CN105194668A - 一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用。本发明将PD1抗体与gp96蛋白联合应用，以期最大程度的减少PD1/PDL1对gp96治疗性疫苗活化T细胞的抑制作用，增强gp96蛋白的免疫活性。通过实验证明：PD1抗体大大提高了肿瘤组织来源的gp96对T细胞免疫反应的激活作用，明显抑制了肿瘤细胞的生长，并显著提高以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对HBV复制的抑制作用，增强了乙肝治疗性疫苗的抗病毒能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用。
背景技术
热休克蛋白(heatshockproteins，HSPs)具有独特的免疫学功能，其免疫学机制包括二方面：一是参与T细胞抗原呈递；二是有效激发天然免疫。热休克蛋白存在于细胞浆和内质网膜内，由多个成员组成，如HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。热休克蛋白作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用，另一个重要功能是能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHCI类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应答。
热休克蛋白本身是迄今为止发现的唯一的来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，它可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体非特异性免疫反应。有研究表明gp96对于APC中Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)发挥免疫学功能起至关重要的作用，gp96基因缺失的DC细胞中TLRs丧失引发天然免疫的功能，导致转基因小鼠抵抗感染的能力明显降低。
热休克蛋白-多肽复合物治疗性疫苗已用于临床试验。HSP治疗性疫苗治疗肿瘤的独特优势，由于肿瘤细胞是一种变异的细胞，因此外源性地给予非特异性或特异性免疫因子或细胞，增强或扩大机体的免疫力，可达到清除体内肿瘤细胞的目的。基于这个原理，多种非特异性免疫学治疗方法如给予外源性白介素2、干扰素、LAK细胞的输注等方法均已在临床使用，但疗效并不令人满意。其主要原因之一是存在肿瘤免疫逃逸。肿瘤细胞常常丢失肿瘤抗原的表达或改变其抗原表达谱，使得针对已知肿瘤抗原而设计的肿瘤疫苗不能有效激发针对肿瘤细胞的免疫反应；研究表明肿瘤具有个体特异性，肿瘤的特异性不仅表现在肿瘤类型之间，还表现在不同个体之间，即同种类型肿瘤患者中，不同个体的肿瘤生物学和免疫学特性也存在显著差别。HSP天然结合肿瘤细胞中各种抗原，因此将热休克蛋白开发成个体化肿瘤疫苗，可以充分考虑到患者个体间的差异，以达到最佳治疗效果。开展个体化治疗亦是当今医学及药物学发展的必然方向之一。
近6年来，HSPgp96-多肽复合物用于临床试验相继在美国、英国、德国、意大利及俄罗斯等国的医院或癌症中心进行，主要用于胃癌、前列腺癌、肾癌，黑色素瘤等肿瘤和HIV、生殖器泡疹等传染性疾病的治疗。目前肾癌和恶性黑色素瘤的治疗完成临床III期，直肠癌和淋巴瘤已完成临床II期。该治疗方法在俄罗斯已经批准上市。从已有的临床资料看，gp96-抗原复合物作为自体疫苗治疗肿瘤疗效无容置疑，肾细胞癌和黑色素瘤已经完成III期临床，接受治疗的患者数量大，并具有统计学意义，M1a和M1b期患者接受10次以上的免疫，平均存活期比医生选择的治疗延长18.4个月(31.2vs12.8月，P＝0.03，危险比HR＝0.45)。对未转移肾癌患者治疗的III期临床资料发现中等风险患者(n＝362)(包括I/II期，III期的T1/2/3)接受gp96自体疫苗治疗，复发时间延长45％(P<0.01，危险比HR＝0.55)，与对照相比复发时间延长约1.8年，同时接受治疗的患者存活期延长。
PD1(programmedcelldeath1)为CD28超家族成员，主要表达于已被激活的T细胞、B细胞、树突状细胞和单核巨噬细胞膜表面，PD1通过与其配体分子PDL1(programmedcelldeathligand1)相互作用抑制了机体的固有或适应性的免疫应答。临床发现，在肿瘤患者的瘤内和乙肝患者的肝脏中，由于被激活的T细胞表面PD1分子的表达上调，以及CTL释放的干扰素同时上调了靶细胞膜表面PDL1的表达，使得T细胞的杀伤效应受到显著抑制。目前，已经开发出了针对PD1分子的单克隆抗体，用于封闭PD1/PDL1的相互作用，恢复被抑制的T细胞应答。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有免疫治疗疾病功能的试剂盒。
本发明提供的具有免疫治疗疾病功能的试剂盒包括包括如下1)或2)：
1)gp96蛋白和PD1抗体，所述gp96蛋白和PD1抗体分别包装和配套使用；
2)由gp96蛋白与PD1抗体偶联得到的gp96-PD1抗体偶联物；
所述gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(1)或(2)：
(1)作为活性成分而免疫治疗肿瘤；
(2)作为疫苗佐剂制备疫苗、进而免疫治疗病毒感染引起的疾病；
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(a)-(d)中至少一种：
(a)激活和增强机体T细胞对病原的免疫应答反应；
(b)使病原特异性T细胞数量增多；
(c)促进T细胞杀伤带有病原的细胞；
(d)抑制病原增殖或生长。
上述试剂盒中，
所述gp96蛋白和所述PD1抗体的质量比为1:1；
所述偶联物中，所述gp96蛋白和所述PD1抗体的偶联比为1:1。
上述试剂盒中，
所述gp96蛋白为利用昆虫细胞表达系统获得的gp96蛋白或来源于离体的肿瘤组织或肿瘤细胞的gp96蛋白；
具体的，所述肿瘤细胞具体为黑色素瘤细胞或乳腺癌细胞或肝癌细胞；
具体的，所述肿瘤组织具体为黑色素瘤组织或乳腺癌组织或脑胶质瘤组织或肾癌组织或肠癌组织或肝癌组织或胃癌组织；
再具体的，所述黑色素瘤细胞具体为黑色素瘤细胞系B16；
再具体的，所述乳腺癌细胞具体为乳腺癌细胞系4T1；
再具体的，所述肝癌细胞具体为肝癌细胞系H22。
上述试剂盒在具体应用时，所述gp96蛋白的来源依据病原而选择，如治疗肝癌，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞，治疗黑色素瘤，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞，治疗乳腺癌，则gp96蛋白最好来源于乳腺癌细胞，治疗乙型肝炎，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞。
本发明的另一个目的是提供一种上述gp96-PD1抗体偶联物的制备方法。
本发明提供的上述gp96-PD1抗体偶联物的制备方法包括如下步骤：
1)分别制备醛化gp96蛋白溶液和PD1抗体溶液；
所述醛化gp96蛋白溶液为将gp96蛋白与戊二醛溶液反应，得到醛化的gp96蛋白溶液；
所述PD1抗体溶液为将PD1抗体溶于NaCl水溶液，得到PD1抗体溶液；
2)将所述醛化gp96蛋白溶液和所述PD1抗体溶液在缓冲体系中反应，得到gp96-PD1抗体偶联物；
所述gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示.
