JP2016509015A - 呼吸器合胞体ウイルス及びインフルエンザ用の混合ワクチン - Google Patents
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Abstract
本開示が、インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスの両方に対する混合免疫原性組成物を同時に投与することによって、これら両方のウイルスに対する免疫応答を高める組成物及び方法に関する。この混合組成物は、RSV成分及び1つ、2つ、3つ、又は4つ以上のインフルエンザ成分を含む。この混合組成物は、RSV成分及びインフルエンザ成分を別個に投与することによって得られる免疫応答よりも強い免疫応答を誘導する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにそれぞれの全開示内容が本明細書で援用される2013年2月11日出願の米国特許仮特許出願第61/763,309号及び2013年9月9日出願の同第61/875,327号の優先権を主張するものである。
本出願は、あらゆる目的のためにそれぞれの全開示内容が本明細書で援用される2013年2月11日出願の米国特許仮特許出願第61/763,309号及び2013年9月9日出願の同第61/875,327号の優先権を主張するものである。
本出願は、あらゆる目的のために次の特許出願の開示内容を本明細書に組み込むものとする:2012年9月27日出願の米国特許出願第13/269,107号、2007年12月20日出願の米国仮特許出願第61/015,440号、2006年10月18日出願の米国特許出願第11/582,540号(米国特許出願公開第2007/0184526号)、2005年10月18日出願の米国仮特許出願第60/727,513号;2006年3月10日出願の米国仮特許出願第60/780,847号;2006年5月15日出願の米国仮特許出願第60/800,006号;2006年7月17日出願の米国仮特許出願第60/831,196号;2006年7月21日出願の米国仮特許出願第60/832,116号、2006年9月19日出願の米国仮特許出願第60/845,495号、2003年7月11日出願の米国特許出願第10/617,569号(米国特許出願公開第2005/0009008号)、2008年12月19日出願の米国特許出願第12/340,186号(米国特許出願公開第2010/129401号)、及び2010年1月19日出願の米国特許出願第12/689,826号(米国特許出願公開第2010/0184192号)。
配列表の相互参照
本明細書と共に電子出願されるテキストファイルの内容は、参照によりその全てが本明細書で援用される:コンピュータ可読形式の配列表のコピー(ファイル名:NOW_53_Seq_List.txt、記録された日付:2014年2月11日;ファイルサイズ:74キロバイト)。
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技術分野
本明細書の開示は、全体として、RSV及びインフルエンザウイルスによる感染の処置及び/又は予防用の免疫原性組成物、例えば、ワクチンに関する。
本明細書の開示は、全体として、RSV及びインフルエンザウイルスによる感染の処置及び/又は予防用の免疫原性組成物、例えば、ワクチンに関する。
発明の背景
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科の肺炎ウイルス(Pneumovirus)属のメンバーである。ヒトRSV(HRSV)は、幼児における重篤な下気道疾患の主な原因であり、ヒトで高い罹患率及び死亡率を引き起こす。RSVはまた、免疫が低下した成人及び高齢者における疾患の重要な病原体としても認識されている。自然感染後の感染宿主でのRSVに対する耐性は不完全であるため、小児期及び成人期にRSVに複数回感染し得る。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科の肺炎ウイルス(Pneumovirus)属のメンバーである。ヒトRSV(HRSV)は、幼児における重篤な下気道疾患の主な原因であり、ヒトで高い罹患率及び死亡率を引き起こす。RSVはまた、免疫が低下した成人及び高齢者における疾患の重要な病原体としても認識されている。自然感染後の感染宿主でのRSVに対する耐性は不完全であるため、小児期及び成人期にRSVに複数回感染し得る。
このウイルスは、一本鎖マイナスセンスRNAから構成されるゲノムを有し、この一本鎖マイナスセンスRNAは、ウイルスタンパク質に密に結合してヌクレオカプシドを形成する。ウイルスエンベロープは、ウイルスによりコードされる構造タンパク質を含む、原形質膜由来の脂質二重層から構成されている。ウイルスポリメラーゼが、ビリオンと共にパッケージングされ、ゲノムRNAをmRNAに転写する。RSVゲノムは、3つの膜貫通型構造タンパク質、F、G、及びSH、2つのマトリクスタンパク質、M及びM2、3つのヌクレオカプシドタンパク質、N、P、及びL、並びに2つの非構造タンパク質、NS1及びNS2をコードする。
HRSVと細胞膜との融合は、細胞表面で起こると考えられ、感染初期におけるウイルスリボ核タンパク質の細胞質への移動に必要なステップである。このプロセスは、融合(F)タンパク質によって媒介され、この融合(F)タンパク質はまた、感染細胞の膜と隣接細胞の膜との融合を促進して特徴的な合胞体を形成させ、この合胞体の形成は、顕著な細胞変性効果があり、かつウイルス伝播の別の機構である。従って、融合活性の中和は、宿主の免疫において重要である。実際、Fタンパク質に対して開発されたモノクローナル抗体は、ウイルス感染力を中和し、かつ膜融合を阻害することが示されている(Calder et al., 2000, Virology 271:1221-131)。
RSVのFタンパク質は、他のパラミクソウイルス(paramyxovirus)のF糖タンパク質と構造的特徴、及び限定的であるが重要なアミノ酸配列同一性を共有する。このFタンパク質は、574のアミノ酸の不活性前駆体(F0)として合成され、小胞体においてアスパラギン上で共翻訳的にグリコシル化され、そこで集合してホモオリゴマーになる。細胞表面に到達する前に、F0前駆体はプロテアーゼによって切断され、N末端から延びたF2とC末端から延びたF1となる。F2鎖及びF1鎖は、1つ以上のジスルフィド結合によって共有結合が維持される。
免疫親和性精製された完全長Fタンパク質は、他の完全長ウイルス膜糖タンパク質で観察されるものに類似したミセル(ロゼットとしても特徴付けられる)の形態で蓄積することが分かっている(Wrigley et al, 1986, in Electron Microscopy of Proteins, Vol 5, p. 103-163, Academic Press, London)。電子顕微鏡下では、ロゼット内の分子は、逆円錐形ロッド構造(約70%)又はロリポップ形構造(約30%)のいずれかとして見え、これらの広い端部が、ロゼットの中心から離れる方向に突き出ている。ロッドの高次構造状態は、融合前の不活性状態にあるF糖タンパク質に関連するが、ロリポップの高次構造状態は、融合後の活性状態にあるF糖タンパク質に関連している。
Calder et al., 2000, Virology 271:122-131によって実証されているように、電子顕微鏡検査を使用して、融合前と融合後(あるいは、前融合性及び融合性と表される)の高次構造を区別することができる。融合前高次構造はまた、リポソーム結合アッセイによって融合性(融合後)高次構造と区別することもできる。加えて、融合前高次構造及び融合性高次構造は、RSV Fタンパク質の融合前形態又は融合性形態のいずれか一方で存在するが、他方の形態では存在しない高次構造エピトープを特異的に認識する抗体(例えば、モノクローナル抗体)を用いて区別することができる。このような高次構造エピトープは、分子の表面上にある抗原決定基の優先的な露出に起因し得る。あるいは、高次構造エピトープは、直鎖状ポリペプチドにおける非連続的なアミノ酸の並置から生じ得る。
以前に、F前駆体が2つの部位(部位I、残基109位の後、及び部位II、残基136位の後)で切断され、フューリン様プロテアーゼによって認識されるモチーフがこれらの両方の部位に先行することが示されている。部位IIは融合ペプチドに隣接し、膜融合には、両方の部位でのFタンパク質の切断が必要である(Gonzalez-Reyes et al., 2001, PNAS 98(17): 9859-9864)。両方の部位で切断が完了すると、円錐形ロッドからロリポップ形ロッドへの変化が存在すると考えられる。
発明の概要
本明細書では、RSV F成分及び少なくとも1つのインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物が提供される。同時に、RSV F成分及びインフルエンザ成分を使用して、動物、例えば、ヒトの、組成物中に含まれるRSV株及びインフルエンザ株による感染を防御する免疫応答を刺激することができる。
本明細書では、RSV F成分及び少なくとも1つのインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物が提供される。同時に、RSV F成分及びインフルエンザ成分を使用して、動物、例えば、ヒトの、組成物中に含まれるRSV株及びインフルエンザ株による感染を防御する免疫応答を刺激することができる。
RSV FとインフルエンザVLPの混合ワクチンは、マウスにおいて十分に耐容性であり、かつ免疫原性である。予想外に、成分の混合により、成分を別個に投与する場合と比較して、混合ではウイルス抗原に対する免疫応答が高まる。メカニズムに縛られるものではないが、免疫原性データは、恐らくは、RSV緩衝液;例えば、インフルエンザ緩衝液よりも低いpHのRSV緩衝液、又はヒスチジンの存在によって、インフルエンザ抗原が(場合によってはHAタンパク質も)RSV F応答を強化し、逆にRSV成分がHA応答を強めたことを示している。
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される「アジュバント」という語は、製剤中で特定の免疫原と組み合わせて使用されると、得られる免疫応答を増強する、又は改変もしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体応答及び細胞性免疫応答の一方又は両方の特異性の強化又は拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低下又は抑制も意味し得る。
定義
本明細書で使用される「アジュバント」という語は、製剤中で特定の免疫原と組み合わせて使用されると、得られる免疫応答を増強する、又は改変もしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体応答及び細胞性免疫応答の一方又は両方の特異性の強化又は拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低下又は抑制も意味し得る。
本明細書で使用される「抗原製剤」又は「抗原組成物」という語は、脊椎動物、特に鳥類又は哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導する調製物を指す。
本明細書で使用される「約」は、表示値の±10%を意味する。
本明細書で使用される「トリインフルエンザウイルス」という語は、主として鳥類に見られるが、ヒト又は他の動物にも感染し得るインフルエンザウイルスを指す。ある場合には、トリインフルエンザウイルスはヒトからヒトに伝染又は伝播し得る。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの大流行、すなわちヒトに罹患率及び/又は死亡率を引き起こす可能性がある。大流行は、新種のインフルエンザウイルス株(ヒトが自然免疫を有していないウイルス)が現れたときに起こり、個々の地域を越えて、場合によっては全世界的に伝播し、多くの人に同時に感染する。
本明細書で使用される「有効用量」は、通常は、免疫を誘導する、感染を予防及び/又は改善する、又は感染もしくは疾患の少なくとも1つの症状を軽減するのに十分な本発明で開示される組成物の量を指す。有効用量は、後の感染病原体又は疾患への曝露に対する対象(例えば、ヒト)の自己免疫応答を亢進させるのに十分な量とすることもできる。免疫レベルは、例えば、中和分泌及び/又は血清抗体の量を、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着、もしくはマイクロ中和アッセイで測定することによって、又は細胞性応答、例えば、限定されるものではないが、細胞傷害性T細胞、抗原提示細胞、ヘルパーT細胞、樹状細胞及び/又は他の細胞性応答を測定することによって監視することができる。T細胞応答は、例えば、蛍光フローサイトメトリー又はT細胞アッセイ、例えば、限定されるものではないが、T細胞増殖アッセイ、T細胞傷害性アッセイ、TETRAMERアッセイ、及び/又はELISPOTアッセイによって特異的マーカーを用いて、例えば、CD4+及びCD8+細胞の存在量を測定することによって監視することができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防し、かつ/又は症状の重症度を軽減する用量である。
本明細書で使用される「有効量」という語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な本明細書で開示される組成物の量を指す。組成物の有効量は、選択された結果を達成する量であり得、かつこのような量は、当業者によってルーチンの実験として決定することができる。例えば、感染を予防、処置、及び/又は改善するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、これにより抗原特異的な免疫応答を生じさせるために必要な量であり得る。この用語はまた、「十分な量」と同義語でもある。
本明細書で使用される「発現」という語は、ポリ核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリ核酸がゲノムDNAに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物が選択される場合は、mRNAのスプライシングを含み得る。本発明の開示の文脈では、この語はまた、RSV F遺伝子mRNA及びその発現後に得られるRSV Fタンパク質の産生も包含する。
本明細書で使用される「Fタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Fタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」という語は、RSV融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に、「Gタンパク質」又は「Gタンパク質ポリペプチド」という語は、RSV付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のRSV融合タンパク質及びRSV付着タンパク質が記載されており、これらは、当業者に公知である。参照によりその全開示内容が本明細書で援用される国際公開第2008/114149号に、例示的なFタンパク質変異体及びGタンパク質変異体(例えば、天然に存在する変異体)が詳述されている。
本明細書で使用される「免疫原」又は「抗原」という語は、免疫応答を誘発することができる物質、例えば、タンパク質、ペプチド、及び核酸を指す。両方の語は、エピトープも包含し、互換的に使用される。
本明細書で使用される「免疫刺激因子」という語は、生体自体の化学メッセンジャー(サイトカイン)を介した免疫応答を亢進させる化合物を指す。このような分子には、免疫刺激活性、免疫強化活性、及び炎症誘導活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、及びケモカイン、例えば、インターフェロン(IFN−γ)、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);成長因子(例えば、顆粒球マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF));及び他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2などが含まれる。免疫刺激因子分子は、本開示のVLPと同じ製剤で投与しても良いし、又は別個に投与しても良い。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。
本明細書で使用される「免疫原性製剤」という語は、脊椎動物、例えば、哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導する調製物を指す。
本明細書で使用される「感染病原体」という語は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、生物は、ウイルス、細菌、寄生生物、原生動物、及び/又は真菌である。
本明細書で使用される「変異した」、「修飾された」、「突然変異」、又は「修飾」という語は、改変された核酸又はポリペプチドをもたらす核酸及び/又はポリペプチドのあらゆる修飾のことである。突然変異には、例えば、遺伝子のタンパク質コード領域内に生じる改変及びタンパク質コード配列、例えば、限定されるものではないが、調節配列又はプロモーター配列の外側の領域における改変を含む、ポリヌクレオチドの単一又は複数の残基の点突然変異、欠失、又は挿入が含まれる。遺伝子改変は、あらゆるタイプの突然変異であり得る。例えば、突然変異は、遺伝子の一部又は全ての点突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、又は欠失を構成し得る。一部の実施形態では、突然変異は自然発生する。他の実施形態では、突然変異は人工的な突然変異圧力の結果である。なお他の実施形態では、RSV Fタンパク質における突然変異は、遺伝子操作の結果である。
本明細書で使用される「多価」という語は、感染病原体又は疾患の複数のタイプ又は株に対する1つ以上の抗原タンパク質/ペプチド又は免疫原を有する組成物を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容され得るワクチン」という語は、脊椎動物に投与することが可能な形態であると共に、感染又は疾患を予防及び/又は改善し、かつ/又は感染もしくは疾患の少なくとも1つの症状を軽減する免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する製剤を指す。典型的には、ワクチンは、本開示の組成物が懸濁又は溶解された従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本開示の組成物を感染の予防、改善、又はその他の処置に便利に使用することができる。宿主に導入されると、ワクチンは、限定されるものではないが、抗体及び/もしくはサイトカインの産生、並びに/又は細胞傷害性T細胞、抗原提示細胞、ヘルパーT細胞、樹状細胞の活性化、及び/もしくは他の細胞性応答を含む免疫応答を引き起こすことができる。
本明細書で使用される「防御免疫応答」又は「防御応答」という熟語は、感染を予防もしくは改善する、又はその少なくとも1つの疾患症状を軽減する、脊椎動物(例えば、ヒト)によって示される、感染病原体又は疾患に対する抗体により媒介される免疫応答を指す。本明細書に開示される組成物は、例えば、感染病原体を中和し、感染病原体が細胞に侵入するのを阻止し、感染病原体の複製を阻止し、かつ/又は宿主細胞を感染及び破壊から保護する抗体の産生を刺激することができる。
本明細書で使用される「脊椎動物」又は「対象」又は「患者」という語は、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種を含む他の霊長類を含め、脊索動物亜門(subphylum cordata)のあらゆるメンバーを指す。農場動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ;家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ及びネコ;げっ歯類、例えば、マウス、ラット(コットンラットを含む)、及びモルモットを含む実験動物;家禽、野鳥、及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、七面鳥、及び他のキジ類の鳥、アヒル、及びガチョウなどを含む鳥類もまた、非限定の例である。「哺乳動物」及び「動物」という語は、この定義に含まれる。成体及び新生児の両方の個体が含まれるものとする。特に、乳児及び幼児は、インフルエンザ及びRSVの免疫に適した対象又は患者である。
本明細書で使用される「ウイルス様粒子」(VLP)という語は、少なくとも1つの属性がウイルスに類似しているが、伝染性であると実証されていない構造を指す。本開示に従ったウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有していない。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムが欠損しており、従って非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は、しばしば、異種発現によって大量に産生することができ、かつ容易に精製することができる。
