CN107779457A - 疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,该gB蛋白片段表达量高,其制备的亚单位抗原免疫效果较gB蛋白更好。本发明还提供了串联表达该gB蛋白片段和gD蛋白制备的亚单位疫苗,该疫苗制备方法简单,针对牛传染性鼻气管炎病毒引起的牛传染性鼻气管炎有着更好的保护作用。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域,具体涉及亚单位疫苗组合物及其制备方法,以及该疫苗组合物的应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)又名牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1,BHV-1),是牛的一种重要病原体,其引起的牛传染性鼻气管炎,是牛的一种急性、热性、接触性传染病。由牛传染性鼻气管炎病毒导致的细胞免疫降低和免疫抑制,常引起继发性细菌感染,给该病的临床诊断造成困难。世界动物卫生组织(OIE)将牛传染性鼻气管炎列为B类动物疫病。
疫苗接种是预防、控制甚至消灭牛传染性鼻气管炎的主要措施之一。亚单位疫苗不含有核酸物质,安全性较好,接种后不会产生持续感染或潜伏感染,产生的免疫应答可以与野毒感染相区分,有利于疫病的控制和消灭,然而,目前研究的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗生产成本高,生产效率低,免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗,应用受到限制。
因此研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明提供了牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物及其制备方法,通过动物实验证明所述疫苗组合物对于牛传染性鼻气管炎具有良好的免疫作用。
本发明的第一方面在于提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列由以下序列顺序连接组成:
对应于牛传染性鼻气管炎病毒Cooper株gB蛋白基因202-357位核苷酸序列、955-1320位核苷酸序列、1423-1509位核苷酸序列、2230-2289位核苷酸序列,上述四段核苷酸序列之间用柔性linker连接。
本发明的第二方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,其中所述gB蛋白片段由上述的核苷酸序列编码。
利用该gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段可制备亚单位疫苗,其对于由牛传染性鼻气管炎病毒引起的牛传染性鼻气管炎有着良好的保护作用,其免疫原性较gB蛋白抗原更优。
本发明的第三方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白,其中,所述gB-gD蛋白包括上述的gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段以及gD蛋白。利用该gB-gD蛋白可制备亚单位疫苗,其对于由牛传染性鼻气管炎病毒引起的牛传染性鼻气管炎有着更好的保护作用。
本发明的第四方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物,其中,所述亚单位疫苗组合物包含免疫量的上述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,和药学上可接受的载体;所述gB蛋白片段的保守性变异体、或其活性片段保持与所述gB蛋白片段相同的免疫原性。
本发明的第五方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物,其中,所述亚单位疫苗组合物包含免疫量的上述gB-gD蛋白以及药学上可接受的载体。
本发明的第六方面在于提供一种制备本发明所述的牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段亚单位疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段的核苷酸序列;2)表达所述步骤1)中克隆的核苷酸序列,得到所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,以及3)在所述步骤2)中获得的所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段中,添加药学上可接受的载体,制备所述亚单位疫苗组合物。
本发明的第七方面在于提供一种制备牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白亚单位疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段的核苷酸序列,克隆gD蛋白的核苷酸序列;2)串联表达所述步骤1)中克隆的所述gB蛋白片段的核苷酸序列以及克隆的所述gD蛋白的核苷酸序列,得到gB-gD蛋白,以及3)使用所述步骤2)中获得的所述gB-gD蛋白,添加药学上可接受的载体,制备所述亚单位疫苗组合物。
本发明的第八方面在于提供本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段、所述gB-gD蛋白、或所述的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物在制备预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的药物中的应用。
基于此,本发明的突出优点在于:
(1)本发明疫苗组合物制备方法简单,可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分进行大量合成表达,不仅耗时短,还可便于大规模生产;
(2)本发明牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段疫苗组合物在gB蛋白片段浓度低至25μg/ml的条件下,仍能完全抵抗牛传染性鼻气管炎病毒对动物的攻毒;本发明牛传染性鼻气管炎病毒疫苗组合物中串联表达两种抗原制备的疫苗组合物可诱导产生协同的免疫效果,相对于单独表达的gB蛋白片段的疫苗组合物,免疫效果更好,还能够进一步降低了免疫使用量,降低了免疫成本;
(3)本发明的方法提供了一种改进的预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒感染的途径,避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生,对于净化牛传染性鼻气管炎有着积极的现实意义。
序列表中:
序列1为IBRV Cooper株截短型gB蛋白的核苷酸序列;
序列2为IBRV Cooper株截短型gB蛋白的氨基酸序列;
序列3为IBRV Cooper株gD蛋白的核苷酸序列;
序列4为IBRV Cooper株gD蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的第一方面在于提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列由以下序列顺序连接组成:对应于牛传染性鼻气管炎病毒Cooper株gB蛋白基因202-357位核苷酸序列、955-1320位核苷酸序列、1423-1509位核苷酸序列、2230-2289位核苷酸序列,上述四段核苷酸序列之间用柔性linker连接。
