CN102462840A - 乙肝治疗性疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙肝治疗性疫苗。本发明提供的疫苗的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。所述活性成分还可包括含有所述gp96蛋白的编码基因的质粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的编码基因的质粒pcDNA-HB和含有所述乙肝核心蛋白的编码基因的质粒pcDNA-HBc。本发明提供的乙肝治疗疫苗可以有效抑制HBV复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及乙肝治疗性疫苗。
背景技术
尽管可以接种有效的预防性HBV疫苗，全世界现在仍有3.5亿HBV携带者，仅在中国就有9300万人慢性感染HBV，大约15-40％的感染病人可能发展为威胁生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢性HBV感染严重危害公众健康。现有的用于慢性乙肝患者的治疗方法包括IFN-α和核苷或核苷类似物(如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦)，治疗成本高，只有部分效果，而且会引起突变增加HBV耐药性。因此，迫切需要开发新的治疗性疫苗以补充或替代现有的抗病毒治疗方案。由于清除HBV病毒主要是由病毒特异性CTL和辅助性T细胞反应介导，慢性病毒感染的特征是T细胞反应低下，所以T细胞在控制和清除病毒感染方面起着重要作用。
乙肝核心抗原(HBcAg)和乙肝表面抗原(HBsAg)是HBV病毒的主要结构蛋白。已经有研究表明在成功清除HBV的急性感染患者中，与那些慢性感染患者体内微弱的和单一的T细胞反应形成对比，靶向这两种抗原表位的多种特异性CD8+T细胞更容易被检测到，说明HBcAg和HBsAg特异性T细胞反应在控制HBV感染能力方面具有重要作用，而且有研究报道HBV侵染过程中，HBcAg特异性CD8+T细胞与病毒控制相关。
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)具有独特的免疫学功能，其免疫学机制包括两方面。一是HSPs参与T细胞抗原呈递。热休克蛋白存在于细胞浆和内质网膜内，由多个成员组成：HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。热休克蛋白作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用，能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHCI类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应。二是HSPs有效激发天然免疫。热休克蛋白本身是迄今为止发现的唯一的来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，它可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体非特异性免疫反应。有研究表明gp96对于APC中Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)发挥免疫学功能起至关重要的作用，gp96基因缺失的DC细胞中TLRs丧失引发天然免疫的功能，导致转基因小鼠抵抗感染的能力明显降低。
发明内容
本发明的目的是提供乙肝治疗性疫苗。
本发明提供的乙肝治疗疫苗，它的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心蛋白(HBcAg)；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白(HBcAg)由序列表的序列3所示。
所述乙肝治疗疫苗的活性成分可由所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白组成。所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白的质量配比可为1∶(0.5-10)∶(0.5-10)，优选为1∶1∶1。
所述乙肝治疗疫苗的活性成分还可由含有所述gp96蛋白的编码基因的质粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的编码基因的质粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的编码基因的质粒pcDNA-HBc、所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白组成。所述gp96蛋白的编码基因可如序列表的序列2所示；所述乙肝表面抗原的编码基因可如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白的编码基因可由序列表的序列4所示。所述质粒pcDNA-gp96可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点；所述质粒pcDNA-HBs可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列6所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点；所述质粒pcDNA-HBc可为在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列4所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点。所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述质粒pcDNA-gp96、所述质粒pcDNA-HBs和所述质粒pcDNA-HBc的质量配比可为1∶(0.5-10)∶(0.5-10)∶(0.5-5)∶(0.5-5)∶(0.5-5)；所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述质粒pcDNA-gp96、所述质粒pcDNA-HBs和所述质粒pcDNA-HBc的质量配比优选为1∶1∶1∶1∶1∶1或1∶1∶1∶2∶2∶2。