本明細書で使用される「キメラVLP」という語は、少なくとも2つの異なる感染病原体由来のタンパク質(異種タンパク質)又はその一部分を含むVLPを指す。通常は、このタンパク質の1つは、宿主細胞からのVLPの形成を駆動することができるウイルスに由来する。例示を目的とする例として、BRSV Mタンパク質及び/又はHRSV GもしくはFタンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される「ワクチン」という語は、ウイルスに対する保護免疫応答を誘導するために使用される1つ以上のウイルス抗原を含む組成物を指す。
組成物
本明細書に開示される混合組成物は、RSV及び複数のインフルエンザウイルスに対して強い免疫応答を示す。複数の病原体に対して応答を示すことは、多くの点で有利である。例えば、これにより、予防接種の一部としてワクチンの投与に関連したコストが低減され、患者コンプライアンスが、複数の免疫化が1回の注射によって達成されるため改善される。
本明細書に開示される混合組成物は、RSV及び複数のインフルエンザウイルスに対して強い免疫応答を示す。複数の病原体に対して応答を示すことは、多くの点で有利である。例えば、これにより、予防接種の一部としてワクチンの投与に関連したコストが低減され、患者コンプライアンスが、複数の免疫化が1回の注射によって達成されるため改善される。
本明細書に記載される組成物は、RSV成分及び1つ以上のインフルエンザ成分を含む。RSV成分は、RSVに対する免疫応答を誘導する。インフルエンザ成分は、インフルエンザ株に対する応答を誘導する。
RSV F成分
本開示の一態様では、RSV F成分はRSV Fタンパク質を含む。適切なRSV Fタンパク質及びその産生方法が米国特許出願第13/269,107号に記載されている。
本開示の一態様では、RSV F成分はRSV Fタンパク質を含む。適切なRSV Fタンパク質及びその産生方法が米国特許出願第13/269,107号に記載されている。
RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(例えば、配列番号2に例示;Genbankアクセッション番号AAB59858)と比較して修飾された又は変異したアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)のP102位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)のI379位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)のM447位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。一実施形態では、RSV Fタンパク質は、上記の位置に対応するアミノ酸に2つ以上の修飾又は変異を含む。別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、上記の位置に対応するアミノ酸に3つの修飾又は変異を含む。
一実施形態では、102位のプロリンはアラニンで置換されている。別の実施形態では、379位のイソロイシンはバリンで置換されている。なお別の実施形態では、447位のメチオニンはバリンで置換されている。特定の実施形態では、RSV Fタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に2つ以上の修飾又は変異を含む。特定の他の実施形態では、RSV Fタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に3つの修飾又は変異を含む。例示的な一実施形態では、RSVタンパク質は、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、RSV Fタンパク質のコード配列は、適切な宿主細胞でのその発現を促進するようにさらに最適化される。一実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。例示的な一実施形態では、昆虫細胞はSf9細胞である。
一実施形態では、コドン最適化RSV F遺伝子のコード配列は配列番号3である。別の実施形態では、コドン最適化RSV Fタンパク質は、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、RSV Fタンパク質は、F2の潜在ポリ(A)部位に少なくとも1つの修飾をさらに含む。別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、一次切断部位(CS)に1つ以上のアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)又はコドン最適化RSV Fタンパク質(配列番号4)のR133位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)又はコドン最適化RSV Fタンパク質(配列番号4)のR135位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。なお別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)又はコドン最適化RSV Fタンパク質(配列番号4)のR136位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。
一実施形態では、133位のアルギニンはグルタミンで置換されている。別の実施形態では、135位のアルギニンはグルタミンで置換されている。なお別の実施形態では、136位のアルギニンはグルタミンで置換されている。特定の実施形態では、RSV Fタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に2つ、3つ又はそれを超える数の修飾又は変異を含む。例示的な一実施形態では、RSVタンパク質は、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、RSV Fタンパク質は、配列番号2、配列番号4、及び配列番号6のアミノ酸137〜146位に対応する融合ドメインのN末端半分に欠失をさらに含む。例示的な一実施形態では、RSV Fタンパク質は、配列番号8で示されるアミノ酸配列を有する。代替の一実施形態では、RSV Fタンパク質は、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する。
RSV Fタンパク質は、株A及び株Bを含む様々なヒト株、並びに限定されるものではないが、ウシ又はトリRSV株を含む非ヒト株に由来し得る。
RSV Fタンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)であり得る。一部の実施形態では、VLPは、1つ以上の別のタンパク質をさらに含む。RSV F成分は、さらなるタンパク質を含み得る。例えば、一実施形態では、VLPは、マトリクス(M)タンパク質をさらに含む。一実施形態では、Mタンパク質はヒトRSV株に由来する。別の実施形態では、Mタンパク質はウシRSV株に由来する。他の実施形態では、マトリクスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のM1タンパク質であり得る。一実施形態では、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザウイルス株である。他の実施形態では、Mタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス(NDV)株に由来し得る。
さらなる実施形態では、VLPは、RSV糖タンパク質Gをさらに含む。別の実施形態では、VLPは、RSV糖タンパク質SHをさらに含む。なお別の実施形態では、VLPは、RSVヌクレオカプシドNタンパク質をさらに含む。
修飾又は変異RSV Fタンパク質は、RSV感染の予防及び/又は処置に使用することができる。従って、別の態様では、RSVに対する免疫応答を誘発する方法が開示される。この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含む組成物を免疫学的に有効な量、対象、例えば、ヒト又は動物対象に投与するステップを含む。
RSV Fタンパク質をコードする単離核酸配列も提供される。例示的な一実施形態では、修飾又は変異RSV Fタンパク質をコードする単離核酸は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、又は配列番号9からなる群から選択される。RSV Fに加えて、他のRSVタンパク質も含まれ得る。例えば、RSV成分は、1つ以上の追加のRSVタンパク質、例えば、M、N、G、及びSHをさらに含み得る。
インフルエンザ成分
本明細書で使用される「インフルエンザ成分」は、インフルエンザ株に対して応答を誘導することができる少なくとも1つの抗原を含む分子を意味する。一部の態様では、分子は、タンパク質又は糖タンパク質である。他の態様では、分子はインフルエンザVLPである。例えば、実施例1に記載される臨床試験では、投与される混合ワクチンは、3つのインフルエンザ成分を含み、各成分は、株A−Perth H3N2 S205、A−Cal H1N1、及びB-Wisconsinに由来するHA及びNAタンパク質を含むVLPであった。3つのVLPはそれぞれ、同じ株、A/Indonesia/5/05に由来するM1タンパク質を含んでいた。
本明細書で使用される「インフルエンザ成分」は、インフルエンザ株に対して応答を誘導することができる少なくとも1つの抗原を含む分子を意味する。一部の態様では、分子は、タンパク質又は糖タンパク質である。他の態様では、分子はインフルエンザVLPである。例えば、実施例1に記載される臨床試験では、投与される混合ワクチンは、3つのインフルエンザ成分を含み、各成分は、株A−Perth H3N2 S205、A−Cal H1N1、及びB-Wisconsinに由来するHA及びNAタンパク質を含むVLPであった。3つのVLPはそれぞれ、同じ株、A/Indonesia/5/05に由来するM1タンパク質を含んでいた。
適切なインフルエンザ成分を調製及び産生させるための組成物及び方法は、上記の参考文献に含まれる出願書類に記載されている。インフルエンザVLPは、インフルエンザマトリクス(M1)タンパク質、HAタンパク質、及びNAタンパク質の1つ以上を含み得る。一部の態様では、インフルエンザVLPは3つ全てのタンパク質を含む。追加のインフルエンザタンパク質も含まれ得る。インフルエンザM2はVLPに含まれ得る;しかしながら、好ましくは、少なくとも1つのインフルエンザVLPは、インフルエンザM2タンパク質を含まない。より好ましくは、どのインフルエンザVLPもM2タンパク質を含まない。
インフルエンザタンパク質は、任意の適切なインフルエンザ株から得ることができる。一部の態様では、インフルエンザタンパク質は全て、同じ株に由来し得る。他の態様では、各タンパク質は異なる株に由来する。なお他の態様では、M1タンパク質は1つの株に由来し、HA及びNAタンパク質は第2の株に由来し、この第2の株は、M1タンパク質インフルエンザ株とは異なる株である。なお他の態様では、M1タンパク質とNAタンパク質又はHAタンパク質の両方ではなくいずれかは、同じ株に由来する。一部の態様では、M1タンパク質は鳥類株に由来する。他の態様では、M1タンパク質は季節性株に由来する。
例示的な株には、限定されるものではないが、以下のHA又はNAタンパク質を有する株が含まれる。HAタンパク質は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択することができる。NAタンパク質は、Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、及びN9からなる群から選択することができる。特定の一態様では、HA及びNAタンパク質はそれぞれ、H5及びN1である。別の態様では、HA及びNAタンパク質はそれぞれ、H9及びN2である。なお別の態様では、HA及びNAタンパク質はそれぞれ、H7及びN9である。HAタンパク質は、赤血球凝集素活性を示し得る。NAタンパク質は、ノイラミニダーゼ活性を示し得る。
一部の態様では、四価インフルエンザ組成物を混合組成物に使用することができる。四価インフルエンザ組成物は、4つのインフルエンザVLP型を含み、各型は、異なるインフルエンザ株に由来するHAタンパク質及びNAタンパク質を含む。一部の態様では、VLPはそれぞれ、A/Indonesia/5/05インフルエンザ株に由来するM1タンパク質を含む。一部の態様では、HA及びNAタンパク質は、インフルエンザの感染を防止するのに有用なFDAによって識別される季節性インフルエンザ株に由来する。他の態様では、3つの季節性インフルエンザ株のみに適したVLPを含む三価組成物を使用することができる。
用量
開示される組成物は、有効用量となるように投与することができる。例えば、送達される各インフルエンザ成分の上限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。送達される各インフルエンザ成分の下限値は、約:0.5μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、又は15μgとすることができる。一部の態様では、インフルエンザ成分の用量は約1μg〜約3μgの範囲である。他の態様では、インフルエンザ成分の用量は約3μg〜約9μgの範囲である。送達されるRSV成分の上限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。送達されるRSV F成分の下限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。一部の態様では、RSV成分の用量は、約1〜約3μgの範囲である。他の態様では、RSV成分の用量は約3μg〜約9μgの範囲である。
開示される組成物は、有効用量となるように投与することができる。例えば、送達される各インフルエンザ成分の上限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。送達される各インフルエンザ成分の下限値は、約:0.5μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、又は15μgとすることができる。一部の態様では、インフルエンザ成分の用量は約1μg〜約3μgの範囲である。他の態様では、インフルエンザ成分の用量は約3μg〜約9μgの範囲である。送達されるRSV成分の上限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。送達されるRSV F成分の下限値は、約:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、又は20μgとすることができる。一部の態様では、RSV成分の用量は、約1〜約3μgの範囲である。他の態様では、RSV成分の用量は約3μg〜約9μgの範囲である。
他の態様では、各インフルエンザ成分は高量で存在し得る。例えば、上限値は約:50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、91μg、92μg、93μg、94μg、95μg、96μg、97μg、98μg、99μg、100μg、101μg、102μg、103μg、104μg、105μg、106μg、107μg、108μg、109μg、110μg、111μg、112μg、113μg、114μg、115μg、116μg、117μg、118μg、119μg、120μg、121μg、122μg、123μg、124μg、125μg、126μg、127μg、128μg、129μg、130μg、131μg、132μg、133μg、134μg、135μg、136μg、137μg、138μg、139μg、140μg、141μg、142μg、143μg、144μg、145μg、146μg、147μg、148μg、149μg、又は150μgとすることができる。各インフルエンザ成分の下限値は約:20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、26μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、又は60μgとすることができる。
他の実施形態では、例えば、ヒトへの投与では、送達されるRSV成分の上限値は約50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、91μg、92μg、93μg、94μg、95μg、96μg、97μg、98μg、99μg、100μg、101μg、102μg、103μg、104μg、105μg、106μg、107μg、108μg、109μg、110μg、111μg、112μg、113μg、114μg、115μg、116μg、117μg、118μg、119μg、120μg、121μg、122μg、123μg、124μg、125μg、126μg、127μg、128μg、129μg、130μg、131μg、132μg、133μg、134μg、135μg、136μg、137μg、138μg、139μg、140μg、141μg、142μg、143μg、144μg、145μg、146μg、147μg、148μg、149μg、又は150μgとすることができる。一部の実施形態では、例えば、ヒトへの投与では、送達されるRSV F成分の下限値は約:20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、26μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、又は60μgとすることができる。一部の態様では、RSV成分の用量は約40μg〜約120μgの範囲である。他の態様では、RSV成分の用量は約60μg〜約90μgの範囲である。
アジュバント
また当分野で周知であるように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強することができる。アジュバントは実験的に使用して、未知の抗原に対する全身の免疫の増加を促進することができる(例えば、米国特許第4,877,611号)。免疫プロトコルは、応答を刺激するためにアジュバントを何年も使用しており、従って、アジュバントは当業者に周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿されるときに増加する。また、抗原の乳化が抗原提示の期間を長くする。あらゆる目的のために参照によりその全開示内容が本明細書で援用されるVogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第2版)“に記載されている任意のアジュバントを含むことは、本開示の範囲内で想定される。
また当分野で周知であるように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強することができる。アジュバントは実験的に使用して、未知の抗原に対する全身の免疫の増加を促進することができる(例えば、米国特許第4,877,611号)。免疫プロトコルは、応答を刺激するためにアジュバントを何年も使用しており、従って、アジュバントは当業者に周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿されるときに増加する。また、抗原の乳化が抗原提示の期間を長くする。あらゆる目的のために参照によりその全開示内容が本明細書で援用されるVogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第2版)“に記載されている任意のアジュバントを含むことは、本開示の範囲内で想定される。
本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容され得るアジュバントと組み合わせることができる。薬学的に許容され得るアジュバントとしては、限定されるものではないが、特に、アルミニウムベースのアジュバント、無機塩アジュバント、張力活性アジュバント(tensoactive advjuvant)、細菌由来アジュバント、エマルションアジュバント、リポソームアジュバント、サイトカインアジュバント、糖アジュバント、並びにDNA及びRNAオリゴアジュバントが挙げられる(Petrovsky and Aguilar 2004, immunology and Cell biology 82,488-496を参照されたい)。
例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント(死結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含む免疫応答の非特異的な刺激因子)及び不完全フロイントアジュバントが挙げられる。他のアジュバントとしては、GMCSP、BCG、MDP化合物、例えば、thur−MDP及びnor−MDP、CGP(MTP−PE)、リピドA、及びモノホスフォリルリピドA(MPL)、MF−59、細菌から抽出された3つの成分を含むRIBI、MPL、トレハロースジミコール酸(TDM)、2%スクアレン/Tween(登録商標)80エマルション中の細胞壁骨格(CWS)、AS01、AS03(スクアレン/トコフェロールエマルション)、AS04、AF3(スクアレン水中油滴型エマルション)、グルコピラノシルリピドアジュバント−安定エマルション(GLA−SE)、CoVaccine、Flagellin、及びIC31(dI:dC−TLR9 ago)が挙げられる。
