一种转移因子的制备方法
(一) 技术领域
本发明涉及医药技术领域,特别涉及一种转移因子的制备方法。
(二) 背景技术
转移因子发现于20世纪40年代,并于20世纪70年代应用于临床,是一种能传递迟发性超敏反应、分子量小于10000的具有生物活性的多肽及核苷酸的混合物,其具有活性不被胰蛋白酶、核糖核酸酶所破坏,耐热、无种属界限的特点。
转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和多核苷酸等。临床可用于辅助治疗某些抗生素难以控制病毒性或霉菌性细胞内感染(如带关疱疹、流行性乙型脑炎、白色念球菌感染、病毒性心肌炎等),对恶性肿瘤可作为辅助治疗剂,对免疫缺陷病,如湿疹、血小板减少、多次感染综合征及慢性皮肤黏膜真菌病等,有一定的疗效。
(三) 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足,提供了一种制备时间短、生产成本低的转移因子的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种转移因子的制备方法,以45日龄以上的健康鸡的新鲜脾脏及淋巴结组织为原料,包括如下步骤:
(1)将原料用冷三蒸水洗净,去除其表面的筋膜、脂肪组织,再用灭菌生理盐水反复冲洗;
(2)将清洗后的原料剪碎,加入2倍体积的冷生理盐水后,采用多频超声正交破壁技术研磨制得匀浆液;
(3)将匀浆液置于-30℃下快速冷冻后,水浴30-37℃中融化,交替冻融6次,每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎;
(4)冻融后的匀浆液加入3倍体积的冷生理盐水,置于低温高速大通量管式连续流离心机中,于4℃下以19000-21000r/min离心30分钟,回收滤液并用0.45μm滤膜加压抽滤;
(5)将抽滤后的滤液采用高通量聚醚砜中空纤维透析器透析,4℃连续循环4次,收集到的滤液经中空纤维超滤膜包加压超滤;
(6)在无菌条件下,将超滤得到的滤液用空间为0.05μm的滤膜抽滤除菌,然后采用纳米膜纯化,最终得到转移因子溶液;
(7)在转移因子溶液中添加绞股蓝提取物、泽兰提取物、三棱提取物、山药提取物和水飞蓟提取物,得到产品。
本发明的更优方案为:
步骤(2)中,研磨过程中,以3000r/min捣碎3次,每次3min,制得匀浆液。
步骤(4)中,冻融后的匀浆液加入0.2%体积的甲醛于37℃下灭活24小时,之后再加入冷生理盐水。
步骤(5)中,高通量聚醚砜中空纤维透析器的孔径为0.22μm,中空纤维超滤膜包的孔径为0.1μm。
步骤(7)中,每100ml转移因子溶液中添加有1-3g绞股蓝提取物、1-5g泽兰提取物、1-5g三棱提取物、1-5g山药提取物和1-3g水飞蓟提取物。
其中,绞股蓝清热,补虚,解毒;泽兰活血化瘀,利水消肿,解毒消痈,有利于改善血液微循环;三棱破血行气,消积止痛,可直接破坏肿瘤细胞,对人肺癌细胞的凋亡有诱导作用;山药补脾,养肺,固肾,益精;水飞蓟清热解毒,保肝,利胆,保脑,抗X射线,可使肝脏病患者自觉症状和某些生化指数如血清胆红素、白朊及球朊系数、凝血酶原、丙氨酸氨基转移酶等迅速改善;上述各提取物的添加有效增强转移因子溶液的功能和应用效果。
步骤(7)中,所述产品用无菌瓶分装后在2-8℃或-20℃下冷藏保存。
本发明简单易行,生产时间短,成本低,采用健康鸡的新鲜脾脏制得的转移因子,能够有效地抑制病毒,保护正常机体细胞免受病毒的感染,从根本上预防病毒病的发生,提供抗病力,增强机体免疫力,具有很好的应用前景。
(四) 具体实施方式
实施例1:转移因子的制备