本发明还保护一种乙肝治疗疫苗，它的活性成分由含有gp96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白组成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
本发明还保护一种乙肝治疗疫苗，其特征在于：它的活性成分由含有所述gp96蛋白的编码基因的质粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的编码基因的质粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的编码基因的质粒pcDNA-HBc、含有gp96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白组成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
所述含有gp96蛋白的提取物可为将离体动物组织或离体肿瘤组织或离体肿瘤细胞的匀浆液依次进行ConA-Sepharose层析和HiTrap-Q Sepharose离子交换层析得到的；所述离体动物组织为离体小鼠肝脏、离体猪肝脏或离体人胎盘；所述肿瘤组织为乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌；所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞B16；
所述ConA-Sepharose层析包括如下步骤：(1)将所述匀浆液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；(2)用10倍层析柱柱体积的洗脱液甲洗涤步骤(1)的层析柱，流速为0.5ml/min；所述洗脱液甲的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；(3)用3倍层析柱柱体积的洗脱液乙洗涤步骤(2)的层析柱，流速为0.25ml/min，收集洗脱液，即为洗脱液丙；所述洗脱液乙的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度为10g/mL，加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析包括如下步骤：(a)将所述洗脱液丙上样于层析柱，流速为1ml/min；(b)用5ml NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min；(c)用10ml NaCl浓度为300mM pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min；(d)用3ml NaCl浓度为600mM pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
本发明提供的乙肝治疗疫苗可以有效抑制HBV复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
附图说明
图1为HBsAg、HBcAg和gp96表达产物的鉴定。
图2为HBcAg溶液的SDS-PAGE和western鉴定结果。
图3为rgp96蛋白的鉴定图谱；1：分子量标准；2：步骤(二)的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：rgp96蛋白的western blot。
图4gp96提取物的鉴定图谱。
图5为人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE和western鉴定结果。
图6为各种gp96提取物和重组gp96的SDS-PAGE电泳图。
图7为通过流式细胞仪鉴定gp96可以激活特异性CTL反应的结果。
图8为通过ELISPOT鉴定gp96可以激活T细胞反应的结果。
图9为免疫后小鼠特异性T细胞的ELISPOT检测和T细胞增殖能力测定结果。
图10为免疫后小鼠血清HBsAg抗体水平检测结果。
图11为治疗性疫苗诱导HBV转基因小鼠产生特异性T细胞和抗体检测结果。
图12为rgp96蛋白下调HBV小鼠Treg水平。
图13为HBV小鼠实验血清S抗原、HBV DNA及ALT和鼠肝脏HBc免疫组化检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。抗CD4的抗体：购自BioLegend，产品目录号100407。抗CD8的抗体：购自BioLegend，产品目录号100705。抗CD25的抗体：购自BioLegend，产品编号101906。抗FoxP3的抗体购自eBioscience，产品目录号77-5775；HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgG1抗体、HRP标记的IgG2a抗体均购自SEROTEC公司，产品号分别为STAR117P，STAR132P，STAR133P；TMB显色液购自江苏碧云天公司，产品号P0209；抗HBcAg抗体购自santa cruz，产品目录号为sc-52407；抗HBsAg抗体购自santa cruz，产品目录号为sc-57761。人肝癌细胞HepG2购自ATCC，产品号HB-8065。
热休克蛋白(gp96蛋白)的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码序列如序列表的序列2所示。乙肝核心抗原(Hepatitis B Core Antigen，HBcAg)，其氨基酸序列如序列表的序列3所示，编码基因如序列表的序列4所示。乙肝表面抗原(HepatitisB Surface Antigen，HBsAg)，其氨基酸序列如序列表的序列5所示，编码基因如序列表的序列6所示。
实施例1、HBsAg基因、HBcAg基因和gp96基因的表达能力验证
一、重组质粒的构建
制备序列表的序列2所示的DNA，插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(购自Invitrogen公司，产品编号V790-20)的EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-gp96。