作为本发明的一种实施方式,所述核苷酸序列编码序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白。
本发明的第二方面在于提供一种由权利要求1所述核苷酸序列编码的牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段。
作为本发明的一种实施方式,所述gB蛋白片段为序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
术语“gB蛋白”又称“糖蛋白B”,在疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白。
术语“gD蛋白”又称“糖蛋白D”,是牛传染性鼻气管炎病毒进行感染必需的结构蛋白,是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一。
作为本发明的一种实施方式,所述gB蛋白片段由序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
作为本发明的一种实施方式,本发明还包括序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的gB蛋白片段的保守性变异体,所述保守性变异体的氨基酸序列中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸的替换、添加或删除,而所述保守性变异体仍能保持与序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的gB蛋白片段相同的抗原活性。
本发明所用术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性,如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般的,多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽。但是差异是有限的,以使母本多肽序列与保守性变异体总体上非常相似,并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列的差异可以是例如:一个或几个氨基酸残基及其任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码,也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生,或者它可以是非自然产生的变异体。多肽非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明所述保守性变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸的替换、添加或删除,而所述保守性变异体或其活性片段仍能保持与所述gB蛋白片段相同的抗原活性,其中,所述一个或几个保守性氨基酸的替换、添加或删除意指一个至十个保守性氨基酸的替换、添加或删除,优选一个至五个保守性氨基酸的替换、添加或删除。所述保守性氨基酸的替换、添加或删除意指性质相似、大小相当的氨基酸的替换、添加或删除,包括但不限于甘氨酸与丙氨酸之间的替换,丝氨酸与苏氨酸之间的替换,精氨酸与赖氨酸之间的替换。
本发明的第三方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白,其中,所述gB-gD蛋白包括本发明所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段以及gD蛋白。
作为本发明的一种实施方式,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与所述gD蛋白比例为1:1。
作为本发明的一种实施方式,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与所述gD蛋白串联表达。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白中,所述gD蛋白氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白中,所述gD蛋白由序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
本发明的第四方面涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗,其中,所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,以及药学上可接受的载体;所述gB蛋白片段的保守性变异体、或其活性片段保持与所述gB蛋白片段相同的免疫原性。
作为本发明的一种实施方式,所述亚单位疫苗中,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段含量为25-100μg/ml。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗包含含量为25-100μg/ml的本发明的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
本发明提供的预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒感染的亚单位疫苗组合物包含的gB蛋白片段和gD蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之,其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时,基本上保留了激发免疫应答,如针对牛传染性鼻气管炎病毒株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。
术语“核苷酸片段”指这样的多核苷酸序列,其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶,或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分,或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分,或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。
如本文一般理解和使用,“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之,在本发明的上下文中,其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段,所述多肽/蛋白质当施用于动物时,激发针对牛传染性鼻气管炎病毒攻击的免疫应答,和更优选地保护性反应。
当指氨基酸序列时,“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列,其与SEQ ID NO:2中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性,或甚至优选地80%同源性,或甚至更优选地90%同源性,或最优选地95%同源性。
在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似,同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具),本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列,同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。
