CN102199204B - 鸡源热休克蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡源热休克蛋白及其编码基因和应用。本发明所提供的蛋白为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进免疫活性功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白可以作为免疫增强剂使用，增强表位肽和减毒或灭活疫苗产生的CTL水平和抗体水平，提高机体对外来抗原的免疫应答。将本发明的蛋白与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强鸡群的体液免疫和细胞免疫，达到清除病毒、治疗疾病的目的，非常适用于鸡病毒病的预防，易于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡源热休克蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
热休克蛋白(HSPs)是一种高度保守的分子伴侣超家族，在维持细胞功能的过程中发挥关键作用，主要是阻止新生多肽链的错误折叠和聚集，并帮助蛋白质进行正确折叠和运输。根据其大小、结构和功能的不同，热休克蛋白可以分为多个家族，包括小分子HSP、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110和Gp96，其中HSP60和HSP70是大量存在于细胞质中的分子伴侣，而Gp96则是内质网腔中的主要分子伴侣。随后，人们发现一些热休克蛋白在机体的免疫反应中发挥功能，如HSP60、HSP70和HSP90参与抗原递呈过程，活化淋巴细胞和巨噬细胞，激活树突状细胞(DC)并促进其成熟。
糖蛋白Gp96(Gp96)是HSP90的内质网同源分子，又叫葡萄糖相关蛋白94(Grp94)。与其他热休克蛋白一样，Gp96含有两个主要结构域：结合并水解ATP的结构域和结合底物疏水残基的结构域。Gp96是定位于内质网的跨膜蛋白，其C-端含有一个内质网滞留基序(KDEL)，从而介导内质网内部的信号通路。除了分子伴侣功能之外，Gp96还在天然免疫和获得性免疫反应中发挥关键作用，如Gp96通过激活树突状细胞并促成熟，从而为体内的获得性免疫反应提供合适的环境，且激活了效应性NK细胞参与天然免疫反应。除了定位于内质网外，1999年Robert等人发现Gp96在一些肿瘤细胞的表面也有表达，这也暗示了Gp96可能在肿瘤免疫过程中发挥作用。随后人们发现，肿瘤、病毒感染等均能诱发Gp96大量表达，从肿瘤组织纯化的Gp96能够产生针对该肿瘤的免疫原性，并有抗肿瘤效果。除了这对肿瘤和病毒感染，Gp96对细菌病原感染也有免疫效果，Zuger等人发现从细菌感染的细胞中分离的Gp96也能诱发细胞毒性免疫反应并产生保护作用。Binder等人于2000年发现，Gp96结合抗原肽之后，能够被巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞表面的CD91识别并结合，从而将抗原肽递呈到MHC-I类分子，并激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡源热休克蛋白及其编码基因和应用。
本发明所提供的蛋白(Chgp96N蛋白)，来自北京油鸡，参与抗原呈递，具有促进免疫活性的功能，为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进免疫活性的功能的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的Chgp96N蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基数 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的Chgp96N蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Chgp96N蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述蛋白的基因(Chgp96N基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有促进免疫活性的功能的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有促进免疫活性的功能的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pPICZαA的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为所述重组质粒导入毕赤酵母菌X33得到的重组菌。
扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述蛋白可应用于制备免疫增强剂，特别是用于制备鸡的免疫增强剂。
本发明还保护一种免疫增强剂，其活性成分为所述蛋白。本发明的免疫增强剂特别适用于鸡。
