CN102210372A

CN102210372A - 从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法

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Publication number: CN102210372A
Application number: CN2011100771956A
Authority: CN
Inventors: 景志刚; 杨洋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明公开了一种从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，属于食品加工的技术领域。其用于解决制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失大，短肽和游离氨基酸含量底的问题。从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法包括以下步骤：(a)将动物血用离心机分离为血浆和红血球；(b)对红血球进行热变性处理；(c)超滤浓缩；(d)沉淀处理；(e)层析；(f)冷冻干燥。采用这种从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，可广泛地应用于从动物血中提取高纯短肽蛋白粉。

Description

从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法

技术领域

本发明涉及一种食品加工的技术领域，尤其是涉及一种从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法。

背景技术

通常，蛋白粉的提取方法，它包括步骤：将动物全血通过离心分离为血浆和血细胞；再用喷雾干燥法，使分离的动物血浆干燥成血浆蛋白粉末，其中喷雾干燥动物血浆时热风进入温度为160-220℃，出风温度为40-80℃。此外，对于分离的血细胞部分，也可喷雾干燥或造粒，得到动物血细胞蛋白粉。其不足之处是制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失大，短肽和游离氨基酸含量底。

发明内容

本发明克服现有技术中的不足，提供了一种制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失少，短肽和游离氨基酸含量高的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法。

为了解决上述技术的问题，本发明是通过以下技术方案实现的：从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，它包括以下步骤：(a)将动物血用离心机分离为血浆和红血球；(b)对红血球进行热变性处理；(c)超滤浓缩；(d)沉淀处理；(e)层析；(f)冷冻干燥。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的离心机为碟式分离机。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的热变性处理为：将收集的红细胞每100升加入3～5公斤氯化钠，30～50克氯化铜，蒸馏水90～110升搅匀，水浴加热到68-70℃恒温25～35分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌1～3小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液1；将滤液1在60～70℃恒温水浴下，向滤液中慢慢加入30～50克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温15～25分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌1～3小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液2。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的超滤浓缩为：将滤液2经布氏漏斗抽滤去除细微颗粒，经中空纤维超滤器超滤浓缩至总体积的1/20～3/20，收集浓缩液，中空纤维超滤器的截留分子量选为5～15千道尔顿。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的沉淀处理为：在浓缩液中，不断搅拌下缓慢加入预冷的0.6～0.8倍全体积的工业丙酮，3～5℃放置0.5～1.5小时，产生大量絮状沉淀，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，沉淀留用；将上清液回收再次不断搅拌下缓慢加入预冷的0.5～0.75倍全体积的工业丙酮，3.5～4℃放置1～1.5小时，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，将两次沉淀合并，加入少量去离子水，充分搅匀，装入透析袋透析11～13小时，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，离心除去不溶性蛋白，得透析液。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的层析为：空纤维离子交换柱预先用2～32.5毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液酸碱度值7.8平衡，透析液上在层析柱上，完毕后用同一缓冲液洗脱至280纳米下的吸收率低于0.02，然后用2.5～2002.5毫摩尔/升的酸碱度7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集，在洗脱过程中，亦可通过肉眼观察收集淡蓝色蛋白粉区带，测定收集液中的酶活力符合酶纯化标准的收集管，混合其收集液。

本发明还可以通过以下技术方案实现：以上所述的冷冻干燥为：收集液经去离子水透析11～13小时，冷冻干燥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：解决了已有技术中血球细胞破壁率不高和产品中短肽和氨基态氮含量偏低的问题，同时保留了血液中的维生素、铁、钾和钙等微量元素，制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失小，短肽和游离氨基酸含量丰富，易于消化吸收等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其主要制备工艺步骤为：以动物血为原料制备食品级蛋白粉。主要内容包括建立相关的质量安全控制体系，实现真空采血和同步检疫，通过添加一定量理想抗凝剂，采用低温连续分离工艺技术，改进完善分离条件，提高血液的分离效果，实现猪血血浆和血球的连续分离；其主要制备工艺步骤为：将动物血液用离心机分离为血浆和血球，血球经微波-酶双效破壁处理后，与血浆分别加水或混合后加水溶解，加入使蛋白质变性的变性剂，变性处理结束后加入生物酶制剂进行酶解，使血浆血球中的蛋白质酶解为短肽蛋白与氨基酸，经喷雾干燥即为制备的产品血浆或/和血球短肽蛋白粉。本技术解决了已有技术中血球细胞破壁率不高和产品中短肽和氨基态氮含量偏低的问题，同时保留了血液中的维生素、铁、钾和钙等微量元素，制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失小，短肽和游离氨基酸含量丰富，易于消化吸收等特点，可用作食品添加剂。