制备序列表的序列2所示的DNA，插入pEGFP-N1的EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒pEGFP-N1-gp96。
制备序列表的序列4所示的DNA，插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1的EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-HBcAg(pcDNA-HBc)。
制备序列表的序列6所示的DNA，插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1的EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-HBsAg(pcDNA-HBs)。
二、基因的表达能力检测
将重组质粒pcDNA-gp96转染293T细胞；将pcDNA3.1转染293T细胞，作为阴性对照；将293T细胞作为空白对照；48小时后western检测蛋白水平。结果见图1A。重组质粒pcDNA-gp96转染的细胞中热休克蛋白gp96的含量远高于空白对照和阴性对照。
将重组质粒pEGFP-N1-gp96转染HepG2细胞，24小时后在荧光显微镜下观察EGFP荧光水平，见图1C，pEGFP-N1-gp96表达60-70％。将pEGFP-N1转染HepG2细胞，24小时后在荧光显微镜下观察EGFP荧光水平，见图1B，pEGFP-N1表达70-80％。
将重组质粒pcDNA-HBcAg转染293T细胞；将pcDNA3.1转染293T细胞，作为阴性对照；将293T细胞作为空白对照；48小时后通过ELISA检测HBcAg，见图1E。
将重组质粒pcDNA-HBsAg转染293T细胞；将pcDNA3.1转染293T细胞，作为阴性对照；将293T细胞作为空白对照；48小时后通过ELISA检测HBsAg，见图1D。
实施例2、HBcAg的制备
1、制备序列4所示的DNA，插入原核表达载体pGEX(购自GE公司，产品号28-9546-48，载体上带有GST标签)的BamH1和Xho1酶切位点之间，得到重组质粒pGEX-HBcAg。
2、将重组质粒pGEX-HBcAg导入大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技公司，产品号CB101-03)，得到重组菌。
3、将重组菌接种于LB培养基，培养至OD≈0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃继续培养4h。
4、收集菌体在冰浴条件下超声破碎(200W，破碎4s停6s，99次3个循环)，4℃下12000转/min离心20min。收集上清。
5、将上清4℃进行亲和层析，载体为Glutathione-Sepharose 4B(购自GE公司，产品编号17-5132-01)，采用还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mmol/L reducedglutathione，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。
6、将洗脱液用超滤浓缩法更换成酶切缓冲体系(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0；150mmol/L NaCl；1mmol/L DTT；1mmol/L EDTA，pH 8.0)，加入过量PreScission Protease酶(PSP蛋白；购自GE公司，产品编号27-0843-01)，4℃酶切16h。
7、将酶切后的酶切体系用超滤浓缩法更换成PBS缓冲液，然后进行亲和层析，载体为Glutathione-Sepharose 4B，采用PBS缓冲液进行洗脱，GST和PSP结合到层析柱上，收集洗脱液，即为HBcAg蛋白(溶液)。
将HBcAg蛋白进行SDS-PAGE和western鉴定。western鉴定所用的一抗为抗HBcAg抗体(购自santa cruz，产品目录号为sc-52407)。步骤5的洗脱液的SDS-PAGE电泳图见图2的泳道2，HBcAg溶液的SDS-PAGE电泳图见图2的泳道3，western鉴定图见图2的泳道4。
8、利用TritonX-114萃取法去除内毒素
取HBcAg蛋白加入Triton X-114(Triton X-114的体积百分含量为1％)，4℃混匀30min，置于37℃水浴中10min，4℃20000g离心10min，取上清(含有HBcAg蛋白)；重复上述步骤两次，得到去除内毒素的HBcAg(内毒素去除率达到99％)，将其用于实施例6和7的免疫。
采用鲎试剂法检测去除内毒素的HBcAg中的内毒素含量(唐宝璋 燕奎华 黄礼云庄林 游晶 陈红英.慢性乙型肝炎患者血清内毒素、IL-4、IL-18水平的变化.世界华人消化杂志，2003，11(12)：2041-2.)。内毒素浓度低于10EU/mg。
实施例3、重组gp96蛋白(rgp96)的制备
一、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建
1、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
上游引物：5’-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3’；
下游引物：5’-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3’。
3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号V20520)，回收载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96。
测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列)。
6、在重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段(序列表的序列3所示的DNA)，BamHI酶切位点插入α-淀粉酶报告系统(序列表的序列4所示的DNA)，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。