所述蛋白可应用于制备用于预防和/或治疗鸡新城疫病的疫苗；所述疫苗中所述蛋白为免疫增强剂。所述疫苗中还含有市售的新城疫病疫苗(如购自北京信得威特科技有限公司的NDV灭活疫苗)。
本发明还保护一种用于预防和/或治疗鸡新城疫病的复合型疫苗，它的活性成分由所述蛋白和新城疫病疫苗组成。作为所述活性成分的组分之一的新城疫病疫苗为市售疫苗(如购自北京信得威特科技有限公司的NDV灭活疫苗)。
本发明所提供的蛋白可以作为免疫增强剂使用，增强表位肽、减毒疫苗或灭活疫苗产生的CTL水平和抗体水平，提高机体对外来抗原的免疫应答。将本发明的蛋白与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强鸡群的体液免疫和细胞免疫，达到清除病毒、治疗疾病的目的，非常适用于鸡病毒病的预防，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为实施例2中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为重组毕赤酵母诱导表达过程中的SDS-PAGE检测图。
图3为重组毕赤酵母诱导表达过程中的western blot检测图。
图4为实施例3中Chgp96N蛋白与市售疫苗联合免疫后的血凝抑制效价。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有引物合成及测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。载体pPICZαA：购自美国Invitrogen公司，货号：V195-20。大肠杆菌DH5α：购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0808。毕赤酵母菌X33：购自美国Invitrogen公司，货号为C180-00。NDV灭活疫苗：购自北京信得威特科技有限公司(兽药生字(2006)010372008)。SPF鸡：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。La Sota病毒：购自中国兽医药品监察所。白油：购自北京信得威特科技有限公司。PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、1.38gNa2HPO4、0.2g KH2PO4溶于1L ddH2O，调pH至7.4。
实施例1、鸡源热休克蛋白及其编码基因的发现
2010年8月，瞿洪仁、刘文军从北京油鸡中发现一种新蛋白及其编码基因。
将序列1所示的蛋白质命名为Chgp96N蛋白，将Chgp96N蛋白的编码基因命名Chgp96N基因，其编码区如序列表的序列2所示。
实施例2、Chgp96N基因的表达及其表达产物的纯化
一、重组质粒和重组酵母的构建
1、目的基因的扩增
合成序列表的序列2所示的Chgp96N基因(1002bp)，然后用F1和F2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-CTGCTCGAGAAAAGAGAGGAGGTGGATGTG-3’，其中CTCGAG为XhoI酶切位点；
F2：5’-CGCTCTAGAAATTTATATTCATCCTCTTC-3’，其中TCTAGA为XbaI酶切位点。
PCR条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。箭头所指为目的基因，约1000bp，与实际大小相符。
2、重组质粒pPICZαA-Chgp96N的构建
(1)切胶回收步骤1的PCR扩增产物，用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后，回收酶切产物。
(2)用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切载体pPICZαA，回收载体骨架(约3.6kb)。
(3)用T4 DNA连接酶将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，得到连接产物。
(4)将步骤(3)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单克隆进行PCR鉴定(采用F1和F2组成的引物对，目标片段为1000bp左右)，阳性克隆提质粒进行测序鉴定，测序结果表明，得到了重组质粒pPICZαA-Chgp96N。重组质粒pPICZαA-Chgp96N的结构描述：在载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA。
3、重组酵母的构建
(1)用限制性内切酶DraI单酶切重组质粒pPICZαA-Chgp96N，得到线性化的质粒。
(2)将步骤(1)得到的线性化质粒电转化毕赤酵母菌X33感受态细胞(电转化的参数为1.5kv、25μF、200Ω)，得到电转化产物。
