CN110078819A - 一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法 - Google Patents

一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及畜禽免疫学和抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法。该抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。生产该抗体制备工艺简单，成本低，可行性高，可以用于非洲猪瘟抗体的大量制备，所得抗体可用于被污染猪场和早期感染猪，以减少非洲猪瘟病毒的复制和传播。

Description

一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及畜禽免疫学和抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(简称ASF)是世界动物卫生组织(OIE)A类法定报告的动物疫病，由非洲猪瘟病毒感染引起，具有急性、热性和高度接触性，我国将其列为一类动物传染病。我国自2018年8月3日辽宁沈阳首次发生非洲猪瘟以来，半年多时间里已传播至28个省市，引发疫情百余起，上百万头猪被扑杀。由于我国养猪场(包括母猪场、商品代猪场等)以几百头到几千头的中小型猪场为主，数量众多，防疫水平和生物安全水平不高，分布也很不合理，使疫情很容易扩散。此外，运输、检疫、屠宰、食品加工、泔水处理等环节还存在大量卫生安全隐患，大大增加了病毒扩散的可能。
对于类似动物疫病的防控方法一般有：①“拔牙疗法”，即猪场一旦发现有明显症状的病猪就处理掉，症状不明显或没有症状的猪则继续饲养，该方法存在遗漏情况，有可能再次引发疫情。②用非洲猪瘟流行毒株的合适天然弱毒株或人工致弱毒株做疫苗，给猪进行免疫，提高猪群抗体水平，以减少非洲猪瘟野毒株对猪群的危害。但由于非洲猪瘟病毒基因组结构复杂，大部分蛋白功能仍为未知，因此至今尚未研制出安全有效的疫苗。③制作非洲猪瘟的抗体，给缺少免疫应答时间的猪补充抗体，减少或阻止非洲猪瘟病毒对猪的侵害、减少病毒在猪体内的复制以及在猪群中的快速传播，最终增加成猪供应。科学实践过程中发现非洲猪瘟康复猪能够产生抗体，其血清也能有效降低其它发病猪体内的病毒滴度，但非洲猪瘟康复猪数量有限，无法满足大量猪群的需求，所以用制备非洲猪瘟抗体成为获得足量抗体的首要手段。利用本体动物猪来制备非洲猪瘟抗体，无论使用强毒株或弱毒株来免疫猪，被免疫猪都可能携带病毒，使血清存在安全隐患，且祛除猪血液中病毒的设备和工艺相对复杂，成本比较高，实际生产中不适用；用马、牛等大型哺乳动物做抗体理论上可行，但是牛、马价格远高于猪，饲养数量却远少于猪，因此使用马、牛制备抗体也存在成本过高以及不易实行的问题。
发明内容
针对目前制备非洲猪瘟抗体存在安全隐患，以及成本过高和不易实行的问题，本发明提供一种抗非洲猪瘟的抗体。
以及，本发明提供一种抗非洲猪瘟的抗体的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种抗非洲猪瘟的抗体，所述抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。
禽类动物不是非洲猪瘟病毒的宿主动物，非洲猪瘟病毒不在禽类动物体内复制，故所得禽蛋中也没有该病毒。由禽类动物产生的抗体与以本体动物猪制备所得抗体相比，其主要轻链部分高度相似，交叉覆盖度比较高，并且禽类动物来源丰富，可选自鸡、鸭、鹅等饲养量庞大的家禽，易于获得且成本低，可行性高，因此可以用于非洲猪瘟抗体的大量制备，所得抗体可用于被污染猪场和早期感染猪，以减少非洲猪瘟病毒的复制和传播。
优选地，步骤a中所述非洲猪瘟病毒的毒价为104～106TCID50/mL，可选自符合毒价范围的天然致弱株、人工致弱株或弱毒株疫苗，一般经过四到六次免疫即可使卵黄中猪瘟抗体含量超过40ng/mL。在能保证生物安全的条件下，也可以利用非洲猪瘟流行强毒株免疫健康禽类动物。
优选地，所述禽类动物为家禽，饲养量庞大，产蛋数量多且易于获得，成本低。可选用19～21周龄的健康产蛋母鸡。
以及，本发明实施例还提供了上述抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤a、用非洲猪瘟病毒免疫健康禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄；