上述方法中，
所述醛化的gp96蛋白溶液中gp96蛋白的浓度为10mg/mL；
所述PD1抗体溶液中PD1抗体的浓度为5mg/mL；
所述醛化gp96蛋白溶液和所述PD1抗体溶液的体积比为0.4：1；
所述步骤1)的反应条件为25℃条件下反应18h；
所述步骤2)的反应条件为4℃透析过夜；
所述缓冲体系的pH值为9.6；
本发明还有一个目的是提供上述方法制备得到的gp96-PD1抗体偶联物。
上述试剂盒或上述gp96-PD1抗体偶联物在制备具有免疫治疗疾病功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述免疫治疗疾病为如下(1)或(2)：
(1)作为活性成分而免疫治疗肿瘤；
(2)作为疫苗佐剂制备疫苗、进而免疫治疗病毒感染引起的疾病；
和/或，所述免疫治疗疾病为如下(a)-(d)中至少一种：
(a)激活和增强机体T细胞对病原的免疫应答反应；
(b)使病原特异性T细胞数量增多；
(c)促进T细胞杀伤带有病原的细胞；
(d)抑制病原增殖或生长。
上述应用中，所述病原为肿瘤或病毒；
具体的，所述病毒为乙型肝炎病毒；
具体的，所述肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或黑色素瘤。
上述应用中，gp96蛋白的来源依据病原而选择，如治疗肝癌，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞，治疗黑色素瘤，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞，治疗乳腺癌，则gp96蛋白最好来源于乳腺癌细胞，治疗乙型肝炎，则gp96蛋白最好来源于肝癌细胞。
本发明的最后一个目的是提供一种乙肝疫苗。
本发明提供的乙肝疫苗由乙肝表面抗原HBsAg、乙肝核心蛋白HBc149和佐剂组成；所述佐剂为权利要求1-3或6中任一所述的gp96-PD1抗体偶联物或gp96蛋白与PD1抗体的混合物。
上述乙肝疫苗中，所述gp96-PD1抗体偶联物、所述乙肝表面抗原HBsAg和所述乙肝核心蛋白HBc149的质量比为6.41：1：1；
所述gp96蛋白与PD1抗体的混合物中的gp96蛋白和PD1抗体的质量比为1:1；
上述乙肝疫苗中，所述gp96蛋白来源于肝癌细胞；所述gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
上述乙肝疫苗在制备治疗和/或预防乙肝病毒引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述疾病具体可为乙型肝炎。
本发明将PD1抗体与gp96蛋白联合应用，PD1抗体大大提高了肿瘤组织来源的gp96对T细胞免疫反应的激活作用，明显抑制了肿瘤细胞的生长，并显著提高以gp96蛋白为佐剂的乙肝治疗性疫苗对HBV复制的抑制作用，增强了乙肝治疗性疫苗的抗病毒能力。通过试验证明：gp96-PD1抗体偶联物不仅可以通过提高乙肝疫苗对乙肝病毒的抑制作用来治疗乙型肝炎；还可以通过抑制肿瘤细胞的生长来治疗黑色素瘤和/或乳腺癌和/或肝癌，最大程度的减少了PD1/PDL1对gp96治疗性疫苗活化T细胞的抑制作用，增强gp96蛋白的免疫活性。
附图说明
图1为昆虫细胞表达系统表达的分泌型人热休克蛋白gp96的SDS-PAGE鉴定结果。
图2为来源于黑色素瘤组织的gp96蛋白经纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。
图3为WesternBlot免疫印迹试验检测来源于肿瘤组织的gp96蛋白。
图4为原核表达的乙肝核心蛋白HBc149抗原经纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。
图5为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，脾脏淋巴细胞中HBsAg和HBc149特异性T细胞的ELISPOT检测结果，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图6为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，利用流式细胞仪分析脾脏淋巴细胞中IFN-γ+CD8+T细胞的数量，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图7为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，利用流式细胞仪分析脾脏淋巴细胞中IFN-γ+CD4+T细胞的数量，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图8为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，肝脏淋巴细胞中HBsAg和HBc149特异性T细胞的ELISPOT检测结果，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。**表示t检验P<0.01。
图9为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，利用流式细胞仪分析肝脏淋巴细胞中IFN-γ+CD8+T细胞的数量，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。**表示t检验P<0.01。
图10为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，利用流式细胞仪分析肝脏淋巴细胞中IFN-γ+CD4+T细胞的数量，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图11为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，小鼠血清中HBsAg含量的ELISA检测结果，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图12为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，小鼠血清中HBVDNA拷贝数的检测结果，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*和**分别表示t检验P<0.05和P<0.01。
图13为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，小鼠血清中ALT测定结果，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图14为将包含HBsAg和HBc149抗原的乙肝疫苗和gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)免疫HBV转基因小鼠后，肝脏组织中表达HBcAg的肝细胞的比例，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*和**分别表示t检验P<0.05和P<0.01。