(3)取200μL步骤(2)得到的电转化产物，均匀涂布于YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天，观察转化子的生长。YPDS选择平板的溶剂为水，溶质及其浓度如下：酵母提取物1％(质量百分含量)，蛋白胨2％(质量百分含量)，D-山梨醇1mol/L，琼脂粉1.5％(质量百分含量)，葡萄糖2％(质量百分含量)，ZeocinTM(博莱霉素)100μg/mL。
(4)挑取YPDS选择平板上的单克隆，接种在高抗性YPDS平板(ZeocinTM浓度为1000μg/mL，其它同YPDS选择平板)上，30℃孵育2-3天。
(5)挑取高抗性YPDS平板的单克隆，扩大培养后提取基因组DNA进行PCR鉴定(采用F1和F2组成的引物对，目标片段为1000bp左右)。PCR鉴定结果表明，序列表的序列2所示的Chgp96N基因已整合进入毕赤酵母菌X33的基因组，得到了重组毕赤酵母。
4、对照酵母甲的构建
用载体pPICZaA代替重组质粒pPICZαA-Chgp96N，其它同步骤3，得到对照毕赤酵母甲。
5、对照酵母乙的构建
专利“一类免疫佐剂及其在抗病毒疫苗或药物制备中的应用”(专利号：200410069192.8；授权公告号CN 1718243A；申请日：2004年7月7日)中，公开了一种蛋白。该蛋白与本发明提供的蛋白具有较高同源性，所以作为本发明的Chgp96N蛋白的对照。
该对照蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质，其编码基因为序列表的序列4所示的DNA分子。
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成序列表的序列4所示的DNA分子，然后用如下引物对进行PCR扩增，引入XhoI和XbaI酶切识别位点：
上游引物：5’-CTGCTCGAGAAAAGAGAGGAGGTGGATGTG-3’；
下游引物：5’-CGCTCTAGAAATTTATATTCATCCTCTTC-3’。
将PCR扩增产物用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后插入载体pPICZa A的XhoI和XbaI酶切位点之间，得到重组质粒。用重组质粒转化毕赤酵母菌X33(方法同步骤一的3)，得到对照毕赤酵母乙。
二、重组酵母的诱导表达
1、将步骤一的3得到的重组毕赤酵母(或步骤一的4得到的对照毕赤酵母甲，或步骤一的5得到的对照比赤酵母乙)的菌液接种于BMGY培养基(溶剂为水，含有质量百分含量为1％的酵母提取物，质量百分含量为2％的酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾，质量百分含量为1.34％的YNB，质量百分含量为0.00004％的生物素，体积百分含量为1％的甘油)中，于29℃、280rpm培养至OD600＝4(约16h；也可30℃、250～300rpm培养至OD600＝4)。
2、将进行步骤1培养后得到的菌液室温下3000rpm离心5min，收集菌体，用适量体积的BMMY培养基(溶剂为水，含有质量百分含量为1％的酵母提取物，质量百分含量为2％的酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾，质量百分含量为1.34％的YNB，质量百分含量为0.00004％的生物素，体积百分含量为0.5％甲醇)重悬菌体，使OD600＝1.0左右。
3、在步骤2得到的菌液中加甲醇至终浓度为1％(体积百分含量)，于29℃、280rpm培养，每24h定点取样并补充甲醇至终浓度为1％(体积百分含量)。步骤3中第一次加入甲醇前的菌液为0d的样品，加入甲醇后培养24小时的菌液为1d的样品，依次类推。
4、分别把0d、1d、2d、3d、4d、5d的样品离心后取上清；取10ml 5d的样本离心后取上清，用PBS缓冲液4℃透析，得到透析后样本。将各个上清和透析后样本一起进行SDS-PAGE分析，并用western blot验证。
重组毕赤酵母的SDS-PAGE结果见图2。结果表明，诱导后得到了约50kD的目的蛋白，且随诱导时间的增加，目的蛋白的表达量增加。重组毕赤酵母的western blot验证结果见图3。对照毕赤酵母甲诱导前后均检测不到目的蛋白。
5、将500ml步骤3中第一次加入甲醇后培养120小时的重组毕赤酵母菌液离心取上清，浓缩，用PBS缓冲液透析，再浓缩至15ml，即为Chgp96N蛋白液。通过BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德)检测Chgp96N蛋白液中的蛋白浓度，为10mg/ml。结果表明，500ml重组毕赤酵母的的菌液表达目的蛋白150mg，即每毫升菌液表达0.3mg目的蛋白。
6、将500ml步骤3中第一次加入甲醇后培养120小时的对照毕赤酵母甲菌液离心取上清，浓缩，用PBS缓冲液透析，再浓缩至15ml，即为对照液甲。
7、将500ml步骤3中第一次加入甲醇后培养120小时的对照毕赤酵母乙菌液离心取上清，浓缩，用PBS缓冲液透析，再浓缩至15ml，即为对照液乙。
实施例3、Chgp96N蛋白促进免疫水平的应用
一、蛋白溶液的稀释
将实施例2制备的Chgp96N蛋白液(10mg/ml)用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到Chgp96N稀释液(1μg/μl)。