一部の実施形態では、アルミニウムベースのアジュバント(Alum)は、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムとすることができる。特定の態様では、2%アルハイドロゲル(Al(OH)3が使用される。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの上限値は、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、1100μg、1200μg、1300μg、1400μg、1500μg、1600μg、1700μg、1800μg、1900μg、2000μgである。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの下限値は、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μgである。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの量は、約200μg〜約800μgの範囲である。
好ましいアジュバントには、サポニンベースのアジュバント、特に、ISCOM形式又はマトリクス形式の特定のサポニン画分の組み合わせが含まれる。ISCOM形式では、抗原は、アジュバントケージ様構造に含められる。マトリクス形式では、まずアジュバントを用意し、次いで本明細書に記載される抗原組成物に結合して所望の製剤にする。特に適したマトリクスアジュバントには、Matrix-M(商標)(AbISCO(登録商標)-100, Isconova AB, Uppsala, Sweden)、約85:15の比のMatrix-A(商標)とMatrix-C(商標)の混合物が含まれる。簡単に述べると、Matrix-A(商標)及びMatrix-C(商標)は、キラヤ(Quillaja saponaria)の別個に精製された画分から調製し、続いてコレステロール及びリン脂質で製剤してマトリクス粒子にし、次いで抗原と混合する。Reimer et al, “Matrix-M(商標) Adjuvant Induces Local Recruitment, Activation and Maturation of Central Immune Cells in Absence of Antigen,”PLoS ONE 7(7): e41451. doi: 10.1371/journal.pone.0041451を参照されたい;また米国特許出願公開第2006/0121065号も参照されたい。これらの画分の他の比も使用することができる;例えば、マトリクスアジュバント組成物におけるMatrix-AとMatrix-Cの比は、約86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、又は96:4とすることができる。典型的には、この範囲は、約85〜95のMatrix Aと約15〜5のMatrix Cである。一部の態様では、サポニン画分QS−7及びQS−21は、Matrix A画分及びMatrix C画分の代わりに使用することができる。例示的なQS−7及びQS−21画分及びそれらの使用は、米国特許第5,057,540号、同第6,231,859号、同第6,352,697号、同第6,524,584号、同第6,846,489号、同第7,776,343号、及び同第8,173,141号に記載されている。
本開示の一実施形態では、アジュバントは、脂質二重層のない大きい非晶質中心キャビティを取り囲む水層によって離間された実質的に球形のシェルの形態に配置された約2〜10の二重層を有する少重膜(paucilamellar)脂質小胞である。少重膜脂質小胞は、いくつかの方法、即ち、非特異的免疫刺激因子として、抗原の担体として、追加のアジュバントの担体として、及びこれらの組み合わせで免疫応答を刺激するように機能し得る。少重膜脂質小胞は、例えば、ワクチンが、抗原が小胞に対して細胞外部に維持されるように抗原が予め形成された小胞との混合によって調製されると、非特異的刺激因子として機能する。小胞の中心キャビティ内に抗原を封入することにより、小胞が、免疫刺激因子及び抗原の担体の両方として機能する。別の実施形態では、小胞は、主に非リン脂質小胞から形成される。他の実施形態では、小胞はNovasome(登録商標)である。Novasome(登録商標)は、約100nm〜約500nmの範囲の少重膜非リン脂質小胞である。Novasome(登録商標)は、Brij 72、コレステロール、オレイン酸、及びスクアレンを含む。Novasomeは、インフルエンザ抗原の有効なアジュバントであることが示されている(あらゆる目的のために参照によりそれらの全開示内容が本明細書で援用される米国特許第5,629,021号、同第6,387,373号、及び同第4,911,928号を参照されたい)。
免疫刺激因子
本開示の組成物は、「免疫刺激因子」を用いて製剤化することもできる。これらの免疫刺激因子は、免疫系の応答を増強する体自体の化学メッセンジャー(サイトカイン)である。免疫刺激因子としては、限定されるものではないが、免疫刺激性、免疫増強性、及び炎症誘導活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、及びケモカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);成長因子(例えば、顆粒球−マクロファージ(GM)−コロニー刺激因子(CSF);及び他の免疫刺激性分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2などが挙げられる。この免疫刺激性分子は、本開示の組成物と同じ製剤で投与しても良いし、又は別個に投与しても良い。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫刺激効果を発生させるために投与することができる。従って、一実施形態では、本開示は、アジュバント及び/又は免疫刺激因子を含む抗原性製剤及びワクチン製剤を含む。
本開示の組成物は、「免疫刺激因子」を用いて製剤化することもできる。これらの免疫刺激因子は、免疫系の応答を増強する体自体の化学メッセンジャー(サイトカイン)である。免疫刺激因子としては、限定されるものではないが、免疫刺激性、免疫増強性、及び炎症誘導活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、及びケモカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);成長因子(例えば、顆粒球−マクロファージ(GM)−コロニー刺激因子(CSF);及び他の免疫刺激性分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2などが挙げられる。この免疫刺激性分子は、本開示の組成物と同じ製剤で投与しても良いし、又は別個に投与しても良い。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫刺激効果を発生させるために投与することができる。従って、一実施形態では、本開示は、アジュバント及び/又は免疫刺激因子を含む抗原性製剤及びワクチン製剤を含む。
免疫応答
組成物に加えて、本開示は、RSV及び複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書に開示される組成物は、脊椎動物(例えば、ヒト)に投与されると、この脊椎動物に実質的な免疫を誘導することができる。従って、一実施形態では、本開示は、対象におけるRSVウイルス感染及びインフルエンザ感染、又は各疾患の少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫を誘導する方法を提供し、この方法は、少なくとも1つの有効用量のRSV成分及びインフルエンザ成分を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、哺乳動物にRSVのワクチン接種をする方法を提供し、この方法は、防御誘導量の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV VLPを1つ以上のインフルエンザVLP及び/又は1つ以上の単離インフルエンザタンパク質と組み合わせて哺乳動物に投与するステップを含む。
組成物に加えて、本開示は、RSV及び複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書に開示される組成物は、脊椎動物(例えば、ヒト)に投与されると、この脊椎動物に実質的な免疫を誘導することができる。従って、一実施形態では、本開示は、対象におけるRSVウイルス感染及びインフルエンザ感染、又は各疾患の少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫を誘導する方法を提供し、この方法は、少なくとも1つの有効用量のRSV成分及びインフルエンザ成分を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、哺乳動物にRSVのワクチン接種をする方法を提供し、この方法は、防御誘導量の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV VLPを1つ以上のインフルエンザVLP及び/又は1つ以上の単離インフルエンザタンパク質と組み合わせて哺乳動物に投与するステップを含む。
一部の態様では、免疫応答は中和抗体を含む。中和抗体の力価は、約:80、90、100、125、150、175、200、225、又は250の上限値を有し得る。中和抗体の力価は、約:70、80、90、100、125、150、175、200、又は225の下限値を有し得る。一部の態様では、力価の範囲は、約80〜約250、約100〜約200、又は約150〜約225である。中和抗体の力価は、ELISAアッセイによって測定することができる。
複数の抗原が投与されると、1つ以上に対する免疫応答が低下し得る。この現象は、抗原干渉と呼ばれる。好ましくは、本明細書で開示される組成物は、各抗原が別個に投与されるときに得られる免疫応答とそれほど異ならない免疫応答を誘導する。従って、好ましい態様では、本組成物は、抗原干渉を誘導しない。他の態様では、各抗原に対する混合組成物の免疫応答は、各抗原のみを用いて得られる免疫応答の少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%である。
有利には、本明細書に開示される混合組成物は、RSV成分のみの投与と比較して、RSVに対する免疫応答の性質を強化することができる。例えば、免疫応答は、抗IgG応答、抗RSV応答の中和、及びパリビズマブ−競合抗体応答を含み得る。一部の態様では、抗IgG応答は、約1.1倍、1.4倍、約1.6倍、約1.8倍、約2.0倍、約2.2倍、約2.4倍、約2.6倍、約2.8倍、約3.0倍、約3.2倍、約3.4倍、約3.6倍、約3.8倍、約4.0倍、約4.5倍、又は約5倍増強される。特定の態様では、抗RSV IgG応答における増加倍数は、約2.0〜約3.0である。他の態様では、抗RSV IgG応答における増加倍数は、約1.4〜約2.8である。一部の態様では、増強された応答を投与後21日間測定する;他の態様では、増強された応答を投与後35日間測定する。
中和抗RSV応答はまた、RSV成分のみの投与と比較して増強され得る。一部の態様では、中和抗RSV応答は、約1.1倍、1.4倍、約1.6倍、約1.8倍、約2.0倍、約2.2倍、約2.4倍、約2.6倍、約2.8倍、約3.0倍、約3.2倍、約3.4倍、約3.6倍、約3.8倍、約4.0倍、約4.5倍、又は約5倍増強される。特定の態様では、中和抗RSV応答における増加倍数は、1.1〜約2.0である。他の態様では、中和抗RSV応答における増加倍数は、約2.3〜約2.8である。一部の態様では、増強された応答を投与後21日間測定する;他の態様では、増強された応答を投与後35日間測定する。
パリビズマブ−競合抗体応答はまた、RSV成分のみの投与と比較して増強され得る。一部の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答は、約2.0倍、約2.2倍、約2.4倍、約2.6倍、約2.8倍、約3.0倍、約3.2倍、約3.4倍、約3.6倍、約3.8倍、約4.0倍、約4.5倍、又は約5.0倍増強される。特定の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答における増加倍数は、約2.0〜約3.0である。他の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答における増加倍数は、約2.3〜約2.8である。一部の態様では、増強された応答を投与後21日間測定する;他の態様では、増強された応答を投与後35日間測定する。
タンパク質及び変異体の同定及びクローニング
本開示はまた、VLP上又はVLP内で発現されるタンパク質の変異体も包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の改変を含み得る。タンパク質に対する「変異体」という語は、基準配列に対して1つ以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されるアミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換を有し得る。あるいは、変異体は、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の小さな変化は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、又はその両方も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を失わずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかの決定のガイダンスを、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、DNASTARソフトウェアを用いて確認することができる。
本開示はまた、VLP上又はVLP内で発現されるタンパク質の変異体も包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の改変を含み得る。タンパク質に対する「変異体」という語は、基準配列に対して1つ以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されるアミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換を有し得る。あるいは、変異体は、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の小さな変化は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、又はその両方も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を失わずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかの決定のガイダンスを、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、DNASTARソフトウェアを用いて確認することができる。
天然の変異体が、タンパク質の変異によって起こり得る。このような変異は、感染性病原体、例えば、インフルエンザの個々の群内での抗原変異性をもたらし得る。従って、例えば、インフルエンザ株に感染した人は、そのウイルスに対する抗体を産生し、新たなウイルス株が出現すると、古い株に対する抗体は、もはや新たなウイルスを認識できず、再感染が起こり得る。本開示は、VLPを作製するための、感染性病原体からのタンパク質の抗原変異性及び遺伝変異性の全てを包含する。
本開示に適用可能な分子生物学的技術、例えば、クローニング、変異、及び細胞培養などを記載する一般的なテキストには、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al. Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (第3版), Vol. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook”) and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al.編, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. とJohn Wiley & Sons, Inc.,とによるジョイントベンチャー(“Ausubel”)が含まれる。これらのテキストには、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、並びに、例えば、RSVのF及び/又はG分子のクローニング及び変異などに関連した多数の他の適切なトピックが記載されている。従って、本開示は、本開示のVLP上又はVLP内で発現されるタンパク質の特性を改善又は改変する、タンパク質操作の既知の方法及び組換えDNA技術の使用も包含する。様々なタイプの変異誘発を使用して、タンパク質分子をコードする変異核酸を作製及び/又は単離し、かつ/又は本開示のVLP内又はVLP上のタンパク質をさらに修飾/変異させることができる。これらの変異誘発としては、限定されるものではないが、部位特異的なランダム点変異誘発、相同組換え(DNAシャフリング)、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発、ギャップドデュプレックスDNAを使用する変異誘発などが挙げられる。さらなる適切な方法として、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物に関わる変異誘発もまた、本開示に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、天然に存在する分子、又は改変されたもしくは変異した天然に存在する分子の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、又は結晶構造などによって誘導することができる。
本開示は、実質的な生物活性を示す、例えば、本開示のVLP上又はVLP内で発現すると有効な抗体応答を誘発することができるタンパク質変異体をさらに含む。このような変異体は、活性に対して殆ど影響を有しないように、当分野で公知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復、及び置換を含む。
タンパク質をクローニングする方法は、当分野で公知である。例えば、特定のRSVタンパク質をコードする遺伝子は、RSVウイルスに感染させた細胞から抽出されたポリアデニル化mRNAからRT−PCRによって単離することができる。得られる産物遺伝子は、DNAインサートとしてベクターにクローニングすることができる。「ベクター」という語は、核酸を増殖させ、かつ/又は生物、細胞、もしくは細胞成分間で移動することができる手段を指す。ベクターには、自己複製する又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、及び人工染色体などが含まれる。ベクターはまた、自己複製しない裸RNAポリヌクレオチド、裸DNAポリヌクレオチド、同じ株内のDNAとRNAとの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リジン結合DNAもしくはRNA、ペプチド結合DNAもしくはRNA、又はリポソーム結合DNAなどとすることができる。全てではないが、多くの共通する実施形態では、本開示のベクターはプラスミド又はバクミドである。
従って、本開示は、本開示のVLPの形成を誘導する細胞内で発現させることができる発現ベクターにクローニングされた、キメラ分子を含むタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、発現を促進することができ、かつそこに組み込まれた核酸の複製を促進することができるプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現される核酸は、プロモーター及び/又はエンハンサーに「作動可能に連結」されており、かつプロモーター及び/又はエンハンサーによる転写調節制御を受ける。一実施形態では、ヌクレオチドは、修飾又は変異RSV Fタンパク質(上記のように)をコードする。別の実施形態では、ベクターは、M及び/又はG RSVタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、M及び/又はN RSVタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、M、G及び/又はN RSVタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、BRSV Mタンパク質及び/又はN RSVタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、BRSV M及び/又はGタンパク質、又はインフルエンザHA及び/又はNAタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ヌクレオチドは、インフルエンザHA及び/又はNAタンパク質と共に、修飾又は変異RSV F及び/又はRSV Gタンパク質をコードする。別の実施形態では、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。
