CN1718243A - 一类免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类新的人或动物热休克蛋白gp96和hsp108 (均属HSP90家族)或hsp70全长分子或其氨基端片段为佐剂，以提高抗原免疫活性。病毒表位肽、共价连接的多表位重组体或蛋白抗原与上述热休克蛋白全长分子或其氨基端片段混合或共价连接使用，作为乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡马立克氏病毒等病毒的抗原佐剂或抗原载体可数十倍的提高抗原免疫活性，达到清除病毒、治疗疾病的目的。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域。具体地讲，涉及一类人或动物热休克蛋白gp96和hsp108(均属HSP90家族)或hsp70全长分子或其氨基端片段作为一类新的免疫佐剂，提高抗原免疫活性。病毒表位肽、共价连接的多表位重组体或蛋白抗原与上述热休克蛋白全长分子或其氨基端片段混合或共价或非共价连接使用，该佐剂可数十倍的提高抗原免疫活性，达到清除病毒、治疗疾病的目。
背景技术
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)又称应激蛋白，是一类在生物进化中高度保守，并且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。根据其分子量大小和结构主要分成HSP90、HSP70等近十个家族。Gp96是HSP90家族中的重要成员，在正常组织和肿瘤组织中均有广泛表达，主要定位于内质网腔(Endoplasmic reticulum，ER)上，是ER中最丰富的蛋白质之一。一般认为gp96是细胞内蛋白质，但研究证实gp96在某些小鼠肿瘤细胞表面也有表达，且表达量随肿瘤免疫原性增强而增加。细胞表面gp96的表达在种系发生上具有保守性，并不仅限于某些哺乳动物肿瘤，在脊椎动物的一些免疫细胞上也有选择性表达。Gp96作为分子伴侣，可结合未折叠的多肽链，阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错折叠蛋白质的分泌。在正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，但热休克、重金属中毒、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等应激条件以及细胞分化等可诱导其表达增加。干扰素-α(IFN-α)和干扰素-γ(IFN-γ)也可在转录水平上调节gp96的表达。
应用gp96多肽复合物疫苗可以自体治疗肿瘤。Antigenics公司开发的黑色素瘤自体治疗已做完三期临床。然而自体疫苗不能广泛应用于不同个体，而且往往携带多价抗原，不利于进行有针对性的特异抗原的免疫治疗。目前临床应用的免疫佐剂多为铝制剂，由于其佐剂效果不稳定，不能增强细胞免疫反应等缺点而使其应用受限。我们的研究结果显示gp96、hsp108或hsp70全长分子及其N端可以作为免疫佐剂，增强肽特异的CTL反应或蛋白特异的抗体的产生。
发明内容
为了克服现有佐剂的不足，本发明的一个目的在于提供一类人或动物的具有免疫增强活性一类新型佐剂，其特征在于是由gp96、hsp108或hsp70的N端重组片段组成的蛋白。此类免疫佐剂与相应的抗原结合形成免疫刺激物，提高机体对外来抗原的免疫反应。
本发明是我们前期工作“乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白的复合物及其应用”(专利号：ZL 01 1 04060.2；证书号：第109175号)的新进展。 由 于 gp96(NM_003299 ，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝4507676)hsp70(NM_005345http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝26787973)和hsp108(AF387865，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝14579648)全长DNA克隆表达产物不稳定，难于作为疫苗或药物之用。我们对gp96、hsp70和hsp108的氨基端，即N-端片段重组DNA的详细研究证明N-端表达产物稳定并具有免疫佐剂活性。
