CN103882085B - 一种复合多肽的联合提取制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复合多肽的联合提取制备方法。本发明采用温和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然后再将温和弱酸法提取多肽过程中所残留和废弃的沉淀物质再采用酶解法进行水解，即将同一种原料分别采用酸解法和酶解法联合进行复合多肽提取，其提取方法不仅体现在被提取的原料或资源得到充分利用、且使原废弃物得到最大限度使用、并使提取制备的复合多肽的得率明显提高；而且，节省宝贵的自然资源、减少环境污染、安全隐患消除、生产周期缩短、提取试剂和仪器减少、投资和生产成本减低、多肽生物利用度提高、未来使用应用范围扩大、人体应用价值提高。

Description

一种复合多肽的联合提取制备方法

技术领域

本发明涉及医学美容保健及抗衰老产品等相关领域的应用，特别是涉及一种复合多肽的联合提取制备方法。

背景技术

1、多肽及其应用的技术背景

肽类(peptide)分为寡肽和多肽，是由两个或两个以上氨基酸缩合并以肽键相连的一类生物活性物质，它是蛋白质的中间产物，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的片段。肽类物质与生物体内其它物质相比，其最大的特点是它们具有很高的生物活性和生物多样性。正是因为它们具有广泛的生物活性，也被称之为活性生物多肽。多肽(polypeptide)是肽类的其中一部分，也是构成生命的最基本和重要的物质之一。事实上，活性生物多肽广泛分布并存在于大自然之中，生物体内有很多生物活性物质大都是以多肽的结构形式存在的。大量科学研究表明，活性生物多肽实际上是由20余种天然氨基酸通过肽链以不同的排列方式和形态构成，即从两肽到多肽的复杂线性和环形结构形成，它们均是源于蛋白质中间产物及天然构象的多功能化合物。

在生物体内，这些活性生物多肽不仅以多肽分子结构及天然构象的形式存在，且也以天然生物活性的作用方式在机体发挥着重要的生物学效应。正如有些学者所言：活性生物多肽可谓生物体生命象征的基本存在形式，它在生物体的生长发育和新陈代谢中起着至关重要的生物学作用。而且，人体内的各种生命活动、代谢进程和生理机能等，也几乎都是受特定氨基酸序列组成的生物活性多肽或蛋白质所主导和调控。

理论上讲，这些活性生物多肽的生物活性主要表现在它们能够参与生物体内蛋白质的合成代谢和分解代谢，能够促进生物体内相关细胞的有丝分裂与增殖分化，能够主动调节细胞内外蛋白质的合成与分泌，能够确保生命遗传基因的表达与复制，能够保证细胞中生命物质的正常合成及蛋白质转录和的数量、质量和速度；同时，还能够提高和调控机体生命活动对蛋白质的生理利用率与生物利用度，增强机体组织与细胞的新陈代谢，进而，有效调控人体的生长与发育、成长与成熟、衰老与疾病。或者说，活性生物多肽在人体内所有的细胞以及由细胞组成的组织、器官乃至整个生理系统都受活性多肽的调节和控制，它决定和控制着人体蛋白质的合成，而蛋白质又是生命最为重要的表现形式。长期以来，很多人根据分子的大小和形状去判断其吸收与否，及小分子物质容易被吸收和利用的观点而片面地认为，人体所需的蛋白质主要依靠其最终分解产物氨基酸的形式吸收后补充。然而，近年来的科学研究却证实，人体所吸收蛋白质的主要形式不都是氨基酸，而是活性生物肽。活性生物多肽与人类健康、抗衰老及延年益寿等密切相关、且意义重大。这是因为，活性生物多肽作为机体生长和发育的智能化生物监控器，能主动调节，并有效监视和调控机体内各个细胞中蛋白产物的表达、翻译、复制等过程。当机体生命活动正常及各类细胞分裂、增殖正常时，活性生物多肽以确保生命活动和细胞正常分裂和蛋白质正常合成。当机体生命活动异常及各细胞增殖异常时，活性生物多肽即会立即发现并实施对错误细胞进行调控、并可能停止对它进行主动修复和迁移，且通过及时剪切和剪接、修正和修复异常错误细胞以保证蛋白质正常合成和人体处于健康状态。因此，目前学术观点认为，活性生物多肽不仅是机体生命活动的主因，也是人体细胞健康和整体抗衰老的要素。可以说，机体如果没有活性生物多肽，就等于机体没有生物活性物质，而机体也就失去了生命的活力和代谢的动力。