(1)原材料选材:要求鸡群严格按特别定制的免疫程序免疫、45日龄以上健康畜禽,从源头上确保能生产出高含量、高活性的新一代多肽制剂。(免疫程序要求:1、全部采用进口疫苗;2、必须最少免疫:马立克免1次,新城疫免3次,法氏囊免2次,新流免2次)。
(2)原材料的制备及预处理:取健康鸡的新鲜脾脏及淋巴结组织,用冷三蒸水洗净鸡脾,去其表面的筋膜、脂肪等组织,再用灭菌生理盐水反复冲洗。
(3)组织破碎:采用多频超声波正交破壁技术。
提取收得率高低主要取决于有效成分脱离胞膜、胞浆的吸附,合理有效的细胞膜破碎技术是利用机械物理方法。将洗干净的鸡脾脏剪碎,加入2倍体积的冷生理盐水, 采用国际先进超声技术研磨,以3000r/min捣碎3次,每次3min,制得匀浆液;通过空化效应破壁(与常规破壁法比)时间短(时间缩至原来的3/8)、操作简单、破壁率提高30%以上,核糖提高25.3-54.4%,大分子杂质全部清除。
(4)反复冻融:将匀浆液置于-30℃快速冷冻,水浴30-37℃中融化,交替冻融6次,每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎;
冻融:-30℃、6天实验数据。
数据可得反复冻融6次,有效物质含量最高,活性最高。选冻融6次最佳。
(5)离心提取:采用低温高速大通量管道式离心机离心技术。
冻融后的匀浆液(加入0.2%甲醛37℃进行灭活24小时)加入3倍体积的冷生理盐水,置于低温高速大通量管式连续流离心机于4℃以19000-21000r/min离心30分钟,取滤液;与常规台式离心机相比,时间短、操作简单、效率高、效果好、成本低。
离心:低温高速大通量连续流管式离心。
开始用杯式离心机,滤液回收率低,残渣无法回收,环境处理费用高。后改用低温连续流离心机离心,滤液回收率提高12%,残渣利用率98%(给饲料公司作为蛋白原料使用),无需环境处理,降低成本,节约资源,增加产量。
(6)抽滤:将离心回收滤液置于布氏漏斗,用0.45μm滤膜加压抽滤。
(7)透析:采用德国萨克森公司最新透析技术.
采用高通量聚醚砜中空纤维膜透析器(孔径0.22μm)透析(治疗尿毒症等血液透析所用),清除率185-192ml/min。4℃连续循环4次,时间缩短,有效物质含量由60mg/ml增加至102.6mg/ml,提高了58%,成本低(一般采用透析袋一次性在冰箱透析,时间长、成本高、含量低)。
透析:德国进口透析器连续循环4次,时间缩短,有效物质含量高。
(8)超滤浓缩:将上述滤液用进口中空纤维超滤膜包(孔径0.1μm)加压超滤,弃液可反复回流利用,通过更换不同孔径的膜包得到不同浓度的滤液;超滤技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂,尤其是超滤技术的实验条件温和,与蒸发、冷冻干燥相比没有相的变化,而且不引起温度、pH的变化,因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。在生物制剂的制备技术中,超滤主要用于生物分子的脱盐、脱水和浓缩等。从而达到高产能、高质量、高浓缩的转移因子。活力测定玫瑰花结率由12.4%,增至21.2%,提高了71%,大大高于质量标准中活力不得低于10%的规定。
(9)除菌:在无菌条件下将超滤得到的滤液用孔径为0.05μm的滤膜抽滤除菌;
(10)净化:在保证产品高生物活性的前提下,率先采用纳米膜纯化。将高活性转移因子包藏于低聚壳聚糖的空穴结构内,形成微囊化包合物,有效保护产品生物活性,提高药物稳定性,确保良好口服效果。工艺收率由3.846mg/ml 增至6.472mg/ml,提高了68%。
每100ml转移因子溶液中添加有1-3g绞股蓝提取物、1-5g泽兰提取物、1-5g三棱提取物、1-5g山药提取物和1-3g水飞蓟提取物,得到最终产品。