本发明提供的免疫佐剂包括：Hgp96，Hhsp70，Chsp108的N-端重组片段，如：人Hgp96N-端片断如序列表1No.2所示的具有267个氨基酸的序列的蛋白、序列表1No.4所示的具有315个氨基酸的序列的蛋白、序列表1No.6所示的具有333个氨基酸的序列的蛋白及序列表1No.8所示的具有349个氨基酸的序列组成的蛋白；人hsp70(Hhsp70)N-端片断具有如序列表2No.2所示的由202个氨基酸序列组成的蛋白；鸡hsp108(Chsp108)N-端片断具有如序列表3No.2所示的由335个氨基酸序列组成的蛋白；还包括由于其基因的缺失、插入和突变产生的与上述所述Hgp96、Chsp108和Hhsp70N-端各片段的氨基酸序列至少有60％同源性的，并且具有相同功能的衍生蛋白。本发明以小鼠为动物模型，对乙肝病毒HBV表位肽：STLPETTVVRR，FLPSDFFPSV，IPIPSSWAF，WLSLLVPFV、FLLSLGIHL；HCV的表位肽：YLLPPRGPRL、GFADLMGYIPL；HIV-1的表位肽：SILDIRQGPK、CQGVGGPGHK；SARS-CoV的表位肽：LLLDRLNQL、VVFLHVTYV；FMDV的表位肽：IKRAETYCPR、HKQKIVAPEK进行了研究，得到相同结论，本发明提供的免疫佐剂可以促进HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV等病毒表位特异性的CTL反应，提高机体对外来抗原的免疫应答。其中一个实例是采用乙肝病毒(HBV)等病毒鼠源Kd限制性的表位肽，其HBV特异9肽与gp96N末端片段gp96N22-355混合物免疫小鼠，刺激增强小鼠特异CTL的产生。本发明提供的免疫佐剂与乙肝病毒的表面抗原HBsAg复合物免疫小鼠，可以显著的增强HBsAg抗体产生滴度。
本发明所提供的免疫佐剂可以增强表位肽，共价连接的多表位重组体以及蛋白性抗原产生的CTL水平和抗体水平。病毒表位肽、共价连接的多表位重组体或蛋白抗原与上述热休克蛋白全长分子或其氨基端片段混合或共价连接使用，作为乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡马立克氏病毒等病毒的抗原佐剂或抗原载体可数十倍的提高抗原免疫活性，达到清除病毒、治疗疾病的目的。所以，本发明所提供的免疫佐剂可以应用于疫苗或药物的制备。
本发明提供的免疫佐剂可以与抗原物质直接混合、非共价连接或共价连接等方式，采用皮内注射或皮下注射或腹腔注射等方式进行免疫。免疫剂量为0.10μmol或100μmol。
附图说明
图1.用ELISPOT技术测定HBV 9肽与鼠gp96-N端片段免疫活性为例。
图2.用Tetramer技术测定以HBV 9肽与鼠gp96-N端片段免疫活性为例。
图351Cr释放实验测定HBV 9肽与鼠gp96-N端片段免疫活性为例。
图4用ELISA技术测定以HBV表面抗原与鼠gp96-N端片段免疫活性为例。
图5用ELISPOT技术测定以HBV表面抗原与鼠gp96-N端片段免疫活性为例。
图6经Hgp96N端诱导成熟的DC细胞。
图7.Hgp96的N22-336促进DC细胞的成熟，表现为CD40增加(A下)，CD80增加(B下)，CD83出现阳性(C下)，CD86表达增加(D下)。
图8.Hgp96N22-336促进HLA-2限制型的T淋巴细胞对核心抗原18-27表位的特异扩增。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下通过具体的实施例进一步的进行描述，但是，本实施例并非是对本发明的限定。
实施例一
本实施例以小鼠为动物模型，对HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV进行了研究，得到相同结论，现以HBV为例：
1.实验动物鼠gp96-N22-355基因片段的克隆
pET-30a质粒(来自novagen)，实验室保存的鼠pET-30a-gp96(gp96见专利号：ZL 01 1 04060.2)。质粒中克隆N端基因。所用引物为：
引物1：5′CCGGATCCGAACTTGATGTGGATGGTACA 3′
引物2：5′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′
PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃50秒，55℃50秒，72℃3分钟，共30循环；72℃5分钟。结果证明与已知序列相同。
PCR产物为约1Kd的片段，片段的5′端和3′端人为引入BamHI和SacI二个酶切位点，将扩增片段进行测序。其序列与已知序列相同。
2.鼠gp96-N22-355片段在大肠杆菌中的表达与蛋白纯化
将扩增片段经BamHI与SacI酶切后连接到表达载体pGEX6p-1(invitrogen公司)中，并转化大肠杆菌BL21(BL21：购自Invitrogen Cat.No.C6000-03)。经1mM异丙基-P-P-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4小时后得到表达产物，以10％十二烷(基)硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量为45Kda，与理论值一致。