2、目前多肽的提取制备方法及其所存在的缺陷或不足：

目前，以大自然中活的生物(包括动物及其脏器、植物及中草药、微生物、昆虫、海洋生物等)为原料提取和制备多肽的方法很多，包括酸水解法、碱水解法、酶水解法、酸醇提取法、膜分离法、超声提取法、微波提取法、以及两种方法结合应用等方法。然而，与其他生物小分子的提取、分离方法不同的是，蛋白质和多肽类等生物大分子化合物的提取、分离是一个梯度纯化的过程，即在不改变这些化合物的结构和性质的条件下，尽量将提取物中的杂质分离出来，因此，提取的条件必须是较为温和的，且不会明显改变蛋白质和多肽的理化性质及其生物活性和抗氧化活性等。

但采用单纯的酸解或碱解法提取多肽，若所选择的溶液体系酸性或碱性太强，都可能使被提取物发生不可逆变性或过度水解以及分子构象等发生明显改变，使其逐步失去了多肽的生物学活性和功能，从而使所提取的多肽失去应有的功效作用和应用价值。采用酶解法通常选用的具有内切功能的各种蛋白水解酶。如采用酶解法时使用的水解酶量过大或pH条件过于剧烈等，同样可能使被提取物发生不可逆变性或过度水解以及分子构象等发生明显改变，使其逐步失去了多肽的生物学活性和功能，从而使所提取的多肽失去应有的功效作用和应用价值。因为维持酸性蛋白酶的最适合pH值为2.0～2.5，碱性蛋白酶的最适pH值为11，其反应条件均较为剧烈，这不仅对设备的要求较高且水解度不容易控制，在生产中不具有实际意义。而中性蛋白酶虽然是从蛋白质内部将肽键打开，专一性突出，反应条件较为温和(pH＝7)，水解效力适中，操作易于控制，并且不会破坏氨基酸结构和其它营养成分，在有效成分的保留上有着不可比拟的优势，而且价格低廉，适用于大规模的工业化生产，但如水解酶量过多或过少、酶类选择不合理、或pH条件太剧烈，其提取得率往往偏低、又得不偿失。而且，为了阻止在完成多肽提取后所加入的蛋白酶继续发生水解、通常需要煮沸进行灭酶活，这样可能在一定程度上造成多肽生物活性的降低或破坏。

而采用酸醇法提取多肽，其提取液体的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分离效果，然而，此pH值虽然不能严重改变其分子结构和生物活性，但此法提取的多肽在pH高于3.5或以上以及一般条件下较难溶解，这不仅影响其溶解度，也影响着实际应用。如果为了该提取多肽的溶解而将其溶解体系的pH降低到3.5或以下，则在某些领域，如皮肤美容品和化妆品中难以直接应用。而且，采用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不仅增加提取成本，又污染环境、影响操作者的健康，而且，残存在多肽提取液中的乙醇其分离、剔除以及乙醇的后期回收等过程工艺繁琐、难度较大。而单纯使用超滤法提取分离多肽，虽然方法简单、适合规模化生产，但膜的堵孔现象、实际使用寿命和成本、以及多肽提取得率等技术瓶颈等尚需要进一步完善和改进。而且，目前采用的多肽超声提取法、微波提取法等也不同程度存在着这样或那样的问题或不足。为此，现在需要设计和研制一种更加适合应用的复合多肽及其制备方法。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，提供一种复合多肽的联合提取制备方法，并克服和解决上述背景技术中存在的缺点：

(1)单纯的酸解或碱解法提取多肽，若所选择的溶液体系酸性或碱性太强，都可能使被提取物发生不可逆变性或过度水解以及分子构象等发生明显改变，使其逐步失去了多肽的生物学活性和功能，从而使所提取的多肽失去应有的功效作用和应用价值

(2)酶解法通常选用的具有内切功能的各种蛋白水解酶。如采用酶解法时使用的水解酶量过大或pH条件过于剧烈等，同样可能使被提取物发生不可逆变性或过度水解以及分子构象等发生明显改变，使其逐步失去了多肽的生物学活性和功能，从而使所提取的多肽失去应有的功效作用和应用价值。

(3)酸醇法提取多肽，其提取液体的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分离效果，但此法提取的多肽在pH高于3.5或以上以及一般条件下较难溶解，这不仅影响其溶解度，也影响着实际应用。如果为了该提取多肽的溶解而将其溶解体系的pH降低到3.5或以下，则在某些领域，如皮肤美容品和化妆品中难以直接应用。而且，采用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不仅增加提取成本，又污染环境、影响操作者的健康，而且，残存在多肽提取液中的乙醇其分离、剔除以及乙醇的后期回收等过程工艺繁琐、难度较大。

(4)单纯使用超滤法提取分离多肽，虽然方法简单、适合规模化生产，但膜的堵孔现象、实际使用寿命和成本、以及多肽提取得率等技术瓶颈等尚需要进一步完善和改进.

