CN103316045B - 一种畜禽用多联特异性转移因子及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种畜禽用多联特异性转移因子及其制备方法，1）免疫；2）取材；3）组织处理和研磨；4）细胞破碎；5）蛋白质等电点离心；6）将上清放入压力过滤器过滤，取滤液，滤膜孔径为0.22μm；7）将以上滤液再经超滤器进行超滤，超滤膜截留分子量5000～9000道尔顿，收取滤液即为含多联特异性转移因子的原液。本发明所述方法免去以上耗时耗力的程序，大大节省人力和时间，更利于工业化生产。

Description

一种畜禽用多联特异性转移因子及制备方法

技术领域

本发明属于兽药技术领域，涉及一种畜禽用多联特异性转移因子及制备方法。

背景技术

转移因子（transfer factor TF）是免疫细胞释放的免疫细胞之间讯息传递分子，它们是一群小分子肽类物质。它们能激活免疫系统，使免疫系统确认已存在或潜在的危险，能武装免疫系统以对抗威胁。支持免疫系统对外来威胁进行快速反应，以抗拒外来威胁。威胁解决后，有能尽快平衡反应系统，使免疫系统不会过度反应，从而避免过敏反应。

自从H.S.Lawrence 1949年发现转移因子以来，它给人们展现一个健康维护和疾病治疗的全新视野。各种非特异性和特异性转移因子相继问世，为医疗事业和兽医事业做出了巨大贡献。

转移因子可分为非特异性转移因子和特异性转移因子，非特异性转移因子是指用自然动物的淋巴器官提取的具有免疫活性的转移因子；特异性转移因子是指用特定的病原体或疫苗免疫动物后，再从动物的淋巴细胞中提取具有该病原体特异性的转移因子。

随着研究的深入，人们发现除了淋巴细胞外，鸡蛋黄和初乳均富含转移因子，所以非特异性转移因子主要是用以上几种材料提取得到。特异性转移因子是经特定病原体免疫后，取以上几种组织提取得到的对某种疾病特异的转移因子，目前已在市场上流通的有乙型肝炎病特异性转移因子、各种肿瘤特异性转移因子、流行出血热转移因子、乙型脑炎转移因子、结核菌转移因子等。

转移因子在医学领域研究较活跃，发展较快，在兽医领域的研究和应用相对滞后，近几年才开始有转移因子应用于兽医领域的报道，如山东生产的信必妥（非特异性转移因子），天津生产的新城疫转移因子和禽流感转移因子等。但是迄今多联特异性转移因子在医学和兽医领域仍未见报道。

传统提取转移因子的工艺主要是经将组织材料多次冻融和研磨，然后用透析膜进行透析。传统方法的主要缺点是收获率和产量低，耗时长，不利于工业化生产。

新近有一些新的转移因子提取工艺报道用超滤法取代透析法，但是超滤膜孔径很小，极易产生堵塞。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种畜禽用多联特异性转移因子及制备方法，用多种畜、禽病原体同时免疫动物，然后取其淋巴器官提取含多种畜、禽疾病特异性转移因子，产生一石多鸟，一箭多星的放大效应。不同动物种类因其所处的环境不同，其转移因子所含的免疫信息不完全一样，如果把各物种的转移因子适当混合制备出新的转移因子，这样新的转移因子中各物种的免疫信息将产生叠加作用，定能显著提高其增强免疫的功效。本发明采取蛋白质等电点沉淀离心、微孔过滤和超滤的方法取代透析膜透析方法提取转移因子，从而大大缩短生产周期，节省人力，提高产量和含量，便于工业化大生产。

其技术方案如下：

一种畜禽用多联特异性转移因子，主要成份由多肽、核糖及氨基酸组成，其中多肽的含量为5～10mg/ml，核糖的含量为30～80μg/ml，氨基酸总量为80～150μg/ml。

一种畜禽用多联特异性转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1）免疫：将畜类主要常见病的疫苗：园环病疫苗、蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗、肺炎支原体病疫苗和猪瘟疫苗，和禽类主要常见病疫苗：禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡支原体病、鸭瘟疫苗，联合免疫动物，第一次免疫后7～10天，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7天，抽取羊静脉血，取血清检测是否产生以上所有疫苗的抗体，如果有的疫苗没有产生可检抗体，再用该疫苗单独加强免疫一次，第三次加强免疫后第五天，再抽取山羊静脉血，取血清检测抗体，能检测几种抗体，之后提取的转移因子就命名为几联特异性转移因子；

2）取材：将经免疫的山羊宰杀取脾脏和淋巴结，另取土鸡蛋和牛初乳作为特异性转移因子的提取材料；

3）组织处理和研磨：将脾脏和淋巴结去除结缔组织及脂肪组织，蒸馏水清洗干净，切成小块，按照重量比：淋巴组织40%～60%，鸡蛋黄20%～30%，牛初乳20%～30%，混和放到研磨机研磨成糊状；

4）细胞破碎：用高压均质机在60pa下进行细胞破碎，破碎后，加3～5倍的蒸馏水，并搅拌均匀；

5）蛋白质等电点离心：用盐酸和氢氧化钠溶液将以上液体的PH值调到球蛋白、白蛋白、纤维蛋白的等电点，使液体产生混浊沉淀，在3000～4000转／分离心机离心20至30分钟，去除沉淀后收取上清；