将gp96-N22-355蛋白用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)层析柱(Pharmacia公司)，经亲和层析和分子筛superdex G200(PE公司)进行纯化，以10％SDS-PAGE电泳和银染鉴定纯度，得到大于95％纯度的N端蛋白。表达的蛋白产物用gp96单克隆抗体(NeoMarkers公司)进行Western鉴定，获得阳性结果。
3.gp96-N22-355片段与人工合成的多肽、多表位重组体和蛋白抗原免疫小鼠试验
选用生长6-8周的雌性BALB/cJ小鼠(MHC为H-2dKd)为本实验动物。
免疫方式采用将样品溶于100μl的PBS中颈背皮下注射。抗原最适免疫剂量为10μg。免疫程序为第一次免疫一周后进行第二次免疫，效果优于免疫一次。采用皮下注射，将gp96-N22-355片段蛋白与Kd限制型抗原混合物溶于缓冲液(90％PBS，10％DMSO/0.1％TFA)中，每支小鼠免疫剂量分别为0.2nmol，2nmol和20nmol，将抗原与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。gp96-N22-355蛋白与Kd限制型抗原复合物免疫剂量0.1nmol，采用颈背皮下注射，第一次免疫一周后进行第二次加强免疫，7天后进行CTL分析。每一处理使用10只小鼠。
4.用ELISPOT方法测定小鼠多肽CTL
小鼠免疫7天后从每只小鼠收获得约3×107脾细胞应用ELISPOT技术测定细胞毒性T细胞分泌γ干扰素的分泌水平。将包被抗γ干扰素抗体的96孔板用脱脂奶粉封闭后，加入待测脾细胞。用多肽抗原刺激18到40小时后，弃去上清加入抗γ干扰素的二抗，37度孵育1到2小时后，加入连接有链亲和素的碱性磷酸酶，37度孵育1小时后，加入显色底物五溴-四氯-三吲哚磷酸酯/氮蓝四唑(BCIP/NBT)。20分钟后蒸馏水终止显色。计数可分泌γ干扰素的细胞。单独应用gp96-N22-355和抗原免疫的小鼠不产生抗原特异的可分泌γ干扰素的CTL细胞，而应用gp96-N22-355和抗原混合物免疫的小鼠产生抗原特异的可分泌γ干扰素的CTL细胞，并且CTL细胞数量随着免疫剂量的增加而增多(图1)。说明gp96-N22-355对抗原的免疫原性有明显的增强作用。
5.Tetramer方法测定抗原对小鼠的CTL
小鼠免疫7天后从每只小鼠收获得约3×107脾细胞，应用Tetramer技术测定细胞毒性T细胞表达抗原特异T细胞受体的水平。将多肽抗原与MHC重链和轻链在体外一起复性合成Kd9肽特异的四聚体复合物(Tetramer)。收集脾细胞，加入tetramer于37度孵育20分钟，再加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD8抗体和PE-cy5标记的抗CD3抗体。在流式细胞仪上分析Tetramer，CD8，CD3，均是阳性的细胞。单独应用gp96-N22-355或抗原免疫的小鼠不产生抗原特异的可以被抗原Tetramer染色的CTL细胞，而应用gp96-N22-355和多肽混合物免疫的小鼠产生抗原特异的被多肽抗原Tetramer染色的CTL细胞，并且CTL细胞数量随着免疫剂量的增加而增多(图2)。说明gp96-N22-355对多肽的免疫原性有明显的增强作用。
6.用51Cr释放实验测定小鼠多肽CTL
小鼠免疫7天后，从每只小鼠收获得约3×107脾细胞应用51Cr释放实验测定细胞毒性T细胞体外杀伤靶细胞的功能。脾细胞悬于含有10mMHEPES缓冲液、5×10-5M巯基乙醇，抗生素和10％(V/V)胎牛血清(FCS)培养液中，6天后收集脾细胞进行4小时标准51Cr释放实验(具体方法见Kuhrober，A，et al.1997.International Immunology，9(8)：1203-1212)测定细胞毒性活性。靶细胞用10μg/ml抗原于37℃致敏30分钟后加入不同数量的效应细胞，反应体系为100μl的完全培养基。37℃共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。单独应用gp96-N22-355和多肽免疫的小鼠不产生抗原特异的可杀伤靶细胞的CTL细胞，而应用gp96-N22-355和抗原混合物免疫的小鼠产生抗原特异的可以杀伤靶细胞的CTL细胞，并且CTL细胞数量随着免疫剂量的增加而增多(图3)。说明gp96-N22-355对抗原的免疫原性有明显的增强作用。
7.gp96-N22-355片段与HBV表面抗原免疫小鼠
选用生长6-8周的雌性BALB/cJ小鼠(MHC为H-2dKd)为本实验动物。
