CN102151295B - 一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及产品的应用 - Google Patents

Abstract

一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及其产品的应用，涉及医药领域，更具体地说，特别是涉及一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及产品的应用。本发明的制备方法包括以下步骤：用75％酒精浸泡红肾豆，加入含β-巯基乙醇的生理盐水提取，研碎红肾豆；加生理盐水浸泡过夜，离心后向上清液中加入固体硫酸铵进行沉淀；在沉淀物中加入蒸馏水溶解，脱色、过滤除菌、干燥即得。本发明的红肾豆提取物应用于防治禽病毒性疾病，不但具有抗病毒作用，而且起到免疫调节作用，疗效确切，无毒副作用。本发明特别用于治疗鸡马立克病毒病、非典型新城疫病、传染性支气管炎病等效果显著。

Description

一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及产品的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地说，特别是涉及一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及产品的应用。

背景技术

随着社会的发展和经济的繁荣以及人类健康观念的改变，回归自然、天人合一的观念越来越受到推崇，“餐桌安全”受到了极大的关注，人们对饮食安全的要求也愈来愈高。在禽疾病中，病毒感染对禽养殖业造成的损失是具大的。鸡传染性法氏囊病、鸡新城疫病、鸡传染性支气管炎是危害养禽业的三大主要疫病，在一些养鸡比较密集地区，已取代非典型性鸡新城疫而居传染病发病率的首位，不分品种，蛋鸡、肉鸡、肉杂鸡；不管免疫与否，均有可能发病，这些病引起雏鸡的免疫抑制，使病鸡对大肠杆菌、腺病毒、沙门氏菌、鸡球虫等病原体更易感，对马立克疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗等接种的反应能力下降，因此该病对养鸡业造成了巨大的危害。在预防禽感染性疾病时，多采用抗生素，但抗生素的滥用给禽产品的食用带来了极大的饮食隐患，药物残留已经成为影响禽产品安全的主要因素之一。

如何找到一种对病毒病原体有直接杀灭或抑制作用，同时通过调节禽的机体内在的抗病原体机制(如免疫系统、补体系统等)来达到抑杀病毒的作用是亟待解决的一个问题。

植物血球凝集素(PHA)是一种有效分裂原，主要用于激活淋巴细胞，是一种天然的干扰诱导剂。本品能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖、释放淋巴因子、并能提高巨噬细胞的吞噬功能，促进骨髓造血和促使白细胞数量上升，对受病毒侵袭的细胞有杀伤作用，并具有诱生干扰素、白细胞介素的作用。PHA能提高动物免疫器官重量并有对抗环磷酰胺对免疫抑制剂的作用。总之PHA是自然界中天然免疫增强剂，PHA的每一种功能都与强化机体免疫力有关。

某些植物的种子含有天然植物凝集素，如豆类、蓖麻子、槲寄生与欧商陆等等，均为大分子蛋白质类物质。一些豆类的提取物如美洲菜豆提取物、芸豆提取物和鹰嘴豆提取物等含有丰富的植物凝集素，可以作为提高人类免疫力和预防感冒的保健产品。

红肾豆又叫大红公鸡豆、鸡子豆、红芸豆、红扁豆等，是PHA含量最高的农作物，生的红肾豆含含量高达20000？0000凝集素单位，煮熟后仍有200？00单位。白肾豆中PHA含量相对较低。红肾豆在中国各地均有栽培，主产区为云南、贵州、陕西、河北、黑龙江、山西、吉林及台湾等省，每公顷产量为1100-1500kg。菜豆宜种植于有机质丰富、土层深厚、排水良好的壤土。pH值以6.0-7.0为佳。籽粒含蛋白质17-23％，脂肪1.3-2.6％，碳水化合物56-61％，还含有钙、磷、铁及各种维生素。籽粒用作主食，干籽粒含有PHA具有医用价值。

常规制备PHA的工艺是：1.提取：取青豌豆、芸豆等100克，用0.15M氯化钠浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液；2.蛋白质沉淀：边搅边向水提液中加入固体硫酸铵达80％饱和过夜。弃上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。3.亲和层析分离：称硫酸铵糊0.3克溶于3ml IM氯化钠中，离心3000rPm10分钟，取上层悬液上Sephadex G25层析柱，用1M NaCl洗脱收集每管3.5ml，在280nm紫外光上比色检测，直至吸光值下降到接近零为止。此洗脱峰为植物血凝素峰。4.透析除盐后干燥。目前市场上使用的PHA都是精制纯化的，成本较高，不适合在养殖业中推广使用。

因此，提供一种成本较低、效果好的红肾豆提取物的制备方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法及其产品的应用，克服现有技术中的不足，。