无论是氨基酸序列同源性,抑或是核苷酸序列同源性,其同源性高低以序列的改变不影响自身免疫原性为限定。
本发明的第五方面在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗,其中,所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明所述的gB-gD蛋白以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与gD蛋白比例为1:1。
作为本发明的一种实施方式,所述亚单位疫苗中,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与gD蛋白串联表达。
作为本发明的一种优选实施方式,所述亚单位疫苗中,所述gD蛋白为序列表SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式,所述亚单位疫苗中,所述gD蛋白由序列表SEQID NO.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
作为本发明的一种实施方式,所述亚单位疫苗中,所述gB-gD蛋白含量为25-100μg/ml。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗gB-gD蛋白为串联表达的序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的gB蛋白片段和序列表SEQID NO:4所示氨基酸序列的gD蛋白,所述串联表达的gB-gD蛋白抗原含量为25-100μg/ml。
术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除牛传染性鼻气管炎病毒抗原之外的其他所有成分,不刺激机体,不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂,优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂;皂苷(saponin),如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals Incorporation,Birmingham AL);油包水乳剂;水包油乳剂如可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂;水包油包水乳剂;丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物;顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物的一种或多种。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型);因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil),如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil),尤其异丁烯或葵烯;酸或醇的含线性烷基的酯,更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯;支链脂肪酸或醇的酯,尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂,尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯,它们任选乙氧基化,还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物,尤其Pluronic产品,特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联,这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer,商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462,其描述了这类丙烯酸聚合物,其与聚羟基化的化合物交联,所述化合物具有至少3个羟基,优选不超过8个,其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团,例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基,如甲基。以(BF Goodrich,Ohio,USA)的名称出售产品是特别合适的。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波姆974P、934P和971P,最优选使用卡波姆971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto),这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液,经中和,优选中和至生理pH,以便产生佐剂溶液,能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括,但不限于,RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地,所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述的疫苗组合物中,所述药学上可接受的载体包括佐剂,所述佐剂包括:(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA;(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂;或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物;以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种;
优选地,皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100;
优选地,乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂,或乳剂由油与乳化剂组合形成,乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油,烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯);乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯,上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121));
优选地,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆,优选为卡波姆974P、934P和971P;
优选地,顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA。