加えて、ヌクレオチドを配列決定して、正しいコード領域がクローニングされ、かつ不所望の変異を一切含まないことを確認することができる。ヌクレオチドは、任意の細胞で発現させるために発現ベクター(例えばバキュロウイルス)にサブクローニングすることができる。上記は、どのようにしてRSVウイルスタンパク質をクローニングできるかの一例に過ぎない。当業者であれば、さらなる方法が利用可能であり、かつ実施可能であることを理解されよう。
本開示はまた、F、M、G、N、SH、もしくはその一部分、及び/又は上記の任意のキメラ分子を含むRSV構造遺伝子をコードするRSVヌクレオチドを含む構築物及び/又はベクターも提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターとすることができる。F、M、G、N、SH、もしくはその一部分、及び/又は上記の任意のキメラ分子を含むRSV構造遺伝子を含む構築物及び/又はベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきであり、例えば、AcMNPVポリヘドリンプロモーター(又は他のバキュロウイルス)、ファージλPLプロモーター、大腸菌(E. coli)lac、phoA、及びtacプロモーター、SV40初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスLTRのプロモーターなどが非限定の例である。宿主細胞及び/又は所望の発現速度に応じて決まる他の適切なプロモーターは、当業者に公知であろう。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び転写領域中の翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始端に翻訳開始コドン、及び終端に適切に配置された終止コドンを含む。
発現ベクターは、好ましくは少なくとも1つの選択可能なマーカーを含む。このようなマーカーには、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、G418、又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌(E. coli)及び他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン、又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ベクターのなかで好ましいのは、ウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鷄痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、豚痘ウイルスなど)、アデノウイルス(例えば、イヌアデノウイルス)、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスなどである。本開示で使用できる他のベクターは、細菌に使用されるベクターを含み、このようなベクターは、pQE70、pQE60、及びpQE-9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、pFastBac1 pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、及びpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVLがある。他の適切なベクターは当業者に容易に明らかであろう。一実施形態では、修飾又は変異RSV F遺伝子、及びM、G、N、SH、もしくはその一部分、及び/又は上記の任意のキメラ分子の遺伝子を含むRSV遺伝子をコードするヌクレオチドを含むベクターはpFastBacである。
上述の組換え構築物を使用して、修飾又は変異RSV Fタンパク質及び少なくとも1つの免疫原を含む、RSVタンパク質をトランスフェクトし、感染させ、又は形質転換させて、これを発現させることができる。一実施形態では、組換え構築物は、真核細胞及び/又は原核細胞中に入る、修飾又は変異RSV F、M、G、N、SH、もしくはその一部分、及び/又は上記の任意の分子を含む。従って、本開示は、修飾又は変異RSV F;及び少なくとも1つの免疫原、例えば、限定されるものではないが、RSV G、N、及びSH、又はその一部分、及び/又は上記に記載の任意の分子を含むRSV構造遺伝子をコードする核酸を含む1つのベクター(又は複数のベクター)を含む宿主細胞を提供し、このベクターは、VLPの形成を可能にする条件下で宿主細胞において、RSV F、G、N、M、もしくはSHもしくはその一部分、及び/又は上記の任意の分子を含む遺伝子の発現を可能にする。
真核宿主細胞の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、C.エレガンス(C. elegans)(又は線虫)、及び哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定の例は、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf)細胞、例えば、Sf9、Sf21、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)細胞、例えば、High Five細胞、及びショウジョウバエ属(Drosophila)S2細胞である。真菌(酵母を含む)宿主細胞の例としては、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)(K.ラクチス(K. lactis))、C.アルビカンス(C. albicans)及びC.グラブラタ(C. glabrata)を含むカンジダ属(Candida)の種、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(S.ポンベ(S. pombe))、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、及びヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)が挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、COS細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、及びアフリカミドリザル細胞、CV1細胞、ヒーラー細胞、MDCK細胞、ベロ、及びHep−2細胞が挙げられる。アフリカツメガエル卵母細胞、又は両生類起源の他の細胞も使用することができる。原核宿主細胞の例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌(E. coli)、B.スブチリス(B. subtilis)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、及びマイコバクテリアが挙げられる。
ベクター、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当分野において周知の方法に従って宿主細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによって行うことができる。一実施形態では、ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、組換えバキュロウイルスは真核細胞にトランスフェクトされる。好ましい一実施形態では、細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、昆虫細胞はSf9細胞である。
本開示はまた、VLP産生の効率を高める構築物及び方法も提供する。例えば、タンパク質にリーダー配列を付加して、細胞内でのタンパク質輸送の効率を改善することができる。例えば、異種シグナル配列、例えば、昆虫細胞遺伝子に由来するシグナル配列を、タンパク質と融合させることができる。一実施形態では、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、この配列は、バキュロウイルス発現系で効率的に機能する。
VLP産生の効率を高める別の方法は、RSVタンパク質をコードするヌクレオチドをコドン最適化することである。Sf9細胞における発現についてのコドン最適化核酸の例については、配列番号3、5、7、9、13、17、19、及び25を参照されたい。
本開示はまた、VLPを産生する方法も提供する。一部の態様では、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質、及び、限定されるものではないが、RSV M、G、N、SH、又はその一部分を含む少なくとも1つのさらなるタンパク質、及び/又は上記の任意のキメラ又は異種分子を含むRSV遺伝子を、VLPの形成を可能にする条件下で発現させるステップを含む。他の態様では、インフルエンザVLPを産生させる方法が提供される。インフルエンザVLPに関するさらなる開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書で援用される米国特許出願公開第2005/0009008号、同第2010/0129401号、及び同第2010/0184192号に記載されている。選択される発現系及び宿主細胞によって、VLPは、組換えタンパク質が発現してVLPが形成される条件下で発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることによって産生される。一実施形態では、本開示は、VLPを産生する方法を含み、この方法は、少なくとも1つの修飾又は変異RSV Fタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、及びVLPの形成を可能にする条件下で修飾又は変異RSV Fタンパク質を発現させるステップを含む。別の実施形態では、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、又は哺乳動物細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、当分野の技術又は当業者の範囲内である。
本開示のVLPを産生するように操作された細胞を成長させる方法には、限定されるものではないが、バッチ、フェドバッチ、連続及び灌流細胞培養技術が含まれる。細胞培養とは、細胞が増殖し、かつ精製及び単離されるタンパク質(例えば、組換えタンパク質)を発現するバイオリアクター(発酵チャンバ)内での細胞の成長及び増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクターにおいて、無菌、制御された温度及び気圧条件下で実施される。バイオリアクターは、細胞を培養するために使用されるチャンバであり、環境条件、例えば、温度、気圧、撹拌、及び/又はpHを監視することができる。一実施形態では、バイオリアクターはステンレス鋼チャンバである。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ(例えば、Cellbag(登録商標)、Wave Biotech、Bridgewater、NJ)である。他の実施形態では、予め滅菌されたプラスチックバッグは、約50L〜1000Lのバッグである。
次いで、VLPは、勾配遠心分離、例えば、塩化セシウム、スクロース、及びイオジキサノール、並びに、例えば、イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術によって、その完全性を維持する方法を用いて単離される。
以下は、どのようにして本開示のVLPを作製し、単離し、そして精製することができるかの一例である。通常、VLPは、細胞が細胞培養(上記を参照)で成長するとVLPを産生するように操作された組換え細胞系から産生される。当業者であれば、本開示のVLPの作製及び精製に利用することのできるさらなる方法があり、従って本開示が記載される方法に限定されないことを理解されよう。
本開示のVLPの産生は、Sf9細胞(非感染)を振盪フラスコに播種し、次いで、細胞を増殖させて細胞が成長して増加したら規模を拡大する(例えば125mlフラスコから50Lのウェーブバッグにする)ことよって開始することができる。細胞を成長させるために使用される培地は、適切な細胞系に対して調製される(好ましくは無血清培地、例えば、昆虫培地ExCe11-420、JRH)。次に、細胞を、最も効率的な感染多重度(例えば、1細胞当たり約1〜約3プラーク形成単位)で組換えバキュロウイルスに感染させる。感染が起こると、修飾又は変異RSV Fタンパク質、M、G、N、SH、もしくはその一部分、及び/又は上記の任意のキメラもしくは異種分子がウイルスゲノムから発現され、VLP内で自己組織化し、そして感染の約24〜72時間後に細胞から分泌される。通常は、感染は、細胞が増殖の対数増殖期中期(4〜8×106細胞/ml)にあるとき最も効率的であり、少なくとも約90%が生存可能である。
本開示のVLPは、細胞培養培地中のVLPのレベルがほぼ最大になるが広範な細胞溶解が起きる前の感染の約48〜96時間後に回収することができる。回収時点でのSf9細胞の密度及び生存率は、色素排除アッセイによって示されるように、約0.5×106細胞/ml〜約1.5×106細胞/ml及び少なくとも20%の生存率であり得る。次に、培地を取り除き、清澄化する。VLPの凝集を回避するために、約0.4〜約1.0M、好ましくは約0.5Mの濃度までNaClを培地に添加することができる。本開示のVLPを含む細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、使い捨ての予め滅菌された中空糸0.5又は1.00μmフィルタカートリッジ又は同様のデバイスを用いたタンジェンシャルフローろ過(TFF)によって達成することができる。
次に、清澄培養培地中のVLPを、使い捨ての予め滅菌された、500,000分子量カットオフ中空糸カートリッジを用いた限外ろ過によって濃縮することができる。濃縮したVLPは、0.5MのNaClを含む10容量のpH7.0〜8.0のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で透析ろ過して、残留培地成分を除去することができる。
濃縮して透析ろ過したVLPを、0.5MのNaClを含むpH7.2のPBS緩衝液中、20%〜60%不連続スクロース勾配で、約4℃〜約10℃、6,500×gで18時間遠心分離することによってさらに精製することができる。通常は、VLPは、約30%スクロースと約40%スクロースの間、又は界面に(20%及び60%の段階的勾配において)特徴的な目に見えるバンドを形成し、これを勾配から回収して保存することができる。この生成物を、精製プロセスにおける次のステップの準備として200mMのNaClを含むように希釈することができる。この生成物は、VLPを含み、かつ無傷のバキュロウイルス粒子を含み得る。
VLPのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、又は44%等密度スクロースクッション遠心分離によって達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配(上記を参照)からのサンプルが、陰イオンを含む媒体が入ったカラム(例えば、Matrix Fractogel EMD TMAE)に充填され、VLPを他の混入物(例えば、バキュロウイルス及びDNA/RNA)と分離することができる塩勾配(約0.2M〜約1.0MのNaCl)によって溶出される。スクロースクッション法では、VLPを含むサンプルが、44%スクロースクッションに添加され、30,000gで約18時間遠心分離される。VLPは、44%スクロースの最上部にバンドを形成するが、バキュロウイルスは底に沈殿し、かつ他の夾雑タンパク質は最上部の0%スクロース層に留まる。VLPのピーク又はバンドは回収される。
必要に応じて、無傷のバキュロウイルスを不活化することができる。不活化は、化学的な方法、例えば、ホルマリン又はβ−プロピオラクトン(BPL)によって達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去及び/又は不活化もまた、上に例示されたように、当分野で公知の選択的沈殿及びクロマトグラフ法を用いることによって概ね達成することができる。不活化の方法は、VLPを含むサンプルを0.2%のBPL中、3時間、約25℃〜約27℃でインキュベートするステップを含む。バキュロウイルスはまた、VLPを含むサンプルを0.05%BPLで、4℃で3日間、次いで37℃で1時間インキュベートすることによって不活化することもできる。
不活化/除去ステップの後に、VLPを含む生成物を、別の透析ろ過ステップに通して不活化ステップの全ての試薬及び/又はあらゆる残留スクロースを除去して、VLPを所望の緩衝液(例えば、PBS)に入れることができる。VLPを含む溶液は、当分野で公知の方法によって滅菌(例えば、滅菌ろ過)し、冷蔵庫又は冷凍庫で保存することができる。
上記の技術は、様々な規模で実施することができる。例えば、T型フラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクターまでの規模である。バイオリアクターは、ステンレス鋼タンク又は予め滅菌されたプラスチックバッグ(例えば、Wave Biotech、Bridgewater、NJが販売するシステム)のいずれかを含み得る。当業者であれば、このような目的に何が最も望ましいかが分かるであろう。
バキュロウイルス発現ベクターの増幅及び産生、並びに組換えVLPを産生するための細胞の組換えバキュロウイルスでの感染は、既に記載されたように昆虫細胞、例えば、Sf9昆虫細胞で達成することができる。一実施形態では、細胞は、VLPを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したSF9である。
医薬製剤又はワクチン製剤及び投与
本明細書で有用な医薬組成物は、任意の適切な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」という語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、ヨーロッパ薬局方もしくは哺乳動物及びより詳細にはヒトでの使用が一般に認められている他の薬局方に掲載されていることを意味する。このような組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び/又は抗原組成物として有用であり得る。このような組成物は、RSV成分及び少なくとも1つのインフルエンザ成分を含む。
本明細書で有用な医薬組成物は、任意の適切な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」という語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、ヨーロッパ薬局方もしくは哺乳動物及びより詳細にはヒトでの使用が一般に認められている他の薬局方に掲載されていることを意味する。このような組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び/又は抗原組成物として有用であり得る。このような組成物は、RSV成分及び少なくとも1つのインフルエンザ成分を含む。
本開示は、少なくとも1つのインフルエンザ抗原と組み合わせられた、VLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このVLPは、RSV Fタンパク質、及び、限定されるものではないが、RSV M、G、N、SH、もしくはその一部分を含む少なくとも1つのさらなるタンパク質、及び/又は上記の任意のキメラ又は異種分子を含む。一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも1つのRSV Fタンパク質及び少なくとも1つのさらなる免疫原を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも1つのRSV Fタンパク質及び少なくとも1つのRSV Mタンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも1つのRSV Fタンパク質及び少なくとも1つのBRSV Mタンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも1つのRSV Fタンパク質及び少なくとも1つのインフルエンザM1タンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも1つの修飾又は変異RSV Fタンパク質及び少なくとも1つのトリインフルエンザVLPを含むVLPを含む。
別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV、BRSV、又はトリRSV Gタンパク質を含むRSV Gタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV、BRSV、又はトリRSV Nタンパク質を含むRSV Nタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV、BRSV、又はトリRSV SHタンパク質を含むRSV SHタンパク質をさらに含むVLPを含む。