将实施例2制备的对照液甲用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到稀释液甲。
将实施例2制备的对照液乙用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到稀释液乙。
二、分组处理
将SPF鸡随机分为21组，每组5只，分别处理如下：
第一组(PBS对照组)：用PBS缓冲液进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：PBS缓冲液0.5毫升；
第二组(疫苗组；V)：用NDV灭活疫苗进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第三组(疫苗+白油组；V+MO)：用NDV灭活疫苗和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，用白油调至0.5毫升；
第四组(疫苗+Chgp96N组；V+Gp96)：用NDV灭活疫苗和Chgp96N稀释液混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液10微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第五组(疫苗+Chgp96N组；V+Gp96)：用NDV灭活疫苗和Chgp96N稀释液混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液50微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第六组(疫苗+Chgp96N组；V+Gp96)：用NDV灭活疫苗和Chgp96N稀释液混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液100微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第七组(疫苗+对照甲组；V+dz)：用NDV灭活疫苗和稀释液甲混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲10微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第八组(疫苗+对照甲组；V+dz)：用NDV灭活疫苗和稀释液甲混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲50微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第九组(疫苗+对照甲组；V+dz)：用NDV灭活疫苗和稀释液甲混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲100微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第十组(疫苗+Chgp96N+白油组；V+Gp96+MO)：用NDV灭活疫苗、Chgp96N稀释液和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液10微升，用白油调至0.5毫升；
第十一组(疫苗+Chgp96N+白油组；V+Gp96+MO)：用NDV灭活疫苗、Chgp96N稀释液和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液50微升，用白油调至0.5毫升；
第十二组(疫苗+Chgp96N+白油组；V+Gp96+MO)：用NDV灭活疫苗、Chgp96N稀释液和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，Chgp96N稀释液100微升，用白油调至0.5毫升；
第十三组(疫苗+对照甲+白油组；V+dz+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液甲和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲10微升，用白油调至0.5毫升；
第十四组(疫苗+对照甲+白油组；V+dz+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液甲和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲50微升，用白油调至0.5毫升；
第十五组(疫苗+对照甲+白油组；V+dz+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液甲和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液甲100微升，用白油调至0.5毫升；