步骤b、提取所述卵黄中的水溶性组分，过滤，即得。
用本发明所提供的制备方法可得到大量带有抗体的卵黄，从而能够实现非洲猪瘟抗体的大量制备。
该方法步骤a所得卵黄可经加工后直接用于猪拌料，通过口服吸收使猪获得抗体，如：向收集所得卵黄中加入3～5倍体积的纯净水，搅拌均匀后抽入离心喷雾干燥塔中进行干燥制粉，干燥温度控制在155～165℃之间(以确保水分瞬间被气化、抽离)，离心喷雾头转速设定为8000～25000rpm，收集卵黄粉，并进一步进行粉碎过筛，所得卵黄粉用于猪的拌料使用。但所得卵黄粉中抗体约损失50％左右，且溶解性差，只能用于拌料，不能用于饮水或注射。
优选地，步骤a中还包括当抗体含量超过40ng/mL后，每15～25天进行一次加强免疫，可维持禽蛋中的抗非洲猪瘟抗体处于较高水平，从而可以持续获得含有抗体的卵黄。
优选地，步骤b中提取所述水溶性组分的方法为：向收集所得卵黄中加入3～5倍体积的纯净水，搅拌破乳，静置2到6个小时，收集上清液，即得。
优选地，所述纯净水中含有乳化剂，促使卵黄破乳。乳化剂可选择无毒的市售乳化剂，如聚乙二醇6000、聚氧乙烯聚氧丙烯等，用量为纯净水质量的1～3％。
优选地，所述过滤为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
优选地，所述制备方法还包括将步骤b过滤所得上清液进行浓缩、干燥。如，可采用浓缩罐在55～65℃进行浓缩，将所得上清液浓缩至原体积的1/3～1/4。干燥可选用离心喷雾干燥机或真空冻干机等将浓缩液制成抗体粉末，收集得到的抗体粉末可以制备注射液、溶液和粉散剂，分别用于猪的注射、饮水和拌料，便于猪场多种方法应用。
优选地，所述干燥为低温真空离心喷雾干燥，干燥温度为55～65℃，离心喷雾头转速控制范围在8000～25000rpm。采用该参数进行干燥能够避免离心喷雾干燥机的高温对抗体产生破坏，使得到的抗体粉末保持效价，又能使生产的时间成本和动力成本远低于真空冻干。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
1、家禽免疫：选择20周龄的健康产蛋母鸡，分3次通过胸肌和颈部皮下各注射0.5mL非洲猪瘟灭天然致弱株(毒价为104TCID50/mL)，并每隔1周再次进行免疫，直至卵黄中非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL。之后每隔15天进行一次加强免疫，以维持卵黄中的抗非洲猪瘟抗体＞40ng/mL。
2、提取、分离卵黄抗体：收集步骤1中符合抗体含量条件的卵黄，加入3倍体积的2.5％w/w聚乙二醇6000纯净水溶液，搅拌破乳后静置2个小时，抽取淡黄色上清液，通过0.22nm滤膜过滤，制成卵黄抗体溶液。
实施例2
本实施例提供了一种抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
1、家禽免疫：选择20周龄的健康产蛋母鸡，分3次通过胸肌和颈部皮下各注射0.5mL非洲猪瘟灭天然致弱株(毒价为105TCID50/mL)，并每隔1周再次进行免疫，直至卵黄中非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL。之后每隔25天进行一次加强免疫，以维持卵黄中的抗非洲猪瘟抗体＞40ng/mL。
2、提取、分离卵黄抗体：收集步骤1中符合抗体含量条件的卵黄，加入5倍体积的1.3％w/w聚氧乙烯聚氧丙烯纯净水溶液，搅拌破乳后静置6个小时，抽取淡黄色上清液，通过0.22nm滤膜过滤，制成卵黄抗体溶液。
3、将卵黄抗体溶液抽入低温真空浓缩罐进行浓缩，设定浓缩温度为55～65℃，将浓缩卵黄抗体溶液浓缩至原体积的1/3，再将精制抗体浓缩液抽入高温离心喷雾干燥机进行干燥制粉，干燥温度设定为155～165℃(以确保水分瞬间被气化、抽离)，离心喷雾头转速控制范围在8000～25000rpm，收集得到的干燥品经粉碎、过筛后，得到抗体粉末。
实施例3
本实施例提供了一种抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