图15为将从黑色素瘤细胞B16中纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)治疗荷瘤小鼠后，脾脏淋巴细胞中黑色素瘤抗原特异性的T细胞的ELISPOT检测结果。只注射PBS和PD1抗体的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图16为将从黑色素瘤细胞B16中纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联(gp96-PD1)治疗荷瘤小鼠后黑色素瘤的生长曲线。只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图17为将从乳腺癌细胞4T1中纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)治疗荷瘤小鼠后，脾脏淋巴细胞中乳腺癌抗原特异性的T细胞的ELISPOT检测结果。只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图18为将从乳腺癌细胞4T1中纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)治疗荷瘤小鼠后，乳腺癌肿瘤的生长曲线，只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*和**分别表示t检验P<0.05和P<0.01。
图19为将从肝癌细胞H22分离纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)治疗荷瘤小鼠后，脾脏淋巴细胞中肝癌抗原特异性的T细胞的ELISPOT检测结果。只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
图20为将从肝癌细胞H22分离纯化的gp96或gp96联合PD1抗体(gp96+PD1抗体)或gp96与PD1抗体偶联物(gp96-PD1抗体)治疗荷瘤小鼠后，肝癌肿瘤的生长曲线。只注射PBS的小鼠作为阴性对照。*表示t检验P<0.05。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS溶液(0.01mol/L、pH7.2)由溶剂和溶质组成，溶质及其在PBS溶液中的浓度为：氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.24g/L，十二水合磷酸氢二钠3.628g/L。
下述实施例中的0.01M、PH6.8的磷酸盐缓冲液是将510ml1mol/L的磷酸二氢钠和490ml1mol/L的磷酸氢二钠混匀制备得到的。
下述实施例中的碳酸盐缓冲液(1mol/LpH9.6)由溶剂和溶质组成，溶质及其在PBS溶液中的浓度为:Na2CO31.59g/L、NaHCO32.93g/L。
实施例1、gp96-PD1抗体偶联物的制备
一、昆虫细胞表达gp96蛋白
1、重组质粒pFastBacTM1-gp96的构建
(1)gp96引物的设计与合成：以GenBank中人gp96基因的序列为模板，在gp96基因5’端加入EcoRI酶切位点，3’端加入XbaI酶切位点。正向引物序列为：5’-GGAATTCATGGGCAGCAGCCATCAT-3’；反向引物序列为：5’-GCTCTAGACTATTACAATTCATCTTTTTC-3’，委托上海生工生物工程技术服务公司合成该引物，测序验证引物的序列正确无误。
(2)提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。
(3)以步骤(2)获得的cDNA为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为gp96基因，经过测序，为序列表中序列2所示的DNA分子。
(4)用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切步骤(3)获得的PCR扩增产物，回收得到大小为2400bp的DNA片段。
(5)用EcoRI和XbaI双酶切pFastBacTM1载体(购自Invitrogen，产品目录号为10359-016)，回收得到大小为4700bp的骨架载体。
(6)将步骤(4)获得的大小为2400bp的DNA片段和步骤(5)获得的大小为4700bp的骨架载体连接，得到连接产物。
(7)将步骤(6)获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(购自北京原平皓生物技术有限公司，产品号CL108-01)，通过定点转移获得重组质粒pFastBacTM1-gp96。
对阳性克隆进行PCR验证(鉴定的引物：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3)，PCR扩增得到含有目的序列的4.7-5kb扩增子，随后对其进行测序验证。
测序结果表明：重组质粒pFastBacTM1-gp96为将序列表中序列2所示的DNA分子插入pFastBacTM1载体的EcoRI和XbaI酶切位点间，且保持pFastBacTM1载体的其他序列不变得到的载体。重组质粒pFastBacTM1-gp96表达gp96蛋白，gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
将生长良好的阳性菌落接种于5ml的LB液体培养基(含有50ug/m卡那霉素、7ug/m庆大霉素、10ug/m四环素)中，37℃200rpm12小时。在超净工作台内用30％甘油与菌液1:1混匀保存菌种，并将剩余菌液通过手提的方法提取质粒。
2、昆虫细胞表达gp96蛋白及gp96蛋白的纯化
利用CellfectinIIreagent(购自Invitrogen，产品目录号为10359-016)将上述步骤1获得的pFastBacTM1-gp96转染到Sf9细胞(购自Invitrogen，产品目录号为11496-015)中，具体步骤如下：
(1)在六孔板中铺1×106个的Sf9细胞(购自Invitrogen，产品目录号为11496-015)，置于室温，将4ug的上述步骤1获得的pFastBacTM1-gp96加入100ul转染培养基Grace’sInsectCellMedium(Invitrogen,Catalogno.11595-030)中，再将8ul的CellfectinIIreagent(购自Invitrogen，产品目录号为10359-016)加入100ul转染培养基中，室温静止5分钟后混匀，室温避光静止20min；用转染培养基将六孔板中细胞洗涤一次，去掉培养基，20分钟后在含有转染试剂CellfectinIIreagent和pFastBacTM1-gp96的Ep管中加入800ul转染培养基，充分混匀后，将其加入到细胞培养板中，置于27℃培养5小时后换成昆虫细胞培养基Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine(购自Lonza公司，货号为12-730Q)，得到混合培养体系；培养3-7天，直到混合培养体系中的细胞变大，且不贴壁时，将混合培养体系500g离心5min，去除细胞和细胞碎片沉淀，取上清液即P1病毒样品。放于4℃避光保存。此时的P1病毒样品可以用来生成滴度更高的P2、P3、P4病毒样品，也可以用于蛋白表达。
(2)将获得的P1病毒样品按照以下公式来扩增，获得更高滴度的P2、P3、P4病毒样品。Xml(需要病毒量)＝[MOI(pfu/细胞)×细胞数目]/病毒滴度(pfu/细胞)。其中，MOI(multiplicityofinfection)称为感染复数，单位为每个细胞感染的病毒颗粒数。一般扩增病毒MOI的值选择0.05-0.1。
将1ml病毒滴度为1×107的P1病毒样品加到10ml的Sf9单层(1×107细胞/mL)细胞中，27℃，120rpm，用昆虫细胞培养基Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsMediumwithL-glutamine(购自Lonza公司，货号为12-730Q)培养72h，待细胞变大且不贴壁时，4000rpm离心5min，去除细胞和细胞碎片，取上清获得P2毒样品。同样的方法获得更高滴度，更大体积的P3、P4病毒样品。