二、rgp96蛋白的表达
1、采用电转化法将重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号MYA-335)细胞，得到重组菌。
2、将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。
3、将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养；使用氨水控制pH维持在5.5；每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上；根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组rgp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵。
三、rgp96蛋白的分离纯化
将步骤(二)的发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞；破碎后的细胞12000转/min离心20min，收集上清液；上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液，将滤液进行浓缩，得到浓缩液。
将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h；然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h；将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样；用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值＜0.01；用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液(即为rgp96蛋白)；所有操作在4℃下进行，流速为0.5mL/min。
每升步骤(二)的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的rgp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液进行离子交换层析(Q柱)，主要步骤：200mM NaCl的PBS液平衡；上样；300mM NaCl的PBS液洗杂质；800mM NaCl的PBS液洗目的蛋白。
将步骤(二)的发酵液、亲和层析后的洗脱液(rgp96蛋白)和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后进行考染，见图3。rgp96蛋白的纯度达90％以上。将rgp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，见图3。
实施例4、gp96提取物的制备
用小鼠肝脏制备gp96提取物，方法如下：
1、组织匀浆
匀浆缓冲液配方：在pH7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S)至终浓度1mM(置于冰上的烧杯中配置；PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜)。
取烧杯置于冰上，将BALB/c小鼠肝组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液；将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上；匀浆液倒入离心管，50,000g离心60min，取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5,200mM NaCl)，用于步骤2的ConA-Sepharose层析。
2、ConA-Sepharose层析
载体为ConA-Sepharose(购自GE公司，产品号17-0440-01)，按“1ml载体/4g组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm。
将上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS(pH7.5,200mM NaCl)中加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液甲；用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱(0.5ml/min)，以去除未结合蛋白。在PBS(pH7.5,200mM NaCl)中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度10％(10g/mL)，加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液乙；用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过层析柱(0.25ml/min)，收集洗脱液。
3、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析
载体为HiTrap-Q Sepharose(层析柱为HiTrap Q HP；购自GE公司，产品号17-1153-01)。层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。
将载体装柱后，先用5ml PBS(pH7.5,200mM NaCl)清洗(1ml/min)。将步骤2的洗脱液上样(1ml/min)；然后将5ml PBS(pH7.5,200mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将10ml PBS(pH7.5,300mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将3ml PBS(pH7.5,600mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，收集洗脱液，即为gp96提取物(mgp96)。