本发明所提供的一种复合多肽的联合提取制备方法，正是针对上述存在的诸多问题或局限设计研制和改进创新一种复合多肽的提取制备方法，从而避免了当前同类方法和技术的一些不足之处。

本发明一种复合多肽的联合提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜的待提取物，匀浆后加入10～30倍重量的白醋，并将PH值调至3.5～4.5，再在冰浴条件下进行超声破碎处理0～40min；将烧杯置于4℃冰箱中进行磁力搅拌4～24h；然后，12000r/min，离心20min，沉淀称重，同时收集上清液进行超滤，1μm膜粗滤，透过液进行10万膜超滤，未透过滤液用于下个步骤提取，透过液再进行1万膜超滤，最后进行纳滤，纳滤液进行冷冻干燥，即可得到复合酸解多肽，也可称为复合天然多肽；

(2)取步骤(1)所得的沉淀和未透过液，加入2倍体积的蒸馏水和中性蛋白酶，搅拌均匀，加入1M NaOH碱液将pH调至至5.5～7.5，在水浴温度45～65℃下提取1～3h，结束后用白醋调酶解液至中性酶PH至4.0，终止酶解反应，12000r/min，离心20min，收集上清液进行超滤，1μm膜粗滤，10万膜超滤，透过液1万膜超滤，滤液进行纳滤，纳滤获得的浓缩液冷冻干燥得到复合酶解多肽。

步骤(1)或(2)所述的透过液进行超滤，它包括两次超滤，第一次经过10万膜超滤，第二次经过1万膜超滤。

步骤(1)中采用蒸馏水调节白醋的PH值；步骤(2)所述调节PH值的碱液为1摩尔的氢氧化钠；步骤(1)或(2)所述的冷冻干燥条件为-45℃预冻1h，-80℃，4.5Pa冷冻干燥约20h。

本发明将同一种原料分别采用酸解法和酶解法联合进行复合多肽提取，不仅其联合提取制备技术本身就具有明显创新性，而且，其中一些提取制备条件、工艺路线设计、具体操作方法等均有鲜明创新。

本发明的创新点主要表现在三个方面：第一，采用食用级白醋进行酸解法提取；第二，采用食用级中性蛋白水解酶进行酶解提取；第三，采用级联超滤进行提取分离等。

1、采用食用级白醋进行酸解法提取的创新点主要有：

(1)采用食用白醋水解蛋白质多肽链进行复合多肽提取，其提取工艺更加简单，甚至可以在确定该食用白醋来源和一定比例时直接将食用白醋添加至被提取组织或原料匀浆之中直接进行提取，与传统多肽提取制备相比，不仅省去了多次添加提取试剂的繁琐工艺，而且还省去了提取试剂配制和pH调校等繁琐步骤。

(2)采用食用白醋水解蛋白质多肽链进行复合多肽提取，其提取工艺更有效成效，体现在采用本发明方法所提取的复合多肽不仅工艺稳定、得率较高、生物活性保持较好、且在实际应用时的相溶性及溶解性更佳。

(3)采用食用白醋水解蛋白质多肽链进行复合多肽提取，其提取工艺更安全，这不仅是因为整个提取过程不需要再添加乙醇等易燃易爆性化学试剂，免除后续提取分离的繁琐，降低提取制备成本，减少环境污染，而且直接用食用白醋提取，其后期应用无论是经口服途径、还是经皮外用等均更加安全可靠。

(4)采用食用白醋水解蛋白质多肽链进行复合多肽提取，其提取工艺更方便；这不仅因为将食用级白醋作为提取溶液条件温和、提取简单、且提取原料来源十分方便，而且，食用级白醋溶液的温和条件，克服了提取溶液酸性或碱性太强都可能使被提取物的多肽发生剧烈变性或水解以及分子构象发生改变并逐步失去生物活性。

