CN101816367B - 一种乌鱼活性肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种乌鱼活性肽的制备方法，它是以乌鱼为原料，通过先进的酶解和膜分离技术，制得肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人体吸收的活性肽，它具有促进伤口愈合、抗疲劳、提高免疫等生物活性，特别适合于手术后病人的营养补充和促进伤口愈合，以及各类人群的滋补和治疗，同时制备工艺科学合理，环保无污染，分离过程为常温操作，节省能源，操作简便易行，效率高，适合于工业化生产。

Description

一种乌鱼活性肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种乌鱼活性肽的制备方法。

背景技术

乌鱼，又名鳢鱼(Ophiolephalus argus Cantor)是一种广泛分布于我国各地的江河、湖泊、沟塘、池沼中的肉食性淡水鱼类。其含肉率高，蛋白质含量高，骨刺少，味道鲜美，素有“鱼中珍品”之称，一向被视为病后康复和老幼体虚者的滋补珍品。尤其是我国民间有食用乌鱼汤促进各种伤口愈合的应用传统，也有乌鳢和月鳢汤能促进小鼠伤口愈合和抗疲劳的作用的文献报道(2005，右江医学)。

乌鱼汤的主要营养和功效成分为蛋白质，乌鱼蛋白质在被人体摄入后，经体内各种蛋白酶水解成游离氨基酸和小分子肽后被人体吸收，发挥各种营养和活性作用，由于人的个体差异，乌鱼的蛋白质的消化率和吸收利用率各不相同，且乌鱼汤中的蛋白质仅占乌鱼总蛋白的35％左右，煮汤后的乌鱼肉多不为人喜食，以致乌鱼蛋白质的利用率低。现代科学研究证实：小分子的肽比氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，且小分子肽可以通过肠道全部吸收和利用，直接经血液循环转运至全身各器官和组织而发挥生物活性功能。以乌鱼为原料制备得到的乌鱼活性肽不仅具有上述优点，还可能将乌鱼蛋白质充分利用并转化为活性肽，同时产物还具有良好的酸、热稳定性、溶解性和低黏度性等，不但可以作为食品原料或辅料应用于婴幼儿营养配方食品、方便食品、速溶饮品和调味品等，还可用于营养食品、功能食品和运动食品等领域。

目前尚未见到利用蛋白酶酶解制备乌鱼活性肽的文献和公开专利技术，现有的公开专利技术也未涉及采用膜分离技术专门制备小分子乌鱼活性肽的方法。现有的公开专利技术虽有关于蛋白酶酶解制备带鱼多肽、鲍鱼多肽、鱼肽营养液的方法，如：申请号为200710164544.1的《带鱼多肽的制备方法》，申请号为200510068010.X的《鲍鱼多肽的制备方法和用途》，申请号为200810160160.7的《一种鲍鱼活性肽的制备方法》，申请号为03132519.X的《鱼肽营养液及由淡水鱼副产物生产鱼肽营养液的方法》，但上述方法获得的产物存有大量游离氨基酸和分子量范围不明的蛋白质和肽。而本发明则是一种以乌鱼为底物，采用蛋白酶酶解和膜分离技术专门制备乌鱼活性肽的方法。本发明涉及的蛋白酶酶解是一些经优化的酶解方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乌鱼活性肽的制备方法，制备的乌鱼活性肽肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人体吸收。

本发明的技术方案为：以乌鱼原料经蛋白酶解、膜分离技术制备一种乌鱼活性肽，主要成分为肽，含量在60％以上，平均分子量小于10000Da。其特征在于工艺步骤为：(A)乌鱼经剖杀、去内脏后剁碎、打浆成肉糜。(B)将上述肉糜，加入质量比为肉糜1.5至10倍的水搅拌均匀后，调pH至6-9，升温至75-95℃保温20-30分钟，再调整温度至45℃-70℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶用量为肉糜湿重的0.25‰-8‰，酶解时间为2-12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃-50℃，除去上层脂肪，取酶解液经初滤或精滤或超滤或纳滤后，再浓缩、干燥即得。

作为一种优选方案，步骤B中蛋白酶为：木瓜蛋白酶，或风味蛋白酶，或复合蛋白酶，或中性蛋白酶，或按质量份数比为10％-90％的风味蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量份数比为10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量份数比为10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的风味蛋白酶复配而成的酶，或按质量份数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量份数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的木瓜蛋白酶复配而成的酶，或按质量份数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的风味蛋白酶复配而成的酶；