将gp96提取物进行10％SDS-PAGE，然后考染，见图4的泳道1。将gp96提取物进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号sc-56399)，见图4的泳道2。
除了小鼠肝脏，也可用如下组织中制备gp96提取物：小鼠黑色素瘤(B16)、猪肝脏、人肝癌细胞系HepG2培养细胞、临床手术切除的人肿瘤组织(乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌)和人胎盘；提取方法参照小鼠肝脏的提取。图5为用人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE电泳图(泳道2)和western鉴定图(泳道3)。用多种哺乳动物组织制备的gp96提取物、用各种肿瘤组织制备的gp96提取物和用酿酒酵母或毕氏酵母表达的重组gp96蛋白的SDS-PAGE电泳图见图6。
实施例5、rgp96蛋白和gp96提取物对特异性T细胞反应的激活
HBcAg87-95：是乙肝核心蛋白表位87-95，序列为SYVNTNMGL，由上海吉尔生化公司合成。rgp96为实施例3制备的rgp96蛋白。mgp96为实施例4制备的gp96提取物。
6-8周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠分成四组，每组6-8只，分别进行免疫(每次各组的免疫体积相同)：
第一组(rgp96)：每只小鼠每次免疫50μg HBcAg87-95和20μg rgp96；
第二组(mgp96)：每只小鼠每次免疫50μg HBcAg87-95和20μg mgp96；
第三组(FA/IFA；阳性对照)：每只小鼠每次免疫50μg HBcAg87-95和弗氏佐剂；
第四组(PBS；阴性对照)：每只小鼠每次免疫PBS。
gp96(rgp96或mgp96)与HBcAg87-95免疫前50℃孵育10分钟，然后室温放置30分钟以形成蛋白多肽复合物。分别于第1、2、4周各进行一次皮下免疫，最后一次免疫1周后处死小鼠分离脾细胞，进行流式细胞仪检测(采用FITC标记的抗CD8的抗体和PE标记的Pentamer)和ELISPOT检测，考察小鼠脾细胞中CD8+T细胞数量和肽特异性CTL。
流式细胞仪检测结果见图7。用流式细胞仪检测结果见图7A，CD8+T细胞占脾细胞的比例见图7C，HBcAg87-95特异性CD8+T细胞占CD8+T细胞的比例见图7B。第一组和第二组的HBcAg87-95特异性CTL明显高于第三组和第四组，第一组和第二组之间没有显著差异。第一组、第二组和第三组CD8+T细胞明显高于第四组。即用mgp96(或rgp96)作为佐剂与HBcAg87-95联合免疫，可以使CD8+T细胞和HBcAg87-95特异性CTL明显增加(P＜0.01)，mgp96和rgp96引发的CLT没有明显区别(P＞0.01)。
ELISPOT分析结果见图8。与流式细胞仪检测结果一致。说明mgp96和rgp96均具有很强的免疫佐剂功能，二者均能激活特异性T细胞反应。
采用同样的方法检测从各个组织(小鼠肝脏、猪肝脏、人胎盘、黑色素瘤、乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌)中制备的gp96提取物的免疫活性，ELISPOT验证各个gp96提取物均能刺激产生抗原肽特异性CTL(所有P＜0.01)。
实施例6、免疫方法的比较
实施例中用于蛋白免疫的HBcAg是实施例2中制备得到的去除内毒素的HBcAg。实施例中用于蛋白免疫的HBsAg购自北京天坛生物制品股份有限公司，批准文号：国药准字S10980007。实施例中用于蛋白免疫的rgp96是实施例3中制备得到的rgp96。实施例中用作DNA免疫的为实施例1中制备的重组质粒pcDNA-gp96、重组质粒pcDNA-HBcAg(pcDNA-HBc)和重组质粒pcDNA-HBsAg(pcDNA-HBs)。gp96佐剂指的是重组质粒pcDNA-gp96或rgp96。
进行蛋白免疫前，将用于免疫的蛋白在组装体系中进行组装。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM HEPES(pH7.2)，20mM NaCl，2mM MgCl2，100mM KCl，1mM PMSF；组装条件：45℃10分钟(也可采用45℃10-30分钟，或4℃30-120分钟)。rgp96与HBcAg、HBsAg的添加比例为1∶(0.5-10)∶(0.5-10)。gp96的蛋白用量为10-200微克/次，DNA载体用量为20-500微克/次。HBcAg和HBsAg用量为5-2000微克/次，DNA载体用量为5-2000微克/次。使用方式为皮下注射、皮内注射或肌肉注射等。
设计3种免疫方案：DNA免疫，蛋白免疫和DNA初免-蛋白加强免疫方案。首先测定哪种方法能最大程度诱导CTL反应，6-8周龄的雌性BALB/c小鼠用HBs和HBc DNA，或者HBs和HBc蛋白，或者DNA初免-蛋白加强方法免疫3次，添加或不加gp96作为佐剂，具体实验分组如表1所示。
表1各组BALB/c小鼠的免疫情况
第3次免疫后1周，测定针对HBsAg和HBcAg的CTL扩增反应。ELISPOT试验分析免疫后小鼠脾细胞中抗原特异性T细胞数量，用植物凝集素(PHA)作为阳性对照。如图9A所示，与不加gp96佐剂相比，使用gp96佐剂的DNA组(组2)或蛋白疫苗组(组4)产生的针对HBsAg和HBcAg的斑点数显著增加(p＜0.05)。值得注意的是，用DNA初免-蛋白加强实验组(组5)的T细胞反应最明显。用BSA作为ELISPOT阴性对照，发现不能有效刺激T细胞，说明gp96诱导T细胞是抗原特异性的。由于T细胞增殖是体内免疫的一个重要的体外参数，进一步用3H掺入试验测定T细胞增殖能力(图9B)，发现与单独免疫DNA或蛋白组比较，gp96能够增加DNA初免-蛋白加强免疫组(组5)的T细胞增殖水平(p＜0.05)。
同时，小鼠首次免疫后，每隔1周用ELISA检测HBsAg的抗体水平，发现初免3周后，添加gp96佐剂的蛋白免疫组有明显的佐剂功能(图10)。4周后，相比S抗原和C抗原单独免疫组，添加gp96佐剂的免疫组的IgG(图10A)、IgG1(图10B)和IgG2a(图10C)分别增加了1.5倍、3.7倍和2.2倍且具有统计学意义(P＜0.05或0.01)。另外，使用gp96佐剂的DNA初免-蛋白加强免疫组的IgG、IgG1和IgG2a水平也明显高于只用S抗原和C抗原免疫组(P＜0.01)，免疫5周后直至小鼠处死时，仍可以观察到类似的结果。这些数据表明，gp96既能增加T细胞反应也能增强体液免疫。与DNA免疫组相比，使用蛋白和DNA初免-蛋白加强并加入gp96的免疫组能更有效的激活T细胞和体液免疫，因此，选取这两种免疫方法进行后续实验。