別の実施形態では、本開示は、キメラVLP、例えば、BRSV M及び修飾又は変異RSV Fタンパク質及び/又はRSV由来のG、H、又はSHタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルス由来のHA又はNAタンパク質を含むVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このHA又はNAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
本開示はまた、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は上記の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物も包含する。
一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、修飾又は変異RSV Fタンパク質及び少なくとも1つのさらなるタンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、RSV Mタンパク質、限定されるものではないが、BRSV Mタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV Gタンパク質を含むRSV Gタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV、BRSV、又はトリRSV Nタンパク質を含むRSV Nタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、HRSV、BRSV、又はトリRSV SHタンパク質を含めたRSV SHタンパク質をさらに含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、BRSV Mタンパク質及びHRSV A群由来のF及び/又はGタンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、BRSV Mタンパク質及びHRSV B群由来のF及び/又はGタンパク質を含むVLPを含む。別の実施形態では、本開示は、キメラVLP、例えば、BRSV由来のキメラMタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHAタンパク質を含むVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このMタンパク質は、インフルエンザHAタンパク質に融合する。別の実施形態では、本開示は、キメラVLP、例えば、BRSV M、及びRSV由来のキメラF及び/又はGタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHAタンパク質を含むVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このキメラインフルエンザHAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、本開示は、キメラVLP、例えば、BRSV M、及びRSV由来のキメラF及び/又はGタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHA又はNAタンパク質を含むVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このHA又はNAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
本開示はまた、少なくとも1つのRSVタンパク質を含むキメラVLPを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物も包含する。一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、修飾又は変異RSV Fタンパク質、及び異種感染病原体又は異常細胞由来の少なくとも1つの免疫原を含むVLPを含む。別の実施形態では、異種感染病原体由来の免疫原はウイルスタンパク質である。別の実施形態では、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、VLPの表面上に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。
本開示はまた、少なくとも1つのRSVタンパク質を含むVLPを含む、脊椎動物、例えば、ヒト対象を免疫するためのキットでも包含する。一実施形態では、このキットは、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むVLPを含む。一実施形態では、このキットは、RSV Mタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、このキットは、RSV Gタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、本開示は、BRSV由来のキメラMタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHAタンパク質を含むVLPを含むキットを包含し、このMタンパク質はBRSV Mに融合する。別の実施形態では、本開示は、BRSV由来のキメラMタンパク質、RSV F及び/又はGタンパク質、及び異種感染病原体由来の免疫原を含むVLPを含むキットを包含する。別の実施形態では、本開示は、BRSV由来のMタンパク質、キメラRSV F及び/又はGタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHAタンパク質を含むVLPを含むキットを包含し、このHAタンパク質は、RSV F又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、本開示は、BRSV由来のMタンパク質、キメラRSV F及び/又はGタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHA又はNAタンパク質を含むVLPを含むキットを包含し、このHAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
一実施形態では、本開示は、修飾又は変異RSV Fタンパク質を少なくとも1つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態では、本開示は、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセルを少なくとも1つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。なお別の実施形態では、本開示は、上記の修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むVLPを少なくとも1つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容され得る担体又は賦形剤と組み合わせることができる。薬学的に許容され得る担体には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容され得る担体、希釈剤、及び他の賦形剤についての十分な考察が、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. N.J. 最新版)に示されている。製剤は、投与方式に適合させるべきである。好ましい一実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適し、好ましくは無菌、非粒子状、及び/又は非発熱性である。
組成物はまた、所望に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤も含み得る。組成物は、固形形態、例えば、もどすのに適した凍結乾燥粉末、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉末とすることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
本開示はまた、ワクチン製剤の1つ以上の成分で充填された1つ以上の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。好ましい一実施形態では、キットは、2つの容器を含み、一方の容器は、RSV成分として、ナノ粒子形態の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPを含み、他方の容器は、インフルエンザ成分、例えば、インフルエンザVLPを含む。各成分は、アジュバントを用いて製剤化しても良いし、又は異なる緩衝剤を用いて製剤化しても良い。このような容器(複数可)には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって指示される形式の注意書きを添えることができ、この注意書きは、ヒトへの投与に関する製造、使用、又は販売の機関による認可を反映している。
一部の態様では、本組成物は、別個の容器、例えば、バイアルで提供され、そして投与の直前に1つの容器で混合される。他の態様では、本組成物は、別個に調製され、混合され、そして使用するまで同じ容器に保存される。
本開示はまた、組成物の分量を表示する密閉容器、例えば、アンプル又はサシェ(sachette)にパッケージされた製剤も提供する。一実施形態では、本組成物は、液体として、別の実施形態では、密閉容器に入れられた乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば、水又は生理食塩水でもどして対象への投与に適切な濃度にすることができる。
代替の一実施形態では、本組成物は、その量及び濃度を表示する密閉容器に入れられた液体形態で供給される。好ましくは、本組成物の液体形態は、少なくとも約50μg/ml、より好ましくは少なくとも約100μg/ml、少なくとも約200μg/ml、少なくとも500μg/ml、又は少なくとも1mg/mlが密閉容器に入れられて供給される。
一例として、本開示の修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むキメラRSV VLPは、それぞれ1つ以上のRSV株に対する応答である免疫応答を刺激するのに十分な有効量又は有効数量(上で定義された)で投与される。本開示の修飾又は変異RSV Fタンパク質、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又はVLPの投与が、RSVに対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食習慣、投与時間、及び他の臨床因子に基づいてこの範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、針及びシリンジを用いた皮下又は筋肉内注射、又は無針注射デバイスによって全身投与される。あるいは、ワクチン製剤は、液滴、大粒子エアロゾル(約10ミクロンより大きい)、又は上気道への噴霧のいずれかによって鼻腔内投与される。上記の送達経路はいずれも免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、RSV及びインフルエンザを含む多くのウイルスの侵入部位における粘膜免疫を誘発するというさらなる利点をもたらす。
従って、本開示はまた、哺乳動物に対して、感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導するワクチン又は抗原組成物を製剤化する方法も含み、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPを有効用量、製剤に添加するステップを含む。一実施形態では、この感染はRSV感染である。
単回用量での免疫の刺激は可能であるが、同じ又は異なる経路によってさらなる用量を投与して所望の効果を達成することができる。例えば、新生児及び乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するためには複数回投与が必要であろう。投与を、必要に応じて小児期全体を通じて一定の間隔で継続して、感染、例えば、RSV感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、特に繰り返しやすい又は重篤感染しやすい成人、例えば、医療従事者、介護従事者、幼児の家族、高齢者、及び心肺機能が低下した人などは、防御免疫応答を確立し、かつ/又は維持するために複数回の免疫を必要とし得る。誘導される免疫のレベルは、例えば、分泌液中及び血清中の中和抗体の量を測定することによって監視し、かつ所望の防御レベルを誘発して維持するために必要に応じて用量を調整する又はワクチン接種を繰り返すことができる。
本組成物の投与
本明細書に開示される混合組成物を投与する方法には、限定されるものではないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、静脈内、及び皮下)、硬膜外、及び粘膜(例えば、鼻腔内及び経口もしくは経肺経路又は坐薬によって)が含まれる。投与は、好ましくは筋肉内投与である。本組成物は、任意の従来の経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜内層(例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、中咽頭、腟、尿道、膀胱、及び腸粘膜など)を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な物質と共に投与することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物の鼻腔内又は他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。投与は、全身投与でも良いし、又は局所的でも良い。
本明細書に開示される混合組成物を投与する方法には、限定されるものではないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、静脈内、及び皮下)、硬膜外、及び粘膜(例えば、鼻腔内及び経口もしくは経肺経路又は坐薬によって)が含まれる。投与は、好ましくは筋肉内投与である。本組成物は、任意の従来の経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜内層(例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、中咽頭、腟、尿道、膀胱、及び腸粘膜など)を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な物質と共に投与することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物の鼻腔内又は他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。投与は、全身投与でも良いし、又は局所的でも良い。
一部の実施形態では、RSV Fとインフルエンザ成分が混合された組成物を、同じ針で同時に投与(即ち、共投与)することができる。他の実施形態では、インフルエンザとRSV F成分を連続的に投与することができる(即ち、短い期間に亘る各成分の別々の投与による;例えば、これらの成分は、約1分おき、約2分おき、又は約5分おきに投与することができる。一部の実施形態では、投与は、間隔を丸一日開けることができる。一部の実施形態では、RSV及びインフルエンザ成分は、同じ領域に投与することができる。一部の実施形態では、RSV F及びインフルエンザ成分は、体の異なる部分に連続的に投与することができる;例えば、これらの成分を、両腕、腕と臀部、又は両側の尻に連続的に投与することができる。
なお別の実施形態では、ワクチン及び/又は免疫原性製剤は、免疫部位に免疫応答を誘発するために粘膜組織を標的とするような方式で投与される。例えば、特定の粘膜を標的とする特性を有するアジュバントを含む組成物を経口投与することによって、粘膜組織、例えば、消化管関連リンパ組織(GALT)を免疫化の標的とすることができる。さらなる粘膜組織、例えば、鼻咽頭リンパ組織(NALT)及び気管支関連リンパ組織(BALT)も標的化することができる。
本開示のワクチン及び/又は免疫原性製剤はまた、ある投与計画で投与することができ、例えば、ワクチン組成物の初回投与とそれに続く追加免疫投与が行われる。特定の実施形態では、この組成物の第2の用量は、初回投与から2週間から1年間まで、好ましくは約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月から約6ヶ月までの任意の時期に投与される。加えて、第3の用量を、第2の投与から約3ヶ月から約2年間又はそれ以降、好ましくは初回投与から約4ヶ月、約5ヶ月、又は約6ヶ月、又は約7ヶ月から約1年の間に投与することができる。第3の用量は、任意選択で、特定の免疫グロブリンが、第2の投与後に対象の血清及び/又は尿又は粘膜分泌物中で検出されない又は低レベルで検出される場合に投与することができる。好ましい一実施形態では、第2の用量は、第1の投与から約1ヶ月後に投与され、第3の用量は、第1の投与から約6ヶ月後に投与される。別の実施形態では、第2の用量は、第1の投与から約6ヶ月後に投与される。別の実施形態では、本開示の組成物は、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本開示の組成物は、他の免疫原性組成物、抗ウイルス薬、及び/又は抗生物質と共に製剤化することができる。
医薬組成物の投与量は、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定して、又は血清サンプル、もしくは尿サンプル、もしくは粘膜分泌物中の抗体の抑制率を測定して、例えば、最初に予防的又は治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を割り出すことによって、当業者が容易に決定することができる。投与量は、動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を調べるために使用される動物の非限定のリストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、及びコットンラットが含まれる。殆どの動物は、感染病原体の天然の宿主ではないが、疾患の様々な面の研究においてなお役立ち得る。例えば、上記のどの動物にも、ワクチン候補、例えば、本開示の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又はVLPを投与して、誘導された免疫応答を部分的に特徴付け、かつ/又は何らかの中和抗体が産生されたか否かを決定することができる。例えば、マウスはサイズが小さく、かつその費用の低さにより研究者が大規模で研究を行うことができるため、多くの研究がマウスモデルで行われている。
加えて、当業者がヒト臨床試験を実施して、ヒトに好ましい有効用量を決定することができる。このような臨床試験は、ルーチンであり、当分野で周知である。利用される正確な用量はまた、投与経路によって決まる。有効用量は、インビトロ又は動物試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。
一部の態様では、RSV及びインフルエンザ成分は、小児、青年、出産年齢の女性、及び高齢者に投与することができる。一部の実施形態では、高齢患者は、50歳、55歳、60歳、65歳、70歳、75歳、80歳、85歳、90歳、95歳、100歳、又は105歳であり得る。一部の実施形態では、高齢患者は、50歳〜100歳である。一部の実施形態では、高齢患者は、約65歳〜約85歳である。
免疫応答を刺激する方法
本開示の修飾又は変異RSV Fタンパク質、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、並びにRSV及びインフルエンザVLPは、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫及び細胞性免疫の両方が、感染病原体及び疾患に対する免疫に寄与し得る。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主な因子である。分泌性免疫グロブリンA(sIgA)が上気道の防御に関与し、かつ血清IgGが下気道の防御に関与する。感染によって誘導される免疫応答は、同じウイルス又は抗原的に類似したウイルス株による再感染を防御する。例えば、RSVは、頻繁かつ予測不可能な変化を受ける;従って、自然感染後、宿主の免疫によって提供される防御の有効期間は、社会全体に蔓延するウイルスの新株に対しては数年間のみ有効であり得る。
本開示の修飾又は変異RSV Fタンパク質、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、並びにRSV及びインフルエンザVLPは、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫及び細胞性免疫の両方が、感染病原体及び疾患に対する免疫に寄与し得る。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主な因子である。分泌性免疫グロブリンA(sIgA)が上気道の防御に関与し、かつ血清IgGが下気道の防御に関与する。感染によって誘導される免疫応答は、同じウイルス又は抗原的に類似したウイルス株による再感染を防御する。例えば、RSVは、頻繁かつ予測不可能な変化を受ける;従って、自然感染後、宿主の免疫によって提供される防御の有効期間は、社会全体に蔓延するウイルスの新株に対しては数年間のみ有効であり得る。