本发明实施例中使用了油佐剂中的一种206佐剂。所述佐剂的浓度范围是从5%到50%V/V,优选50%V/V。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的第六方面在于提供一种制备亚单位疫苗的方法,其中,所述方法包括:1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段的核苷酸序列;2)表达所述步骤1)中克隆的核苷酸序列,得到所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,以及3)在所述步骤2)中获得的所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中,添加药学上可接受的载体,制备所述亚单位疫苗组合物。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述制备亚单位疫苗的方法中,所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
本发明的第七方面在于提供一种制备亚单位疫苗的方法,其中,所述方法包括:1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段的核苷酸序列,克隆gD蛋白的核苷酸序列;2)串联表达所述步骤1)中克隆的所述gB蛋白片段的核苷酸序列以及克隆的所述gD蛋白的核苷酸序列,得到gB-gD蛋白,以及3)使用所述步骤2)中获得的所述gB-gD蛋白,添加药学上可接受的载体,制备所述亚单位疫苗组合物。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述制备亚单位疫苗的方法中,表达的gB-gD蛋白为串连表达的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的gB蛋白片段和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的gD蛋白。
本发明的第八方面在于提供本发明所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段在制备预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的药物中的应用。
本发明还涉及本发明所述的gB-gD蛋白在制备预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的药物中的应用。
本发明还涉及本发明所述的牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗在制备预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的药物中的应用。
术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制牛传染性鼻气管炎病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使牛传染性鼻气管炎病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
本发明涉及的牛传染性鼻气管炎病毒多肽,其有利地激发动物中的保护性反应。具体地,本发明涉及的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
术语“保护性反应”意为在动物中预防牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
本发明中的术语“头份”是指每头牛注射的疫苗量。
本发明中所述的“TCID50”(50%tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量,是表示病毒感染力的一种表示方式。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写,本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS,按《分子克隆》第三版所述配制。
实施例1牛传染性鼻气管炎病毒截短型gB蛋白和gD蛋白的串联表达
1.牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因片段和gD蛋白基因的合成
根据IBR Cooper的序列(登录号:KU198480.1)gB蛋白和gD蛋白基因序列设计合成基因序列,由基因合成公司进行基因合成,分别在gB蛋白和gD蛋白的基因序列的N端加入杆状病毒GP67蛋白的信号肽,C端加入6个组氨酸标签。合成的gB蛋白基因片段如序列SEQ IDNO:1所示,gD蛋白基因如序列SEQ ID NO:3所示。
2.截短型gB蛋白和gD蛋白串联表达供体质粒的构建
将步骤1中合成的gD蛋白基因利用KpnI+NcoI进行双酶切,与经过同样双酶切的pFastBac Dual进行连接,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,将获得的阳性质粒命名为pFastBac Dual-co-gD。
将步骤1中合成的gB蛋白基因片段通过BamHI和EcoRI双酶切回收,与经过同样双酶切的pFastBac Dual-co-gD进行连接,鉴定的阳性质粒命名为pFastBac Dual-co-gD+gBdel。
3.重组杆粒的构建
将2μl pFastBac Dual-co-gD+gBdel供体质粒加入DH10Bac感受态细胞,轻弹混匀,冰上孵育30min,42℃热激45s,冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基中37℃200rpm培养4h,取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/那卡/四环/庆大三抗平板,37℃培养至少48h,待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml那卡/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物大小约为4500bp,使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取,经PCR鉴定正确的重组杆粒命名为Bacmid-co-gD+gBdel。
4.重组杆状病毒的获得及传代
将重组杆粒Bacmid-co-gD+gBdel转染昆虫细胞sf9。参照II Regent说明书进行转染,转染后经48-72h待细胞病变后,收获细胞上清标记为P1代重组杆状病毒rBac-co-gD+gBdel。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/100mm dish(培养皿)接种细胞培养皿,待细胞完全贴壁后,将P1代重组杆状病毒按1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中,27℃继续培养,直到72h左右细胞病变明显时,收获上清标记为P2代重组杆状病毒,用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200体积比接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
5.串联蛋白gD+gBdel蛋白的表达
将传至P4代的重组病毒按照1:10~1:100的体积比接种Hi5细胞1L,接种48~72h左右收获细胞,将离心获得的上清进行蛋白质印迹试验(Western Blot)以确认目的蛋白得到表达。经过亲和层析纯化,参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量,结果显示1L Hi5细胞可以表达获得IBR cooper株gD+gBdel蛋白(即本发明的gD+gB蛋白片段)15mg。
实施例2牛传染性鼻气管炎病毒截短型gB蛋白的制备
