CN103923178B - 一种小肽、其合成方法及其增强家畜免疫力的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小肽、其合成方法及其增强免疫力的用途，其特征在于该小肽为线型五肽Tyr‑Pro‑Ile‑Ser‑Leu，是用逐步接链和片段接链结合的方法合成,所得肽纯度高，能在极低添加浓度下即可发挥免疫作用刺激动物的免疫功能，增强动物对疫病的抗病力。

Description

一种小肽、其合成方法及其增强家畜免疫力的用途
发明领域
本发明涉及一种增强免疫力活性小肽，具体地说是涉及增强免疫力活性小肽及其制备方法。
背景技术
肽是氨基酸的线性聚合物，含氨基酸残基50个以上的通常称为蛋白质，低于50个氨基酸残基的称为肽。小肽也称寡肽，一般是指由2-10个氨基酸组成。现已证实小肽能完整地被吸收进入血液循环，在机体发挥着重要的生物学功效。动物为了达到最佳免疫性能和生产性能，必须需要一定数量的小肽。近年来，随着现代生物技术特别是现代微生物发酵技术的发展，目前市场上已有许多通过水解动植物蛋白、微生物发酵等工艺生产的蛋白质-肽-氨基酸混合制品,逐渐广泛的还被用于医药、保健品和化妆品等行业，还作为一种新型的饲料原料或添加剂用于畜牧业生产。
目前市场上可见到的增强免疫力活性小肽是大多由动物的小肠和肠粘膜加工而成的肽蛋白或是含有一定量的小肽的肽蛋白饲料或饲料添加剂，虽然也能提高动物的免疫力和生产性能，降低腹泻率和增强动物抗病力，但是大都存在以下缺陷：(1)产品的添加量较大0.1～1.5％；(2)产品功能不明确，功效不明显；(3)肽的分子量较大，一般为6000左右，仍然具有抗原性，对动物不利，易引起动物过敏反应；(4)制备成本高或产品成本高，不适于动物养殖使用。
目前市场上制备增强免疫力活性小肽的方法主要是酶解法，一般分为直接酶解法和微生物发酵法。直接酶解法使用高价格的酶，如使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶，或是使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，但容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高，因而限制了其在相关行业中的应用；微生物发酵法虽然具有原料来源广泛、反应条件温和、生产成本低、环保等优点，但该法对于肽的提取难度大，产率低、成本高，对于其对机体的作用机制也难以阐述；第二是DNA重组技术法，该法由于小分子基因片段操作、表达与检测均存在着不少困难，且不易筛选到高效表达的菌株以及菌株的产量较低，同时因许多消费者反对使用由遗传改性生物所生产的食物产品，并担心有生物安全性和生物污染，而受到限制。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种增强免疫力活性小肽，用量低、但免疫功能明确，能显著提高动物(家畜)对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)的吸收利用率、提高奶、肉、蛋的产量和生产能力，改善肉、蛋、奶的品质和风味，刺激动物免疫器官发育、提高抗病力、减少发病率，并能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品。
本发明的另一目的在于提供生物活性小肽的合成方法，所得增强免疫力活性小肽为纯品。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
小肽的合成方法，包括GE-C增强免疫力活性肽的合成和纯化，其中GE-C增强免疫力活性肽合成路线如下：
试剂说明：(a)DIEA,DCC,HOBt；(b)TFA,CH2Cl2；(c)1NNaOH,CH3OH.