实施例7、乙肝治疗性疫苗的制备和效果评价
实施例中用于蛋白免疫的HBcAg是实施例2中制备得到的去除内毒素的HBcAg。实施例中用于蛋白免疫的HBsAg购自北京天坛生物制品股份有限公司，批准文号：国药准字S10980007，氨基酸序列如序列表的序列5所示。实施例中用于蛋白免疫的rgp96是实施例3中制备得到的rgp96。实施例中用作DNA免疫的为实施例1中制备的重组质粒pcDNA-gp96、重组质粒pcDNA-HBcAg(pcDNA-HBc)和重组质粒pcDNA-HBsAg(pcDNA-HBs)。
一、分组给药
HBV转基因小鼠(购自中国人民解放军第四五八医院全军肝病中心)进行分组，每组10只，分别免疫。
第一组(组1)：第1次免疫重组质粒pcDNA-HBs(20微克/只)和重组质粒pcDNA-HBc(20微克/只)；第2次免疫HBcAg(10微克/只)和HBsAg(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(10微克/只)和HBsAg(10微克/只)。
第二组(组2)：第1次免疫重组质粒pcDNA-HBs(20微克/只)、重组质粒pcDNA-HBc(20微克/只)和pcDNA-gp96(20微克/只)；第2次免疫HBcAg(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和rgp96(10微克/只)。
第三组(组3)：第1次免疫HBcAg(10微克/只)和HBsAg(10微克/只)；第2次免疫HBcAg(10微克/只)和HBsAg(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(10微克/只)和HBsAg(10微克/只)。
第四组(组4)：第1次免疫HBcAg(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和rgp96(10微克/只)；第2次免疫HBcAg(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和rgp96(10微克/只)。
第五组(空白组)：第一次免疫pcDNA3.1(20微克/只)；第二次免疫pcDNA3.1(20微克/只)；第三次免疫pcDNA3.1(20微克/只)。
第六组(组6)：第1次免疫重组质粒pcDNA-HBs(5微克/只)、重组质粒pcDNA-HBc(5微克/只)和pcDNA-gp96(5微克/只)；第2次免疫HBcAg(5微克/只)、HBsAg(5微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(5微克/只)、HBsAg(5微克/只)和rgp96(10微克/只)。
第七组(组7)：第1次免疫重组质粒pcDNA-HBs(50微克/只)、重组质粒pcDNA-HBc(50微克/只)和pcDNA-gp96(50微克/只)；第2次免疫HBcAg(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和rgp96(10微克/只)。
第八组(组8)：第1次免疫HBcAg(5微克/只)、HBsAg(5微克/只)和rgp96(10微克/只)；第2次免疫HBcAg(5微克/只)、HBsAg(5微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(5微克/只)、HBsAg(5微克/只)和rgp96(10微克/只)。
第九组(组9)：第1次免疫HBcAg(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和rgp96(10微克/只)；第2次免疫HBcAg(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和rgp96(10微克/只)；第3次免疫HBcAg(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和rgp96(10微克/只)。
进行DNA免疫前，将各个质粒混合。进行蛋白免疫前，将用于免疫的蛋白在组装体系中进行组装。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM HEPES(pH7.2)，20mMNaCl，2mM MgCl2，100mM KCl，1mM PMSF；组装条件：45℃10分钟(也可采用45℃10-30分钟，或4℃30-120分钟)。免疫方式为皮下注射，第一次免疫时间为实验第一周、第二次免疫时间为实验第二周、第三次免疫时间为实验第四周，第八周时进行分析。
二、免疫相关因子的分析
取小鼠脾细胞进行ELISPOT分析。(ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书)，结果见图11A(抗体为抗HBcAg抗体和抗HBsAg抗体)和图11B(抗体为CD8+抗体)。由图11A可见：第一组至第四组、第六组至第九组能引起很强的T细胞反应，而第五组只有很弱的T细胞反应，说明转基因鼠对HBV产生免疫耐受；第二组与第一组相比，第四组与第三组相比，小鼠针对HBcAg和HBsAg的特异性T细胞活化程度显著增加。由图11B可见，第二组和第四组CD8+T数量显著高于第一组和第三组，第五组数量最低。
取小鼠肝脏进行免疫组化(抗体为CD8+抗体)，结果见图11C和图11D。由图11C和图11D可见，第二组和第四组中肝浸润性CD8+T细胞数量显著高于第一组和第三组，九组中第五组数量最低。
取小鼠血清进行ELISA检测，操作如下：每孔包被10ug HBsAg(或HBcAg)，4℃孵育过夜，然后再以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；将血清稀释，每孔加入100ul，共加3孔，分别检测IgG、IgG1、IgG2a；37℃孵育2h，再以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；分别加入HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgG1抗体、HRP标记的IgG2a抗体，37℃孵育1h；再以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；每孔加入100ulTMB显色液，37℃放置15min后加入50ul 2M硫酸终止反应，在酶标仪上以波长490nm检测。结果见图11E(包被HBsAg)和图11F(包被HBcAg)。第二组与第一组相比，第四组与第三组相比，其它八组与第九组相比，体液免疫水平均有显著增加。