(3)以gp96单克隆抗体作为一抗(购自SantaCruz，产品目录号为sc-56399)、HRP标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗(购自中杉金桥，产品目录号为ZB-2307)，分别对P1、P2、P3和P4病毒样品进行westernblotting杂交，具体杂交步骤参照文献“张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定.[J]中国生物制品学杂志,2013,26:5.”中的方法。
结果表明：人热休克蛋白gp96已经在Sf9细胞中表达。
(4)将密度为2×106/600ml昆虫培养基的HighFiveTM细胞(购自Invitrogen公司，产品目录号为B855-02)按照MOI＝5加入滴度为4×107pfu/ml的P4病毒样品150ml，27℃，120rpm，悬浮培养染72小时，然后将悬浮液7000rpm离心20min，得到上清液。
(5)将步骤(4)得到的上清液经过0.22mm滤膜滤过后，依次经过HiTrap-QSepharose层析和Superdex20010/300GL离子柱纯化后得到gp96蛋白。
HiTrap-QSepharose离子交换层析的具体步骤如下：
a)将昆虫细胞培养基上样于层析柱，流速为1ml/min；
b)用5mlNaCl浓度为200mMpH7.5的PBS洗涤步骤a)的层析柱，流速为1ml/min；
c)用10mlNaCl浓度为300mMpH7.5的PBS洗涤步骤b)的层析柱，流速为1ml/min；
d)用3mlNaCl浓度为600mMpH7.5的PBS洗涤步骤c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物。
Superdex20010/300GL分子筛层析的具体步骤如下：
a)将HiTrap-QSepharose离子交换层析所得gp96提取物通过50Kd超滤管(MerckMillipore，货号为UFC905096)浓缩换液，用PBS溶液浓缩为1ml；
b)通过上样环将a)上样于层析柱，流速为0.25ml/min；
c)用pH7.5的PBS溶液洗涤柱子，流速为0.25ml/min，收集9-12ml处穿透液，即为gp96蛋白。
d)将上述c)收集的穿透液用50Kd超滤管(MerckMillipore，货号为UFC905096)浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。
e)将最终纯化得到的穿透液经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图1所示。从图1可以看出，纯化得到大小为96kDa的gp96蛋白。
二、来源于肿瘤组织的gp96蛋白
1、来源于黑色素瘤组织的gp96蛋白的制备
(1)将8g组织(选用接种于小鼠皮下的B16细胞形成的黑色素瘤)剪碎，溶于100ml溶液A(将PMSF和NaHCO3溶于水，得到溶液A；溶液A中，PMSF的浓度为1mM，NaHCO3的浓度为30mM)，用玻璃匀浆器磨碎。
(2)16500g离心1h，弃沉淀，取上清。
(3)16500g离心50min，弃沉淀，取上清(上清体积为X)。
(4)在步骤(3)得到的溶液中加入X/9体积的溶液B，得到上样液；上述溶液B的溶剂为20mMTris-HCl(pH7.4)溶液，溶质及其浓度如下：2mMMnCl2、2mMCaCl2、500mMNaCl、PMSF1mM。
(5)给预先平衡后的ConA琼脂糖凝胶柱(ConASepharose4B，购自GE公司，产品号17-0440-01，层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm)上样。
(6)用清洗液清洗柱子，直到没有蛋白检测出(A280<0.01)；所述清洗液为将溶液B用水稀释至10倍体积得到的溶液。
(7)用溶液C洗脱柱子，前0.5个柱体积不要，然后收集1个柱体积，然后使柱子孵育50min，再收集1.5个柱体积，共得到2.5个柱体积的ConA洗脱液；所述溶液C的溶剂为20mMTris-HCl(pH7.4)溶液，溶质及其浓度如下：10％(10g/100mL)α-D-吡喃葡萄糖、500mMNaCl、1mMPMSF。
(8)用ConA洗脱液给HitrapQ阴离子交换柱(HiTrapQHP；购自GE公司，产品号17-1153-01；内径和柱长是0.7x2.5cm)上样。
(9)用300-800mMNaCl的PBS溶液进行线性梯度洗脱，流速1ml/min，共洗脱20个柱体积，收集400-450mMNaCl的洗脱液。
(10)将步骤(9)得到的洗脱液用millipore超滤管(型号为50KDa、15ml)浓缩到5mg/ml，即为来源于黑色素瘤组织的gp96蛋白，在-70℃条件下冻存。
(11)将来源于黑色素瘤组织的gp96蛋白进行常规10％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和WesternBlot免疫印迹试验。westernblot所用的一抗为热休克蛋白gp96单克隆抗体(购自santacruz，产品号sc-56399)，二抗为HRP标记的IgG抗体(购自SEROTEC公司，产品号为STAR117P)。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳结果如图2所示：从图2中可以看出，利用该方法从黑色素瘤组织中提取了高纯度的gp96蛋白。
WesternBlot杂交鉴定试验结果如图3所示：从图3中可以看出：从黑色素瘤组织中获得大小为96kDa的gp96蛋白。
2、来源于肝癌肿瘤组织的gp96蛋白的制备
将上述步骤1中的B16细胞形成的黑色素瘤组织替换为H22细胞形成的肝癌肿瘤组织，其他步骤不变，得到来源于肝癌肿瘤组织的gp96蛋白。
3、来源于乳腺癌肿瘤组织的gp96蛋白的制备
将上述步骤1中的B16细胞形成的黑色素瘤组织替换为4T1细胞形成的乳腺癌肿瘤组织，其他步骤不变，得到来源于乳腺癌肿瘤组织的gp96蛋白。
三、gp96-PD1抗体偶联物的制备
1、取20mg步骤一中利用昆虫细胞获得的gp96蛋白溶于0.4mL1.25％的戊二醛溶液(溶质为戊二醛，溶剂为0.01M、PH6.8的磷酸盐缓冲液)，溶质在戊二醛溶液中的质量分数为1.25％)中，在25℃条件下反应18h，得到反应产物；将反应产物加入PBS溶液中，4℃透析过夜，除去游离的戊二醛，得到醛化的gp96蛋白溶液(10mg/mL)。
2、将5mgPD1抗体(美国百施美施贵宝医药有限公司，货号为0003-3772-11，商品名为OPDIVO)溶于1mL0.15mol/L的NaCl水溶液中，得到PD1抗体溶液(5mg/mL)。
3、将步骤1获得的醛化的gp96蛋白溶液与步骤2获得的PD1抗体溶液(5mg/mL)按照体积比为0.4：1混匀，得到混合液。
4、向步骤3中的混合液中加入0.1mL1mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液，将pH值调为9.6，4℃条件下电磁搅拌24h。
5、向步骤4的反应产物中加入0.1mL0.2mol/L的赖氨酸溶液，4℃放置4h，终止反应。
6、将步骤5的反应产物装入透析袋，在4℃条件下，0.01mol/L、pH7.2的PBS溶液中透析过夜。
7、将步骤6的反应产物通过SephadexG-200凝胶柱层析，以PBS溶液为洗脱溶液，收集得到第1峰洗脱液(含有gp96-PD1抗体偶联物)。
8、将上述步骤7获得的洗脱液经过HiTrapQHP柱，Superdex20010/300GL离子柱纯化后，得到纯化后的gp96-PD1抗体偶联物(昆虫杆状病毒表达系统获得的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物，偶联比为1:1)，并对其进行纯化，纯化的步骤参见步骤一中的2。
将上述步骤1中的gp96蛋白替换为步骤二获得的来源于黑色素瘤肿瘤组织的gp96蛋白，其他步骤不变，得到gp96-PD1抗体偶联物(来源于黑色素瘤肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物，偶联比为1:1)。
