CN111944022B - 一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽及其应用，属于生物医药技术领域；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。本发明的多肽能够显著促进ASFV致敏免疫细胞增殖，并且能够通过促进猪CD8⁺T细胞分泌IFN‑γ促进猪机体产生ASFV抗原特异性免疫应答。免疫动物后，能显著促进猪机体免疫应答。本发明所述多肽或者由多肽聚合得到的多肽聚合物能够用于制备非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗。

Description

一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多 肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒主要感染巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞，感染后ASFV通过不同机制逃逸宿主先天和固有的免疫防御系统，如Ⅰ型干扰素(IFN)应答、细胞凋亡、炎症反应及特异靶基因的活化。

疫苗是预防非洲猪瘟最有效的方法之一。传统的减毒活疫苗和灭活疫苗是目前最为常用的疫苗。但是ASFV的天然致弱毒株或基因缺失致弱毒株因存在生物安全隐患、免疫副反应、散毒危险及遗传背景不清等诸多缺陷限制了其在疫苗生产中的应用。ASFV编码多达167种蛋白，这对筛选能诱导机体免疫保护的候选抗原造成极大难度。然而，已报道数种蛋白可作为病毒中和的靶子，并对其进行了重组蛋白疫苗研究。P30和p54两种蛋白位于病毒外部，分别涉及病毒吸附和内化作用。用p30和p54蛋白免疫家猪可诱导产生中和抗体，但不能抵御致死性攻毒，病程亦未改变，而用p30和p54联合疫苗免疫既可产生中和抗体，也可改善病程。Inovoa等评估了模拟病毒蛋白的46种肽以确定其建立保护免疫应答的能力。接种某些联合肽可延迟家猪死亡。但是目前为止，尚未见报道完全有效的ASFV亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽及其应用，本发明的多肽能够用于制备ASFV亚单位疫苗，制备得到的亚单位疫苗能够有效增强机体ASFV特异性免疫应答，预防非洲猪瘟病毒感染。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；

所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述第五多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述多肽通过促进猪机体中的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答；和/或，

所述多肽通过促进非洲猪瘟病毒抗原特异性单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答。

优选的，所述ASFV抗原特异性单核巨噬细胞包括CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞和B细胞的增殖。

本发明提供了一类由上述方案所述多肽聚合得到的多肽聚合物。

本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用。

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的活性成分包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物。

优选的，所述亚单位疫苗的剂型包括注射剂。

优选的，所述亚单位疫苗中所述多肽或者所述多肽聚合物的含量为100μg/组分/头份。

本发明的有益效果：本发明提供了一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。本发明的多肽能够显著促进ASFV致敏免疫细胞增殖，并且能够通过促进猪CD8⁺T细胞分泌IFN-γ促进猪机体产生ASFV抗原特异性免疫应答。免疫动物后，能够显著促进猪机体免疫应答。本发明所述多肽或者由所述多肽聚合得到的多肽聚合物能够用于制备非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗。本发明的多肽没有毒副作用以及生物安全隐患，作为ASFV疫苗组分具有产业化优势。

附图说明

图1为AP1的鉴定色谱图；

图2为AP1的质谱图；

图3为AP2的鉴定色谱图；

图4为AP2的质谱图；

图5为AP3的鉴定色谱图；

图6为AP3的质谱图；

图7为AP4的鉴定色谱图；

图8为AP4的质谱图；

图9为AP5的鉴定色谱图；

图10为AP5的质谱图；

图11为AP1～AP5促ASFV致敏淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图；

图12为AP1～AP5促健康猪淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图；

图13为AP1促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；

图14为AP2促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；

图15为AP3促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；

图16为AP4促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；

图17为AP5促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；

图18为二免14d，B淋巴细胞亚群比例水平；

图19为CD8⁺T淋巴细胞亚群比例水平。

具体实施方式

本发明提供了一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；所述多肽通过促进猪机体中的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答；和/或，所述多肽通过促进非洲猪瘟病毒抗原特异性单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答。

在本发明中，所述非洲猪瘟病毒抗原特异性淋巴细胞包括CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞和B细胞。

在本发明中，所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：SMMMVFNQL(Ser-Met-Met-Met-Val-Phe-Asn-Gln-Leu)，平均分子量为1100.37g/mol，化学式为：C₄₇H₇₇N₁₁O₁₃S₃。该多肽的理论等电点为pH 7，该多肽的GRAVY值为0.97，具有疏水性。该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。