动物血分离方面，采用碟式分离机，建立了红细胞连续分离技术。与传统的离心机分离红细胞方法相比，不仅速度快(一小时处理量可达2吨血以上)，而且耗能低，提高了效率，大幅度降低了生产成本和劳动强度。

在铜盐保护下将粗提液在68-70℃条件下加热30分钟，可得到杂蛋白含量少。该方法无须成本较高的氯仿和乙醇。

使用的中性金属盐为氯化钠，成本低廉，且无毒无害，使用的过渡金属盐为氯化铜。二者的加入，增加了红细胞溶血液的离子强度，适当的离子强度可以使变性的血红蛋白沉淀，同时高盐浓度对蛋白粉有一定的保护作用，从而提高蛋白粉的得率和活力。

采用的层析柱为二乙基胺乙基弱阴离子高流速琼脂糖凝胶阴离子交换层析。层析柱先用酸碱度值7.8的2.5毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液平衡，然后上样。出于降低成本考虑，优选纤维素阴离子交换层析为可以重复使用且流速较快的纤维素快速流琼脂糖。

动物血采集在肉联厂屠宰轨道的放血位置上进行，预先准备好无毒塑料或不锈钢制成的接血槽，大小应便于采血为准，一般为200厘米×120厘米×25厘米。抗凝剂选用3.8％的食品级柠檬酸钠，用量约为总血量的12.5％-16.7％。在规模化的屠宰场内，将失神后的动物用铁连锁住后肢并倒挂于滑道之上，通常采用真空抽血和同步检疫。避免了血液的污染。加一些抗凝剂的整个过程中需要不断的搅拌，防止局部凝血。

溶血采用低温连续分离工艺技术，提高血液的分离效果，实现动物血血浆和血球的连续分离，采用超滤浓缩技术对血清进行浓缩，使其固形物浓度增大1-2倍。

铜盐存在下的热变性。热变性1：收集的红细胞每100升加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68-70℃恒温30分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌2小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液1。

热变性2：将滤液1在65℃恒温水浴下，向滤液中慢慢加入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌2小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液2。

超滤浓缩将滤液2经布氏漏斗抽滤去除细微颗粒，经中空纤维超滤器超滤浓缩至总体积的5％，收集浓缩液。中空纤维超滤器的截留分子量选为10千道尔顿。

丙酮沉淀在浓缩液中，不断搅拌下缓慢加入预冷的0.75倍全体积的工业丙酮，4℃放置1小时，产生大量絮状沉淀，3000转/分冷冻离心30分钟，沉淀留用；将上清液回收再次不断搅拌下缓慢加入预冷的0.75倍全体积的工业丙酮，4℃放置1小时，3000转/分冷冻离心30分钟。将两次沉淀合并，加入少量去离子水，充分搅匀，装入透析袋透析12小时，3000转/分冷冻离心30分钟，离心除去不溶性蛋白，得透析液。

二乙基胺乙基弱阴离子高流速琼脂糖凝胶离子交换柱预先用2.5毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液(酸城度值7.8)平衡。透析液上在层析柱上，完毕后用同一缓冲液洗脱至280纳米下的吸收率值低于0.02，然后用2.5-200毫摩尔/升的酸碱度7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集。在洗脱过程中，亦可通过肉眼观察收集淡蓝色蛋白粉区带。测定收集液中的酶活力符合酶纯化标准的收集管，混合其收集液。