免疫方式采用将样品溶于100 1的磷酸缓冲液(PBS)中颈背皮下注射。蛋白最适免疫剂量为10μg。免疫程序为第一次免疫一周后进行第二次免疫，效果优于免疫一次。采用皮下注射，将gp96-N22-355片段与上述病毒表面抗原结合物溶于缓冲液(90％PBS，10％二甲基亚砜/0.1％TFA)中，每支小鼠免疫剂量分别为10μg。每次免疫后15天取血，测定抗表面抗原的抗体并进行CTL分析。单独应用gp96-N22-355免疫的小鼠不产生抗原特异的抗体，而应用gp96-N22-355和HBV、AIV。或NDV表面抗原结合物免疫的小鼠产生抗原特异的抗体，其抗体量为单独应用表面抗原产生抗体的10倍(图4)。杀伤靶细胞的CTL细胞也有相应增加，而且CTL细胞数量随着免疫剂量的增加而增多。说明gp96-N22-355对病毒抗原的免疫原性有明显的增强作用。单独应用gp96-N22-355免疫的小鼠不产生抗原特异的可以杀伤靶细胞的CTL细胞，而应用gp96-N22-355和病毒表面抗原结合物免疫的小鼠产生抗原特异的CTL为单独应用表面抗原产生CTL的5倍(图5)。说明gp96-N22-355对蛋白抗原的免疫原性有明显的增强作用。
本实验室首次重组表达了人热休克蛋白gp96N端的22-288，22-336，22-355，22-370及hsp70 N端的161-362。利用提取和重组的热休克蛋白刺激体外由外周血分化诱导来的非成熟树突状细胞(DC细胞)，发现gp96的重组片段可以诱导非成熟DC细胞的成熟，使共刺激分子CD80，CD86表达提高，使标志性的细胞表面分子CD83由阴性变为阳性，使得DC细胞呈递加工抗原的能力增强。用人热休克蛋白gp96及其重组片段分别与HBV、HCV、HIV-l或SARS-CoV乙肝病毒的核心表位联合刺激抗原呈递细胞，然后与健康人外周血来源的
T淋巴细胞混合，可以体外诱导产生病毒肽特异性的CTL细胞。实验结果表明产生的CTL细胞可以特异性的杀伤带有对应表位的靶细胞。
实施例二
在细胞水平上以在抗原呈递过程中起重要作用的人DC细胞为材料，研究热休克蛋白Hgp96及Hhsp70不同片段对DC细胞活化的影响。对HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV进行了研究，得到相同结论，以HBV为例：
8.从人肝组织中纯化Hgp96全长蛋白
将50g车祸死亡的正常人肝组织匀浆后离心，用50％-70％的(NH4)2SO4沉淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose(Pharmacia公司)进行亲和层析，结合的蛋白用10％的α-甲基葡萄糖苷洗脱，洗脱液上POROS20QE(PE公司BioCAD灌注层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得＞95％纯度的Hgp96蛋白。Hgp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(NeoMarkers公司)进行Western blot鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相高效液相色谱(HPLC)鉴定。
9.Hgp96 N端和Hhsp70 N端重组片段的基因克隆和重组表达
设计引物，从pET-30a-Hgp96质粒中克隆N端基因。所设计的引物和反应条件为：
Hgp96 N端22-288(DNA序列具有如表序列1No.1所示的801个核苷酸的序列、其所编码的蛋白具有如序列表1No.2所示的267个氨基酸的序列。)
引物1：CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG
引物2：GCCTCGAGTCAAGTTTCAGTCTTGCTGCT
Hgp96 N端22-336(DNA序列具有如表序列1No.3所示的945个核苷酸的序列、其所编码的蛋白具有如序列表1No.4所示的315个氨基酸的序列)：
引物1：CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG
引物2：GCACTCGAGTCACATAAGTTCCCAGTCCCA
Hgp96N端22-355(DNA序列具有如表序列1No.5所示的999个核苷酸的序列、其所编码的蛋白具有如序列表1No.6所示的333个氨基酸的序列。)：
引物1：CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG
引物2：GCACTCGAGTCATTCATCTTCTTCTACTTC
Hgp96 N端22-370(DNA序列具有如表序列1No.7所示的1047个核苷酸的序列、其所编码的蛋白具有如序列表1No.8所示的349个氨基酸的序列。)：
引物1：CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG
