CN101721427B - 一种鸡新城疫特异性转移因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体地，本发明涉及一种鸡新城疫特异性转移因子的制备方法，包括以下步骤1)用杨树皮类脂饲喂健康鸡，用量为每只鸡每天0.8～1.0g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫，获取脾脏；2)将强化免疫新城疫的健康鸡脾脏洗净，经破碎、冻融、过滤，获得鸡新城疫特异性转移因子。通过本发明的方法制备的鸡新城疫特异转移因子不仅具有增强机体特异性、非特异性免疫应答，提高机体免疫系统清除异物的能力，还具有降低机体免疫应答的强度，减轻由于超敏反应而造成的组织病理损伤，对于鸡新城疫病的免疫治疗有较好的应用前景。

Description

一种鸡新城疫特异性转移因子的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地，本发明涉及一种鸡新城疫特异性转移因子的制备方法。

背景技术

转移因子(transfer factor，TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能。TF自50年代发现至今，国内外学者都对其进行了大量研究，并于1979年将其引入到兽医免疫和临床治疗中，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。

由于转移因子无种属特异性，因此临床上转移因子的来源较为广泛，人类临床上常见的有人转移因子、猪转移因子、牛转移因子、羊转移因子、鹅、猴转移因子等。现阶段畜禽上常见的有牛转移因子、猪转移因子，鸡转移因子。肉鸡脾脏为加工过程中的废物，因此有着极广的应用开发前景，已成为转移因子研究的热点。

转移因子为分子量小于10000，具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其内含物包括游离氨基酸(16-18种)，核酸，多肽及K、Na、Ca、Mg、Za等金属元素。各种TF内的理化特性，组成成分差异不大，但含量有较大羞异。以SephadexG-255进行柱层析，一般哺乳动物脾脏小分子活性物质提取物可得到3-6个峰，鸡脾脏小分子活性物质提取液层析后可得到3个组分，其中组分1的多肽含量高，组分2、组分3中核苷酸含量高。水解人，猪，牛的TF可得到18种氮基酸，其中谷氨酰胺含量最高，精氨酸和天门冬氨酸次之。鸡脾脏小分子活性物质提取液的活性组分中甘氨酸、丝氪酸、谷氨酸含量较高，有研究报道G-25柱层析各组分均含有甘氨酸、丝氨酸，且各组分免疫活性的强弱与这两种氨基酸的浓度呈正相关。

从免疫学上，TF可分为特异性转移因子和非特异性转移因子两大类。特异性转移因子系采用某种特定病原感染或免疫人群、动物后再提取含该抗原特异活性的转移因子。目前临床已经应用有乙型肝炎病毒特异转移因子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙型脑炎转移因子，结核菌转移因子等。非特异性转移因子是指用自然人群或动物白细胞提取的具有多种免疫活性的转移因子，可非特异性调节机体的免疫机能，从而提高机体的抵抗力或疫苗的免疫效果。

杨树皮类脂(Poplar Bark Lipid，PBL)是从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物质，富含大量的多糖、有机酸、甾醇、磷脂、甙类及维生素等物质。多糖类具有促胸腺体液反应、刺激网状内皮系统，提高机体特异性免疫反应能力；有机酸具有增强机体免疫功能的作用，能够刺激和促进单核吞噬细胞功能，对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用；甙类能够加速抗体的产生、促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用。这些物质在动物体内协调统一，大大提高动物体的免疫机能。

作为杨树皮的提取物，杨树皮类脂与大多数的中草药一样，也存在着双向性，当使用剂量过大时，不但不能起到正向促进作用，相反免疫器官会出现免疫抑制作用，因此，合适的剂量是发挥杨树皮类脂免疫增强作用的关键所在。

脾脏作为最重要的外周免疫器官，其发育的状况、淋巴细胞发育程度、分化成熟程度将直接影响到制备转移因子的质量。适量的杨树皮类脂对脾脏发育具有明显的促进作用。由于杨树皮类脂成分中含有大量的必需氨基酸、微量元素、维生素等，这些营养物质正是转移因子中不可或缺的组分，通过饲喂适量的杨树皮类脂，可以很好的促进脾脏等免疫器官的发育，刺激并促进各淋巴细胞的分裂与增值，使脾脏各活性组分具有较强的生物学活性，从而整体提高转移因子的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡新城疫特异性转移因子。

根据本发明的鸡新城疫特异性转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1)用杨树皮类脂饲喂健康鸡，用量为每只鸡每天0.8～1.0g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫，获取脾脏；

2)将强化免疫新城疫的健康鸡脾脏洗净，经破碎、冻融、过滤，获得鸡新城疫特异性转移因子。

根据本发明的鸡新城疫特异性转移因子的制备方法，其中，对饲喂杨树皮类脂的健康鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫的过程如下：