(5)由于多肽源于蛋白，故应先使带有活性肽的蛋白质溶解。复合多肽提取的匀浆液，传统方法可用水溶液、盐溶液或缓冲溶液等作为提取溶剂，而本发明采用食用级白醋水溶液作为其提取溶剂，实验证明，它不仅能够充分溶解蛋白质或肽类化合物，而且通过调节稳定的pH，使其提取的微环境及其稳定性更好，不易与样品发生反应，可更好地保证所提取的多肽不失去生物活性。这是因为食用级白醋水溶液为弱酸溶液，而提取复合多肽的蛋白质在弱酸性环境中不仅其肽链可被温和水解、且复合多肽在该溶液中的溶解度比在水中更大，而且食用级白醋水溶液为弱酸溶液的存在尚不会改变拟提取复合多肽的理化性质和生物学特性，也不会影响其良好的生物活性和抗氧化活性。

2、采用食用级中性蛋白水解酶进行酶解法提取的创新点主要有：

(1)本发明采用食用级中性蛋白水解酶水解蛋白质多肽链进行剩余或残留物质进行复合多肽提取，该中性蛋白酶是具有内切功能的中性蛋白酶，而中性蛋白酶主要从蛋白质内部将肽键打开，专一性突出，反应条件温和(pH＝7.0)，水解效力适中，操作易于控制，并且不会破坏氨基酸结构和其它营养成分，在有效成分的保留上有着不可比拟的优势，而且价格低廉，适用于大规模的工业化生产。

(2)本发明采用食用级中性蛋白水解酶水解蛋白质多肽链进行剩余或残留物质进行复合多肽提取，其提取所采用溶液的酸碱度值控制在中性的条件之中(pH7.0)，这样可避免使用酸性蛋白水解酶和碱性蛋白水解酶水解蛋白质多肽链时必须使用过强的酸性或碱性环境条件，而提取溶液的酸性或碱性过强，都可能使被提取的复合多肽发生变性或水解以及分子构象发生改变并逐步失去生物活性。因为酸性蛋白酶的最适合pH值为2.0～2.5，碱性蛋白酶的最适pH值为11，其反应条件均较为剧烈，对设备的要求较高且水解度不容易控制，在生产中不具有实际意义。

虽然，目前也有人曾使用过食用级中性蛋白水解酶进行蛋白质水解和多肽提取，但本发明通过我们自己的正交试验，探索并得到最佳的提取条件，而这，是与目前同类提取方法完全不同的，也是本发明的创新之处。

特别是，目前使用食用级中性蛋白水解酶进行蛋白质水解和多肽提取后需要加热甚至高温对该酶进行灭活，而灭酶的温度过高，都可能使被提取的复合多肽发生变性或水解以及分子构象发生改变并逐步失去生物活性。而本发明则采用常温或低温超滤方式去除残留水解酶，不仅减少工艺、节省能源，而且，可完整保留提取复合多肽的理化性质和生物学特性，也不会影响其良好的生物活性和抗氧化活性。

3、采用级联超滤进行提取分离的创新点主要有：

(1)本发明设计并采用的是级联超滤方法，即首先通过粗滤器初滤经过自然沉淀的粗提液，这样不仅可省去无大容量低温离心机的条件限制，还可在常温或低温条件下有效过滤掉肉眼明显可见的颗粒物。

(2)本发明还设计了对经过粗滤器过滤的粗提液再以10万分子量的超滤膜进行截留，这样它不仅可快速对粗滤液进行第二次过滤，也可使提取液中某些肉眼不可见的不溶性微粒及杂蛋白或微生物、以及未经完全酸解的大分子蛋白质截留而除去，而且通过此法还可确保后续小分子超滤膜不被或少被异物堵塞，从而可提高提取分离复合多肽的效率和效果。

(3)在此基础上，本发明再设计了1万分子量的超滤膜，对经过10万分子量的超滤膜超滤后的透过液再次进行透过，使大于1万分子量和小于10万分子量的蛋白质或非复合多肽等杂质进一步被分离或截留；同时，使小于1万分子量的复合多肽顺利透过，从而使较低分子量的复合多肽得到进一步的提取和分离。而这些小于1万分子量的复合多肽未来将可通过经皮给药途径应用。