従って、本開示は、対象における感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を包含し、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質及び少なくとも1つのさらなるタンパク質を含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、RSV Mタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、RSV Nタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、RSV Gタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、RSV SHタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、HRSV A群及び/又はB群由来のF及び/又はGタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のMタンパク質及びキメラRSV F及び/又はGタンパク質又はMMTVエンベロープタンパク質、例えば、インフルエンザウイルスに由来するHA又はNAタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このHA及び/又はNAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質又はMMTVエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のMタンパク質及びキメラRSV F及び/又はGタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するHA又はNAタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このHA又はNAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、RSV VLPは、アジュバント又は免疫刺激因子と共に製剤化される。
一実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質の少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセルの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。なお別の実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、RSV VLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含み、このVLPは、修飾又は変異RSV Fタンパク質、M、G、SH、及び/又はNタンパク質を含む。別の実施形態では、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの症状に対する免疫を誘導する方法は、RSV VLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含み、このVLPは、BRSV M(キメラMを含む)並びにRSV F、G、及び/又はNタンパク質から本質的になる。VLPは、さらなるRSVタンパク質及び/又は無視できる濃度のタンパク質夾雑物を含み得る。別の実施形態では、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの症状に対する免疫を誘導する方法は、RSV VLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含み、このVLPは、BRSV M(キメラMを含む)、RSV G、及び/又はFからなる。別の実施形態では、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法は、RSVタンパク質を含むRSV VLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含み、このRSVタンパク質は、BRSV M(キメラMを含む)、キメラF、キメラG、及び/又はキメラNタンパク質を含むF、G、及び/又はNタンパク質からなる。これらのVLPは、BRSV M(キメラMを含む)、RSV F、G、及び/又はNタンパク質を含み、かつさらなる細胞構成要素、例えば、細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物などを含み得るが、(BRSV M(キメラMを含む)、BRSV/RSV F、G、及び/又はNタンパク質の断片以外の)さらなるRSVタンパク質は含まない。別の実施形態では、対象は脊椎動物である。一実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、この方法は、製剤を単回投与で投与することによりRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、製剤を複数回投与で投与することによりRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する免疫を誘導するステップを含む。
本開示はまた、感染病原体によって引き起こされる対象の感染又はその少なくとも1つの症状に対する免疫を誘導することを包含し、この誘導は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの少なくとも1つの有効用量を投与することを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質及び異種感染病原体由来の少なくとも1つのタンパク質を含むVLPを投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質及び同種又は異種の感染病原体由来の少なくとも1つのタンパク質を含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、異種感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、VLPの表面に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、RSV Mタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質、RSV F、G、及び/又はNタンパク質に結合し得る。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、RSVタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質、RSV F、G、及び/又はNタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、RSVタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質、RSV F、G、及び/又はNタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、RSVタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質、RSV F、G、及び/又はNタンパク質の一部に融合する。別の実施形態では、RSVタンパク質に融合した感染病原体由来のタンパク質の一部分が、VLPの表面に発現する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合したRSVタンパク質又はその一部分は、RSV Mタンパク質に結合する。他の実施形態では、RSVタンパク質又はその一部分は、RSV F、G、N、及び/又はPに由来する。別の実施形態では、キメラVLPは、RSV由来のN及び/又はPタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、キメラVLPは、同種及び/又は異種の感染病原体由来の2つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態では、キメラVLPは、2つ以上の感染病原体タンパク質を含み、従って多価VLPを形成する。
本開示の組成物は、脊椎動物(例えばヒト)に投与されるとこの脊椎動物に実質的な免疫を誘導することができる。実質的な免疫は、脊椎動物の感染を防御もしくは改善する、又はこの感染の症状を少なくとも軽減する本開示の組成物に対する免疫応答によって生じる。ある場合には、脊椎動物が感染しても、この感染は無症状である。この免疫応答は、完全な防御応答ではない場合もある。この場合、脊椎動物が感染病原体に感染すると、この脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比較して症状が軽い、又は症状の持続時間が短い。
一実施形態では、本開示は、対象におけるRSVウイルス感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する実質的な免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、哺乳動物にRSVに対するワクチン接種をする方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの防御誘導量を哺乳動物に投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、RSV Mタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、RSV Gタンパク質、例えば、HRSV Gタンパク質を含むVLPを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、HRSV A群由来のNタンパク質を含むVLPを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、HRSV B群由来のNタンパク質を含むVLPを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のキメラMタンパク質及びRSV由来のF及び/又はGタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このF及び/又はGタンパク質は、Mタンパク質の膜貫通及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のMタンパク質及びキメラRSV F及び/又はGタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このF及び/又はGタンパク質は、インフルエンザHA及び/又はNAタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のMタンパク質及びキメラRSV F及び/又はGタンパク質及び任意選択のインフルエンザHA及び/又はNAタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このF及び/又はGタンパク質は、HAタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、BRSV由来のMタンパク質及びキメラRSV F及び/又はGタンパク質、及び任意選択のインフルエンザHA及び/又はNAタンパク質を含むVLPを投与するステップを含み、このHA及び/又はNAタンパク質は、RSV F及び/又はGタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
本開示はまた、感染病原体によって引き起こされる対象における感染、又はその少なくとも1つの疾患症状に対する実質的な免疫を誘導する方法も包含し、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、RSV Mタンパク質、例えば、BRSV Mタンパク質、及び別の感染病原体由来の少なくとも1つのタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、BRSV Mタンパク質及び同種又は異種の感染病原体由来の少なくとも1つのタンパク質をさらに含むVLPを投与するステップを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、VLPの表面に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、RSV Mタンパク質に結合することができる。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、BRSV Mタンパク質に結合することができる。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、RSVタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、RSVタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、RSVタンパク質の一部分に融合する。別の実施形態では、RSVタンパク質に融合する感染病原体由来のタンパク質の一部分はVLPの表面に発現する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合するRSVタンパク質又はその一部分は、RSV Mタンパク質に結合する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合するRSVタンパク質又はその一部分は、BRSV Mタンパク質に結合する。他の実施形態では、RSVタンパク質又はその一部分は、RSV F、G、N、及び/又はPに由来する。別の実施形態では、VLPは、RSV由来のN及び/又はPタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、VLPは、感染病原体由来の2つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態では、VLPは2つ以上の感染病原体タンパク質を含み、従って多価VLPを形成する。
別の実施形態では、本開示は、対象における感染又はその少なくとも1つの症状に対する防御抗体応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、又は上記の修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLPの少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。
本明細書で使用される「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に又は部分的にコードされる1つ以上のポリペプチドを含むタンパク質のことである。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらがそれぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを規定する。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は四量体を含む。各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対が1つの「軽」鎖(約25kD)及び1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端が、主に抗原認識に関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって生成される多数の十分に特徴付けられた断片として存在する。
一実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染及びインフルエンザ感染又はそれぞれの疾患の少なくとも1つの症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質及びインフルエンザ成分の少なくとも1つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの疾患症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセルを少なくとも1つの有効用量投与するステップを含む。なお別の実施形態では、本開示は、対象におけるRSV感染又はその少なくとも1つの症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、VLPを少なくとも1つの有効用量の投与するステップを含み、このVLPは、上記の修飾又は変異RSV Fタンパク質を含む。細胞性免疫はまた、RSV感染からの回復において一定の役割を果たすことができ、かつRSVに関連した合併症を予防することができる。RSV特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物中で検出された。RSV感染細胞の細胞溶解は、RSV特異的抗体及び補体と協働してCTLにより媒介される。一次細胞傷害性応答は、感染した人又はワクチン接種された人において6〜14日後に血液中で検出可能であり、21日目には消失する(Ennis et al., 1981)。細胞性免疫はまた、RSV感染からの回復において一定の役割を果たすことができ、かつRSVに関連した合併症を予防することができる。RSV特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物において検出された。
上述のように、本開示の免疫原性組成物は、対象におけるRSV感染の少なくとも1つの症状を予防又は軽減する。RSVの症状は当分野で公知である。RSVの症状には、鼻漏、咽頭痛、頭痛、嗄声、咳、喀痰、発熱、ラ音、喘鳴音、及び呼吸困難が含まれる。従って、本開示の方法は、RSV感染に関連する少なくとも1つの症状の予防又は軽減を含む。症状の軽減は、例えば、対象による自己評価、臨床医の評価、又は適切なアッセイもしくは測定(例えば、体温)を行うことによって主観的又は客観的に決定することができ、この適切なアッセイもしくは測定には、例えば、生活の質の評価、RSV感染もしくはさらなる症状の進行の遅延、RSV症状の重症度の軽減、又は適切なアッセイ(例えば、抗体価及び/又はT細胞活性化アッセイ)が含まれる。客観的な評価には、動物の評価及びヒトの評価の両方が含まれる。
本開示は、限定として解釈されるべきではない以下の例によってさらに実証される。本明細書で言及された全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容並びに添付の図面及び配列表は、あらゆる目的のために参照により本明細書で援用される。
実施例1:マウスでの実験
6〜8週齢の80匹のBalb/cマウスに、表1に示されているプロトコルに従って候補ワクチンを注射した。
6〜8週齢の80匹のBalb/cマウスに、表1に示されているプロトコルに従って候補ワクチンを注射した。
緩衝液1「Flu緩衝液」は、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2、500mMの塩化ナトリウム、0.3mMのCaCl2、及び0.01%w/vPS80を含んでいた。緩衝液2「RSV緩衝液」は、25mMのリン酸塩、0.15MのNaCl、0.01%(W/V)PS80、(w/v)ヒスチジン、pH6.2を含んでいた。
3つのインフルエンザ成分を含む三価組成物を使用して抗インフルエンザ応答を刺激した。三価組成物は、次の株:A-Perth H3N2 S205 (Victoria)、A-Cal H1N1、及びB-Wisconsinの3つのVLPを含んでいた。各VLPは、言及した株に由来するHA及びNAタンパク質の両方を含む。3つ全ての株のM1タンパク質は、A/Indonesia/5/05に由来した。そのロットには、ロット番号75511013、75511008A、5511009が付されている。インフルエンザ成分は、0.25%BPL処置し、0.2μmフィルターでろ過し、一元放射免疫拡散法(SRID)で測定した。それぞれのHAレベルは:354、626、280μg HA/mlであった。この成分を、緩衝液:25mMのリン酸塩、pH7.2/0.5MのNaCl/0.01%PS−80/300μMのCaCl2に2〜8℃で保存した。RSV F成分(配列番号8;米国特許出願第13/269,107号に記載されているように調製され精製された;ロット番号683.15P)を緩衝液:25mMのリン酸ナトリウム、0.15MのNaCl、0.01%(W/V)PS−80、1%(W/V)ヒスチジンpH6.2で2〜8℃で保存した。
RSV成分及び三価インフルエンザ成分をそれぞれ、緩衝液1「Flu」緩衝液及び緩衝液2、「RSV」緩衝液に含めて投与した。緩衝液1は、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2、500mMの塩化ナトリウム、0.3mMのCaCl2、及び0.01%w/vPS80を含んでいた。緩衝液2「RSV緩衝液」は、25mMのリン酸塩、0.15MのNaCl、0.01%(W/V)PS80、(w/v)ヒスチジンpH6.2を含んでいた。0日目及び21日目にマウスに注射した。0日目、21日目、及び35日目にマウスから血液サンプルを採取した。表1の群1及び2では、RSV成分及び三価インフルエンザ成分を注射の前に混合した。