作为一种优选方案，步骤B中酶解液初滤为过滤或板框压滤机过滤，滤材为纯绵帆布或尼龙滤布。

作为一种优选方案，步骤B中酶解液精滤为：过滤或板框压滤机初滤后的滤液，用无机陶瓷膜或有机膜微滤除去杂蛋白、筋膜碎片，其特征在于无机陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑，截留粒子范围为0.05-1μm。有机膜材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类等有机高分子材料，截留粒子范围为0.05-1μm。

作为一种优选方案，步骤B中酶解液超滤为：酶解液精滤后的滤液用有机复合膜超滤截留收获分子量小于10000Da的肽。其特征在于有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于10000Da。

作为一种优选方案，步骤B中酶解液纳滤为：酶解液用有机复合膜超滤截留收获分子量小于10000Da的肽后，再经纳滤除去大部分水分、游离氨基酸，其特征在于纳滤的有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为150-1000Da。

作为一种优选方案，步骤B中的干燥为真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥；喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃-130℃。

本发明的优点是：乌鱼活性肽的肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人体吸收，并具有抗疲劳、促进伤口愈合、提高免疫力等生物活性，制备工艺科学合理，环保无污染，分离过程为常温操作，节省能源，操作简便易行，效率高，适合于工业化生产。

具体实施方式

实施例1

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温95℃保温20分钟，再调整并维持温度至69±1℃，调pH至9，加入木瓜蛋白酶16g进行酶解；酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间10分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心和板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，然后浓缩、真空干燥即得。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.311公斤，分子量小于10000Da的肽含量为69％。

实施例2

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入1.5倍量的水搅拌均匀后，升温75℃保温30分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至9，加入诺维信产复合蛋白酶0.5g进行酶解；酶解时间为2小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心和板框压滤机初滤，再经截留粒径1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，然后浓缩、真空干燥即得。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.115公斤，分子量小于10000Da的肽含量为64％。

实施例3

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入3倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温20分钟，再调整并维持温度至45±1℃，调pH至6，加入诺维信产风味蛋白酶6g进行酶解；酶解时间为8小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心和板框压滤机初滤，再经截留粒径0.05μm的氧化锑陶瓷膜精滤，滤过压0.25Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.2Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，然后浓缩、真空干燥即得。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.145公斤，肽含量为89％，分子量小于10000Da。

实施例4

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温28分钟，再调整并维持温度至50±1℃，调pH至7.0，加入中性蛋白酶8g进行酶解，酶解时间为6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为100℃，灭酶时间10分钟；灭酶后酶解液冷却降温至80℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心过滤，再经截留粒径0.1μm的氧化铝陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚哌嗪酰胺类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥喷雾干燥时，设备进口热风温度为130℃，即得。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.131公斤，肽含量为91.5％，分子量小于1000Da。

实施例5

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温20分钟，再调整并维持温度至50±1℃，调pH至7.5，加入诺维信风味蛋白酶与复合蛋白酶(质量份数比为诺维信风味蛋白酶10％，复合蛋白酶90％)共8g进行酶解，酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为尼龙滤布，再经截留粒径0.1μm的聚砜有机膜精滤，滤过压0.18Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的芳香聚酰胺类有机复合膜超滤，滤过压0.2Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为100℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.167公斤，肽含量为88.4％，分子量小于6000Da。

实施例6

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入5倍量的水搅拌均匀后，调pH至7.5，升温90℃保温20分钟，再调整并维持温度至50±1℃，加入诺维信风味蛋白酶与复合蛋白酶(质量份数比为诺维信风味蛋白酶90％，复合蛋白酶10％)共6g进行酶解，酶解时间为6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯棉帆布，再经截留粒径0.1μm的聚四氟乙烯有机膜精滤，滤过压0.1Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.2Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的芳香聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.128公斤，肽含量为92.4％，蛋白质分子量小于1000Da。

实施例7

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温75℃保温30分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至7，加入诺维信中性蛋白酶与诺维信复合蛋白酶共8g(质量份数比为诺维信风味蛋白酶90％，复合蛋白酶10％)，酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为尼龙滤布，再经截留粒径0.1μm的醋酸纤维有机膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的芳香聚酰胺类有机复合膜超滤，滤过压0.2Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为100℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.218公斤，肽含量为70.8％，分子量小于10000Da。

实施例8

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入5倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温25分钟，再调整并维持温度至45±1℃，调pH至9，加入诺维信产中性蛋白酶与诺维信复合蛋白酶(质量份数比为诺维信风味蛋白酶10％，复合蛋白酶90％)共5g，进行酶解，酶解时间为5小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，分离除去上层脂肪，取酶解液经离心和过滤，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.15Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为90℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.208公斤，肽含量为77.8％，分子量小于10000Da。