(4)本发明最后还设计了分子量为300纳米以下的纳滤膜，对经过1万分子量的超滤膜超滤后的透过液进行纳滤，使小于1万分子量和大于300纳米的复合多肽得以截留，这不仅起到常温或低温条件了快速浓缩大容量超滤透过液的目的，而且，还能将300纳米以下的非复合多肽物质及无机盐、非蛋白氮、激素等有效滤除，从而使复合多肽的纯度进一步提高。特别是，采用本发明的级联超滤进行提取分离，确保复合多肽提取条件完全温和，这也与某些传统多肽的提取、分离方法不同，而且，本发明正好符合复合多肽类提取、分离这样一种梯度纯化的过程，即在不改变这些多肽生物活性和多肽化合物的结构和性质的条件下，尽量将提取物中复合多肽提取出来、而将那些非复合多肽的杂质分离出去。

虽然，目前也有人曾使用过超滤膜进行蛋白质和多肽提取分离，但本发明通过我们自己设计的级联超滤再结合纳滤浓缩和分离技术探索并得到更好的综合效应，而这，并与目前同类提取方法在设计思路和实施方法有很大不同，而这，也是本发明的创新之处。

综上所述，本发明主要具有以下有益效果，即本发明将同一种原料分别采用酸解法和酶解法联合进行复合多肽提取，其发明的有益效果，不仅体现在被提取的原料或资源得到充分利用、且使原废弃物得到最大限度使用、并使提取制备的复合多肽的得率明显提高；而且，节省宝贵的自然资源、明显减少环境污染、安全隐患消除、生产周期缩短、提取试剂和仪器减少、投资和生产成本减低、生物利用度提高、未来使用应用范围扩大、人体应用价值提高。

本发明的有益效果具体表现在如下几个方面：

(1)节省宝贵的自然资源：过去提取制备天然生物活性多肽一般采用单一方法进行提取和制备，这些方法对提取单一多肽后的余料或其它多肽以及所谓的沉淀废除物将直接丢弃而不会再回收和利用，造成本来宝贵的自然资源及蛋白多肽资源的大量浪费。本发明则首先采用温和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然后再将温和弱酸法提取多肽过程中所残留和废弃的沉淀物质再采用酶解法进行水解，如此可得到更多的数量和种类的多肽，节省和利用了本来就非常宝贵的自然资源。

(2)节省能源、减少环境污染：过去提取制备天然生物活性多肽，常采用酸-醇提取法，该方法对提取多肽虽然经典和传统，但提取过程中使用乙醇量较大，有一定的环境污染和人体刺激；而且，由于提取所用的乙醇回收难度较大、或即使能够使乙醇回收，但操作较为繁琐、实际丢失较多，造成较大的能源浪费和较明显的环境污染、且存在较多的安全隐患。本发明直接采用单纯食用级白醋以弱酸性条件进行提取，省略乙醇添加，不仅节省能源、确保安全生产、且也大大减少环境污染及对长期乙醇刺激对人体健康的影响。

(3)投资和生产成本减低：过去大量提取制备天然生物活性多肽，无论采用酸-醇提取法，还是酶解法，其提取试剂较多、制备仪器和设备众多，尤其在提取制备过程及多肽分离等环节，必须使用大容量低温匀浆机、大容量冷冻离心机、超声细胞破碎仪、透析、层析和梯度洗脱以及浓缩装置等，甚至需要滤菌系统和有机溶剂回收体系等，其耗资较多、投资较大，但采用本发明方法，只要增加本发明设计和制造的级联超滤和纳滤系统，即可省去上述大部分仪器和设备及提取试剂，甚至无需冷冻离心和过滤除菌设备等，不仅使大规模生产复合多肽的投资大大降低，而且也可使复合多肽的生产成本大大减少。

(4)操作简便、易于产业化：本发明提取条件已通过正交实验优化、操作方法也基本程序化、且实施过程已经简化，使整个提取制备操作简便、生产程序减少、生产周期缩短、且易于产业化和规模化生产，特别是本发明的纳滤浓缩部分，不仅简便而快速、保留多肽生物活性，还可除去应用中忌讳的某些激素类成分和重金属离子等，这是过去传统方法旋转浓缩所无法达到的有益效果。

(5)多肽提取效率及纯度和得率均提高明显：本发明采用酸解法和酶解法联合提取，不仅大大减少蛋白及多肽资源浪费，而且，大大提高了复合多肽的提取效率，特别是采用本发明的级联超滤结合纳滤提取法，使复合多肽提取的得率和纯度等明显提高。