以上合成路线的具体说明如下：
在冰浴条件下，以DIEA为缚酸剂，DCC与HOBt为混合缩合剂，二氯甲烷为溶剂,异亮氨酸酸甲酯盐酸盐(化合物2)与Boc-脯氨酸(化合物1)反应得到Boc-Pro-Ile-OMe(化合物3)，然后同样在冰浴条件下下将所得的Boc-Pro-Ile-OMe与三氟醋酸反应，得到Pro-Ile-OMe三氟醋酸盐(化合物4)。
按照合成化合物3的反应条件，以亮氨酸甲酯盐酸盐(化合物6)与Boc-丝氨酸(化合物5)反应得到纯Boc-Ser-Leu-OMe(化合物7)，然后同样在冰浴条件下下将所得的Boc-Ser-Leu-OMe与三氟醋酸反应，得到Ser-Leu-OMe三氟醋酸盐(化合物8)。
同样，按照合成化合物3的反应条件，以Boc-Tyr-OH(化合物9)和Pro-Ile-OMe盐酸盐(化合物4)为原料，合成得到Boc-Tyr-Pro-Ile-OH(化合物11)。
以化合物8和化合物11为原料合成Boc-Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OMe(化合物12)，然后用NaOH将其水解，最后用三氟醋酸(TFA)处理脱去Boc保护基，得到Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OH(化合物13)。
以下将具体说明所获得的增强免疫力活性小肽的用途
该增强免疫力活性肽的使用方法为：直接口服或加入水中饮用和肌肉注射。
(1)对鸡外周血PBMC细胞增殖活力的影响
为检测本发明的增强免疫力活性肽对鸡外周血T-淋巴细胞增殖活力的影响，即检测本发明产品对肉仔鸡细胞免疫力的作用效果或影响程度。进行了微量法淋巴细胞转化试验，即在肉仔鸡淋巴细胞培养液中加入不同剂量的无菌增强免疫力活性肽液，观察增强免疫力活性肽对肉仔鸡血液中淋巴细胞增殖活力的影响，具体方法如下：
(1)外周血淋巴细胞的制备：无菌取5mL鸡外周血小心沿侧壁加入到10mL玻璃离心管中4mL的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心15min；收集上层与淋巴细胞分离液两相界面上的细胞(白色云雾层)，放入新的10mL玻璃离心管，以2000rpm离心10min；吸去上清液，沉淀经PBS反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数后，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至5×106个/mL；将细胞悬液加到96孔细胞板中，100μL/孔。
(2)淋巴细胞增殖试验：淋巴细胞增殖试验参照文献的方法稍作修改。将纯化NDV抗原用RPMI-1640完全培养基调节至20μg/mL作为刺激抗原，每孔加入100μL，对照孔加入100μLRPMI-1640完全培养基，各作3个重复孔。37℃下培养66h，然后每孔加入40μLMTT(5mg/mL)，37℃下继续培养72h。吸弃培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm的值，计算刺激指数(SI)，SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。结果见图1，由图1中可以看出，本发明所得小肽具有刺激动物免疫功能，增强动物T细胞活力的功能，T细胞室畜禽动物体内参与非特异性免疫(如抗肿瘤、抗病毒)和细胞免疫的主力军，其活力的增强说明可提高动物的抗病力。
(2)对鸡IBV抗体效价的影响
为检测本发明的增强免疫力活性小肽对肉鸡IBV特异性抗体效价的影响，将肉仔鸡分为6组，每个组分成3个重复，每个重复10只鸡，试验期7周。试验设计见表1，将本发明制备的小肽按照不同剂量和灭活的IBVH120均匀混合后，分别于7日龄和14日龄肌肉注射肉鸡0.5ml。
表1对鸡IBV抗体效价的影响实验设置
组别 处理组
试验1组 10mg/L
试验2组 20mg/L
试验3组 40mg/L
试验4组 80mg/L
阴性对照组 溶媒
阳性对照组 Al(OH)3
分别于7、28、35和42日龄每组取8只鸡翅静脉采血，然后4000rpm离心10min分离血清，于-20℃冰箱冷冻保存，用HA和HI试验检测IBV抗体效价，结果以Log2的对数值表示，见表2。
表2：肉鸡血清中IBVHI抗体滴度(log2)
从表2中可看出，添加活性肽组的肉仔鸡的IBV抗体效价明显高于阳性和阴性对照组，特别是试验2和4组更为显著(右上角打*的组别)。说明本发明所得小肽可显著提高肉仔鸡的抗体效价，抗体效价是衡量机体抵抗病原能力的重要指标，抗体效价高即表明机体的抗病力强。
本发明提供的活性肽是一种绿色产品，与已有技术相比具有如下优越性：
(1)使用剂量低，如在每吨饲料仅添加100克左右，是目前肽蛋白饲料的1/10；
(2)该活性肽的功能明确，具有如下的功能：①可提高动物对营养素，如蛋白质、矿物质、维生素等重要营养素的吸收利用率，提高饲料利用率。②可提高肉、蛋产量和生产能力，改善肉、蛋的品质和风味；③本发明产品具有刺激动物免疫器官发育和提高抗病力和减少发病率等功能，明显提高畜禽成活率，降低死淘率，可作为抗生素的替代品，降低药物残留。
(3)该增强免疫力活性肽的分子量较小；
附图说明
图1是增强免疫力活性肽对鸡外周血PBMC细胞增殖活力影响柱状图；
图2是本发明所得小肽的质谱图；
