CN110179762A - 一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)组织捣碎：将脾淋组织装入捣碎缸，加入稀释液，开启捣碎机进行捣碎，捣碎完成后将乳剂取出；2)过滤：将捣碎完的乳剂经不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液；3)离心：将过滤后组织液以2800‑4000r/min，离心5‑15min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用不锈钢网进行过滤；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂；6)分装、冻干即可。本发明采用捣碎过滤后再离心过滤方法可以去除组织液中多余残渣、油脂。使疫苗更加纯净，有效成分含量更高。

Description

一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于生物与医药生物技术领域，具体涉及一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性热性接触性传染病。其特征为败血性病理变化，内脏出血、梗塞及坏死。猪瘟是威胁养猪业的重要传染病之一，一年四季都可发生，常给养猪业造成毁灭性损失，预防猪瘟最有效的方法就是接种猪瘟疫苗。用的猪瘟疫苗主要有两种：猪瘟活疫苗(细胞源)和猪瘟耐热保护剂活疫苗(兔源)。其中猪瘟耐热保护剂活疫苗(兔源)在制造过程中如脂肪去除不净，进入疫苗内，会造成疫苗溶解不佳导致免疫效果不好和外源用兔检验有因注射含脂肪的疫苗时造成脂肪性栓塞而死亡，致该项目不合格的情况，从而造成产品报废，生产企业产生经济损失。
传统猪瘟耐热保护剂活疫苗(兔源)的配苗方式是选择定性热和轻热反应兔，以无菌手术采集脾脏和淋巴结，剔除脂肪组织后称重、加入适量的保护剂捣碎、研磨，然后过滤，扣除残渣后按重量加入足量的保护剂后，充分摇匀，定量分装后冻干成成品。在其制造过程中剔除脂肪组织环节非常重要，而不同季节附着在脾脏和淋巴上的脂肪量又不同，温度低时会较温度高时脂肪多2％-5％。操作时为避免污染及病毒失活，要求无菌操作且速度要快，这种方式的处理会存在脂肪处理不净而被研磨进入疫苗中造成成品的不合格。因此一种去除脂肪的工艺对产品的合格与否非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服已有工艺的缺陷，过程中新增一道工序，即二次去除脂肪类残渣，使猪瘟耐热保护剂活疫苗制备方法更加科学，提高疫苗的溶解性同时用兔进行的外源病毒检测不会因脂肪性栓塞致兔死亡而造成产品不合格。
本发明通过如下技术方案实现：
一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)组织捣碎：将脾淋组织装入捣碎缸，加入稀释液，开启捣碎机进行捣碎，捣碎完成后将乳剂取出；2)过滤：将捣碎完的乳剂经不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液；3)离心：将过滤后组织液以2800-4000r/min，离心5-15min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用不锈钢网进行过滤；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂；6)分装、冻干即可。
在其中一些实施例中，步骤1)中所述脾淋组织为脾脏和淋巴组织按1:1的比例混合。
在其中一些实施例中，步骤1)中所述捣碎具体为捣碎25-35min。
在其中一些实施例中，步骤1)中所述稀释液为乳汉液、生理盐水或PBS液。
在其中一些实施例中，步骤1)中所述脾淋组织与稀释液的体积比为1:(4-5)。
在其中一些实施例中，所述保护剂为耐热保护剂，所述耐热保护剂由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖5％～18％，乳糖5％～7％，聚赖氨酸5％～8％，明胶0.1％～0.4％，柠檬酸钠0.1％～0.8％，丝素蛋白7％～10％，余量为水。
在其中一些实施例中，步骤2)中所述不锈钢网为双层80目不锈钢网。
在其中一些实施例中，步骤4)中所述不锈钢网为单层80目不锈钢网。
在其中一些实施例中，步骤5)中所述组织液与保护剂的体积比为(4-6)：1。
在其中一些实施例中，所述步骤2)和步骤4)中过滤完后，收集残渣称重。
相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明采用捣碎过滤后再离心过滤方法可以去除组织液中多余残渣、油脂。使疫苗更加纯净，有效成分含量更高。分装过程不会出现油脂的漂浮，并且冻干成成品溶解性提高，在做外源病毒检验时离心操作表层不会出现油脂析出，实验用兔不会因疫苗溶解后含有脂肪等杂质造成静脉栓塞而死，造成因该项检验项目不通过而使该批产品报废。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例中试验用材料为：18024、18025、18026三批脾脏和淋巴；
设备名称为：捣碎机：D9078001 HLF-4；
过滤机：D9083001 HLD-06；
低温离心机：SA2-DL-5000B。
实施例1
一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)组织捣碎：将带有冰碴状的脾淋组织2000g装入捣碎缸，加入乳汉液，开启捣碎机进行捣碎25min，捣碎完成后将乳剂取出，所述脾淋组织为18024批次脾脏和淋巴组织按1:1的比例混合，所述脾淋组织与稀释液的体积比为1:5；2)过滤：将捣碎完的乳剂经双层80目不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液，并收集残渣称重；3)离心：将过滤后组织液以4000r/min，离心5min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用单层80目不锈钢网进行过滤，并收集残渣称重；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂，所述组织液与保护剂的体积比为4：1；6)分装、冻干即可。所述耐热保护剂由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖5％，乳糖7％，聚赖氨酸5％，明胶0.4％，柠檬酸钠0.1％，丝素蛋白10％，余量为水。