引物2：GGTCTCGAGTCACATGGGGTCATCACTTTC
Hhsp70 N端161-362(DNA序列具有如表序列2No.1所示的606个核苷酸的序列、其所编码的蛋白具有如序列表2No.2所示的202个氨基酸的序列。)
引物1：CTGGATCC GCGGGTGTGATCGCGGGGCT
引物2：GGTCTCGAGTCAGCTCTTTGCACCTTGG
PCR反应条件如下：94℃变性1分钟；56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30循环；72℃末次延伸15分钟。
PCR产物分别约为800-1000bp的片段，片段的5′端和3′端人为引入二个酶切位点BamHI和XholI。
将扩增片段经BamHI与XholI酶切后连接到表达载体pGEX-6p1(invitrogen公司)上，转化大肠杆菌BL21，经1mM IPTG诱导4小时后产物表达，以10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量分别为30Kda，36Kda，38Kda，40Kda与理论值一致。
将Hgp96 N端重组蛋白过谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione Sepharose)4B亲和层析柱(Pharmacia公司)进行亲和层析，然后用superdex 200进行分子筛层析。SDS-PAGE电泳鉴定纯度，得到大于95％纯度的Hgp96N端重组蛋白。表达的Hgp96蛋白产物用gp96/grp94单克隆抗体(NeoMarkers公司)和GST抗体进行Western blot鉴定，证明得到产物为Hgp96的一部分。
10.Hgp96刺激抗原呈递细胞的活化
将纯化的Hgp96蛋白与多粘菌素(polymyxin B sulfate)(sigma)10ug/ml混合，室温放置1小时，或者将纯化的Hgp96过detoxi柱(Pierce)柱，除去内毒素的影响。将LPS按照浓度梯度稀释为0.2ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml，然后与多粘菌素(sigma)10ug/ml混合，室温放置1小时。将处理好的Hgp96(浓度梯度0.3ug/ml，3ug/ml，10ug/ml，100ug/ul)和LPS(浓度梯度0.2ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml)加入到外周血单核细胞(PBMC)诱导分化到的第六天的非成熟树突状细胞(imDC)(图6)中，37度5％的CO2培养箱中培养24小时，测定树突状细胞表面分子的变化，检测为CD14-，HLA-DR+，CD40high，CD86high，CD83+，与第六天的imDC(CD14-，HLA-DR+，CD40low，CD86low，CD83-，)比较，3-10ug/ml(0.02-0.1nm)的Hgp96及可以促进抗原呈递细胞的成熟(图6)。实验证明gp96对抗原呈递细胞的活化作用不是由于污染的内毒素引起的。
11.Hgp96的N端促进抗原呈递细胞DC的活化
将纯化的gp96N端蛋白(N288，N336，N355，N370)过detoxi柱(Pierce)柱除内毒素。刺激前将其与多粘菌素(sigma)10ug/ml混合，室温放置1小时，按照浓度梯度梯度0.3ug/ml，3ug/ml，10ug/ml，100ug/ul加入到培养到第六天的非成熟树突状细胞(imDC)中，37度5％的CO2培养箱中培养24小时，测定树突状细胞表面分子的变化，检测为CD14-，HLA-DR+，CD86高，CD83+，与第六天的imDC(CD14-，HLA-DR+，CD86低，CD83-，)比较，3-10ug/ml(0.02-0.1nm)的gp96 N端及可以促进抗原呈递细胞的活化。实验证明gp96对抗原呈递细胞的活化作用不是由于污染的内毒素引起的。而N端片段中的N336和N355对抗原呈递细胞的活性较强(图7)。
12.Hgp96活化的DC细胞和乙肝核心抗原特异表位刺激天真T淋巴细胞的扩增
用A2型乙肝病毒核心抗原表位按照梯度(10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml)与gp96诱导活化的自体DC细胞37度刺激4小时后，用30Gy的射线照射，然后与外周血分离的天真
T淋巴细胞混合，37度5％CO2培养箱中培养。刺激后的第二天加10U/ml的重组人IL-2。7天后，用同样的方法刺激，第二天加10U/ml的重组人IL-2。第三轮刺激7天后，测定IFN-r的释放和51Cr释放实验。结果证实Hgp96诱导活化的DC细胞可以增强肽特异CTL的产生，且产生的CTL的数量呈现剂量效应。
13.Hgp96的N端重组片段与HLA-A2型的乙肝核心抗原表位联合刺激，促进天真