在本发明中，所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：RGLMEITFML(Arg-Gly-Leu-Met-Glu-Ile-Thr-Phe-Met-Leu)。平均分子量为1210.5g/mol，化学式为：C₅₄H₉₁N₁₃O₁₄S₂。该多肽的理论等电点为pH 7，该多肽的GRAVY值为0.96，具有疏水性。该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。

在本发明中，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：MQWFMTMVI(Met-Gln-Trp-Phe-Met-Thr-Met-Val-Ile)。平均分子量为1186.5g/mol，化学式为：C₅₅H₈₃N₁₁O₁₂S₃。该多肽的理论等电点为pH 7，该多肽的GRAVY值为1.34，具有疏水性。该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。

在本发明中，所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：YKLHGMRWF(Tyr-Lys-Leu-His-Gly-Met-Arg-Trp-Phe)。平均分子量为1237.47g/mol，化学式为：C₆₀H₈₄N₁₆O₁₁S。该多肽的理论等电点为pH 10.39，该多肽的GRAVY值为-0.63，具有亲水性。

在本发明中，所述第五多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：HLLNFTLHCHA(His-Leu-Leu-Asn-Phe-Thr-Leu-His-Cys-His-Ala)。平均分子量为1305.5g/mol，化学式为：C₅₉H₈₈N₁₈O₁₄S。该多肽的理论等电点为pH 7.41，该多肽的GRAVY值为0.43，具有疏水性，该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。

在本发明中，上述技术方案所述的多肽是通过对ASFV流行毒株序列进行测定，并通过计算机辅助生物信息学预测获得，具有特异性。

本发明提供了一类由上述方案所述多肽聚合得到的多肽聚合物。

本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用。

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的活性成分包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物。

优选的，所述亚单位疫苗的剂型包括注射剂。

优选的，所述亚单位疫苗中所述多肽或多肽聚合物的含量为100μg/组分/头份。

在本发明中，所述多肽优选的由上海生工生物工程有限公司合成。

本发明提供了一种包括上述方案所述多肽的多肽聚合物。

本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用。

在本发明中，所述多肽或者所述多肽聚合物通过促进猪CD8⁺T细胞分泌IFN-γ来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答；或者，所述多肽或者所述多肽聚合物通过促进非洲猪瘟病毒抗原特异性单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答；所述ASFV抗原特异性单核巨噬细胞包括CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞和B细胞的增殖。

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的活性成分包括上述方案所述多肽或者上述方案所述多肽聚合物。本发明的亚单位疫苗能够增强猪机体的免疫能力。

本发明上述方案所述制剂或者上述方案所述亚单位疫苗的剂型分别包括注射剂；所述制剂或者所述亚单位疫苗中所述多肽或者多肽聚合物的含量为100μg/组分/头份，即每种多肽或每种多肽聚合物的含量均为100μg/头份；所述制剂或者所述亚单位疫苗优选的还包括佐剂50V2；所述制剂或者所述亚单位疫苗的状态优选为油包水乳化态。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1多肽的固相合成及纯度检测

本发明的多肽如下：

SEQ ID NO.1：SMMMVFNQL，AP1；

SEQ ID NO.2：RGLMEITFML，AP2；

SEQ ID NO.3：MQWFMTMVI，AP3；

SEQ ID NO.4：YKLHGMRWF，AP4；

SEQ ID NO.5：HLLNFTLHCHA，AP5；

上述多肽由上海生工生物工程有限公司合成。检测波长为214nm。得到最终的多肽提纯产物纯度>98％，并经ESI-MS鉴定结构，鉴定结果参见图1～图10，其中图1为AP1的鉴定色谱图，出峰时间为8.607min；图2为AP1的质谱图，鉴定分子量为1100.45g/mol，与理论值相符；图3为AP2的鉴定色谱图，出峰时间为15.534min；图4为AP2的质谱图，鉴定分子量为1210.65g/mol，与理论值相符；图5为AP3的鉴定色谱图；图6为AP3的质谱图，鉴定分子量为1186.55g/mol，与理论值相符；图7为AP4的鉴定色谱图，出峰时间为11.688min，图8为AP4的质谱图，鉴定分子量为1237.85g/mol，与理论值相符；图9为AP5的鉴定色谱图，出峰时间为10.485min；图10为AP5的质谱图，鉴定分子量为1306.75g/mol，与理论值相符。由图1～图10可知，成成功合成了上述5条多肽。