実施例2:RSV F抗体の特徴付け
実施例1に記載された混合組成物をマウスに投与した。図2は、ELISAアッセイによる測定で得られた抗RSV F応答を示している。0日目の力価は<100であった(不図示)。予想通り、flu成分のみでは、抗RSV F応答を誘導しなかった。RSV成分のみの投与は、ロバストな抗RSV F応答を誘導した。ロバストな応答が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で、35日目(D35)及び21日目(D21)の両方で得られた。35日目の力価の方が高かった。注目すべきことに、三価インフルエンザ成分がRSV成分と併用されると、高い抗RSV F応答が達成された。
実施例1に記載された混合組成物をマウスに投与した。図2は、ELISAアッセイによる測定で得られた抗RSV F応答を示している。0日目の力価は<100であった(不図示)。予想通り、flu成分のみでは、抗RSV F応答を誘導しなかった。RSV成分のみの投与は、ロバストな抗RSV F応答を誘導した。ロバストな応答が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で、35日目(D35)及び21日目(D21)の両方で得られた。35日目の力価の方が高かった。注目すべきことに、三価インフルエンザ成分がRSV成分と併用されると、高い抗RSV F応答が達成された。
同様のデータが、中和抗体の産生を決定するために免疫応答を評価したときに得られた。図3は、実施例1に記載された試験で得られた中和抗体を示している。中和抗体は、各サンプルについて35日目に測定した。0日目の血清サンプルの力価は<20であった(不図示)。中和抗RSV応答は、95〜226の範囲であった。
実施例3:RSV Fパリビズマブ−競合抗体の特徴付け
パリビズマブ(Synagis(商標))は、ヒトのRSVウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、RSV Fのエピトープ(配列番号35)に結合する。有利には、RSV成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図4は、混合組成物によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ELISAである。0日目の血清力価は<20であった(不図示)。21日目及び35日目の両方で、エピトープに対するロバストな応答が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で得られた。3つのflu成分及びRSV成分が同時投与されたときに同様の応答が得られた。
パリビズマブ(Synagis(商標))は、ヒトのRSVウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、RSV Fのエピトープ(配列番号35)に結合する。有利には、RSV成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図4は、混合組成物によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ELISAである。0日目の血清力価は<20であった(不図示)。21日目及び35日目の両方で、エピトープに対するロバストな応答が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で得られた。3つのflu成分及びRSV成分が同時投与されたときに同様の応答が得られた。
実施例4:抗インフルエンザ応答の特徴付け
マウスに、実施例1に記載されたワクチン組成物を投与した。赤血球凝集阻害アッセイを行って、各インフルエンザ成分の赤血球凝集阻害を決定した。図5〜図7が実証するように、実質的な阻害は3つ全ての株で達成された。図5は、A-California株の結果を示している。図6は、A/Victoria株の結果を示している。図7は、B/Wisconsin株の結果を示している。0日目の血清力価は<20であった(不図示)。35日目に、ロバストな赤血球凝集阻害力価が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で得られた。三価flu組成物(VLP形態の3つのインフルエンザ成分を含む)及びRSV成分を含む混合組成物が、三価flu組成物のみよりも優れた応答を誘導した。
マウスに、実施例1に記載されたワクチン組成物を投与した。赤血球凝集阻害アッセイを行って、各インフルエンザ成分の赤血球凝集阻害を決定した。図5〜図7が実証するように、実質的な阻害は3つ全ての株で達成された。図5は、A-California株の結果を示している。図6は、A/Victoria株の結果を示している。図7は、B/Wisconsin株の結果を示している。0日目の血清力価は<20であった(不図示)。35日目に、ロバストな赤血球凝集阻害力価が、3μg及び9μgの用量の緩衝液1及び緩衝液2で得られた。三価flu組成物(VLP形態の3つのインフルエンザ成分を含む)及びRSV成分を含む混合組成物が、三価flu組成物のみよりも優れた応答を誘導した。
実施例5:ヒトでの実験
高齢者集団において、インフルエンザ免疫原性組成物を用いたRSV F連続投与の臨床試験を行った。この試験では、220人のヒト対象に無作為に、1200μgのAlPO4アジュバントを含む又は含まない60又は90μgのRSV Fタンパク質;又はプラセボを単回投与した。また、全ての対象にインフルエンザワクチン(TIV)を投与して、使用中に行われる可能性の高い連続投与を模倣した。投与は、同じ対象の両方の腕へのRSV F及びTIV用量の別の筋肉注射によって連続投与で行った。プロトコル及び実験の文書は、適切に構成された施設内倫理委員会によって調査され承認された;全ての対象が書面で同意した。実験デザインを、無作為、年齢別、及び観察者盲検とした。アッセイの実施者には患者の処置が分からないようにした。実験的な処置の概要は以下から分かるであろう。
高齢者集団において、インフルエンザ免疫原性組成物を用いたRSV F連続投与の臨床試験を行った。この試験では、220人のヒト対象に無作為に、1200μgのAlPO4アジュバントを含む又は含まない60又は90μgのRSV Fタンパク質;又はプラセボを単回投与した。また、全ての対象にインフルエンザワクチン(TIV)を投与して、使用中に行われる可能性の高い連続投与を模倣した。投与は、同じ対象の両方の腕へのRSV F及びTIV用量の別の筋肉注射によって連続投与で行った。プロトコル及び実験の文書は、適切に構成された施設内倫理委員会によって調査され承認された;全ての対象が書面で同意した。実験デザインを、無作為、年齢別、及び観察者盲検とした。アッセイの実施者には患者の処置が分からないようにした。実験的な処置の概要は以下から分かるであろう。
赤血球凝集阻害アッセイを行って、各インフルエンザ成分の赤血球凝集阻害を決定した。インフルエンザ赤血球凝集阻害(HAI)アッセイを、確立された世界保健機関の方法に本質的に従ってNovavax社で実施した。免疫化後HAIセロコンバージョン及びGMTによって測定されたTIV応答は、RSV F連続投与による影響を全く受けなかった。
実施例6:ヒトでの実験におけるRSV F抗体の特徴付け
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F組成物及びTIV組成物を連続投与した。図8は、(Falsey AR, et al. Vaccine 2013;31:524)に記載されているプロトコルを用いたELISAアッセイによる測定で得られた抗RSV F応答を示している。予想通り、プラセボ処置のみでは、抗RSV F応答を誘導しなかった。RSV F成分の投与では、ロバストな抗RSV F応答が誘導された。血清抗F IgGのレベルは、3.1〜5.6倍に上昇し、90μg+Al処置を受けたときに最適な応答であった。ALアジュバント添加群での血清応答率は89〜92%であった。
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F組成物及びTIV組成物を連続投与した。図8は、(Falsey AR, et al. Vaccine 2013;31:524)に記載されているプロトコルを用いたELISAアッセイによる測定で得られた抗RSV F応答を示している。予想通り、プラセボ処置のみでは、抗RSV F応答を誘導しなかった。RSV F成分の投与では、ロバストな抗RSV F応答が誘導された。血清抗F IgGのレベルは、3.1〜5.6倍に上昇し、90μg+Al処置を受けたときに最適な応答であった。ALアジュバント添加群での血清応答率は89〜92%であった。
実施例7:ヒトでの実験におけるRSV Fパリビズマブ−競合抗体の特徴付け
パリビズマブ(Synagis(商標))は、ヒトのRSVウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、RSV Fのエピトープ(配列番号35)に結合する。有利には、RSV成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図9は、連続投与によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ELISAの結果を含む。28日目及び56日目に、エピトープに対するロバストな応答が、ミョウバンを用いる又は用いない60μg及び90μgの両方の処置で得られた。パリビズマブと競合する抗体は、実験的なRSV処置において0日目の検出不能から85〜185mg/mlに上昇した;応答率は、ミョウバンを用いないと74〜78%であり、アジュバントを用いると97.4%であった。
パリビズマブ(Synagis(商標))は、ヒトのRSVウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、RSV Fのエピトープ(配列番号35)に結合する。有利には、RSV成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図9は、連続投与によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ELISAの結果を含む。28日目及び56日目に、エピトープに対するロバストな応答が、ミョウバンを用いる又は用いない60μg及び90μgの両方の処置で得られた。パリビズマブと競合する抗体は、実験的なRSV処置において0日目の検出不能から85〜185mg/mlに上昇した;応答率は、ミョウバンを用いないと74〜78%であり、アジュバントを用いると97.4%であった。
実施例8:ヒトでの実験における抗原部位に対する抗体の特徴付け
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F及びTIV組成物を連続投与した。図10が実証するように、抗原部位IIに対する実質的な免疫原性応答は、全ての非プラセボ処置で達成された。抗原部位IIペプチドに応答するIgGの力価は、5.3〜12.5倍に上昇し、90μg+Al処置で最も高い力価であった。これらの結果は、組成物が、抗原干渉を受けない免疫応答を誘導することを実証している。
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F及びTIV組成物を連続投与した。図10が実証するように、抗原部位IIに対する実質的な免疫原性応答は、全ての非プラセボ処置で達成された。抗原部位IIペプチドに応答するIgGの力価は、5.3〜12.5倍に上昇し、90μg+Al処置で最も高い力価であった。これらの結果は、組成物が、抗原干渉を受けない免疫応答を誘導することを実証している。
実施例9:ヒトRSV F及びTIV実験の重要な安全性の結果
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F及びTIV組成物を連続投与した。安全性を、反応源性日誌(reactogenicity diaries)、安全性の実験室試験、健康の変化に関する自由回答形式の質問を用いて評価した。処置群の平均年齢は、67.7〜69.1歳であった;15%は≧75歳であった。対象の大部分は、白人であり、男性が全体の43%を占めた;対象の99%で56日目までデータが得られた。プラセボレシピエントのうちの70%が、様々な群における活性ワクチンの58〜75%と比較して、少なくとも1つの有害事象(AE)を報告した。一過性の注射部位の痛みは、活性ワクチンで15〜20%以上頻繁であるが、その他では、ワクチンの安全性のプロフィールは、プラセボと殆ど変わらなかった;プラセボ群で1件の重大なAEが起きた。結果の概要が以下に示される。
ヒト対象に、実施例5に記載されているようにRSV F及びTIV組成物を連続投与した。安全性を、反応源性日誌(reactogenicity diaries)、安全性の実験室試験、健康の変化に関する自由回答形式の質問を用いて評価した。処置群の平均年齢は、67.7〜69.1歳であった;15%は≧75歳であった。対象の大部分は、白人であり、男性が全体の43%を占めた;対象の99%で56日目までデータが得られた。プラセボレシピエントのうちの70%が、様々な群における活性ワクチンの58〜75%と比較して、少なくとも1つの有害事象(AE)を報告した。一過性の注射部位の痛みは、活性ワクチンで15〜20%以上頻繁であるが、その他では、ワクチンの安全性のプロフィールは、プラセボと殆ど変わらなかった;プラセボ群で1件の重大なAEが起きた。結果の概要が以下に示される。
これらの結果は、RSV Fワクチンが、TIV連続投与に適合し、高齢者にとって十分に耐容性であり、潜在的に防御特異性の抗体の増加を誘発することを実証している。免疫原性応答の増加が、全てのリン酸アルミニウムアジュバントの実験的な処置で見られた。
実施例10:四価インフルエンザ(Q−Flu)とRSV Fの混合ワクチンのマウスでの実験
合計90匹の6〜8週齢の雌BALB/cマウス(各群10匹)をこの実験に使用した。6.0、1.5、又は0.5μgの用量のRSV F又は四価季節性インフルエンザVLPワクチン又は表1に示されているRSV FとインフルエンザVLPの混合ワクチンを用いて、0日目及び21日目に全ての動物に合計2回のIMワクチン接種を行った。四価インフルエンザワクチンは、1株当たり1.5、0.375、又は0.125μgを含んでいた(各株の25%)。
合計90匹の6〜8週齢の雌BALB/cマウス(各群10匹)をこの実験に使用した。6.0、1.5、又は0.5μgの用量のRSV F又は四価季節性インフルエンザVLPワクチン又は表1に示されているRSV FとインフルエンザVLPの混合ワクチンを用いて、0日目及び21日目に全ての動物に合計2回のIMワクチン接種を行った。四価インフルエンザワクチンは、1株当たり1.5、0.375、又は0.125μgを含んでいた(各株の25%)。
免疫原性評価のために0日目、21日目、35日目に血液サンプルを採取した。
群1、2、及び3は、RSV F緩衝液:25mMのリン酸塩、pH6.2、0.15MのNaCl、0.01%(w/v)ポリソルベート80、1%(w/v)ヒスチジンで処置した。群4、5、及び6は、インフルエンザ緩衝液:25mMのリン酸ナトリウム、pH7.2、0.3MのNaCl、300μMのCaCl2、及び0.01%(w/v)ポリソルベート80で処置した。群7、8、及び9は、50%インフルエンザと50%RSVの混合緩衝液で処置した。
免疫学的方法
(a)抗RSV F IgG ELISA
RSV F特異的抗体の力価を、0日目、21日目、及び35日目に採取した血清サンプルでの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価した。簡単に述べると、NUNC MaxiSorpマイクロタイタープレートに、2μg/mlのRSV Fタンパク質をコーティングし、2〜8℃で一晩インキュベートした。未処置表面を、スターティングブロック(starting block)(Pierce biological)で、室温で1時間ブロックした。マウス血清の段階希釈(5倍、1:100〜1:390,625)を2連で行い、これをRSV Fタンパク質がコーティングされたプレートに添加し、室温で2時間インキュベートし、tween、PBS-T (Quality Biologicals)を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Southern Biotech)の添加後、マイクロタイタープレートを1時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、タンパク質が結合した抗RSV FマウスIgG抗体を検出するために、ペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Sigma)をこのプレートに添加した。発色のために約5〜6分間放置した。TMB停止緩衝液(Scy Tek Laboratories)の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー(Molecular Devices)で、450nmでプレートを測定した。データを、SoftMax proソフトウェア(Molecular Devices)を用いて分析した。4PL曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、1.0のOD450となった血清希釈度の逆数値として決定した。陽性RSV Fマウス血清を対照として使用した。力価<100の前採血マウス血清が、陰性対照としての機能を果たした。
(a)抗RSV F IgG ELISA
RSV F特異的抗体の力価を、0日目、21日目、及び35日目に採取した血清サンプルでの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価した。簡単に述べると、NUNC MaxiSorpマイクロタイタープレートに、2μg/mlのRSV Fタンパク質をコーティングし、2〜8℃で一晩インキュベートした。未処置表面を、スターティングブロック(starting block)(Pierce biological)で、室温で1時間ブロックした。マウス血清の段階希釈(5倍、1:100〜1:390,625)を2連で行い、これをRSV Fタンパク質がコーティングされたプレートに添加し、室温で2時間インキュベートし、tween、PBS-T (Quality Biologicals)を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Southern Biotech)の添加後、マイクロタイタープレートを1時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、タンパク質が結合した抗RSV FマウスIgG抗体を検出するために、ペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Sigma)をこのプレートに添加した。発色のために約5〜6分間放置した。TMB停止緩衝液(Scy Tek Laboratories)の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー(Molecular Devices)で、450nmでプレートを測定した。データを、SoftMax proソフトウェア(Molecular Devices)を用いて分析した。4PL曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、1.0のOD450となった血清希釈度の逆数値として決定した。陽性RSV Fマウス血清を対照として使用した。力価<100の前採血マウス血清が、陰性対照としての機能を果たした。
(b)パリビズマブ−競合ELISA
RSV Fマウス血清及びビオチン標識パリビズマブ(MedImmune LLC)のRSV F抗原に対する競合結合を、96ウェルマイクロタイタープレートで行った。パリビズマブ(10mg/ml)を、製造者の取扱説明書に従ってビオチン標識キット(Pierce)を用いてビオチン標識した。Nunc MaxiSorbマイクロタイタープレートを2μg/mlのRSV F抗原でコーティングし、2〜8℃で一晩インキュベートした。次いで、反応しなかった部位を、室温で1時間、1%乳でブロックした。マウス血清の2倍段階希釈(1:20〜1:1280)を2連で調製して、120ng/mlのビオチン化パリビズマブを用いてスパイクした。プレートを室温で2時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水(Quality Biologicals)で洗浄した。ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(e-Bioscience)の添加後、マイクロタイタープレートを室温で1時間インキュベートした。tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水での3回の洗浄後、抗原が結合したビオチン化パリビズマブを検出するために、ペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Sigma)をこのプレートに添加した。TMB停止緩衝液(Scy Tek Laboratories)の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー(Molecular Devices)で、450nmでプレートを測定した。緩衝液中にビオチン化パリビズマブを含むウェルは非競合を示し、ビオチン標識パリビズマブを一切含まないPBSのみを含むウェルをこのアッセイで陰性対照として使用した。陽性RSV Fマウス血清及び免疫前マウス血清をアッセイの対照として使用した。SoftMax Proソフトウェア(Molecular Devices)を用いてデータを分析した。競合した結合力価を、50%阻害力価として表した。阻害力価率(%)を、次の式を用いて各血清希釈度について計算した:(ODpalivizumab−ODsapmle/ODpalivizumab)×100%。