(6)生物利用度提高、未来使用应用范围扩大、人体应用价值提高：本发明提取制备的复合多肽，其显著的特点是分子量较小、而生物活性较高，且含有多种功能性多肽等，因此，与传统多肽提取法所制备的多肽相比，本发明提取制备的复合多肽其生物利用度更高、未来应用范围更大、人体应用价值更好。总之，本发明提取制备多肽，其基本处理过程为单纯物理过程，无任何相变。设备操作温度低，避免了传统工艺的种种弊端；而且，联合体提取制备最终提取系统均采用先进的超滤膜和纳滤膜相结合的分离技术，其工艺简单，运行稳定可靠，处理效率高；同时，可以对首次提取制备过程中剩余蛋白资源及其有用物质进行多肽提取制备和综合利用，实现经济、环保双赢；除此之外，多肽提取仪器和设备投资少、运行费用低、但提取制备多肽得率明显提高。

附图说明

图1.一种复合多肽的联合提取制备方法工艺流程及技术路线。

图2.海虾酸解多肽的标准曲线

图3.Bicinchoninic acid(BCA)法测定虾酸解多肽正交试验得到的多肽含量

图4.海虾酸解正交试验结果因素指标分析

图5.海虾酶解多肽的标准曲线

图6.BCA法测定鲜虾酶解正交试验得到的多肽含量

图7.海虾酶解正交试验结果因素指标分析

图8.鲜虾酸解正交试验所得鲜虾天然多肽样品20％SDS-PAGE图

图9.鲜虾酶解多肽的20％SDS-PAGE图

具体实施方式

本发明实施例公开了一种复合多肽联合提取制备方法。为了进一步理解本发明，下面以海虾多肽提取为例对本发明进行详细说明。

实施例1：海虾复合多肽的联合提取制备方法

(1)酸解法海虾复合多肽提取制备的实验设计和制备方法

按照实验设计要求，准确取一定量的新鲜海虾，洗净后沥干；添加一定量的预冷匀浆液，以后，立即置于组织匀浆器中进行匀浆；待匀浆充分后，再称重并记录之；然后，即可进行四因素三水平的正交试验(如表1所示)。

表1L9-3-4正交表(软件：正交设计助手II v3.1)

利用正交设计助手IIv3.1软件设计L9(34)正交试验，每个实验组均重复三次：首先，取已经洗消和干燥过的50mL烧杯9个，为了保证每组的操作体积均为30mL，再分别取3.0mL，1.5mL，1.0mL(定量计算时折合成原始虾质量)，加入预冷的食用白醋(分别用蒸馏水将食用白醋的pH值调至3.5，4.0，4.5)；再在冰浴条件下进行超声破碎处理0min、20min、40min(如果超声过程中发生过热现象，可适当置于冰柜中进行冷却后再超声)；然后，将烧杯置于4℃冰箱中进行磁力搅拌(适当速度)提取(4h，12h，24h)。12000r/min，20min离心，沉淀称重，上清量体积，留取1mL用于测定蛋白浓度和SDS-PAGE上述实验重复三次。其余上清液则进行超滤(1μm膜粗滤，透过液10万膜超滤，浓缩液用于酶解实验，透过液进行1万膜超滤，透过液进行纳滤)，纳滤液进行冷冻干燥(-45℃预冻1h，-80℃，4.5pa冷冻干燥约20h)，即可得到酸解法提取制备的海虾复合多肽。最后，根据上述用量，再计算其得率。