为实现上述目的本发明所述制备方法采用的技术方案如下：

(1)选红肾豆10g，用蒸馏水冲洗后用浓度为75％的酒精浸泡5-20分钟，倒掉酒精，放置37℃恒温箱内12-48小时；

(2)在无菌条件下用无菌生理盐水或蒸馏水漂洗二次，加入含0.01-0.2％的β-巯基乙醇的生理盐水10ml，研碎红肾豆；

(3)加生理盐水30-100ml浸泡过夜，无菌条件下移入离心管内，3000-4000rpm离心30分钟；

(4)弃沉淀，取上清液。向上清液中加入固体硫酸铵达50-80％，放置过夜；

(5)3000-4000rpm离心30分钟，弃上清液，在沉淀物中加入蒸馏水50ml后，用活性炭进行脱色；

(6)经过滤除菌，分装后置冰箱中保存；

(7)干燥：将红肾豆提取物真空干燥或冷冻干燥；

(8)所述步骤(3)中生理盐水中β-巯基乙醇含量为0.05％；

(9)所述步骤(4)中向上清液中加入固体硫酸铵达90％饱和度；

(10)所述步骤(5)中脱色工艺条件为活性炭用量1.5％，脱色温度40℃，pH值4.5，脱色时间60min。

所述的红肾豆提取物应用于制备防治禽病毒性疾病的药物中，使用剂量为0.5～5mg/Kg体重，每日1-2次，应用方法是注射或口服。

本发明涉及的各项成分均为市售品，其规格是食品级。

红肾豆提取物主要对治疗禽病毒性疾病的预防和治疗具有显著的优势。研究证实：红肾豆提取物对人工感染鸡马立克病毒的鸡模型和鸡传染性支气管炎发病鸡亦有显著治疗作用。可见，红肾豆提取物是治疗禽病毒性疾病的天然药物。

红肾豆提取物是一种绿色天然、无残留危害，符合绿色健康的理念的天然药物。它既对病原体有直接杀灭或抑制作用，同时通过调节动物机体内在的抗病原体机制(如免疫系统、补体系统等)来达到抑杀病毒作用。

红肾豆提取物含有大量的PHA，PHA对受病毒侵袭的细胞有杀伤作用，并具有诱生干扰素、白细胞介素的作用，提高动物免疫力，预防动物病毒病发生和传播。红肾豆提取物能提高免疫细胞的活性，促进干扰素的合成，诱导细胞内产生抗病毒蛋白，达到杀伤动物病毒的作用。临床研究证实红肾豆提取物对禽病毒性疾病有良好的治疗效果，尤其能解除病毒感染引起的临床症状、降低病禽的死亡率，促进病禽恢复采食，一般5～7天痊愈，疗效显著。本发明的制备工艺简单、提取率高、成本低。

本发明有益效果是：(1)为临床开发出一种防治禽类病毒性疾病的新药物。(2)工艺简单、成本低。(3)制剂稳定，贮存期长。(4)药物来源广泛，天然绿色环保，无毒副作用。特别用于治疗禽类鸡马立克病毒病、非典型新城疫病、传染性支气管炎病等效果显著。