将上述步骤1中的gp96蛋白替换为步骤二获得的来源于肝癌肿瘤组织的gp96蛋白，其他步骤不变，得到gp96-PD1抗体偶联物(来源于肝癌肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物，偶联比为1:1)。
将上述步骤1中的gp96蛋白替换为步骤二获得的来源于乳腺癌肿瘤组织的gp96蛋白，其他步骤不变，得到gp96-PD1抗体偶联物(来源于乳腺癌肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物，偶联比为1:1)。
实施例2、gp96-PD1抗体偶联物在抑制乙肝病毒生长中的应用
一、乙肝疫苗的制备
本发明的乙肝疫苗由乙肝表面抗原HBsAg(购自北京天坛生物制品股份有限公司，批准文号：国药准字S10980007，氨基酸序列如序列表中序列3所示)、乙肝核心蛋白HBc149(乙肝核心蛋白HBc149的氨基酸序列如序列表中序列4所示)和实施例1制备的gp96-PD1抗体偶联物组成。
本实施例中gp96为实施例1中制备的昆虫细胞表达的gp96蛋白。
本实施例中的PD1抗体是美国百施美施贵宝医药有限公司的产品，货号为0003-3772-11，商品名为OPDIVO。
本实施例中的gp96-PD1抗体偶联物为实施例2中制备的gp96-PD1抗体偶联物(昆虫细胞获得的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物)。
其中，乙肝核心蛋白HBc149也可以按照如下方法制备：
1、乙肝核心蛋白HBc149的制备
(1)重组质粒pET21a-HBc149的构建
1)目的片段HBc149的获得
以序列表中序列5所示的DNA分子为模板，在其5’末端加入NdeI酶切位点及保护碱基，序列为：5’-GGGAATTCCAT-3’，在其3’末端加入XhoⅠ酶切位点及保护碱基，序列为5’-TGACTCGAGCGG-3’，委托上海生工生物工程技术服务公司合成目的片段HBc149，测序验证基因序列正确无误。
2)用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切步骤1)获得的基因片段，回收得到大小约为500bp的DNA片段。
3)用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pET21a(+)载体(购自Novagen公司，产品目录号为69710-3)，回收得到大小约为5400bp的骨架载体。
4)将步骤2)获得的大小约为500bp的DNA片段和步骤3)获得的大小约为5400bp的骨架载体连接，得到重组质粒pET21a-HBc149并对其进行测序。
测序结果表明：重组质粒pET21a-HBc149为将序列表中序列5所示的DNA分子插入pET21a载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点间，且保持pET21a载体的其他序列不变得到的载体。
(2)原核表达HBc149抗原蛋白
利用大肠杆菌表达HBc149蛋白，具体方法如下：
1)将上述步骤(1)的重组质粒pET21a-HBc149转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自天根生化科技公司，产品号CB105-02)感受态细胞，从平板上挑取单菌落接入含100mg/mL氨苄霉素的10ml的2×YT培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL)活化；12h后将10ml活化液(菌液)接入1L的2×YT培养基中，37℃培养至OD600值为0.6-1.0，然后加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导5h，收集菌体。
2)将上述步骤1)获得的菌体用80ml溶液(50mMTRISpH7.5、5mMDTT、1mMPMSF、0.01mg/mLDNase、0.1mg/mLRNaseA)重悬，冰浴条件下超声破碎(200W，破碎3s停7s，99次3个循环)，然后4℃12000转/分钟离心20min，收上清液。
3)向上述步骤2)获得的上清液中缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度，4℃缓慢搅拌1h，然后4℃、12000转/min离心20min，弃上清，收集沉淀。
4)用50ml溶液A(100mMTRISpH7.5、100mMNaCl、2mMDTT)重悬上述步骤3获得的沉淀，4℃12000转/min离心20min，取上清，将上清转移至50KD超滤浓缩管浓缩，蛋白浓缩液经SuperdexS400分子筛分离纯化，取其90-120个二聚体大小(约2700-3600kD)起峰处收集蛋白，蛋白经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
5)将步骤4)收集的蛋白用10mMTRIS-HCl(pH7.5)换液后，经HiTrapQHP阴离子交换柱进一步纯化，收集穿透，蛋白经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定(图4)。
6)将上述步骤5)收集的穿透液用PBS溶液换液，浓缩，得到纯化后的HBc149蛋白。
7)利用TritonX-114萃取法去除步骤6)获得的HBc149蛋白的内毒素，具体步骤如下：取HBc149蛋白加入TritonX-114(TritonX-114的体积百分含量为1％)，4℃混匀30min，置于37℃水浴中10min，4℃20000g离心10min，取上清(含有HBc149蛋白)；重复上述步骤两次，得到去除内毒素的HBc149蛋白(内毒素去除率达到99％)。
采用鲎试剂法检测去除内毒素的HBc149蛋白中的内毒素含量，检测方法参照文献“唐宝璋燕奎华黄礼云庄林游晶陈红英.慢性乙型肝炎患者血清内毒素、IL-4、IL-18水平的变化.世界华人消化杂志,2003,11(12)：2041-2.”中的方法。
检测结果表明：HBc149蛋白中的内毒素浓度低于10EU/mg。
二、乙肝疫苗的免疫相关因子分析
1、实验分组及处理
对HBV转基因小鼠(购自中国人民解放军第四五八医院全军肝病中心)进行分组，每组10只，根据每组给药的不同分成如下五组。分别免疫。免疫后第八周时处死小鼠，分析疫苗效果。其中，第三、四、五组进行蛋白免疫前，将用于免疫的组分在组装体系中进行组装，使得gp96蛋白与HBsAg和HBc149蛋白充分的结合，有利于抗原的呈递和免疫激活作用。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH2PO40.24g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L；组装条件：4℃，120分钟。
第一组(PBS)：PBS溶液：第1周免疫PBS溶液；第2周免疫PBS溶液；第3周免疫PBS溶液；第4周免疫PBS溶液。给药途径均为皮下注射。
第二组(PD1抗体)：PD1抗体：第1周注射PD1抗体(100微克/只)；第2周注射PD1抗体(100微克/只)；第3周注射PD1抗体(100微克/只)；第4周注射PD1抗体(100微克/只)。给药途径均为腹腔注射。
第三组(疫苗+gp96)：疫苗(包含乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBc149)+gp96：第1周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和gp96(25微克/只)；第2周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和gp96(25微克/只)；第3周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和gp96(25微克/只)；第4周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)和gp96(25微克/只)。给药途径均为皮下注射。