实施例9

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼肉2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温80℃保温25分钟，再调整并维持温度至50±1℃，调pH至8，加入诺维信木瓜蛋白酶与诺维信复合蛋白酶(质量份数比为诺维信木瓜蛋白酶90％，诺维信复合蛋白酶10％)共8g，进行酶解，酶解6小时后再调整并维持温度至60±1℃，继续酶解6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为88℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为130℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.259公斤，肽含量为75.9％，蛋白质分子量小于10000Da。

实施例10

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入5倍量的水搅拌均匀后，升温80℃保温25分钟，再调整并维持温度至60±1℃，调pH至8，加入诺维信木瓜蛋白酶与诺维信复合蛋白酶(质量份数比为诺维信木瓜蛋白酶10％，诺维信复合蛋白酶90％)共8g，进行酶解，酶解6小时后再调整并维持温度至60±1℃，继续酶解6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为100℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的芳香聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为120℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.184公斤，肽含量为93.1％，蛋白质分子量小于1000Da。

实施例11

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入8倍量的水搅拌均匀后，调pH值至9，升温80℃保温30分钟，再调整并维持温度至48±1℃，加入诺维信中性蛋白酶与诺维信木瓜蛋白酶(质量份数比为诺维信中性蛋白酶90％，诺维信木瓜蛋白酶10％)共8g，进行酶解，酶解4小时后再调整并维持温度至70±1℃，继续酶解8小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心和过滤，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量小于10000Da的肽液，然后浓缩、冷冻干燥，即得。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.226公斤，肽含量为88.8％，分子量小于10000Da。

实施例12

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温75℃保温30分钟，再调整并维持温度至48±1℃，调pH至8，加入诺维信中性蛋白酶与诺维信木瓜蛋白酶(质量份数比为诺维信中性蛋白酶10％，诺维信木瓜蛋白酶90％)共8g，进行酶解，酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为88℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心和过滤，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.181公斤，肽含量为86.1％，蛋白质分子量小于1000Da。

实施例13

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温95℃保温20分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至7，加入诺维信中性蛋白酶与诺维信风味蛋白酶(质量份数比为诺维信中性蛋白酶90％，诺维信风味蛋白酶10％)共0.6g进行酶解，酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间25分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.221公斤，分子量小于10000Da的肽含量为73.5％。

实施例14

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入5倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温20分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至8，加入诺维信中性蛋白酶与诺维信风味蛋白酶(质量份数比为诺维信中性蛋白酶10％，诺维信风味蛋白酶90％)共8g，进行酶解，酶解时间为6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间25分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为90℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.139公斤，肽含量为89.7％，分子量小于1000Da。

实施例15

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入10倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温28分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至8，加入诺维信木瓜蛋白酶与诺维信风味蛋白酶(质量份数比为诺维信木瓜蛋白酶90％，诺维信复合蛋白酶10％)共8g，进行酶解，酶解时间为12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为88℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽成品0.278公斤，分子量小于10000Da肽含量为64.8％。

实施例16

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入5倍量的水搅拌均匀后，升温90℃保温28分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调pH至8，加入诺维信木瓜蛋白酶与诺维信风味蛋白酶(质量份数比为诺维信木瓜蛋白酶90％，诺维信复合蛋白酶10％)共8g，进行酶解，酶解时间为6小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为88℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于10000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于10000Da的肽液，超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15-0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽成品0.194公斤，肽含量为85.3％，蛋白质分子量小于1000Da。

实施例17

取经剖杀，去内脏后剁碎、打浆成肉糜的乌鱼2公斤。

将上述肉糜，加入1.5倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温22分钟，再调整并维持温度至50±1℃，调pH至7，加入诺维信风味蛋白酶和诺维信复合蛋白酶(质量份数比为诺维信风味蛋白酶30％，诺维信复合蛋白酶70％)共6g，进行酶解，酶解时间为3小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为100℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为尼龙滤布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为120℃。

上述干燥步骤完成后制得乌鱼活性肽0.187公斤，肽含量为84.5％，分子量小于6000Da。

采用本发明实施例17方法制备所得乌鱼活性肽和乌鱼汤进行活性实验对比，活性对比实验如下：

1.乌鱼活性肽促进伤口愈合功能实验

取小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半，均分为4组，分别为空白对照组、阳性药物组、乌鱼活性肽给药组、乌鱼汤给药组。分别在小鼠颈背部作1.5×1.5cm大创面为模型，建立模型后，用生理盐水冲洗伤口，碘酒、酒精消毒，均用凡士林油纱敷盖，再用无菌干纱布包扎。阳性药物组给予云南白药胶囊，剂量为60mg/kg体重，乌鱼活性肽给药组给予乌鱼活性肽，剂量为1.5g/kg体重，乌鱼汤给药组为剂量相同的乌鱼汤，正常对照组小鼠给予同等容量生理盐水，每天灌胃一次，连续9天，每只小鼠每天用生理盐水冲洗伤口后各用原法处理。第3、6、9天观察、测量伤口面积，计算伤口愈合率。伤口愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。结果见表1。结果表明与乌鱼汤给药组相比，本发明方法制备的乌鱼活性肽给药组能更好的起到促进伤口愈合的作用。