RSV Fマウス血清及びビオチン標識パリビズマブ(MedImmune LLC)のRSV F抗原に対する競合結合を、96ウェルマイクロタイタープレートで行った。パリビズマブ(10mg/ml)を、製造者の取扱説明書に従ってビオチン標識キット(Pierce)を用いてビオチン標識した。Nunc MaxiSorbマイクロタイタープレートを2μg/mlのRSV F抗原でコーティングし、2〜8℃で一晩インキュベートした。次いで、反応しなかった部位を、室温で1時間、1%乳でブロックした。マウス血清の2倍段階希釈(1:20〜1:1280)を2連で調製して、120ng/mlのビオチン化パリビズマブを用いてスパイクした。プレートを室温で2時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水(Quality Biologicals)で洗浄した。ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(e-Bioscience)の添加後、マイクロタイタープレートを室温で1時間インキュベートした。tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水での3回の洗浄後、抗原が結合したビオチン化パリビズマブを検出するために、ペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Sigma)をこのプレートに添加した。TMB停止緩衝液(Scy Tek Laboratories)の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー(Molecular Devices)で、450nmでプレートを測定した。緩衝液中にビオチン化パリビズマブを含むウェルは非競合を示し、ビオチン標識パリビズマブを一切含まないPBSのみを含むウェルをこのアッセイで陰性対照として使用した。陽性RSV Fマウス血清及び免疫前マウス血清をアッセイの対照として使用した。SoftMax Proソフトウェア(Molecular Devices)を用いてデータを分析した。競合した結合力価を、50%阻害力価として表した。阻害力価率(%)を、次の式を用いて各血清希釈度について計算した:(ODpalivizumab−ODsapmle/ODpalivizumab)×100%。
4PL曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、ビオチン化パリビズマブ結合の50%阻害となった血清希釈度の逆数値として決定した。50%阻害が得られなかった場合は、サンプルについて<20の力価が報告され、10の値を計算群GMTで使用した。
(c)マイクロ中和
RSV F粒子ワクチンがRSV中和抗体を誘発できるかを決定するために、35日目の血清サンプルを、RSV-A Long strain中和アッセイで分析した。1:20で開始したマウス血清の2倍段階希釈物を96ウェルプレートに添加した。等量(50μl)のウイルス(約200PFU)を希釈した血清に添加し、36℃で1時間インキュベートした。成長培地(L−15、10%ウシ胎児血清及び2mMのグルタミン)中、新たにトリプシン処理された100μlのHEp−2細胞(5×105細胞/ml)を、ウイルス/血清混合物に添加し、36℃で6〜7日間、又は陽性対照(ウイルスのみ)ウェルが100%の細胞変性効果(CPE)を示すまでインキュベートした。
RSV F粒子ワクチンがRSV中和抗体を誘発できるかを決定するために、35日目の血清サンプルを、RSV-A Long strain中和アッセイで分析した。1:20で開始したマウス血清の2倍段階希釈物を96ウェルプレートに添加した。等量(50μl)のウイルス(約200PFU)を希釈した血清に添加し、36℃で1時間インキュベートした。成長培地(L−15、10%ウシ胎児血清及び2mMのグルタミン)中、新たにトリプシン処理された100μlのHEp−2細胞(5×105細胞/ml)を、ウイルス/血清混合物に添加し、36℃で6〜7日間、又は陽性対照(ウイルスのみ)ウェルが100%の細胞変性効果(CPE)を示すまでインキュベートした。
5%グルテルアルデヒド中、0.25%クリスタルバイオレットで固定及び染色する前及び/又は後で、細胞をCPE顕微鏡によって計数した。染色したプレートを空気乾燥させて、解剖顕微鏡でCPEについて評価した。CPE形成の100%阻害となる最後の希釈度を、そのサンプルの抗体力価を中和する終点として決定した。20未満の力価となる全てのサンプルに10の値を割り当てた。各群の幾何平均を計算した。力価が6400のヒツジRSV F血清を陽性対照として使用した。
(d)HAI抗体測定
インフルエンザA/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に対するHAI応答を、35日目に得た血清サンプルに対して評価した。七面鳥赤血球(Lampire Biological Laboratories)をPBS中、1%懸濁液に調製した。血清サンプル及び血清対照をRDEで処置して非特異的阻害剤を不活化した。RDE処置血清を、96ウェルV底プレートにおいてPBSで段階希釈した(1:10で開始)。七面鳥赤血球及び標準HA抗原を希釈した血清に添加し、プレートを室温で45〜50分間インキュベートした。プレートを傾けて、赤血球対照のウェルと同じ速度で流れるサンプルのウェル内の赤血球細胞の涙型ストリーミングを検出することによって赤血球凝集阻害を決定した。HAI阻害力価を、赤血球凝集阻害が観察された最も高い血清希釈度の逆数として記録した。血清の最終力価を、再現HAI力価の幾何平均(GMT)として報告した。力価が10未満となる全てのサンプルに5の値を割り当てた(図14を参照)。
インフルエンザA/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に対するHAI応答を、35日目に得た血清サンプルに対して評価した。七面鳥赤血球(Lampire Biological Laboratories)をPBS中、1%懸濁液に調製した。血清サンプル及び血清対照をRDEで処置して非特異的阻害剤を不活化した。RDE処置血清を、96ウェルV底プレートにおいてPBSで段階希釈した(1:10で開始)。七面鳥赤血球及び標準HA抗原を希釈した血清に添加し、プレートを室温で45〜50分間インキュベートした。プレートを傾けて、赤血球対照のウェルと同じ速度で流れるサンプルのウェル内の赤血球細胞の涙型ストリーミングを検出することによって赤血球凝集阻害を決定した。HAI阻害力価を、赤血球凝集阻害が観察された最も高い血清希釈度の逆数として記録した。血清の最終力価を、再現HAI力価の幾何平均(GMT)として報告した。力価が10未満となる全てのサンプルに5の値を割り当てた(図14を参照)。
(e)統計的方法
幾何平均力価(GMT)及び対応する95%CIを用いて結果を表す。ワクチン群の一対比較を分析して、2テールスチューデントt検定(two-tailed student’s t-test)を用いることによって推定した。p値<0.05を、ワクチン群の比較で有意と見なした。
幾何平均力価(GMT)及び対応する95%CIを用いて結果を表す。ワクチン群の一対比較を分析して、2テールスチューデントt検定(two-tailed student’s t-test)を用いることによって推定した。p値<0.05を、ワクチン群の比較で有意と見なした。
実施例11:四価インフルエンザ(Q−Flu)とRSV Fの混合ワクチンについてのマウスでの実験の結果
実施例10に記載されているようにマウスを免疫化した。RSV F免疫応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、パリビズマブ競合ELISA、マイクロ中和(MN)アッセイを用いた抗F IgG力価決定によって評価する一方、インフルエンザ免疫応答は、同様に実施例10に記載されているように赤血球凝集阻害アッセイ(HAI)によって測定した。
実施例10に記載されているようにマウスを免疫化した。RSV F免疫応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、パリビズマブ競合ELISA、マイクロ中和(MN)アッセイを用いた抗F IgG力価決定によって評価する一方、インフルエンザ免疫応答は、同様に実施例10に記載されているように赤血球凝集阻害アッセイ(HAI)によって測定した。
(a)IgG応答
RSV F単独ワクチン及びRSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンで免疫化したマウスの全ての群は、非常に高い用量依存性の血清IgG応答を示した(図20)。全ての群の第2の免疫化で有意な追加免疫効果が見られた(p<0.01)(図20及び図21)。混合ワクチンは、RSV F投与のみと比較して、全ての用量で抗RSV F IgG力価が上昇し、6μg及び1.5μgの用量で有意な差が出た(p<0.05)(図11A、図11B、及び図21)。35日目のRSV Fのみの抗RSV F GMT範囲は46,087〜108,932であったが、混合ワクチンのGMTの範囲は108,178〜284,639(図21)であり、2.3〜2.8倍の上昇を示した(図11B)。
RSV F単独ワクチン及びRSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンで免疫化したマウスの全ての群は、非常に高い用量依存性の血清IgG応答を示した(図20)。全ての群の第2の免疫化で有意な追加免疫効果が見られた(p<0.01)(図20及び図21)。混合ワクチンは、RSV F投与のみと比較して、全ての用量で抗RSV F IgG力価が上昇し、6μg及び1.5μgの用量で有意な差が出た(p<0.05)(図11A、図11B、及び図21)。35日目のRSV Fのみの抗RSV F GMT範囲は46,087〜108,932であったが、混合ワクチンのGMTの範囲は108,178〜284,639(図21)であり、2.3〜2.8倍の上昇を示した(図11B)。
(b)パリビズマブ−競合抗体
全てのワクチン群で産生された抗体の機能的能力を、パリビズマブに対して50%阻害力価を示すように設定された競合ELISAによって決定した。RSVF IgG応答と同様に、パリビズマブ競合抗体(PCA)力価も、RSV Fのみが投与された群と比較すると、RSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンが投与された群で有意に高かった(p<0.05)(図12A、図12B、及び図22)。RSV FのみのPCAの範囲は55〜95μg/mlであったが、混合ワクチンの範囲は、125〜268μg/ml(図22)であり、2.2〜2.8倍の上昇を示した(図12B)。
全てのワクチン群で産生された抗体の機能的能力を、パリビズマブに対して50%阻害力価を示すように設定された競合ELISAによって決定した。RSVF IgG応答と同様に、パリビズマブ競合抗体(PCA)力価も、RSV Fのみが投与された群と比較すると、RSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンが投与された群で有意に高かった(p<0.05)(図12A、図12B、及び図22)。RSV FのみのPCAの範囲は55〜95μg/mlであったが、混合ワクチンの範囲は、125〜268μg/ml(図22)であり、2.2〜2.8倍の上昇を示した(図12B)。
(c)RSV F中和抗体
RSVウイルスを中和する抗体の能力を決定するためにマイクロ中和アッセイを行った。全ての群で、中和力価のレベルが用量依存的に上昇した(図13A及び図13B)。混合ワクチンは、混合ワクチンが投与された全ての群の力価を上昇させ、0.5μgの用量で有意差が生じた(p<0.01)(図23)。
RSVウイルスを中和する抗体の能力を決定するためにマイクロ中和アッセイを行った。全ての群で、中和力価のレベルが用量依存的に上昇した(図13A及び図13B)。混合ワクチンは、混合ワクチンが投与された全ての群の力価を上昇させ、0.5μgの用量で有意差が生じた(p<0.01)(図23)。
(d)インフルエンザ特異的応答
インフルエンザ特異的応答を評価するために、HAI力価を4つ全ての個々の株、A/California/04/09(H1N1)(図15A、図15B、及び図16を参照)、A/Victoria/361/11(H3N2)(図15C、図15D、及び図17を参照)、及びB/Brisbane/60/08(図15E、図15F、及び図18を参照)、及びB/Massachusetts/2/12(図15G、図15H、及び図19を参照)について決定した。最終Q−Flu調製物が各株を1.5μg、0.375μg、又は0.125μgしか含んでいなかったにもかかわらず、HAI力価が高かった。RSV F応答とは対照的に、Q−FluワクチンのみでのHAI応答は、RSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンのHAI応答と有意差がなかった(図15〜図19)。この結果は、インフルエンザVLPワクチンの免疫原性が、RSV Fとの同時投与によって低減されなかったことを示唆した。
インフルエンザ特異的応答を評価するために、HAI力価を4つ全ての個々の株、A/California/04/09(H1N1)(図15A、図15B、及び図16を参照)、A/Victoria/361/11(H3N2)(図15C、図15D、及び図17を参照)、及びB/Brisbane/60/08(図15E、図15F、及び図18を参照)、及びB/Massachusetts/2/12(図15G、図15H、及び図19を参照)について決定した。最終Q−Flu調製物が各株を1.5μg、0.375μg、又は0.125μgしか含んでいなかったにもかかわらず、HAI力価が高かった。RSV F応答とは対照的に、Q−FluワクチンのみでのHAI応答は、RSV F/インフルエンザVLP混合ワクチンのHAI応答と有意差がなかった(図15〜図19)。この結果は、インフルエンザVLPワクチンの免疫原性が、RSV Fとの同時投与によって低減されなかったことを示唆した。
(e)倍数増加比較
以下の表6は、抗RSV F応答の大きさ及び特徴に対するRSV成分とQ−flu成分の両方を混合する増強効果を例示している。実験識別番号27ではA/Perth株を使用し、実験46ではA/Victoria/361/11株を使用したことに留意されたい。
以下の表6は、抗RSV F応答の大きさ及び特徴に対するRSV成分とQ−flu成分の両方を混合する増強効果を例示している。実験識別番号27ではA/Perth株を使用し、実験46ではA/Victoria/361/11株を使用したことに留意されたい。
前述の詳細な説明は、単に理解しやすくするために記載されたものであり、当業者には変更形態が明らかであるため、この説明から不要な限定と解釈されるべきものではない。
本開示は、その特定の実施形態に関連付けて記載されているが、さらなる変更が可能であり、かつ本出願が、一般に本開示の原理に従い、かつ本開示が属する分野のうちの公知又は慣行の範囲内である本開示からの逸脱を含む、本開示のあらゆる変形形態、使用、又は適応形態を包含することを意図するものであり、かつ上文で説明された、添付の特許請求の範囲のような本質的な特徴に適用できることを理解されたい。
Claims (25)
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)成分及びインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物。
- 前記RSV F成分がRSV Fタンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記インフルエンザ成分がインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記インフルエンザVLPが、インフルエンザHAタンパク質、インフルエンザNAタンパク質、及びインフルエンザM1タンパク質を含む、請求項3に記載の組成物。
- 2つ、3つ、又は4つのインフルエンザVLPをさらに含み、各VLPが異なる株に由来するHAタンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 各インフルエンザVLPが、前記HAタンパク質と同じ株に由来するNAタンパク質をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
- 各インフルエンザVLPが、インフルエンザ株A/Indonesia/5/05に由来するM1タンパク質を含む、請求項5に記載の組成物。
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)成分及び3つのインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物であって、
各インフルエンザ成分がVLPを含み、
各VLPが、インフルエンザM1タンパク質、インフルエンザNAタンパク質、及びインフルエンザHAタンパク質を含み;かつ
各VLPの前記NAタンパク質及び前記HAタンパク質が、同じインフルエンザ株に由来し、
第1、第2、及び第3のVLPのインフルエンザタンパク質が、互いに異なる株に由来し、
前記第1、前記第2、及び前記第3のVLPがそれぞれ、同じ株に由来するM1タンパク質を含む、免疫原性組成物。 - 第4のインフルエンザ成分をさらに含み、前記第4のインフルエンザ成分がVLPを含み、前記第4のVLPが、前記第1、前記第2、及び前記第3のVLPの株とは異なる株に由来するHAタンパク質及びNAタンパク質を含み;かつ前記M1タンパク質が、前記第1、前記第2、及び前記第3のVLPと同じ株に由来する、請求項8に記載の免疫原性組成物。
- 前記M1タンパク質がトリインフルエンザウイルスに由来する、請求項8に記載の免疫原性組成物。
- 前記トリインフルエンザウイルスがA/Indonesia/5/05インフルエンザウイルス株である、請求項10に記載の免疫原性組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、一次切断部位又は二次切断部位を不活化する変異を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)の133位のアルギニン、135位のアルギニン、及び136位のアルギニンに対応する位置における少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することによって不活化される一次切断部位を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、前記野生型RSV Fタンパク質(配列番号2)の137〜146位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が配列番号8を含む、請求項2に記載の組成物。
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)成分及び少なくとも1つのインフルエンザ成分を含むキットであって、各成分が別個の容器に入れられている、キット。
- 請求項1の組成物を投与するステップを含む、RSV株及びインフルエンザ株に対する防御応答を誘導する方法。
- 前記投与するステップが、
(a)前記RSV成分を容器内で2〜8℃で保存するステップ、
(b)前記インフルエンザ成分を容器内で2〜8℃で保存するステップ、
(c)RSV成分と前記インフルエンザ成分を混合して混合組成物を調製するステップ;及び
(d)前記組成物を動物に筋肉注射し、これによりインフルエンザ及びRSVによる感染に対する防御免疫応答が得られるステップを含む、請求項17に記載の方法。 - 前記動物がヒトである、請求項18に記載の方法。
- 前記ヒトが乳児である、請求項19に記載の方法。
- 前記防御応答が抗RSV F中和抗体を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記防御応答が赤血球凝集阻害を含み、前記赤血球凝集阻害が、各成分のみの投与と比べると前記RSV成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項18に記載の方法。
- 前記抗RSV F中和抗体応答が、各成分のみの投与と比べると前記RSV成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項21に記載の方法。
- 前記防御応答が抗パリビズマブ抗体応答を含む、請求項18に記載の方法。
- 抗パリビズマブ抗体応答が、各成分のみの投与と比べると前記RSV成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項24に記載の方法。
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