以上结果证明第一组至第四组、第六组至第九组均可以产生特异性T细胞和体液免疫，其中第二组、第四组、第六至九组由于使用gp96佐剂能明显增加T细胞反应。
由于CD4+CD25+FoxP3+Treg能抑制多种细胞包括CD4+和CD8+T细胞的活化、增殖和功能作用，测定了小鼠脾脏Treg水平，以了解Treg在gp96诱导T细胞反应和打破HBV免疫耐受的作用。Treg定义为CD4+CD25+FoxP3+T细胞数所占CD4+T细胞总数的百分比。Treg流式测定结果见图12A，测定数据分析结果见图12B。各组的Treg如下：第一组9.09±0.67，第二组6.61±0.72，第三组11.39±0.74，第四组6.63±0.58，第一组和第二组之间P＜0.05，第三组和第四组之间P＜0.01。第二组和第一组相比，Treg降低27％。第四组和第二组相比，Treg降低41％。研究结果提示，gp96增强T细胞反应与Treg活性的降低有关，gp96具有打破HBV小鼠免疫耐受的作用。
三、疫苗效果评价
自初次免疫开始，每周检测一次小鼠血清中S抗原、HBV DNA和丙氨酸转氨酶水平以及小鼠肝中的C抗原水平。
1、检测血清中的S抗原
血清中S抗原采用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)检测(购自上海科华生物技术有限公司，批准文号：国药准字S10910113)；操作步骤按照生产商说明书进行。
各组的比较见图13A，与第5组相比，其它八组的S抗原在第6周开始下降。rgp96蛋白的添加与否，在初免/加强方法(组2vs组1，1.3±0.11vs1.5±0.07，P＜0.05)和蛋白免疫方法(组4vs组3，1.5±0.10vs1.75±0.12，P＜0.05)对于S抗原的影响具有显著差异。
第8周：第一组的S抗原为0.50ug/ml，第二组的S抗原为0.39ug/ml，第三组的S抗原为0.53ug/ml，第四组的S抗原为0.425ug/ml，第五组的S抗原为0.69ug/ml，第六组的S抗原为0.44ug/ml，第七组的S抗原为0.35ug/ml，第八组的S抗原为0.48ug/ml，第九组的S抗原为0.45ug/ml。
2、检测血清中的HBV DNA
使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(购自中山大学达安基因股份有限公司，产品号Cat.#DA-B051)的对小鼠100ul血清进行DNA拷贝数的绝对定量；按照生产商产品说明书进行操作。
第8周各组的比较见图13B，与第5组相比，其它八组的HBV DNA拷贝数明显降低达100倍以上，低于或接近于qPCR检测极限。在初免-加强免疫组，rgp96蛋白对HBV DNA水平的影响具有明显差异。
第8周：第一组的DNA水平为104个拷贝，第二组的DNA水平为102.5个拷贝，第三组的DNA水平为103.75个拷贝，第四组的DNA水平为103.1个拷贝，第五组的DNA水平为106个拷贝，第六组的DNA水平为103.3个拷贝，第七组的DNA水平为102.2个拷贝，第八组的DNA水平为103.65个拷贝，第九组的DNA水平为103.5个拷贝。
3、检测血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)
采用丙氨酸转氨酶检测试剂盒检测小鼠血清中的ALT水平(检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司，产品号6129B)；按照产品说明书对小鼠血清进行转氨酶检测。
结果见图13C，其它八组的血清ALT水平在第3周时开始升高，第5周达到峰值，到第8周时回复到正常水平，而第5组血清ALT水平保持稳定。与S抗原和HBV DNA的检测结果对照分析，所有免疫组的病毒学和ALT变化模式相似，随着血清S抗原的降低，ALT也降低或正常化。丙氨酸转氨酶检测结果同S抗原和HBV DNA分析结果一致。
第8周：第一组的ALT水平为30U/L，第二组的ALT水平为35U/L，第三组的ALT水平为30U/L，第四组的ALT水平为28U/L，第五组的ALT水平为23U/L，第六组的ALT水平为32U/L，第七组的ALT水平为38U/L，第八组的ALT水平为30U/L，第九组的ALT水平为31U/L。
4、检测肝细胞的C抗原
将小鼠肝脏进行免疫组化(抗体为抗HBcAg抗体)，结果见图13D，统计HBc阳性细胞在肝细胞中的比例，见图13E。
第一组的比例为12％，第二组的比例为7％，第三组的比例为17％，第四组的比例为8％，第五组的比例为70％，第六组的比例为8.3％，第七组的比例为6％，第八组的比例为11％，第九组的比例为9.5％。
除了第5组以外的八组肝细胞的C抗原表达降低，肝细胞C抗原的阳性率由第5组的70％下降为免疫组低于20％。值得注意的是，用S/C抗原和gp96免疫组的C抗原表达比对照降低90％以上。两种免疫方法中，rgp96蛋白的有无对于肝细胞C抗原阳性率具有显著差异(初免/加强方法：组2vs组1，7％vs 12％，P＜0.05；蛋白免疫法：组4vs组3，8％vs 17％，P＜0.05)。
采用从各种哺乳动物组织如猪肝脏、小鼠肝脏和人胎盘，或从人的各种肿瘤组织如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、胃癌等分离纯化的gp96，或用酵母，包括汉逊酵母、毕赤酵母或酿酒酵母表达的gp96制备乙肝治疗性疫苗，通过HBV转基因鼠免疫实验验证以上来源的gp96均能刺激产生HBs和HBc抗原特异性CTL，对病毒有显著的抑制活性。
Claims (10)
1.一种乙肝治疗疫苗，它的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
2.如权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于：所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白的质量配比为1∶(0.5-10)∶(0.5-10)，优选为1∶1∶1。