6）将上清放入压力过滤器过滤，取滤液，滤膜孔径为0.22μm；

7）将以上滤液再经超滤器进行超滤，超滤膜截留分子量5000～9000道尔顿，收取滤液即为含多联特异性转移因子的原液。

进一步优选，步骤1）中所述联合免疫动物为羊。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.本发明制备的转移因子比传统技术制备的产量高、质量优，传统方法每1000g材料能制备3000ml～5000ml的转移因子，本发明每1000g材料能制备20000ml～40000ml转移因子，传统方法制备转移因子的含量为1mg/ml,本方法制备的转移因子含量为5～10mg/ml。

2.省力省时：传统方法制备转移因子要经过反复冻融、几次透析，每冻融一次要历时几个小时，每透析一次历时24小时。本法免去以上耗时耗力的程序，大大节省人力和时间。

3.本方法更利于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。

一种畜禽用多联特异性转移因子，主要成份由多肽、核糖及氨基酸组成，其中多肽的含量为5～10mg/ml，核糖的含量为30～80μg/ml，氨基酸总量为80～150μg/ml。

一种畜禽用多联特异性转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1）免疫：将畜类主要常见病的疫苗：园环病疫苗、蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗、肺炎支原体病疫苗和猪瘟疫苗，和禽类主要常见病疫苗：禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡支原体病、鸭瘟疫苗，联合免疫动物，所述联合免疫动物为羊，第一次免疫后7～10天，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7天，抽取羊静脉血，取血清检测是否产生以上所有疫苗的抗体，如果有的疫苗没有产生可检抗体，再用该疫苗单独加强免疫一次，第三次加强免疫后第五天，再抽取山羊静脉血，取血清检测抗体，能检测几种抗体，之后提取的转移因子就命名为几联特异性转移因子；

2）取材：将经免疫的山羊宰杀取脾脏和淋巴结，另取土鸡蛋和牛初乳作为特异性转移因子的提取材料；

3）组织处理和研磨：将脾脏和淋巴结去除结缔组织及脂肪组织，蒸馏水清洗干净，切成小块，按照重量比：淋巴组织40%～60%，鸡蛋黄20%～30%，牛初乳20%～30%，混和放到研磨机研磨成糊状；

4）细胞破碎：用高压均质机在60pa下进行细胞破碎，破碎后，加3～5倍的蒸馏水，并搅拌均匀；

5）蛋白质等电点离心：用盐酸和氢氧化钠溶液将以上液体的PH值调到球蛋白、白蛋白、纤维蛋白的等电点，使液体产生混浊沉淀，在3000～4000转／分离心机离心20至30分钟，去除沉淀后收取上清；

6）将上清放入压力过滤器过滤，取滤液，滤膜孔径为0.22μm；

7）将以上滤液再经超滤器进行超滤，超滤膜截留分子量5000～9000道尔顿，收取滤液即为含多联特异性转移因子的原液。

8）含量检测用紫外分光光度计检测本多联特异性转移因子多肽的含量为5～10mg/ml，核糖的含量为30～80μg/ml，用氨基酸分析仪检测氨基酸总量为80～150μg/ml。

9)安全检测用10倍单剂量转移因子腹腔注射小鼠，观察20天，小鼠不发生异常反应及异常死亡。

10）效力检测本多联特异性转移因子单独注射或喂饲动物，连续给药5～7天，动物外周血淋巴细胞转化率提高20%～40%。和疫苗配伍使用能使疫苗效力调高20%～140%。

11）本发明所使用疫苗的规格、生产厂家、注册批号如表1所示：

表1

以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种畜禽用多联特异性转移因子的制备方法，其特征在于，所述畜禽用多联特异性转移因子，主要成分由多肽、核糖及氨基酸组成，其中多肽的含量为5～10mg/ml，核糖的含量为30～80μg/ml，氨基酸总量为80～150μg/ml，包括以下步骤：

1)免疫：将畜类主要常见病的疫苗：园环病疫苗、蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗、肺炎支原体病疫苗和猪瘟疫苗，和禽类主要常见病疫苗：禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡支原体病、鸭瘟疫苗，联合免疫动物，第一次免疫后7～10天，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7天，抽取羊静脉血，取血清检测是否产生以上所有疫苗的抗体，如果有的疫苗没有产生可检抗体，再用该疫苗单独加强免疫一次，第三次加强免疫后第五天，再抽取山羊静脉血，取血清检测抗体，能检测几种抗体，之后提取的转移因子就命名为几联特异性转移因子；

2)取材：将经免疫的山羊宰杀取脾脏和淋巴结，另取土鸡蛋和牛初乳作为特异性转移因子的提取材料；

3)组织处理和研磨：将脾脏和淋巴结去除结缔组织及脂肪组织，蒸馏水清洗干净，切成小块，按照重量比：淋巴组织40％～60％，鸡蛋黄20％～30％，牛初乳20％～30％，混和放到研磨机研磨成糊状；

4)细胞破碎：用高压均质机在60pa下进行细胞破碎，破碎后，加3～5倍的蒸馏水，并搅拌均匀；

5)蛋白质等电点离心：用盐酸和氢氧化钠溶液将以上液体的pH值调到球蛋白、白蛋白、纤维蛋白的等电点，使液体产生混浊沉淀，在3000～4000转/分离心机离心20至30分钟，去除沉淀后收取上清；

6)将上清放入压力过滤器过滤，取滤液，滤膜孔径为0.22μm；

7)将以上滤液再经超滤器进行超滤，超滤膜截留分子量5000～9000道尔顿，收取滤液即为含多联特异性转移因子的原液；

步骤1)中所述联合免疫动物为羊。