T淋巴细胞的肽特异性扩增
用A2型HBV和HCV抗原表位按照梯度(10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml)与gp96 N端片段诱导活化的自体DC细胞37刺激4小时后，用30Gy的射线照射，然后与外周血分离的
T淋巴细胞混合，37 5％CO2培养箱中培养。刺激后的第二天加10U/ml的重组人IL-2。7天后，用同样的方法刺激，第二天加10U/ml的重组人IL-2。第二轮刺激后的7天后，测定IFN-r的释放和51Cr释放实验。结果证实Gp96 N端诱导活化的DC细胞可以增强肽特异CTL的产生，且产生的CTL的数量对肽呈现剂量效应(图8)。以HBV为例，结果见图8。
14.Hgp96与其它限制型的乙肝病毒表位联合刺激，促进肽特异的CTL扩增
按照实施例3所述的方法将Hgp96与HLA-A2、A11、A24和A31/68型的下述表位(表2)联合刺激
T淋巴细胞，TETRAMER染色证实，可以引起针对其它表位的CTL细胞克隆扩增。
表2.HBV的HLA-A2、A11、A24和A31/68限制表位多肽
| HLA型 | HBV蛋白来源 | 序列 | 编号 |
| A2 | 核心抗原18-27 | FLPSDFFPSV | 序列表4No.1 |
| 囊膜抗原335-343 | WLSLLVPFV | 序列表4No.2 | |
| 复制酶抗原575-583 | FLLSLGIHL | 序列表4No.3 | |
| A11 | 核心抗原(P2)88-96 | YVNVNMGLK | 序列表4No.4 |
| 前S-1 10-17 | FLGFFPDH | 序列表4No.5 | |
| A24 | 复制抗原756-764 | KYTSFPWLL | 序列表4No.6 |
| 核心抗原117-125 | EYLVSFGVW | 序列表4No.7 | |
| A31/68 | 核心抗原141-151 | STLPETTVVRR | 序列表4No.8 |
15.Hgp96的N端与表1所列其它限制型的乙肝病毒表位联合刺激，促进肽特异的CTL扩增
按照实施例14的方法将gp96的N端与表1所列表位联合刺激，可以引起肽特异CTL的扩增。
16.Hgp96与乙肝病毒的表1所列多表位联合刺激，促进多个肽特异的CTL的扩增
按照实施例14的方法将gp96与多个表位联合，TETRAMER染色证明可以诱导多个肽特异CTL克隆的扩增。
17.Hgp96的N端与乙肝病毒的多表位联合刺激，促进多个肽特异的CTL的扩增
按照实施例13的方法，将gp96的N端与多个表位联合，TETRAMER染色证明可以诱导多个肽特异CTL克隆的扩增。
实施例三
本实施例以SPF鸡为动物模型，以Chsp108 N21-355为佐剂，对MDV、AIV和NDV蛋白抗原进行研究，得到相同结论。现以MDV为例：
1.从鸡肝脏中提取HSP90家族的Chsp108及其基因序列分析
根据上述的提取方法。分别取-70℃保存的健康和鸡马立克氏病毒(MDV)感染引发的鸡肿瘤肝脏组织80克，加入4倍体积低渗缓冲液，至冰浴中用匀浆器匀浆至95％以上肝细胞破碎。14000转/分钟离心30分钟除去细胞碎片及其他杂质，超速离心。上清用50％～70％的饱和硫酸氨沉淀，沉淀溶解后过亲和层析柱，结合的糖蛋白用10％的α-葡萄糖苷酸钠洗脱。收集洗脱液。在AKTA层析系统上过阴离子柱。结合的蛋白先用300毫摩尔/升NaCl洗脱，然后梯度洗脱直至NaCl浓度为1000毫摩尔/升。每1毫升收集1次，收集液经SDS-PAGE电泳并银染检测。在400～600毫摩尔/升浓度的NaCl时被洗脱下来得到纯化的Chsp108蛋白，分子量约108kDa。银染结果显示纯度在95％以上。对Chsp108进行了基因序列分析，MDV感染引发的鸡肿瘤肝脏组织的Chsp108与正常鸡肝脏组织的Chsp108氨基酸完全相同，没有发生变异；
2.Chsp108 N21-355片段的克隆
从实验室保存的鸡pET-30a-hsp108质粒中克隆N端基因(hsp108出处：为GeneBank收录，收录号为AF387865)。所用引物为：
引物1：5′TTACCCGGGTGAGGAGGTGGATGTGGAT 3′
引物2：5′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′
PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃50秒，55℃50秒，72℃3分钟，共30循环；72℃5分钟。结果证明与已知序列相同。
PCR产物为约1Kd的片段，片段的5′端和3′端人为引入SmaI和SacI二个酶切位点，将扩增片段进行测序。其序列与上述序列相同，其序列具有如序列表3No.1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白具有如序列表3No.2所示的335个氨基酸序列。