3.如权利要求1或2所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于：它的活性成分由所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白组成。
4.如权利要求1或2所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于：它的活性成分由含有所述gp96蛋白的编码基因的质粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的编码基因的质粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的编码基因的质粒pcDNA-HBc、所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白组成。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述gp96蛋白的编码基因如序列表的序列2所示；所述乙肝表面抗原的编码基因如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白的编码基因由序列表的序列4所示。
6.如权利要求4或5所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于：所述质粒pcDNA-gp96是在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点；所述质粒pcDNA-HBs是在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列6所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点；所述质粒pcDNA-HBc是在载体pcDNA3.1的多克隆位点插入序列表的序列4所示的DNA得到的重组质粒，所述多克隆位点优选为EcoR I和Xho I酶切位点。
7.如权利要求4或5或6所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于：所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述质粒pcDNA-gp96、所述质粒pcDNA-HBs和所述质粒pcDNA-HBc的质量配比为1∶(0.5-10)∶(0.5-10)∶(0.5-5)∶(0.5-5)∶(0.5-5)；所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述质粒pcDNA-gp96、所述质粒pcDNA-HBs和所述质粒pcDNA-HBc的质量配比优选为1∶1∶1∶1∶1∶1或1∶1∶1∶2∶2∶2。
8.一种乙肝治疗疫苗，它的活性成分由含有gp96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白组成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
9.一种乙肝治疗疫苗，其特征在于：它的活性成分由含有所述gp96蛋白的编码基因的质粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的编码基因的质粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的编码基因的质粒pcDNA-HBc、含有gp96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白组成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
10.如权利要求8或9所述的疫苗，其特征在于：所述含有gp96蛋白的提取物是将离体动物组织或离体肿瘤组织或离体肿瘤细胞的匀浆液依次进行ConA-Sepharose层析和HiTrap-Q Sepharose离子交换层析得到的；所述离体动物组织为离体小鼠肝脏、离体猪肝脏或离体人胎盘；所述肿瘤组织为乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌或胃癌；所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞B16；
所述ConA-Sepharose层析包括如下步骤：
(1)将所述匀浆液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；
(2)用10倍层析柱柱体积的洗脱液甲洗涤步骤(1)的层析柱，流速为0.5ml/min；所述洗脱液甲的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
(3)用3倍层析柱柱体积的洗脱液乙洗涤步骤(2)的层析柱，流速为0.25ml/min，收集洗脱液，即为洗脱液丙；所述洗脱液乙的制备方法为：在NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度为10g/mL，加苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；
所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析包括如下步骤：
(a)将所述洗脱液丙上样于层析柱，流速为1ml/min；
(b)用5ml NaCl浓度为200mM pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min；
(c)用10ml NaCl浓度为300mM pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min；
(d)用3ml NaCl浓度为600mM pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
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