表1 各处理组伤口模型小鼠第3、6、9天伤口愈合率

与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

2.乌鱼活性肽增强免疫功能实验

取昆明种小鼠30只，体重14-18g，雌雄各半，随机分为3组，分别为生理盐水组，乌鱼活性肽给药组、乌鱼汤给药组，灌胃给药7天，剂量为1.5g/kg体重，乌鱼活性肽给药组给予乌鱼活性肽(经实施例17制得)，乌鱼汤给药组给予剂量相同的乌鱼汤，生理盐水对照组灌胃以给药组同等体积的生理盐水，每天一次，于末次给药后24小时，颈椎脱位处死，称体重，摘出胸腺及脾脏称重，以胸腺或脾脏重量与体重之比作胸腺或脾指数。结果见表2。结果表明乌鱼活性肽能显著增加小鼠胸腺指数和脾指数，有增强小鼠免疫功能作用。同时也可以看出比较之下本发明方法制备的乌鱼活性肽具有更好的增强小鼠免疫功能的作用。

表2 乌鱼活性肽对小鼠免疫器官重量的影响

与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

3.乌鱼活性肽抗疲劳功能实验

取昆明种小鼠30只，体重18-22g，雌雄各半，随机分为3组，给药组给予乌鱼活性肽(经实施例17制得)，剂量为1.5g/kg体重，乌鱼汤给药组给予剂量相同的乌鱼汤，生理盐水对照组灌胃以给药组同等体积的生理盐水，连续灌胃给药7天，每天一次，于末次给药30min后将小鼠尾根部负荷7％体重的铅丝，放入水温20±0.5℃、水深20cm的玻璃缸内游泳，并开始计时。当小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面者即为体力耗竭，计为小鼠游泳时间。结果见表3。结果表明本发明所制备的乌鱼活性肽能更显著地延长小鼠游泳时间，说明本发明所制备的乌鱼活性肽有更为显著的抗疲劳作用。

表3 乌鱼活性肽对小鼠游泳时间的影响

与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

Claims (6)

1.一种乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于工艺步骤为：

(A)乌鱼经剖杀、去内脏后剁碎、打浆成肉糜；

(B)将上述肉糜，加入质量比为肉糜1.5至10倍的水搅拌均匀后，调pH至6-9，升温至75-95℃保温20-30分钟，再调整温度至45℃-70℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶用量为肉糜湿重的0.25‰-8‰，酶解时间为2-12小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃-50℃，除去上层脂肪，取酶解液经初滤，或初滤和精滤，或初滤和精滤和超滤，或初滤和精滤和超滤和纳滤后，再浓缩、干燥即得；酶解所用蛋白酶为：木瓜蛋白酶，或风味蛋白酶，或复合蛋白酶，或中性蛋白酶，或按质量分数比为10％-90％的风味蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量分数比为10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量分数比为10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的风味蛋白酶复配而成的酶，或按质量分数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的复合蛋白酶复配而成的酶，或按质量分数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的木瓜蛋白酶复配而成的酶，或按质量分数比为10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的风味蛋白酶复配而成的酶；所获得的产物主要成分为肽，肽含量在60％以上，平均分子量小于10000Da。

2.如权利要求1所述的乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于步骤B中酶解液初滤为：灭酶除脂后的酶解液经过离心过滤或板框压滤机过滤，滤材为纯绵帆布或尼龙滤布。

3.如权利要求1所述的乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于步骤B中酶解液精滤为：经过离心过滤或板框压滤机过滤后的初滤滤液，用无机陶瓷膜或有机微滤膜进行精滤，无机陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑，截留粒子范围为0.05-1μm；有机微滤膜材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类有机高分子材料，截留粒子范围为0.05-1μm。

4.如权利要求1所述的乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于步骤B中酶解液超滤为：精滤后的酶解液采用有机超滤膜进行超滤，超滤所用的有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于10000Da，超滤后收获分子量小于10000Da的乌鱼活性肽。

5.如权利要求1所述的乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于步骤B中酶解液纳滤为：超滤后的酶解液采用有机纳滤膜进行纳滤，纳滤所用有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为150-1000Da，纳滤后收获分子量小于1000Da的乌鱼活性肽。

6.如权利要求1所述的乌鱼活性肽的制备方法，其特征在于干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥；在喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃-130℃。