3.Chsp108 N21-355片段在大肠杆菌中的表达与蛋白纯化
将扩增片段经SmaI与SacI酶切后连接到表达载体pGEX6p-1中，并转化大肠杆菌BL21，经1mM异丙基-P-P-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4小时后得到表达产物，以10％十二烷(基)硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量为45kDa，与理论值一致。
将Chsp108N-端片段蛋白用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)层析柱(Pharmacia公司)，经亲和层析和分子筛superdex G200(PE公司)进行纯化，以10％SDS-PAGE电泳和银染鉴定纯度，得到大于95％纯度的N端蛋白。表达的蛋白产物用gp96单克隆抗体(NeoMarkers公司)进行Western鉴定，获得阳性结果。
4.Chsp108 N21-355与MDV gB糖蛋白抗原免疫鸡
免疫方式采用将样品溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)中皮下注射。免疫程序为第一次免疫三周后进行第二次免疫。采用皮下注射，将Chsp108 N-端片段与上述MDV gB糖蛋白抗原结合物溶于缓冲液(90％PBS，10％二甲基亚砜/0.1％TFA)中，每支鸡免疫剂量分别为10μg。每次免疫后15天取血，测定抗MDV gB糖蛋白抗原的抗体。单独应用Chsp108N-端片段免疫的鸡不产生抗原特异的抗体，而应用Chsp108N-端片段和MDV gB糖蛋白抗原结合物免疫的小鼠产生抗原特异的抗体，其抗体量为单独应用MDV gB糖蛋白抗原产生抗体的10倍。说明Chsp108 N-端片段对蛋白抗原的免疫原性有明显的增强作用。在新城疫病毒和禽流感病毒的研究中应用实施2，3中的研究方法，发现鸡肝脏Chsp108 N-端片段同样可以增强鸡对上述病毒抗原的免疫反应。
序列表1
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一类新的免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物开发中的应用
<130>tianpo-6-21
<160>8
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<213>Human gp96
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序列表2
<110>中国科学院微生物研究所
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<110>中国科学院微生物研究所
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145 150 155 160
Gln Asp Asp Ser Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val
165 170 175
Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Arg Val Ile Val Thr Ser
180 185 190
Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn Glu
195 200 205
Phe Ser Val Ile Asp Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr
210 215 220
Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Ser Asp His Leu Glu Leu
225 230 235 240
Asp Thr Val Ile Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe
245 250 255
Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro Val
260 265 270
Glu Glu Glu Glu Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Thr Asp Asp Asp Glu
275 280 285
Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys
290 295 300