1、家禽免疫：选择20周龄的健康产蛋母鸡，分3次通过胸肌和颈部皮下各注射0.5mL非洲猪瘟灭天然致弱株(毒价为106TCID50/mL)，并每隔1周再次进行免疫，直至卵黄中非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL。之后每隔20天进行一次加强免疫，以维持卵黄中的抗非洲猪瘟抗体＞40ng/mL。
2、提取、分离卵黄抗体：收集步骤1中符合抗体含量条件的卵黄，加入5倍体积的1.2％w/w聚氧乙烯聚氧丙烯纯净水溶液，搅拌破乳后静置4个小时，抽取淡黄色上清液，通过0.22nm滤膜过滤，制成卵黄抗体溶液。
3、将卵黄抗体溶液抽入低温真空浓缩罐进行浓缩，设定浓缩温度为55～65℃，将浓缩卵黄抗体溶液浓缩至原体积的1/4，再将精制抗体浓缩液装入冷冻干燥机中，在-40℃真空条件下经过48小时制成冻干粉，收集得到的干燥品经粉碎、过筛后，得到抗体粉末。
实施例4
本实施例提供了一种抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
1、家禽免疫：选择20周龄的健康产蛋母鸡，分3次通过胸肌和颈部皮下各注射0.5mL非洲猪瘟灭天然致弱株(毒价为105TCID50/mL)，并每隔1周再次进行免疫，直至卵黄中非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL。之后每隔20天进行一次加强免疫，以维持卵黄中的抗非洲猪瘟抗体＞40ng/mL。
2、提取、分离卵黄抗体：收集步骤1中符合抗体含量条件的卵黄，加入5倍体积的2.6％w/w聚乙二醇6000纯净水溶液，搅拌破乳后静置4个小时，抽取淡黄色上清液，通过0.22nm滤膜过滤，制成卵黄抗体溶液。
3、将卵黄抗体溶液抽入低温真空浓缩罐进行浓缩，设定浓缩温度为55～65℃，将浓缩卵黄抗体溶液浓缩至原体积的1/4，再将精制抗体浓缩液抽入低温真空离心喷雾干燥机进行干燥，温度设定为55～65℃，离心喷雾头转速控制范围在8000～25000rpm，收集得到的干燥品经粉碎、过筛后，得到抗体粉末。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗非洲猪瘟的抗体，其特征在于，具体包括如下步骤：所述抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。
2.根据权利要求1所述的抗非洲猪瘟的抗体，其特征在于，步骤a中所述非洲猪瘟病毒的毒价为104～106TCID50/mL。
3.根据权利要求1所述的抗非洲猪瘟的抗体，其特征在于，所述禽类动物为家禽。
4.一种权利要求1～3任一项所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤a、用非洲猪瘟病毒免疫健康禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄；
步骤b、提取所述卵黄中的水溶性组分，过滤，即得。
5.根据权利要求4所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，步骤a中还包括当抗体含量超过40ng/mL后，每15～25天进行一次加强免疫。
6.根据权利要求4所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，步骤b中提取所述水溶性组分的方法为：向收集所得卵黄中加入3～5倍体积的纯净水，搅拌破乳，静置2到6个小时，收集上清液，即得。
7.根据权利要求6所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，所述纯净水中含有乳化剂。
8.根据权利要求6所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，所述过滤为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤所述上清液。
9.根据权利要求4所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤b过滤所得上清液进行浓缩、干燥。
10.根据权利要求9所述的抗非洲猪瘟的抗体的制备方法，其特征在于，所述干燥为低温真空离心喷雾干燥，干燥温度为55～65℃，离心喷雾头转速控制范围在8000～25000rpm。
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