具体实施方式

以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

一种红肾豆提取物的制备方法，具体实施步骤如下：

(1)选红肾豆100g，用蒸馏水冲洗后用75％酒精浸泡10分钟，倒掉酒精，放置37℃恒温箱内24小时；

(2)在无菌条件下用无菌生理盐水漂洗二次，加入含0.1％的β-巯基乙醇的生理盐水100ml，研碎红肾豆；

(3)加生理盐水400ml浸泡过夜，3000-4000rpm离心30分钟；

(4)向上清液中加入固体硫酸铵达80％饱和度，放置过夜；

(5)3000-4000rpm离心30分钟，弃上清液，在沉淀物中加入蒸馏水100ml后，用活性炭进行脱色；

(6)经过滤除菌，真空干燥。

实施例2

一种红肾豆提取物的制备方法，具体实施步骤如下：

(1)选红肾豆50g，用75％酒精浸泡15分钟，倒掉酒精，室温放置16小时；

(2)用无菌生理盐水漂洗二次，加入含0.05％的β-巯基乙醇的生理盐水100ml，组织捣碎机研碎红肾豆；

(3)加生理盐水250ml浸泡过夜，3000-4000rpm离心30分钟；

(4)向上清液中加入固体硫酸铵达60％饱和度，放置24小时；

(5)3000-4000rpm离心30分钟，在沉淀物中加入PBS 80ml后，用活性炭进行脱色；

(6)经过滤除菌，分装后置冰箱中保存。

(7)干燥：将红肾豆提取物冷冻干燥。

实用例1

红肾豆提取物对鸡马立克病的治疗作用

在人工致病病毒模型中治疗试验  将54只SPF鸡用人工感染鸡马立克病毒的方法使雏鸡发生鸡马立克，同时随机分成为3组，每组18只。A组为“红肾豆提取物”治疗组，红肾豆提取物的质量百分含量为30％；B组为黄芪多糖治疗组，黄芪多糖的质量百分含量为30％；C组为对照组，用生理盐水治疗，对3组鸡同时用鸡马立克病毒染毒，每只鸡用鸡马立克病毒强毒滴鼻0.2ml，待出现临床症状后，给A组鸡注射“红肾豆提取物”(使用剂量为0.5/Kg体重)，每天一次，B组鸡注射芪多糖(使用剂量为0.5/Kg体重)，每天一次，C组鸡注射生理盐水0.3ml/只，每天一次，连用2-3天，然后观察鸡的发病死亡及病理变化，并详细记录。

人工致病治疗效果

染毒24h后，试验鸡开始出现临床症状：精神不振，呆立不动，羽毛蓬乱，饮食减少或废绝。用药后，A组和B组鸡从第2d病情开始好转，第3d、4d有死亡鸡只出现，5d后存活的鸡只基本康复，C组在出现症状第2天后病情恶化，开始出现死亡，第3-5d达到死亡高峰，未死亡鸡第6d后自愈。红肾豆提取物治疗组与对照组差异极显著(P＜0.01)，说明“红肾豆提取物”对鸡马立克有一定的治疗作用。

表1  三组治疗结果比较(例，％)

组别

例数

治愈

好转

有效

死亡

A组	18	12(67％)	5(28％)	15(83％)	2(11％)
						B组	18	9(50％)	7(39％)	13(72％)	3(17％)
C组	18	0	2(11％)	4(22％)	13(72％)

实用例2

临床治疗试验  选典型鸡传染性支气管炎发病鸡，将30只鸡随机分成3组，A组口服红肾豆提取物8.0mg/只；B组口服黄芪多糖8.0mg/只。C组口服生理盐水。

实验结果

表2“红肾豆提取物”治疗鸡传染性支气管病试验结果

组别	数量	发病数	死亡数	死亡率％	有效数	有效率％
							A组	10	10	2	20	8	80
B组	10	10	3	30	7	70
							C组	10	10	8	80	2	20

由表2可见，“红肾豆提取物”试验组有效率为80％，口服生理盐水组的有效率为20％。可见，红肾豆提取物对鸡传染性支气管病有很好的治疗效果。

实用例3

“红肾豆提取物”治疗鸡新城疫病的实例

2007年10月10日某养殖场的蛋鸡，陆续出现相同症状：肿眼眶、咳嗽、呼噜、采食降低，产蛋率下降，10月13日以后发现鸡死亡率上升，死亡快，采食量下降快，每1000只鸡每天死亡20-30只，最严重死亡约50只/天。

针对上述现象，建议使用红肾豆提取物饮水口服，按2.0mg/只鸡使用，连用3-5天，另外配合多维电解质等可迅速控制死亡，鸡群恢复精神状态。

分析：经剖检诊断：鸡新城疫病。

总结：类似症状，早发现早治疗，按红肾豆提取物2.0mg/只鸡进行饮水口服，每日一次，连用3-5天。实践证明，红肾豆提取物可控制病情，降低死亡率。

Claims (3)

1.一种防治禽病毒性疾病药物的制备方法，其特征在于实施步骤如下： 

（1）选红肾豆10g，用蒸馏水冲洗后用浓度为75%的酒精浸泡5-20分钟，倒掉酒精，放置37℃恒温箱内12-48小时；

（2）用无菌生理盐水或蒸馏水漂洗二次，加入含0.01-0.2%的β-巯基乙醇的生理盐水10ml，研碎红肾豆；

（3）加生理盐水30-100 ml 浸泡过夜，移入离心管内，3000-4000rpm离心30分钟； 

（4）弃沉淀，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵达50-80%饱和度，放置过夜；

（5）3000-4000rpm 离心30分钟，弃上清液，在沉淀物中加入蒸馏水50 ml后，用活性炭进行脱色；

（6）经过滤除菌，分装后置冰箱中保存；

 （7）干燥：将红肾豆提取物真空干燥或冷冻干燥；

  （8）所述步骤（5）中脱色工艺条件为活性炭用量1.5%、脱色温度40℃、 PH值4.5、脱色时间60min 。

2.根据权利要求1所述的防治禽病毒性疾病药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中生理盐水中β-巯基乙醇含量为0.05% 。

3.根据权利要求1所述的防治禽病毒性疾病药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中向上清液中加入固体硫酸铵饱和度为80% 。