冷冻干燥收集液经去离子水透析12小时，冷冻干燥，得成品。

活性检测经柱层析分离纯化后洗脱得到的短肽蛋白粉样品，测定其蛋白质含量和酶活力。利用邻苯三酚自氧化速率法测定酶活力为5000单位/毫克使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，短肽蛋白粉成品蛋白质纯度达到95％。

目前，使用碟式分离机连续分离红细胞的技术未见报道，碟式分离机连续分离动物血的关键是保证猪血的不凝固及清洁。由于规模化屠宰场的屠宰量大、时间上比较集中而且流水线作业等条件限制，采用真空抽血使猪血不被污染同时防止猪胃里的内容物进入接血槽里；适当加大抗凝剂加入量，加抗凝剂时应缓慢加入并不断搅拌；采集完的猪血应立即用尼龙纱布过滤后尽快分离，防止其变质腐败和溶血。

本发明解决了已有技术中血球细胞破壁率不高和产品中短肽和氨基态氮含量偏低的问题，同时保留了血液中的维生素、铁、钾和钙等微量元素，制备的血球或/和血浆短肽蛋白粉具有有效成分损失小，短肽和游离氨基酸含量丰富，易于消化吸收等特点，可用作食品添加剂。

从动物血提取蛋白粉规模化生产是以规模化应用为目标的科技自主创新成果转化项目。本发明突破了动物血提取短肽蛋白粉大规模生产的关键技术瓶颈，完全摒弃老工艺中对氯仿乙醇等有机溶剂的使用，极大的降低了对丙酮的使用，具有更高的环境安全性；本发明采用了碟式分离机，建立了红细胞连续分离技术，降低了能耗，提高了效率，大幅度降低了生产成本和劳动强度，推动了血液铜锌超氧化物歧化酶生产技术的革新。实现了对动物血液制品的大规模开发和利用。

Claims

1.一种从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于它包括以下步骤：(a)将动物血用离心机分离为血浆和红血球；(b)对红血球进行热变性处理；(c)超滤浓缩；(d)沉淀处理；(e)层析；(f)冷冻干燥。

2.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的离心机为碟式分离机。

3.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的热变性处理为：将收集的红细胞每100升加入3～5公斤氯化钠，30～50克氯化铜，蒸馏水90～110升搅匀，水浴加热到68-70℃恒温25～35分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌1～3小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液1；将滤液1在60～70℃恒温水浴下，向滤液中慢慢加入30～50克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温15～25分钟，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌1～3小时，甩干机甩干过滤去除变性血红蛋白，得滤液2。

4.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的超滤浓缩为：将滤液2经布氏漏斗抽滤去除细微颗粒，经中空纤维超滤器超滤浓缩至总体积的1/20～3/20，收集浓缩液，中空纤维超滤器的截留分子量选为5～15千道尔顿。

5.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的沉淀处理为：在浓缩液中，不断搅拌下缓慢加入预冷的0.6～0.8倍全体积的工业丙酮，3～5℃放置0.5～1.5小时，产生大量絮状沉淀，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，沉淀留用；将上清液回收再次不断搅拌下缓慢加入预冷的0.5～0.75倍全体积的工业丙酮，3.5～4℃放置1～1.5小时，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，将两次沉淀合并，加入少量去离子水，充分搅匀，装入透析袋透析11～13小时，3000～3500转/分冷冻离心25～35分钟，离心除去不溶性蛋白，得透析液。

6.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的层析为：空纤维离子交换柱预先用2～32.5毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液酸碱度值7.8平衡，透析液上在层析柱上，完毕后用同一缓冲液洗脱至280纳米下的吸收率低于0.02，然后用2.5～2002.5毫摩尔/升的酸碱度7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集，在洗脱过程中，亦可通过肉眼观察收集淡蓝色蛋白粉区带，测定收集液中的酶活力符合酶纯化标准的收集管，混合其收集液。

7.如权利要求1所述的从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法，其特征在于所述的冷冻干燥为：收集液经去离子水透析11～13小时，冷冻干燥。