第四组(疫苗+gp96+PD1抗体)：疫苗(包含乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBc149)+gp96+PD1抗体：第1周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96(25微克/只)、PD1抗体(100微克/只)；第2周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96(25微克/只)、PD1抗体(100微克/只)；第3周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96(25微克/只)、PD1抗体(100微克/只)；第4周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96(25微克/只)、PD1抗体(100微克/只)。给药途径：HBc149、HBsAg和gp96均为皮下注射，PD1抗体为腹腔注射。
第五组(疫苗+gp96-PD1抗体)：疫苗(包含乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBc149)+gp96-PD1抗体偶联物：第1周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96-PD1抗体偶联物(64.1微克/只)(所含gp96蛋白的摩尔数与Vaccine组等同)；第2周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96-PD1抗体偶联物(64.1微克/只)；第3周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96-PD1抗体偶联物(64.1微克/只)；第4周免疫HBc149(10微克/只)、HBsAg(10微克/只)、gp96-PD1抗体偶联物(64.1微克/只)。给药途径均为皮下注射。
2、免疫相关因子的分析
(1)取小鼠脾脏淋巴细胞采用ELISPOT检测试剂盒进行ELISPOT分析。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。
结果如图5所示(分别采用HBc149蛋白和HBsAg蛋白)：图5的纵坐标代表能够分泌IFNγ形成斑点的细胞的数目(SFC，spot-formingcell)：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的分泌IFNγ形成斑点的细胞的数目明显增多，说明疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组能更强的激活T细胞的免疫应答反应。
(2)取小鼠脾脏淋巴细胞进行IFN-γ细胞内细胞因子染色。染色的具体步骤参照文献“ZhaoB,WangY,ZhangY,LiY,ZhangX,XuY,ChenL,LiC,JuY,MengS.TAT-mediatedgp96transductiontoAPCsenhancesgp96-inducedantiviralandantitumorTcellresponses.Vaccine2013；31:545-552.”中的方法。
结果如图6和图7所示：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力显著地增强；与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力极大地增强。
(3)取小鼠肝脏淋巴细胞采用ELISPOT检测试剂盒进行ELISPOT分析。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。
结果如图8所示：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组分泌IFNγ形成斑点的细胞的数目明显增多，能更强的激活T细胞的免疫应答反应。
(4)取小鼠肝脏淋巴细胞进行IFN-γ细胞内细胞因子染色。染色的具体步骤参照文献“FerraroB,TalbottKT,BalakrishnanA,CisperN,MorrowMP,HutnickNA,etal.Inducinghumoralandcellularresponsestomultiplesporozoiteandliver-stagemalariaantigensusingexogenousplasmidDNA.InfectImmun2013；81:3709-3720.”中的方法。
结果见图9和图10：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力显著地增强；与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力显著地增强。
三、乙肝疫苗的效果评价
自初次免疫开始，第0、3、6、9周检测小鼠血清中的HBsAg和丙氨酸转氨酶水平，第9周时检测小鼠血清中HBVDNA拷贝数和小鼠肝脏中的HBcAg水平。
1、检测血清中的乙肝表面抗原(HBsAg)
血清中HBsAg采用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)检测(购自上海科华生物技术有限公司，批准文号：国药准字S10910113)；操作步骤按照生产商说明书进行。
结果如图11所示：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的HBsAg水平均明显下降，说明PD1抗体能显著提高以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对乙肝病毒的抑制作用。gp96+PD1偶联物可作为疫苗佐剂。
2、检测血清中的乙肝病毒核酸(HBVDNA)
使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(购自中山大学达安基因股份有限公司，产品号Cat.#DA-B051)对小鼠100μl血清进行DNA拷贝数的绝对定量；按照生产商产品说明书进行操作。
结果如图12所示：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的HBVDNA水平均明显下降，说明PD1抗体能显著增强以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对乙肝病毒复制的抑制作用。
3、检测血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)
采用丙氨酸转氨酶检测试剂盒(检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司，产品号6129B)检测小鼠血清中的ALT水平；按照产品说明书对小鼠血清进行转氨酶检测。
结果如图13所示：与PBS组、PD1抗体组和疫苗+gp96组相比，疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的ALT水平均明显上升，说明抗原特异性的T细胞有效地杀伤了被HBV感染的靶细胞。
4、检测肝脏细胞中的HBc抗原
免疫组化分析小鼠肝脏中的HBc抗原(抗体为抗HBcAg抗体，购于福州迈新生物技术开发有限公司，产品号Cat.#RAB-0090)，操作步骤按照生产商产品说明书进行。统计HBcAg阳性细胞在肝脏细胞中所占的比例。