(11)分装:用无菌瓶分装后在2-8度或-20度冷藏保存。
(12)全程经过11道工序全部万级无菌处理.生产工艺改进以后,不仅提高了转移因子的收率、含量及活性,而且为利用超滤技术制备高含量制剂提供了基础,降低了生产成本,提高了经济效益。
实施例2:产品临床试验证明
聊城兽医站在肉食鸡、蛋鸡通过对照组、试验组做对比试验,结果显著。
聊城张某处选择3棚1日龄AA雏鸡,分别编号1号棚、2号棚、3号棚,其中1、2号棚为实验组,3号棚为对照组。2号棚又分为a组和b组,其中a组为实验组,b组为对照组。
1号棚在1、2、3日龄全群使用蓝盾,1000羽/瓶。2号棚a组鸡群使用蓝盾,b组鸡群作为相同饲养环境下的对照组。3号棚使用安慰剂作为对照组。
在第7日龄,首免新城疫时,蓝盾配合疫苗使用,1000羽/瓶蓝盾。
在第10和20日龄,分别于1号和3号取5只鸡,取其法氏囊、胸腺和脾脏,分别称重,并记录。在2号棚分别于实验组和对照组取5只鸡,取其法氏囊、胸腺和脾脏,分别称重并记录30日龄肉鸡免疫器官质量结果。
1号棚在1、2、3日龄全群使用转移因子溶液,1000羽/瓶。2号棚a组鸡群使用转移因子溶液,b组鸡群作为相同饲养环境下的对照组。3号棚使用安慰剂作为对照组。
60日龄蛋鸡抗体水平检测结果(同时检测1号、2号和3号)
自30日龄后记录各组临床数据。
采食量,伤亡率,呼吸道症状,消化道症状,出栏率,平均体重及料肉比等等。
实施例3:脾源转移因子溶液的临床试验数据:
选1日龄雏鸡200羽,饲养至6日龄时选优150羽随机分为5组,每组30羽。
各组7日龄首免新城疫Lasota株;10日龄剖检部分鸡,测其胸腺、脾脏、法氏囊重量;10日龄测白细胞介素Ⅱ水平;
对脾脏重量的影响:10日龄
对法氏囊重量的影响:10日龄
对胸腺重量的影响:10日龄
对新城疫抗体水平的影响:14日龄抗体抑制价Log2
实施例3:使用实例
(1)临沂蒙阴某养殖场饲养白羽肉鸡1.8万羽,共两个鸡舍,每栋9000羽。据场主回忆,当时由于鸡苗在运输过程中保温措施没做好,同时鸡苗的整体状况也较差,到场接苗时已经有些死苗,鸡群扎堆严重。用脾源转移因子溶液,从一日龄开始,1000羽/瓶,连用了三天之后,两个棚的鸡群整体状况很好,采食增料都非常好。在7日龄、14日龄、21日龄防疫时把转移因子溶液配合着疫苗使用,。最后40天鸡群出栏时,平均体重达到了2.6公斤,料肉比1.66,场主非常认可,准备重新考虑养殖用药程序,把转移因子加到程序中去。
(2)潍坊寿光某养殖户,养殖肉鸭15000羽,每批用转移因子溶液两次,分别在10日龄和30日龄,500羽/瓶,连用2天。直至出栏未有病毒病发生。在36日龄剖检验证,脾脏发育较大、鲜亮、无坏死斑驳;胸腺和法氏囊发育较大,成粉红色。
(3)威海蓬莱某养殖场张老板,有多年的肉鸡饲养管理经验,据他反应,21日龄是整个养殖过程中的关键时期,疫苗免疫成功,皆大欢喜;如果免疫失败,鸡群出现呼吸道副反应,导致抵抗力下降,再继发其他细菌感染,30日龄后的免疫空白期感染其他病毒病,损失不可估量。所以,每次养鸡到21天时,张老板都是心惊胆战,纠结于是否要进行二次免疫新城疫。
今年9月份,张老板再次补栏时,用了脾源转移因子蓝盾,二免新城疫时配合疫苗和替代疫苗使用:配合疫苗使用,可以减少由于应激引起的的呼吸道副反应;替代疫苗使用,免疫前若鸡群出现轻微呼吸道症状时,用转移因子替代疫苗。
在场里随机选出两个棚做对比试验。一个棚在1、2、3日龄育雏壮苗,21日龄配合疫苗,30日龄预防病毒病三个阶段分别使用蓝盾;一个棚按原有正常的程序饲养。结果42日龄回访时,用转移因子的一棚已经成功提前两天出栏,没有用转移因子的一棚由于21日龄免疫后出现了呼吸道副反应,导致后期感染H9、大肠杆菌,伤亡将近10%,损失不可估量。