实施例2猪淋巴细胞增殖实验

1、ASFV灭活病毒免疫猪。

用ASFV流行毒株灭活病毒(来源于中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室)(10HID50)免疫5只90日龄雄性长白猪，一个月后加强免疫一次，7天后对猪执行安乐死，解剖后取出脾脏。用未免疫的健康猪作为阴性对照组。

2、脾细胞的制备、培养及增殖情况检测。

1)用75％酒精对采取的猪脾脏进行无菌处理，PBS清洗三次后，将脾脏剪成小块，置于折叠的无菌纱布(2层)中，并在含5mL含血清1640培养基的平皿中研磨脾脏。

2)之后吸取液体于15ml离心管中，1000rpm，离心5min。

3)弃去上清，敲击沉淀物(细胞)使其均匀悬浮。

4)加入10ml红细胞裂解液，裂解10min，之后加入6ml含血清1640培养基终止裂解，混匀后1000rpm，离心5min。

5)弃去上清，再次敲击沉淀物使其均匀悬浮，之后取10μL悬浮液稀释40倍，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁶个细胞/mL。

6)CFSE染色后，将制备好的脾细胞接种到24孔板中(1×10⁶个细胞/孔)。

7)分别加入0.2μg本发明提供的多肽(AP1～AP5)，置于CO₂培养箱中培养60h，流式细胞术检测ASFV抗原特异性脾细胞增殖情况。

检测结果参见图11。图11为AP1～AP5促ASFV致敏淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图。由图11可知，本发明的5条多肽均能显著促进ASFV特异性脾免疫细胞增殖，免疫细胞的主要类型为淋巴单核巨噬细胞。

同样的方式处理健康猪脾淋巴细胞，检测该多肽对猪机体内非抗原特异性脾细胞增殖的影响。

检测结果参见图12。图12为AP1～AP5促健康猪淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图。由图12可知，本发明的5条多肽不能显著促进健康猪脾免疫细胞增殖。

实施例3不同亚型脾淋巴细胞分泌IFN-γ的情况检测

猪免疫程序及脾细胞分离培养同实施例2。获得分散的脾细胞后，以RPMI1640完全培养基制备成单细胞悬液，浓度为1×10⁶/ml。接种到24孔板中，每孔分别加入0.2μg本发明提供的多肽(AP1～AP5)，置于CO₂培养箱中培养60h。收集每孔细胞，分别用猪CD3、CD4、CD8及IFN-γ特异性抗体标记细胞，之后用含2％血清的PBS缓冲液洗涤2次，最后用该洗涤液分散成细胞悬液，利用流式细胞仪检测、分别确定B淋巴细胞、CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞及单核巨噬细胞分泌IFN-γ的水平。

检测结果参见图13～图17。其中图13为AP1促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；图14为AP2促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；图15为AP3促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；图16为AP4促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；图17为AP5促进不同亚型免疫细胞分泌IFN-γ的水平；由图13～图17可知，本发明中的五条多肽均能显著增强单核巨噬细胞及CD8⁺T淋巴细胞细胞分泌IFN-γ的能力。

实施例4多肽作为ASFV疫苗有效成分免疫动物免疫细胞分型实验

用本发明中的5条多肽混合(每种多肽100μg/头份)免疫3只90日龄雄性长白猪，一个月后加强免疫一次，二免后14d流式细胞仪检测外周血中免疫细胞的比例。同样体积PBS免疫组作为对照。

检测结果参见图18～图19。其中图18为二免14d，B淋巴细胞亚群比例水平；图19为CD8⁺T淋巴细胞亚群比例水平。由图18～图19可知本发明中的5条多肽混合免疫能够促进猪机体产生淋巴细胞免疫应答，增强猪的免疫力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一类促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Met Met Met Val Phe Asn Gln Leu

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Gly Leu Met Glu Ile Thr Phe Met Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gln Trp Phe Met Thr Met Val Ile

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Tyr Lys Leu His Gly Met Arg Trp Phe

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

His Leu Leu Asn Phe Thr Leu His Cys His Ala

1 5 10

Claims (5)

1.一种促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述多肽通过促进猪机体中的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答，和/或，

所述多肽通过促进非洲猪瘟病毒抗原特异性单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答。

2.根据权利要求1所述多肽，其特征在于，所述ASFV抗原特异性单核巨噬细胞包括CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞和B细胞。

3.权利要求1或2所述多肽在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用。

4.一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的活性成分包括权利要求1或2所述多肽。

5.根据权利要求4所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗的剂型包括注射剂。

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