首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1ml油乳剂灭活苗。

根据本发明一具体实施例的鸡新城疫特异性转移因子的制备方法包括以下步骤：

1)利用杨树皮类脂(购自山东省莒县林产化工厂)饲喂健康鸡，用量为每只鸡每天0.8～1.0g，每天一次；

2)一个月后对饲喂杨树皮类脂的鸡强化免疫法氏囊灭活疫苗，每周一次，连续三次；

3)第三次免疫后一周，获取脾脏；

4)将强化免疫新城疫的健康鸡脾脏用灭菌生理盐水洗净；

5)在无菌条件下，剔除被膜、脂肪和大的血管

6)剪碎剩余脾脏，加入等量PBS缓冲液，用高压均质机将上述混合物通过破碎压力为15MPa，剪切压力为45MPa乳化，破碎温度要求在10℃左右，进行细胞破碎；

7)破碎液反复动融三次后，4℃5000转/分离心5分钟，收集上清；

8)利用超滤装置选取分子量5000的滤包进行过滤，收集滤液；

9)校正滤液pH值至6.5-7.5，用0.22μm的滤器加压过滤，滤液加入0.01％的硫柳汞防腐处理，无菌分装，安全检验(无菌检验、安全检验根据2008版农业部兽用生物制品质量标准进行)合格后备用。

根据本发明的制备鸡新城疫特异性转移因子的方法，利用杨树皮类脂的免疫增强功能先显著提高健康鸡脾脏的免疫功能，再利用机体对疫苗注射产生的特殊免疫应答使注射过杨树皮类脂的鸡产生特异性转移因子。通过本发明的方法制备的鸡新城疫特异转移因子不仅具有增强机体特异性、非特异性免疫应答，提高机体免疫系统清除异物的能力，还具有降低机体免疫应答的强度，减轻由于超敏反应而造成的组织病理损伤，对于鸡新城疫病的免疫治疗有较好的应用前景。

具体实施方式

实施例1鸡新城疫特异性转移因子的制备

利用杨树皮类脂(购自山东省莒县林产化工厂)饲喂健康鸡，每只鸡每天0.8g每天一次；一个月后对饲喂杨树皮类脂的鸡强化免疫新城疫灭活疫苗(购自齐鲁动物保健品厂)，每周一次，连续三次。

第三次免疫后一周，获取脾脏。将强化免疫新城疫的健康鸡脾脏用灭菌生理盐水反复洗净，在无菌条件下，剔除被膜、脂肪和大的血管，剪碎剩余脾脏，加入等量PBS缓冲液，用高压均质机将上述混合物通过破碎压力为15MPa，剪切压力为45MPa，控制温度在10℃左右进行细胞破碎。将破碎液反复动融三次后，4℃5000转/分离心5分钟，收集上清。

利用超滤装置选取分子量5000的滤包进行过滤，收集滤液。校正滤液pH值至6.5-7.5，用0.22μm的滤器加压过滤，滤液加入0.01％的硫柳汞防腐处理，无菌分装，安全检验(无菌检验、安全检验根据2008版农业部兽用生物制品质量标准进行)合格后备用。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给7日龄雏鸡饮用，每只0.1ml，同时免疫新城活疫苗，7天以后测血清抗体，比不使用杨树皮类脂制备的转移因子的鸡只抗体高1-2个滴度。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给发生新城疫的病鸡饮用，每只0.2ml，可大大降低病鸡的死亡率，与不使用用杨树皮类脂制备的转移因子的病鸡相比，死亡率可降低30-40％。

实施例2鸡新城疫特异性转移因子的制备

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天1.0g外，其余步骤同实施例1。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给7日龄雏鸡饮用，每只0.1ml，同时免疫新城活疫苗，7天以后测血清抗体，比不使用转移因子的鸡只抗体高2-3个滴度。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给发生新城疫的病鸡饮用，每只0.2ml，可大大降低病鸡的死亡率，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的病鸡相比，死亡率可降低30-40％。

实施例3鸡新城疫特异性转移因子的制备

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.9g外，其余步骤同实施例1。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给7日龄雏鸡饮用，每只0.1ml，同时免疫新城活疫苗，7天以后测血清抗体，比不使用杨树皮类脂制备的转移因子的鸡只抗体高1-2个滴度。

利用本发明制备的鸡新城疫特异性转移因子给发生新城疫的病鸡饮用，每只0.2ml，可大大降低病鸡的死亡率，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的病鸡相比，死亡率可降低5-10％。

对比实施例1

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.5g外，其余步骤同实施例1。

利用这个方案制备的鸡新城疫特异性转移因子给7日龄雏鸡饮用，每只0.1ml，同时免疫新城活疫苗，7天以后测血清抗体，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的鸡只抗体相比无明显增高。

利用该对比实施例1制备的鸡新城疫特异性转移因子给发生新城疫的病鸡饮用，每只0.2ml，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的病鸡相比，死亡率未见有明显降低。

对比实施例2

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天1.2g外，其余步骤同实施例2。

利用该对比实施例2制备的鸡新城疫特异性转移因子给7日龄雏鸡饮用，每只0.1ml，同时免疫新城活疫苗，7天以后测血清抗体，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的鸡只抗体相比无明显增高。

利用这个方案制备的鸡新城疫特异性转移因子给发生新城疫的病鸡饮用，每只0.2ml，与不使用杨树皮类脂制备的转移因子的病鸡相比，死亡率未见有明显降低。

Claims (1)

1.一种鸡新城疫特异性转移因子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用杨树皮类脂饲喂健康鸡，用量为每只鸡每天0.8～1.0g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫，获取脾脏，其中，进行新城疫灭活疫苗强化免疫的过程如下：

首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗；

2)将强化免疫新城疫的健康鸡脾脏洗净，经破碎、冻融、过滤，获得鸡新城疫特异性转移因子。