Val Glu Arg Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys Pro
305 310 315 320
Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys
325 330 335
序列表4
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一类免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物制备中的应用
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>HBV
<400>1
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>HBV
<400>2
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1 5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>HBV
<400>3
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu
1 5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>HBV
<400>4
Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys
1 5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>HBV
<400>5
Phe Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>HBV
<400>6
Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>HBV
<400>7
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
1 5
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>HBV
<400>8
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg
1 5 10
Claims (7)
1.一类人或动物的具有免疫增强活性的热休克蛋白免疫佐剂，其特征在于是由gp96、hsp108或hsp70的N端重组片段，即氨基端具有免疫增强活性片段组成的蛋白。
2.根据权利要求1所述的免疫佐剂，包括gp96、hsp108或hsp70的N端重组片段如序列表1No.2所示的267个氨基酸序列组成的蛋白、序列表1No.4所示的315个氨基酸序列组成的蛋白、序列表1No.6所示的333个氨基酸序列组成的蛋白及序列表1No.8所示的349个氨基酸序列组成的蛋白；具有如序列表2No.2所示的由202个氨基酸序列组成的蛋白；具有如序列表3No.2所示的由335个氨基酸序列组成的蛋白。
3.据权利要求2所述的免疫佐剂，还包括由于其基因的缺失、插入和突变产生的与所述Hgp96、Chsp108和Hhsp70N-端片段的氨基酸序列至少有60％同源性的，并且具有免疫增强活性功能的衍生蛋白。
4.据权利要求1至3所述的免疫佐剂，任选其中之一项在制备疫苗或/和药物中的应用。
5.据权利要求1至3所述的免疫佐剂，选与其宿主来源相同的一项在制备与乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒HIV-1、SARS冠状病毒(SARS-CoV)和口蹄疫病毒(FMDV)的表位肽，共价连接的多表位重组体蛋白和抗原构成治疗性疫苗或药物，禽流感病毒(AIV)或鸡新城疫病毒(NDV)或鸡马立克氏病毒蛋白抗原构成治疗性疫苗或药物中的应用。
6.据权利要求5所述的免疫佐剂，其中乙肝病毒HBV表位肽包括：STLPETTVVRR，FLPSDFFPSV，IPIPSSWAF，WLSLLVPFV、FLLSLGIHL；HCV的表位抗原肽，包括：YLLPPRGPRL、GFADLMGYIPL；HIV-1的表位肽，包括：SILDIRQGPK、CQGVGGPGHK；SARS-CoV的表位肽，包括：LLLDRLNQL、VVFLHVTYV；FMDV的表位肽，包括：IKRAETYCPR、HKQKIVAPEK。
7.根据权利要求1至5所述的免疫佐剂，其通过与抗原物质直接混合、非共价连接或共价连接的方式，免疫剂量为0.10nM至100μM，采用皮下注射或皮内注射或腹腔注射的方式进行免疫。
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