图3是本发明所得小肽的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明的技术方案：
小肽的合成方法，步骤如下：
1)Boc-Ser-Leu-OMe(化合物3)的合成
在0℃下，将二异丙基乙胺(试剂a：DIEA)21mmol缓慢滴加到异亮氨酸甲酯盐酸盐(化合物2，7mmol)的30ml二氯甲烷中，用DIEA调节pH＝7-8，然后再加入Boc-脯氨酸(化合物1，7mmol)与1-羟基苯并三唑0.92g(HOBt，7mmol)，在0℃下再反应15min，然后再加入N,N'-二环己基碳二亚胺1.54g(DCC，7.49mmol)，室温下反应12h(TLC跟踪反应)，停止反应后，过滤，减压蒸去溶剂，再用乙酸乙酯溶解，依次用柠檬酸，NaHCO3和NaCl溶液萃取，合并有机相，在Na2SO4中干燥2h，过滤，减压蒸去溶剂，300-400目硅胶柱层析进行纯化，从而得到纯产物Boc-Pro-Ile-OMe(化合物3)，得到2.2g纯白色固体,收率92％。
2)Pro-Ile-OMe三氟醋酸盐(化合物4)的合成
准确称取步骤1)获得的Boc-Ser-Leu-OMe(2.5mmol)溶解于25ml的圆底烧瓶中，用12ml二氯甲烷溶解，并冷却到0℃，然后加入3ml三氟醋酸，在0℃反应4h，反应结束后，在压下旋去二氯甲烷与未反应的三氟醋酸，得到白色固体Ser-Leu-OMe三氟醋酸盐(化合物4)，其不需提纯可以直接用于第5)步合成。
3)Boc-Ser-Leu-OMe(化合物7)的合成
合成方法同步骤1),得到2g白色固体，收率为89％。
4)Ser-Leu-OMe三氟醋酸盐(化合物8)的合成
合成方法同步骤2)。
5)Boc-Tyr-Pro-Ile-OMe(化合物10)的合成
在0℃下，将二异丙基乙胺(DIEA)21mmol缓慢滴加到Pro-Ile-OMe三氟醋酸盐(化合物4，6.44mmol的30ml二氯甲烷中，搅拌10min，然后再加入Boc-Tyr-OH(化合物9，7mol)与1-羟基苯并三唑0.92g(HOBt，7mmol)，在0℃下再反应15min，然后再加入DCCl.54g(7.49mmol)，然后升到室温反应12h(TLC跟踪反应)，停止反应后，过滤，减压蒸去溶剂，再用乙酸乙酯溶解，依次用柠檬酸，NaHCO3和NaCl溶液萃取，合并有机相，在Na2SO4中干燥2h，过滤，减压蒸去溶剂，用300-400目硅胶柱层析进行纯化，从而得到较纯产物，产物为白色固体Boc-Tyr-Pro-Ile-OMe(化合物10)2.77g,收率为85％。
6)Boc-Tyr-Pro-Ile-OH(化合物11)合成
冰浴条件下，在Boc-Tyr-Pro-Ile-OMe(化合物7，5.47mmol)中加入1NNaOH20mL和甲醇20mL，5min后让其在室温下皂化2小时，点板至原料点消失，加HCl调pH＝7-8，停止反应旋去甲醇，在冰浴下加HCl调pH＝2-3，有大量的白色沉淀析出，用无水乙醚萃取一次，水相用28乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用饱和NaCl洗3-4次，乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥2小时，过滤浓缩，得到Boc-Tyr-Pro-Ile-OH(化合物11)2.15g，收率为80％。
7)Boc-Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OMe(化合物12)的合成
合成方法同步骤1),得到Boc-Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OMe(化合物12)2.31g,收率为75％。
8)Boc-Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OH的合成
合成方法同步骤2)
9)Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OH(化合物13)的合成
合成方法同步骤(2)，反应完后减压旋去二氯甲烷与未反应的三氟醋酸,然后用离子交换树脂去除三氟醋酸，冷冻干燥得到五肽粗品。
随后用300-400目硅胶柱层析进行纯化,纯化步骤是：将得到的粗肽加入去离子水，温度保持在20～40℃，用超声波振荡10～30分钟进行溶解；如有不溶物，以1∶100加入三氯乙酸帮助溶解。溶解后，用0.45μm的膜过滤，得到澄清溶液。将得到的粗肽溶液进行离子交换色谱分离模块与低压有机色谱分离模块的分离纯化，即离子交换柱和低压有机色谱柱，醋酸盐缓冲系统和醋酸/乙醇缓冲系统，进行色谱柱的平衡、进样、吸附、洗脱等工艺，获得高纯度的多肽产品Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu-OH(化合物13)1.3g，9)、10)两步收率为67％。所得产品的质谱图见图2，高效液相色谱图见图3。

Claims (2)

1.一种小肽用于制备提高家禽免疫力的药物的用途，所述的小肽为线型五肽Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu。
2.权利要求1所述的小肽用于制备提高家禽免疫力的药物的用途，所述的家禽是鸡。
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