(2)酶解法海虾复合多肽提取制备的实验条件优选：

将上述酸解法制备海虾复合多肽所得到的各段沉淀物和超滤浓缩截留液进行合并和混匀，并以量筒准确量取其体积之后，再加入其2倍体积的蒸馏水，充分搅拌和混合均匀，然后按预先设计好的实验方案进行酶解正交试验(如表2)。即按照如下剂量，分别加入食用级的中性蛋白酶(1000M/g，1500M/g，2000M/g)，搅拌均匀，用1M的NaoH溶液调PH至(5.5，6.5，7.5)在水浴温度(45，55，65℃)下提取(1，2，3h)，结束后用白醋调中性酶PI至4.0，终止酶解反应，离心(12000r/min，20min)，量取上清体积，(取1ml，调PH5.5，①BCA法测定蛋白浓度；②SDS-PAGE)。得到的上清液进行超滤(1μm滤膜粗滤，10万膜超滤，浓缩液用于酶解实验，透过液1万膜超滤，滤液进行纳滤)，纳滤液冷冻干燥(-45℃预冻1h，-80℃，4.5MPa冷冻干燥20h)得到酶解多肽。将上述酸解实验过滤得到的沉淀和超滤浓缩液合并，量取体积后，加入2倍体积的蒸馏水，再加1000U/g的中性蛋白酶，1M的NaOH调PH至6.5，水浴65℃提取3h，加入白醋调pH至4.0，终止酶解反应。过滤，滤液进行超滤(1μm粗滤，10万膜超滤，浓缩液用于酶解实验，透过液1万膜超滤，透过液进行纳滤)，纳滤液冷冻干燥(-45℃预冻1h，-80℃，4.5Pa冷冻干燥20h)得到酶解法提取制备的海虾复合多肽。最后，再计算其得率。

表2L9-3-4正交表(软件：正交设计助手II v3.1)

(3)海虾复合多肽联合提取制备的正交实验结果

1)酸解法提取制备海虾复合多肽的正交实验结果

①标准曲线的绘制(如图2)；

②用Bicinchoninic acid(BCA)法测定酸解法提取制备海虾复合多肽含量(如图3)：由图3结果可知，酸解法提取制备海虾复合多肽的正交实验中以3号的实验条件提取制备的多肽含量最多，为119.90mg/g。

③正交实验结果分析(如表3、图4)；

表3、酸解法提取制备海虾复合多肽的正交试验结果极差分析

极差结果显示：酸解法提取制备海虾复合多肽的影响因素大小：体积＞pH＞超声＞时间。最优条件：pH4.5，时间4h，料液比1：30，超声40min。考虑到工业生产减少成本，超声破碎时间选择0min。

2)酶解法提取制备海虾复合多肽的正交实验结果

①标准曲线的绘制(如图5)；

②用BCA法测定酶解法提取制备海虾复合多肽含量(如图6)：由图6结果可知，酶解法提取制备海虾复合多肽的正交实验中以3号的实验条件提取制备的多肽含量最多，为32.40mg/g。

③正交实验结果分析(如表4、图7)；

表4酶解法提取制备海虾复合多肽的正交试验结果极差分析

极差结果显示：酶解法提取制备海虾复合多肽的影响因素大小：温度＞时间＞pH＞加酶量。最优条件：加酶量1000U/g，时间：3h，pH6.5，温度：65℃。(4)20％SDS-PAGE测定正交实验得到海虾复合多肽

1)SDS-PAGE测定经酸解法正交实验得到的海虾复合多肽(如图8)：对图8进行灰度分析可知：小于17kD的多肽占总蛋白的百分比1-9组分别为9.8％、4.3％、10.8％、6.3％、4.1％、4.7％、9.5％、10.5％和6.1％，所以SDS-PAGE结果显示经酸解法正交实验得出的实验条件3为最佳的提取条件，即pH4.5，时间4h，料液比1：30，超声40min。经冷冻干燥后，得到的酸解法提取制备的海虾复合多肽为24g，提取所用虾的质量为950g，则提取率为2.53％。

2)SDS-PAGE测定经酶解法提取海虾复合多肽超滤液(如图9)：对图9进行灰度分析可知：1-9组小于17kD的多肽占总蛋白的百分比分别为2.5％、0％、64.9％、6.8％、26.3％、38.0％、54.7％、10.6％和0.8％。以酶解海虾正交实验3号条件为最佳提取条件：加酶量1000U/g，时间：3h，pH6.5，温度：65℃。经冷冻干燥后，得到酶解海虾复合多肽为14g，提取所用虾的质量为950g，则提取率为1.47％。(5)海虾复合多肽的联合提取制备方法

海虾复合多肽的联合提取制备方法的具体实施步骤如下：①将冰鲜虾反复洗净、沥干、匀浆、称重、记录重量；②再加入经过冰箱提前预冷的30倍鲜虾体积的食用白醋(PH4.5)水溶液；③立即置于4℃环境下进行匀浆、并搅拌提取4h；④将过滤得到沉淀收集好并置于冰箱保存用于酶解小分子活性多肽提取；⑤而将过滤得到滤液立即进行天然活性多肽的分级超滤提取：即先经过1μm滤膜粗滤，再经过10万膜超滤(其浓缩液用于酶解提取)，然后再将其透过液用1万膜超滤，其透过液再进行纳滤；⑥其纳滤截留液中添加4％的甘氨酸(其计算方法是：每100ml纳滤截留液中加入4g分析纯甘氨酸)，待充分混合均匀后，立即置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥(-45℃预冻1h，-80℃，4.5Pa冷冻干燥20h)即可得到天然鲜虾多肽；⑦将冷冻干燥得到的天然海虾多肽按照今后使用需要的数量进行分装；⑧最后加盖密封、置于冷冻保存之。