结果如图14所示：PBS组的比例为79.5％，PD1抗体组的比例为58.6％，疫苗+gp96组的比例为51.5％，疫苗+gp96+PD1抗体组的比例为22％，疫苗+gp96-PD1抗体组的比例为11％。疫苗+gp96+PD1抗体组和疫苗+gp96-PD1抗体组的HBcAg阳性细胞在肝脏细胞中所占的比例明显降低。说明PD1抗体能显著提高以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对HBV复制的抑制作用，增强了乙肝治疗性疫苗的抗病毒能力。
综上所述，将PD1抗体与gp96偶联可明显提高gp96的免疫学活性，尤其是提高以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对机体免疫T细胞免疫的激活效应和对HBV病毒的抑制作用，提升了病毒特异性的T细胞的比例及其应答能力。
实施例3、gp96-PD1抗体偶联物在抑制黑色素瘤生长中的应用
本实施例中的gp96蛋白为实施例1的步骤二中的来源于黑色素瘤B16肿瘤组织的gp96蛋白。
本实施例中的gp96-PD1抗体偶联物为实施例1的步骤三中的gp96-PD1抗体偶联物(来源于黑色素瘤肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物)。
一、实验分组及处理
将BALB/c小鼠皮下接种黑色素瘤细胞系B16(购自ATCC(Americantypeculturecollection)，产品号为CRL-6475)(每只皮下注射5×104个细胞)，将接种后的小鼠分成五组，每组10只，接种后第二天，免疫小鼠，处理如下：
第一组(PBS)：PBS溶液：腹部皮下注射0.2mlPBS溶液，每隔三天免疫一次，共免疫五次。
第二组PD1抗体：腹腔注射0.2mlPD1抗体溶液(浓度：0.5g/L，溶剂：PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。
第三组(gp96)：从黑色素瘤肿瘤组织中纯化的gp96蛋白：腹部皮下注射gp96蛋白溶液(浓度：0.1g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96蛋白的单次免疫剂量为20ug/只。
第四组(gp96+PD1抗体)：从黑色素瘤肿瘤组织中纯化的gp96和PD1抗体：腹腔注射PD1抗体溶液0.2ml(浓度：0.5g/L，溶剂为PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。同时，腹部皮下注射gp96蛋白溶液(浓度：0.1g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96蛋白的单次免疫剂量为20ug/只。
第五组(gp96-PD1抗体)：从黑色素瘤肿瘤组织中纯化的gp96与PD1抗体偶联物：腹部皮下注射gp96-PD1抗体偶联物(浓度：0.2565g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96-PD1抗体偶联物的单次免疫剂量为51.3ug/只(所含gp96蛋白的摩尔数与gp96组等同)。
2、ELISPOT检测
分别将上述步骤1的五组在实验第0天进行第一次免疫，第30天处死小鼠取脾脏细胞进行ELISPOT检测，并自实验第1天开始至30天统计肿瘤体积变化(平均值)。ELISPOT检测步骤如下：处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用B16黑色素瘤细胞(死细胞)刺激一周，检测特异性有活性的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)数目。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。肿瘤体积计算公式V＝πab2/6(V—体积，a—肿瘤长径，b—肿瘤短径)。
ELISPOT的检测结果如图15所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体组和gp96-PD1抗体组分泌IFNγ形成斑点的细胞的数目明显增多，能更强地激活T细胞的免疫应答反应，说明肿瘤组织来源的gp96与PD1抗体的联合应用可以大大提高gp96对T细胞免疫反应的激活作用。
肿瘤体积的检测结果如图16所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体组和gp96-PD1抗体组处理的肿瘤细胞体积明显变小，说明肿瘤组织来源的gp96与PD1抗体的联合应用显著抑制了黑色素瘤生长。
实施例4、gp96-PD1抗体偶联物在抑制乳腺癌癌细胞生长中的应用
本实施例中的gp96蛋白为实施例1的步骤二中的来源于乳腺癌4T1肿瘤组织的gp96蛋白。
本实施例中的gp96-PD1抗体偶联物为实施例1的步骤三中的gp96-PD1抗体偶联物(来源于乳腺癌肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物)。
一、实验分组及处理
将BALB/c小鼠皮下接种乳腺癌细胞系4T1(购自ATCC(Americantypeculturecollection)，产品号为CRL-2539)(每只皮下注射2×106个细胞)，将接种后的小鼠分成五组，每组10只，接种后第二天，免疫小鼠，处理如下：
第一组(PBS)：PBS溶液：腹部皮下注射0.2mlPBS溶液，每隔三天免疫一次，共免疫五次。
第二组PD1抗体：腹腔注射0.2mlPD1抗体溶液(浓度：0.5g/L，溶剂：PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。
第三组(gp96)：从乳腺癌肿瘤组织中纯化的gp96蛋白：腹部皮下注射gp96蛋白，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，提取物的单次免疫剂量为20ug/只。
第四组(gp96+PD1抗体)：从乳腺癌肿瘤组织中纯化的gp96和PD1抗体：腹腔注射PD1抗体溶液0.2ml(浓度：0.5g/L，溶剂为PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。同时，腹部皮下注射gp96蛋白溶液(浓度：0.1g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96蛋白的单次免疫剂量为20ug/只。
第五组(gp96-PD1抗体)：从乳腺癌肿瘤组织中纯化的gp96与PD1抗体偶联物：腹部皮下注射gp96-PD1抗体偶联物(浓度：0.2565g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96-PD1抗体偶联物的单次免疫剂量为51.3ug/只(所含gp96蛋白的摩尔数与gp96组等同)。
2、ELISPOT检测
分别将上述步骤1的五组在实验第0天进行第一次免疫，第30天处死小鼠取脾脏细胞进行ELISPOT检测，并自实验第1天开始至30天统计肿瘤体积变化(平均值)。ELISPOT检测步骤如下：处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用乳腺癌细胞系4T1(死细胞)刺激一周，测特异性有活性的CTL数目。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。肿瘤体积计算公式V＝πab2/6(V—体积，a—肿瘤长径，b—肿瘤短径)。
结果如图17所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体和gp96-PD1抗体组分泌IFNγ形成斑点的细胞的数目明显增多，能更强的激活T细胞的免疫应答反应，说明肿瘤组织来源的gp96与PD1抗体的联合应用大大提高了gp96对T细胞免疫反应的激活作用。