实施例2
一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)组织捣碎：将带有冰碴状的脾淋组织2000g装入捣碎缸，加入生理盐水，开启捣碎机进行捣碎35min，捣碎完成后将乳剂取出，所述脾淋组织为18025批次脾脏和淋巴组织按1:1的比例混合，所述脾淋组织与稀释液的体积比为1:4；2)过滤：将捣碎完的乳剂经双层80目不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液，并收集残渣称重；3)离心：将过滤后组织液以2800r/min，离心15min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用单层80目不锈钢网进行过滤，并收集残渣称重；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂，所述组织液与保护剂的体积比为6：1；6)分装、冻干即可。所述耐热保护剂由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖18％，乳糖5％，聚赖氨酸8％，明胶0.1％，柠檬酸钠0.8％，丝素蛋白7％，余量为水。
实施例3
一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)组织捣碎：将带有冰碴状的脾淋组织2000g装入捣碎缸，加入PBS液，开启捣碎机进行捣碎30min，捣碎完成后将乳剂取出，所述脾淋组织为18026批次脾脏和淋巴组织按1:1的比例混合，所述脾淋组织与稀释液的体积比为1:5；2)过滤：将捣碎完的乳剂经双层80目不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液，并收集残渣称重；3)离心：将过滤后组织液以3000r/min，离心10min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用单层80目不锈钢网进行过滤，并收集残渣称重；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂，所述组织液与保护剂的体积比为5：1；6)分装、冻干即可。所述耐热保护剂由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖13％，乳糖6％，聚赖氨酸7％，明胶0.3％，柠檬酸钠0.5％，丝素蛋白8％，余量为水。
将实施例1-3第一次和第二次过滤出来的残渣分别进行称重，测试重量。结果如表1所示：
表1
1804批次 18025批次 18026批次
第一次过滤 360g 307g 348g
第二次过滤 72g 65g 80g
在制苗操作过程中，组织捣碎后一次过滤的残渣为15-18％，在不断的过滤过程中肉眼会看到油脂进入组织过滤液中，原操作是在一次过滤后即进行分装，在分装过程中观察油脂漂浮情况，到油脂界线处停止分装，弃掉剩余组织液，即使如此也会有油脂进入疫苗，冻干后的成品在溶解过程出现不易溶解、外源病毒检测时离心后表层油脂的析出，且实验兔耳静脉接种后易死亡。在采用离心后再过滤的残渣为19-22％，可以多过滤出2-4％的油脂，分装过程不会出现油脂的漂浮而弃去部分组织液，并且冻干成品溶解性好，表层未出现油脂析出。
综上所述，本发明在制备疫苗过程中新增一道工序：二次去除脂肪类残渣，使猪瘟耐热保护剂活疫苗制备方法更加科学，提高疫苗的溶解性，有效成分提高，同时用兔进行的外源病毒检测不会因脂肪性栓塞致兔死亡而造成产品不合格而报废的损失。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)组织捣碎：将脾淋组织装入捣碎缸，加入稀释液，开启捣碎机进行捣碎，捣碎完成后将乳剂取出；2)过滤：将捣碎完的乳剂经不锈钢网过滤至玻璃瓶内，得组织液；3)离心：将过滤后组织液以2800-4000r/min，离心5-15min，控温在10℃以下；4)二次过滤：离心完毕后组织液用不锈钢网进行过滤；5)混合：将二次过滤后的组织液内加入保护剂；6)分装、冻干即可。
2.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述脾淋组织为脾脏和淋巴组织按1:1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述捣碎具体为捣碎25-35min。
4.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述稀释液为乳汉液、生理盐水或PBS液。
5.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述脾淋组织与稀释液的体积比为1:(4-5)。
6.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，所述保护剂为耐热保护剂，所述耐热保护剂由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖8％～18％，乳糖5％～7％，聚赖氨酸5％～8％，明胶0.1％～0.4％，柠檬酸钠0.1％～0.8％，丝素蛋白7％～10％，余量为水。
7.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述不锈钢网为双层80目不锈钢网。
8.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述不锈钢网为单层80目不锈钢网。
9.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述组织液与保护剂的体积比为(4-6)：1。
10.根据权利要求1所述的兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤4)中过滤完后，收集残渣称重。
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