报告样品滴度<20且在计算组GMT时使用10的值。

c)微量中和作用

为了确定RSVF颗粒疫苗是否能引发RSV中和抗体，在RSV-ALong株中和反应测定中对来自第35天的血清样品进行测定。以1:20开始的两倍连续稀释的小鼠血清制备于96孔板中。向稀释的血清添加等体积(50μl)的病毒(～200PFU)，并于36℃温育1小时。将生长培养基(L-15，10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺)中的100μl新制的胰蛋白酶化的HEp-2细胞(5×10⁵细胞/ml)添加至病毒/血清混合物并在36℃温育6-7天或直至阳性对照(仅病毒)孔显示出100％细胞病变效应(CPE)。

在用5％戊二醛(gluteraldehyde)中的0.25％结晶紫进行固定和染色之前和/或之后，通过显微镜针对细胞的CPE进行评分。将被染色的孔通风干燥并用解剖显微镜评估CPE。导致对CPE形成的100％抑制的最后一个稀释鉴定为该样品的中和抗体滴度的终点。将任何导致滴度低于20的样品赋值为10。计算每组的几何平均数。滴度为6400的绵羊RSVF血清用作阳性对照。

d)HAI抗体测量

在第35天获取的血清样品上评估针对流感A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08和B/Massachusetts/2/12的HAI响应。将土耳其红细胞(LampireBiologicalLaboratories)制备于PBS中的1％悬液。用RDE来处理血清样品和对照，以使非特异性抑制剂失活。将RDE处理过的血清在96孔V底平板上的PBS中连续稀释(从1:10开始)。将土耳其红细胞(Turkeyredbloodcells)和经标准化的HA抗原添加至稀释的血清，并将平板于室温温育45-50分钟。通过倾斜平板来检测样品中红细胞的泪滴状流，其以与红细胞对照孔相同的速度流动，从而确定凝血抑制。HAI抑制滴度记为最高血清稀释的倒数，其中观察到了凝血抑制。血清的最终滴度报告为重复HAI滴度的几何平均数(GMT)。任何导致滴度低于10的样品赋值为5(参见图14)。

e)统计学方法

结果用几何平均滴度(GMT)和对应的95％CI表示。分析了疫苗组的成对比较，并用双尾Student’st检验对其进行评估。小于0.05的p值认为对于疫苗组比较是显著的。

实施例11：对于四价流感(Q-Flu)和RSVF组合疫苗的小鼠研究的结果

如实施例10中所述对小鼠进行免疫。通过抗-FIgG滴度确定来评估RSVF免疫响应，所述确定是用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、帕利珠单抗竞争性ELISA、微量中和(MN)测定法来进行的，而流感免疫响应是通过凝血抑制测定法(HAI)来测量的，其同样如实施例10中所述。

a)IgG响应

用RSVF单疫苗免疫的和用组合RSVF/流感VLP疫苗免疫的所有组的小鼠都达到了非常高的且剂量依赖性的血清IgG响应(图20)。对所有组使用第二免疫见到了显著的推动效果(p<0.01)(图20和21)。与单独施用RSVF相比，所有剂量的组合疫苗都增加了抗-RSVFIgG滴度，其显著性差异达到了6μg和1.5μg剂量，p<0.05(图11A、11B和21)。第35天，单独RSVF的抗-RSVFGMT范围为46,087至108,932，而组合疫苗的GMT范围为108,178至284639(图21)，指示2.3至2.8倍的升高(图11B)。

b)帕利珠单抗竞争性抗体

所有免疫组产生的抗体的功能能力都是通过竞争性ELISA来确定的，所述竞争性ELISA设置为指示针对帕利珠单抗的50％抑制滴度。与RSVFIgG响应类似，接受组合RSVF/流感VLP疫苗的组的帕利珠单抗竞争性抗体(PCA)滴度也比单独接受RSVF的组显著更高(p<0.05)(图12A，12B和22)。RSVF单用的PCA范围为55至95μg/ml，而组合疫苗的范围为125至268μg/ml(图22)，指示2.2至2.8倍的升高(图12B)。

c)RSV-F中和抗体

为了确定抗体中和RSV病毒的能力，进行了微量中和测定法。所有组都以剂量依赖性的方式产生高水平的中和滴度(图13A和13B)。组合疫苗增加了所有接受组合疫苗的组的滴度，其显著性差异达到0.5μg剂量(p<0.01)(图23)。

d)流感特异性响应

为了评估流感特异性响应，确定所有四个个体菌株的HAI滴度，其分别为：A/California/04/09(H1N1)(参见图15A、15B、和16)、A/Victoria/361/11(H3N2)(参见图15C、15D、和17)和B/Brisbane/60/08(参见图15E、15F、和18)和B/Massachusetts/2/12(参见图15G、15H、和19)。尽管事实是最终的Q-Flu制备物仅含1.5μg、0.375μg、或0.125μg的各株，但HAI滴度高。与RSVF响应形成对比的是，单独用Q-Flu疫苗的HAI响应与使用组合RSVF/流感VLP疫苗的HAI响应没有显著差异(图15-19)。这个结果表明，RSVF的共同施用并不降低流感VLP疫苗的免疫原性。

e)倍数增加对比

下表6显示了将RSV组分和Q-flu组分组合对于抗-RSV-F响应的幅度(magnitude)和特性(character)的增强效果。要注意的是，在研究IDNo.27中，使用的是A/Perth株，而在研究46中，使用的是A/Victoria/361/11株。