同时将①将上述酸解法所得过滤物沉淀和超滤浓缩后截留液合并；②量取体积后，加入2倍体积的蒸馏水，并不断搅拌均匀；③加入中性蛋白酶1000U/g，再次搅拌均匀；④之后再用1M的NaOH溶液调PH至6.5，并在恒温水浴温度65℃下提取3h；⑤然后用食用白醋调中性酶PI至4.0，以终止酶解反应；⑥高速冷冻离心(12000r/min，20min)，或者过滤，并准确量取上清体积；⑦该离心上清液或过滤液随即进行超滤提取酶解活性多肽，即先经过1μm滤膜粗滤，再经过10万膜超滤(其浓缩液用于酶解提取)，然后再将其透过液用1万膜超滤，其透过液再进行纳滤；⑧其纳滤截留液中添加4％的甘氨酸(其计算方法是：每100ml纳滤截留液中加入4g分析纯甘氨酸)，待充分混合均匀后，立即置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥(-45℃预冻1h，-80℃，4.5Pa冷冻干燥20h)即可得到酶解鲜虾活性多肽；⑨将冷冻干燥得到的酶解鲜虾活性多肽按今后使用需要的数量进行分装；⑩最后加盖密封、置于冷冻保存之。最后，再计算其得率。

实施例2：对实施例1提取制备的海虾复合多肽进行分析鉴定。

蛋白质含量测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质的含量。

酸溶性蛋白含量测定原理：样品中的高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物(酸溶蛋白质)可溶于酸性溶液(其中包含肽及游离氨基酸。)样品经酸化后，滤液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。

多肽相对分子质量分布的测定原理：采用高效凝胶过滤色谱法测定样品多肽相对分子质量分布，即以多孔性填料为固定相，依据样品组分相对分子质量大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱法测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到肽的相对分子质量大小及分布范围。

其分析鉴定结果列表如下：

(1)酸解法提取制备海虾复合多肽的蛋白质、酸溶性蛋白含量及分子量分布结果

蛋白质	94.38％		酸溶蛋白	89.38％
					分子量范围	≥500	500-300	300-190	≤190
占比例％	4.51	9.86	52.47	33.16

(2)酶解法提取制备海虾复合多肽的蛋白质、酸溶性蛋白含量及分子量分布结果

本发明所述的实施举例仅仅是针对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (5)

1.一种复合多肽联合提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜的待提取物，匀浆后加入10～30倍重量的白醋，并将pH值调至3.5～4.5，再在冰浴条件下进行超声破碎处理0～40min；将烧杯置于4℃冰箱中进行磁力搅拌4～24h；然后，12000r/min，离心20min，沉淀称重，同时收集上清液进行超滤，1μm膜粗滤，透过液进行10万分子量膜和1万分子量的膜超滤，未透过滤液用于下个步骤提取，最后进行纳滤，纳滤液进行冷冻干燥，即可得到复合天然多肽；

(2)取步骤(1)所得的沉淀和未透过液，加入2倍体积的蒸馏水和1000U/g、1500U/g、2000U/g的中性蛋白酶，搅拌均匀，加入碱液将pH调节至5.5～7.5，在水浴温度45～65℃下提取1～3h，结束后用白醋调节中性酶pH至4.0，终止酶解反应，12000r/min，离心20min，收集上清液进行超滤，1μm膜粗滤，透过液进行10万分子量的膜和1万分子量的膜超滤，滤液再通过300纳米的纳滤膜进行纳滤，纳滤截留获得的浓缩液冷冻干燥得到复合酶解多肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)或(2)所述的透过液进行超滤，它包括两次超滤，第一次经过10万膜超滤，第二次经过1万膜超滤。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用蒸馏水调节白醋的pH值。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述调节pH值的碱液为1摩尔的氢氧化钠。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)或(2)所述的冷冻干燥条件为-45℃预冻1h，-80℃，4.5Pa冷冻干燥20h。