1.供体质粒的构建
利用实施例1中合成的gB蛋白基因片段,将合成的gB蛋白基因片段通过BamHI和EcoRI双酶切,与经过同样双酶切的pFastBacI载体相连,转化DH5α感受态细胞,经鉴定正确的阳性质粒命名为pFastBac-co-gBdel。
2.重组杆粒的构建
参照实施例1中重组杆粒的构建方法,将本实施例步骤1获得的供体质粒进行重组杆粒的构建,经PCR鉴定正确的重组杆粒命名为Bacmid-co-gBdel。
3.重组杆状病毒的获得及传代
参考实施例1中重组杆状病毒获得及传代的方法,将本实施例步骤2中鉴定正确的重组杆粒Bacmid-co-gBdel转染细胞,制备重组杆状病毒。
4.截短型gB蛋白蛋白的表达
将本实施例步骤3得到的重组杆状病毒传至P4代,按照1:10~1:100的体积比接种Hi5细胞1L,接种48~72h左右收获细胞,将离心获得的上清进行WesternBlot以确认目的蛋白得到表达。经过亲和层析纯化,参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量,结果显示1L Hi5细胞可以表达获得IBR cooper株gBdel蛋白(即本发明的gB蛋白片段)10mg。
实施例3牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物的制备
取实施例1中表达获得的IBR cooper株gD+gBdel蛋白,缓缓加入到206佐剂中,并在此过程中不断用乳化机以800rpm的转速搅拌12min,混匀,4℃保存;以同样的方法,取实施例2表达获得的IBR cooper株gBdel蛋白,制备疫苗,即为牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物。具体配比见表1。
表1牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物成分配比
实施例4牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物免疫原性试验
将5月龄IBRV抗原抗体阴性牛30头随机分成6组,5头/组,1-5组分别注射本发明实施例3制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5,第6组注射等量的PBS,单次免疫。免疫后28日采血分离血清进行抗体效价测定,同时对1-6组牛均进行攻毒,攻毒剂量为牛传染性鼻气管炎病毒107.0TCID50/头,攻毒后每天观察临床症状和体温变化,观察14天,根据牛的发病情况计算被免疫牛的攻毒保护率。
结果显示在该攻毒剂量下1-5组中每组内的5头牛均无临床症状,疫苗1-5均可达到100%的保护率,即使如疫苗1和4在抗原浓度低至25μg/ml的条件下,仍能达到完全保护;第6组内的5头牛在攻毒后出现不同程度的发热,持续高温3天以上,鼻镜潮红,流泪,眼睛有脓性分泌物,食欲减退等症状。攻毒保护结果见表2。
表2牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物免疫后的攻毒保护结果
不同组牛血清中和效价测定结果见表3,结果显示免疫28天后疫苗1~5组中和效价均转阳,对照组无中和效价。其中疫苗1、疫苗2和疫苗3效果较好,疫苗5次之,疫苗4中和效价较低。虽然疫苗1的抗原含量(25μg/ml)远低于疫苗5(100μg/ml),但是疫苗1的中和效价仍然优于疫苗5。证明了本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物免疫效果要优于单独表达的gB蛋白片段的疫苗组合物,而且还发现,本发明串联表达的两种抗原制备的疫苗组合物在更低的抗原含量时,却能达到更好的免疫效果。
表3牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗免疫28天后血清中和效价检测
组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
1 | 1:16 | 1:16 | 1:32 | 1:32 | 1:32 |
2 | 1:32 | 1:64 | 1:64 | 1:64 | 1:32 |
3 | 1:64 | 1:64 | 1:128 | 1:64 | 1:64 |
4 | 1:16 | 1:16 | 1:16 | 1:8 | 1:8 |
5 | 1:16 | 1:32 | 1:16 | 1:32 | 1:16 |
6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
实施例5牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的制备
1.供体质粒的构建
根据IBR Cooper的序列(登录号:KU198480.1)gB蛋白基因序列设计合成基因序列,由基因合成公司进行基因合成,将合成的gB蛋白基因片段通过BamHI和EcoRI双酶切,与经过同样双酶切的pFastBacI载体相连,转化DH5α感受态细胞,经鉴定正确的阳性质粒命名为pFastBac-co-gB。
2.重组杆粒的构建
参照实施例1中重组杆粒的构建方法,将本实施例步骤1获得的供体质粒进行重组杆粒的构建,经鉴定正确的重组杆粒命名为Bacmid-co-gB。
3.重组杆状病毒的获得及传代
参考实施例1中重组杆状病毒获得及传代的方法,将本实施例步骤2中鉴定正确的重组杆粒Bacmid-co-gB转染细胞,制备重组杆状病毒。
4.gB蛋白蛋白的表达
将本实施例步骤3得到的重组杆状病毒传至P4代,按照1:10~1:100的体积比接种Hi5细胞1L,接种48~72h左右收获细胞,将离心获得的上清进行Western Blot以确认目的蛋白得到表达。经过亲和层析纯化,参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量,结果显示1L Hi5细胞可以表达获得IBR cooper株gB蛋白8mg。
实施例6牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白亚单位疫苗组合物的制备
取实施例5中表达获得的IBR cooper株gB蛋白,缓缓加入到206佐剂中,并在此过程中不断用乳化机以800rpm的转速搅拌12min,混匀,4℃保存,即为牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白亚单位疫苗组合物。具体配比见表4。
表4牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白亚单位疫苗组合物成分配比
疫苗6 | |
IBR cooper株gB蛋白(μg/ml) | 50 |
206佐剂(%V/V) | 50 |
实施例7牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物免疫原性对比试验
将5月龄IBRV抗原/抗体阴性牛15头随机分成3组(即7-9组),5头/组,第7组注射本发明实施例6制备的疫苗6,第8组注射本发明实施例3制备的疫苗4,第9组注射等量的PBS,单次免疫。免疫后28日采血分离血清进行抗体效价测定,同时对7-9组牛均进行攻毒,攻毒剂量为牛传染性鼻气管炎病毒107.0TCID50/头,攻毒后每天观察临床症状和体温变化,观察14天,根据牛的发病情况计算被免疫牛的攻毒保护率。
结果显示在该攻毒剂量下,第7组3头牛出现不同程度的发热,持续高温3天以上,鼻镜潮红,流泪,眼睛有脓性分泌物,食欲减退等症状,保护率为40%;第8组5头牛均无临床症状,保护率达到100%;第9组5头牛在攻毒后出现不同程度的发热,持续高温3天以上,鼻镜潮红,流泪,眼睛有脓性分泌物,食欲减退等症状。虽然疫苗6的抗原含量高于疫苗4,但是疫苗4对受到牛传染性鼻气管炎病毒攻毒的牛的保护效果仍然优于疫苗6,疫苗4在gB蛋白片段浓度低至25μg/ml的条件下,仍能达到完全保护。攻毒保护结果见表5。