表6：组合组合物RSV响应与单独组合物RSV响应的比(ratio)

*******

给出上述详细说明仅用于理解清楚，而不必理解为对其的限制，因为修饰对于本领域技术人员是显而易见的。

当本公开以其具体的实施方案进行描述时，其应当理解为能够进行进一步修改，并且本申请意在涵盖本文公开内容的任何变化、用途或适应方式，其总体是遵循本公开的原则的，并且包括了与本公开有出入、但在本公开所属领域已知的或惯常的实践范围内、并可以适用于本文所述的和所附权利要求范围内的本质特征的那些内容。

Claims (25)

1.一种免疫原性组合物，其包含呼吸道合胞体病毒(RSV)融合物(F)组分和流感组分。

2.权利要求1的组合物，其中所述RSVF组分包含RSVF蛋白。

3.权利要求1的组合物，其中所述流感组分包含流感病毒样颗粒(VLP)。

4.权利要求3的组合物，其中所述流感VLP包含流感HA蛋白、流感NA蛋白、和流感M1蛋白。

5.权利要求1的组合物，其还包含2、3、或4个流感VLP，其中每个VLP包含来自不同株的HA蛋白。

6.权利要求5的组合物，其中每个流感VLP还包含来自与HA蛋白相同株的NA蛋白。

7.权利要求5的组合物，其中每个流感VLP包含来源于流感株A/Indonesia/5/05的M1蛋白。

8.一种免疫原性组合物，其包含呼吸道合胞体病毒(RSV)融合物(F)组分和三个流感组分，

其中每个流感组分包含VLP，

其中每个VLP包含流感M1蛋白、流感NA蛋白、和流感HA蛋白；及

其中每个VLP中的所述NA蛋白和HA蛋白来源于相同的流感株；

其中第一、第二和第三VLP中的流感蛋白来源于彼此不同的株，

其中所述第一、第二和第三VLP各自包含来源于相同株的M1蛋白。

9.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含第四流感组分，其中所述第四流感组分包含VLP，其中所述第四VLP包含来源于与第一、第二和第三VLP不同株的HA蛋白和NA蛋白；并且其中所述M1蛋白来源于与第一、第二和第三VLP相同的株。

10.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述M1蛋白来源于禽流感病毒。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述禽流感病毒是A/Indonesia/5/05流感病毒株。

12.权利要求2的组合物，其中所述RSVF蛋白包含使一级切割位点或二级切割位点失活的突变。

13.权利要求2的组合物，其中所述RSVF蛋白包含一级切割位点，所述一级切割位点通过在对应于野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)中的精氨酸133、精氨酸135、和精氨酸136的位置处引入至少一个氨基酸取代而失活。

14.权利要求2的组合物，其中所述RSVF蛋白包含对应于野生型RSVF蛋白(SEQIDNO:2)的氨基酸137-146的氨基酸缺失。

15.权利要求2的组合物，其中所述RSVF蛋白包含SEQIDNO:8。

16.一种试剂盒，其包含呼吸道合胞体病毒(RSV)融合物(F)组分和至少一个流感组分，其中各组分在分开的容器中。

17.一种诱导针对RSV和流感株的保护性响应的方法，包括施用权利要求1的组合物。

18.权利要求17的方法，其中施用包含如下步骤：

(a)将RSV组分在2-8℃储藏于容器中，

(b)将流感组分在2-8℃储藏于容器中，

(c)将RSV组分与流感组分混合以提供组合组合物；及

(d)将所述组合物肌内注射到动物中，

由此获得针对通过流感或通过RSV的感染的保护性免疫响应。

19.权利要求18的方法，其中所述动物是人。

20.权利要求19的方法，其中所述人是婴幼儿。

21.权利要求18的方法，其中所述保护性响应包括抗-RSVF中和抗体。

22.权利要求18的方法，其中所述保护性响应包括血凝抑制，并且所述血凝抑制在共同施用RSV组分和流感组分时比单独施用各组分时更大。

23.权利要求21的方法，其中所述抗-RSVF中和抗体响应在共同施用RSV组分和流感组分时比单独施用各组分时更大。

24.权利要求18的方法，其中所述保护性响应包括抗帕利珠单抗(anti-palivizumab)抗体响应。

25.权利要求24的方法，其中抗帕利珠单抗抗体响应在共同施用RSV组分和流感组分时比单独施用各组分时更大。