结果如图18所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体和gp96-PD1抗体组处理的肿瘤细胞体积明显变小，说明肿瘤组织来源的gp96与PD1抗体的联合应用显著增强了肿瘤组织来源的gp96对乳腺癌细胞生长的抑制作用。
实施例5、gp96-PD1抗体偶联物在抑制肝癌癌细胞生长中的应用
本实施例中的gp96蛋白为实施例1的步骤二中的来源于肝癌细胞系H22形成的肿瘤组织的gp96蛋白。
本实施例中的gp96-PD1抗体偶联物为实施例1的步骤三中的gp96-PD1抗体偶联物(来源于肝癌肿瘤组织的gp96蛋白与PD1抗体的偶联物)。
一、实验分组及处理
将BALB/c小鼠皮下接种肝癌细胞系H22(购自ATCC，ATCC编号为58426)(每只皮下注射2×106个细胞)，将接种后的小鼠分成五组，每组10只，接种后第二天，免疫小鼠，处理如下：
第一组(PBS)：PBS溶液：腹部皮下注射0.2mlPBS溶液，每隔三天免疫一次，共免疫五次。
第二组PD1抗体：腹腔注射0.2mlPD1抗体溶液(浓度：0.5g/L，溶剂：PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。
第三组(gp96)：从肝癌肿瘤组织中纯化的gp96蛋白：腹部皮下注射gp96蛋白溶液(浓度：0.1g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，提取物的单次免疫剂量为20ug/只。
第四组(gp96+PD1抗体)：从肝癌肿瘤组织中纯化的gp96和PD1抗体：腹腔注射PD1抗体溶液0.2ml(浓度：0.5g/L，溶剂为PBS溶液)，每周注射一次，连续注射四周，单次注射剂量为100微克/只。同时，腹部皮下注射gp96蛋白溶液(浓度：0.1g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96蛋白的单次免疫剂量为20ug/只。
第五组(gp96-PD1抗体)：从肝癌肿瘤组织中纯化的gp96与PD1抗体偶联物：腹部皮下注射gp96-PD1抗体偶联物(浓度：0.2565g/L，溶剂为PBS溶液)，每隔三天免疫一次，共免疫五次(每次0.2ml)，gp96-PD1抗体偶联物的单次免疫剂量为51.3ug/只(所含gp96蛋白的摩尔数与gp96组等同)。
二、ELISPOT检测
分别将上述步骤1的五组在实验第0天进行第一次免疫，第30天处死小鼠取脾脏细胞进行ELISPOT检测，并自实验第1天开始至30天统计肿瘤体积变化(平均值)。ELISPOT检测步骤如下：处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用肝癌细胞系H22(死细胞)刺激一周，测特异性有活性的CTL数目。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。肿瘤体积计算公式V＝πab2/6(V—体积，a—肿瘤长径，b—肿瘤短径)。
结果如图19所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体组和gp96-PD1抗体组能更强的激活T细胞的免疫应答反应，说明PD1抗体大大提高了肿瘤组织来源的gp96对T细胞免疫反应的激活作用。
结果如图20所示：与PBS组、PD1抗体组和gp96组相比，gp96+PD1抗体组和gp96-PD1抗体组处理的肿瘤细胞体积明显变小，说明PD1抗体显著增强了肿瘤组织来源的gp96对肝癌细胞生长的抑制作用。
Claims (10)
1.一种具有免疫治疗疾病功能的试剂盒，包括如下1)或2)：
1)gp96蛋白和PD1抗体，所述gp96蛋白和PD1抗体分别包装和配套使用；
2)由gp96蛋白与PD1抗体偶联得到的gp96-PD1抗体偶联物；
所述gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(1)或(2)：
(1)作为活性成分而免疫治疗肿瘤；
(2)作为疫苗佐剂制备疫苗、进而免疫治疗病毒感染引起的疾病；
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(a)-(d)中至少一种：
(a)激活和增强机体T细胞对病原的免疫应答反应；
(b)使病原特异性T细胞数量增多；
(c)促进T细胞杀伤带有病原的细胞；
(d)抑制病原增殖或生长。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述gp96蛋白和所述PD1抗体的质量比为1:1；
所述偶联物中，所述gp96蛋白和所述PD1抗体的偶联比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述gp96蛋白为利用昆虫细胞表达系统获得的gp96蛋白或来源于离体的肿瘤组织或肿瘤细胞的gp96蛋白；
具体的，所述肿瘤细胞具体为黑色素瘤细胞或乳腺癌细胞或肝癌细胞；
具体的，所述肿瘤组织具体为黑色素瘤组织或乳腺癌组织或脑胶质瘤组织或肾癌组织或肠癌组织或肝癌组织或胃癌组织；
再具体的，所述黑色素瘤细胞具体为黑色素瘤细胞系B16；
再具体的，所述乳腺癌细胞具体为乳腺癌细胞系4T1；
再具体的，所述肝癌细胞具体为肝癌细胞系H22。
4.一种制备权利要求1-3中任一所述gp96-PD1抗体偶联物的制备方法，包括如下步骤：
1)分别制备醛化gp96蛋白溶液和PD1抗体溶液；
所述醛化gp96蛋白溶液为将gp96蛋白与戊二醛溶液反应，得到醛化的gp96蛋白溶液；
所述PD1抗体溶液为将PD1抗体溶于NaCl水溶液，得到PD1抗体溶液；
2)将所述醛化gp96蛋白溶液和所述PD1抗体溶液在缓冲体系中反应，得到gp96-PD1抗体偶联物；
所述gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述醛化的gp96蛋白溶液中gp96蛋白的浓度为10mg/mL；
所述PD1抗体溶液中PD1抗体的浓度为5mg/mL；
所述醛化gp96蛋白溶液和所述PD1抗体溶液的体积比为0.4：1；
所述步骤1)的反应条件为25℃条件下反应18h；
所述步骤2)的反应条件为4℃透析过夜；
所述缓冲体系的pH值为9.6。
6.权利要求4或5所述的方法制备得到的gp96-PD1抗体偶联物。
7.权利要求1-3中任一所述的试剂盒或权利要求6所述的gp96-PD1抗体偶联物在制备具有免疫治疗疾病功能的产品中的应用：
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(1)或(2)：
(1)作为活性成分而免疫治疗肿瘤；
(2)作为疫苗佐剂制备疫苗、进而免疫治疗病毒感染引起的疾病；
和/或，具体的，所述免疫治疗疾病为如下(a)-(d)中至少一种：
(a)激活和增强机体T细胞对病原的免疫应答反应；
(b)使病原特异性T细胞数量增多；
(c)促进T细胞杀伤带有病原的细胞；
(d)抑制病原增殖或生长。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述病原为肿瘤或病毒；
具体的，所述病毒为乙型肝炎病毒；
具体的，所述肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或黑色素瘤。
9.一种乙肝疫苗，由乙肝表面抗原HBsAg、乙肝核心蛋白HBc149和佐剂组成；所述佐剂为权利要求1-3或6中任一所述的gp96-PD1抗体偶联物或gp96蛋白与PD1抗体的混合物；
所述gp96-PD1抗体偶联物、所述乙肝表面抗原HBsAg和所述乙肝核心蛋白HBc149的质量比为6.41：1：1；
所述gp96蛋白与PD1抗体的混合物中的gp96蛋白和PD1抗体的质量比为1:1。
10.权利要求9所述的乙肝疫苗在制备治疗和/或预防乙肝病毒引起的疾病的产品中的应用。
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