表5牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物免疫后攻毒保护对比结果
不同组牛血清中和效价测定结果见表6,结果显示免疫28天后疫苗第7组中和效价3头不转阳,第8组中中和效价均转阳,对照组无中和效价。虽然疫苗6的抗原含量高于疫苗4,但是疫苗4的中和效价仍然优于疫苗6。证明了本发明表达的gB蛋白片段抗原制备的疫苗组合物免疫效果要优于全长gB抗原制备的疫苗组合物。
表6牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗免疫28天后血清中和效价检测对比结果
组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
7 | 1:8 | 1:8 | <1:2 | <1:2 | <1:2 |
8 | 1:16 | 1:16 | 1:16 | 1:8 | 1:8 |
9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种核苷酸序列,所述核苷酸序列由以下序列顺序连接组成:
对应于牛传染性鼻气管炎病毒Cooper株gB蛋白基因202-357位核苷酸序列、955-1320位核苷酸序列、1423-1509位核苷酸序列、2230-2289位核苷酸序列,上述四段核苷酸序列之间用柔性linker连接;优选地,所述核苷酸序列编码序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白。
2.一种由权利要求1所述核苷酸序列编码的牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段;优选地,所述gB蛋白片段为序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;更优选地,所述gB蛋白片段由序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
3.一种牛传染性鼻气管炎病毒gB-gD蛋白,其中,所述gB-gD蛋白包括根据权利要求2所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段以及gD蛋白;优选地,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与gD蛋白比例为1:1;优选地,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与所述gD蛋白串联表达;优选地,所述gD蛋白氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;更优选地,所述gD蛋白由序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
4.一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物,其中,所述亚单位疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求2所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段,以及药学上可接受的载体;所述gB蛋白片段的保守性变异体、或其活性片段保持与所述gB蛋白片段相同的免疫原性。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物,其中,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段含量为25-100μg/ml;优选地,所述疫苗组合物包含含量为25-100μg/ml的序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
6.一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗组合物,其中,所述亚单位疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求3所述的gB-gD蛋白以及药学上可接受的载体;优选地,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与gD蛋白比例为1:1;优选地,所述gB蛋白片段、或其保守性变异体、或其活性片段与gD蛋白串联表达;优选地,所述gD蛋白为序列表SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列;更优选地,所述gD蛋白由序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸或其简并序列编码。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物,其中,所述gB-gD蛋白含量为25-100μg/ml;优选地,所述gB-gD蛋白为串联表达的序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的gB蛋白片段和序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的gD蛋白,所述串联表达的gB-gD蛋白抗原含量为25-100μg/ml。
8.根据权利要求4~7任一项所述的疫苗组合物,其中,所述的药学上可接受的载体包括佐剂,
所述佐剂包括:(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA;(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂;或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物;以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种;
优选地,皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100;
优选地,乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂,或乳剂由油与乳化剂组合形成,乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油,烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯);乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯,上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121));
优选地,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波姆974P、934P和971P;
优选地,顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA;
优选地,所述佐剂为206佐剂;
所述佐剂的浓度范围是从5%到50%V/V,优选50%V/V。
9.根据权利要求4~8所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病或由牛传染性鼻气管炎病毒导致的感染的药物中的应用。
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