第十六组(疫苗+对照乙组；V+dzy)：用NDV灭活疫苗和稀释液乙混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙10微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第十七组(疫苗+对照乙组；V+dzy)：用NDV灭活疫苗和稀释液乙混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙50微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第十八组(疫苗+对照乙组；V+dzy)：用NDV灭活疫苗和稀释液乙混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙100微升，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第十九组(疫苗+对照乙+白油组；V+dzy+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液乙和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙10微升，用白油调至0.5毫升；
第二十组(疫苗+对照乙+白油组；V+dzy+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液乙和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙50微升，用白油调至0.5毫升；
第二十一组(疫苗+对照乙+白油组；V+dzy+MO)：用NDV灭活疫苗、稀释液乙和白油混合后进行免疫；2周龄时进行初次免疫，2周后进行加强免疫；单次免疫剂量：NDV灭活疫苗108EID50，稀释液乙100微升，用白油调至0.5毫升；
免疫方式为肌肉注射。加强免疫后2周取血，分离血清和外周血单核细胞(PBMC)，分别测定体液免疫和细胞免疫反应水平。
三、免疫效果检测
1、测定免疫后血清的血凝抑制效价
(1)在96孔V型反应板中加入25μl生理盐水。
(2)取待检血清25μl置于第1孔中，混匀后从第1孔吸出25μl置于第2孔中，如此倍比稀释直至第11孔，第11孔混匀后弃去25μl；第12孔(25μl生理盐水)为红细胞对照。
(3)每孔加配制好的La Sota病毒25μl(含4个单位血凝效价)，置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置20min。
(4)每孔各加1％红细胞悬液25μl，置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min后观察结果。
(5)结果观察：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制试验滴度，以2的指数表示。
设置三次重复实验，结果取三次试验5只鸡的平均值。结果见表2和图4。
表2血凝抑制效价的检测结果
| 组别 | 血凝抑制效价(log2) |
| 第一组 | －－ |
| 第二组 | 2.2 |
| 第三组 | 3.7 |
| 第四组 | 4.3 |
| 第五组 | 7.4 |
| 第六组 | 7.6 |
| 第七组 | 2.1 |
| 第八组 | 2.0 |
| 第九组 | 2.5 |
| 第十组 | 5.7 |
| 第十一组 | 8.2 |
| 第十二组 | 8.0 |
| 第十三组 | 3.2 |
| 第十四组 | 3.0 |
| 第十五组 | 3.5 |
| 第十六组 | 3.3 |
| 第十七组 | 5.4 |
| 第十八组 | 4.6 |
| 第十九组 | 5.3 |
| 第二十组 | 6.2 |
| 第二十一组 | 6.0 |
结果表明，Chgp96N蛋白液能显著提高La Sota的免疫效果(4-32倍)。对照蛋白液甲没有提高免疫效果的作用。对照蛋白液乙对免疫效果的提高作用比Chgp96N蛋白液差。
2、测定免疫后淋巴细胞增殖水平
(1)将PBMC悬于DMEM培养基(含有10mM HEPES、青霉素和链霉素各100U/ml、体积百分含量为10％的FBS)中，以2×106个细胞/孔铺于96孔板中，CO2细胞培养箱中37℃培养。
(2)24小时后加入10微升灭活纯化的La Sota病毒(La Sota病毒HA蛋白的含量为200纳克)作为刺激物(同时以DMEM作为阴性对照的刺激物，以ConA为阳性对照的刺激物)，培养72小时后加入MTT(20uL/孔)，培养4小时后再加入DMSO(150uL/孔)，混匀10分钟测定570nm吸光值，计算刺激系数SI。SI＝0D570值(样本孔-空白孔)/0D570值(阴性孔-空白孔)。
结果见表3。
表3刺激系数SI的检测结果
| 组别 | 刺激系数SI |
| 第一组 | 1.0 |
| 第二组 | 2.5 |
| 第三组 | 5.4 |
| 第四组 | 6.7 |
| 第五组 | 7.9 |
| 第六组 | 8.4 |
| 第七组 | 2.2 |
| 第八组 | 2.6 |
| 第九组 | 2.3 |
| 第十组 | 7.5 |
| 第十一组 | 8.6 |
| 第十二组 | 8.3 |
| 第十三组 | 5.2 |
| 第十四组 | 4.9 |
| 第十五组 | 5.3 |
| 第十六组 | 3.7 |
| 第十七组 | 5.3 |
| 第十八组 | 6.1 |
| 第十九组 | 5.5 |
| 第二十组 | 6.6 |
| 第二十一组 | 6.8 |
与单独疫苗组相比，联合免疫组(V+Gp96)的SI能提高2-3倍。联合免疫组(V+Gp96+MO)的SI提高幅度更大，说明Chgp96N能明显增强La Sota灭活疫苗的细胞反应水平。对照蛋白液甲没有提高免疫效果的作用。对照蛋白液乙对免疫效果的提高作用比Chgp96N蛋白液差。
实施例4、Chgp96N蛋白与疫苗联合免疫的应用
将实施例2制备的Chgp96N蛋白液(10mg/ml)用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到Chgp96N稀释液(1μg/μl)。
将实施例2制备的对照液甲用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到稀释液甲。
将实施例2制备的对照液乙用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到稀释液乙。
一、分组给药
选用25只2周龄的SPF鸡为试验动物进行免疫。试验分为五组，每组5只鸡，各组的免疫情况如下：
第一组(阴性对照组)：用PBS缓冲液免疫(0.5ml)；
第二组(灭活疫苗+Chgp96组)：用NDV灭活疫苗和Chgp96N稀释液混合后免疫，每次每只鸡免疫108EID50NDV灭活疫苗和50微升Chgp96N稀释液，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第三组(灭活疫苗+稀释液甲组)：用NDV灭活疫苗和稀释液甲混合后免疫，每次每只鸡免疫108EID50NDV灭活疫苗和50微升稀释液甲，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第四组(灭活疫苗+稀释液乙组)：用NDV灭活疫苗和稀释液乙混合后免疫，每次每只鸡免疫108EID50NDV灭活疫苗和50微升稀释液乙，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
第五组(灭活疫苗组)：用NDV灭活疫苗免疫，每次每只鸡免疫108EID50NDV灭活疫苗，用PBS缓冲液调至0.5毫升；
每次免疫均采用肌肉注射。实验进行40天，第一次免疫作为实验第1天，第15天进行第二次免疫。持续观察鸡体的临床症状。
二、临床表征
每天观察试验动物，对临床症状进行统计评分。临床症状观察项目：精神状态、有无食欲、是否呕吐、是否有分泌物、粪便形状、采食及死亡情况、增重情况等。临床症状评分标准：按照下表给鸡群进行打分，分数越高，体况越好，满分10分，评分标准见表4，评分结果见表5。评分时间和频率：对试验动物从实验第1天开始每10天评分一次。
表4临床症状评分标准
表5鸡群临床症状评分统计结果
根据临床观察，结果表明各试验组及阴性对照组临床症状评分统计学上不存在着差异，即灭活疫苗和Chgp96蛋白联合免疫对鸡的生长无不良影响。
三、免疫学指标
分别于免疫前、免疫后14、21和28天颈静脉采血，检测鸡血中的如下免疫学指标：淋巴细胞增殖水平和血凝抑制效价，检测方法参见实施例3，结果见表6。
表6免疫后各组鸡血IFN-γ水平分析表
根据以上结果显示，与其他组相比，第二组(灭活疫苗+Chgp96组)中淋巴细胞增殖水平水平存在着差异，明显高过其他四组。可见Chgp96作为佐剂可以显著增强市售灭活疫苗的免疫效力。
四、攻毒实验
在实验第28天对鸡群进行攻毒试验，攻毒方式为肌肉注射0.5ml新城疫病毒(购自中国兽医药品监察所，货号为CVCC AV29)，攻毒7天后检测鸡群中疫苗及免疫增强剂的保护率(存活率)。
结果表明，第二组(灭活疫苗+Chgp96组)的保护率为100％，第三组(灭活疫苗+稀释液甲组)的保护率为80％，第四组(灭活疫苗+稀释液乙组)的保护率为90％，第五组(灭活疫苗组)的保护率为80％，第一组(阴性对照组)鸡群全部死亡。
以上数据均表明Chgp96蛋白溶液可以作为禽用疫苗的免疫增强剂，显著增加疫苗的免疫效果。将Chgp96蛋白和现有疫苗作为新疫苗使用，可以有效地预防鸡新城疫的发生，对鸡群具有保护力。
Claims (2)
1.一种用于预防和/或治疗鸡新城疫病的复合型疫苗，它的活性成分由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质和新城疫病疫苗组成；
所述新城疫病疫苗为新城疫病毒灭活疫苗。
2.由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在制备用于预防和/或治疗鸡新城疫病的复合型疫苗中的应用：
所述复合型疫苗，它的活性成分由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质和新城疫病疫苗组成；所述复合型疫苗中所述蛋白质作为免疫增强剂；所述新城疫病疫苗为新城疫病毒的灭活疫苗。
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