NO341881B1 - Polypeptid, protein, metode for fremstilling av salmonid alphavirus nøytraliserende antistoffer, nukleinsyre, bærer, vaksine og diagnostisk sett - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår veterinær immunologi, det vil si den immunologiske responsen hos fisk på et virus. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen en epitop av salmonid alfavirus hvilken epitop er i stand til å indusere en virusnøytraliserende immunrespons. Spesielt angår oppfinnelsen et polypeptid omfattende en bestemt aminosyresekvens, et protein omfattende slikt polypeptid, en bærer omfattende slikt protein og en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer. Videre angår oppfinnelsen en nukleinsyre som koder for slikt polypeptid eller slikt protein og en bærer omfattende en slik nukleinsyre. Oppfinnelsen angår også en vaksine og et diagnostisk sett omfattende et slikt polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår veterinær immunologi, dvs. den immunologiske responsen hos fisk på et virus. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen polypeptid, protein, metode for fremstilling av salmonid alphavirus nøytraliserende antistoffer, nukleinsyre, bærer, vaksine og diagnostisk sett. Det er beskrevet en epitop av salmonid alfavirus hvilken epitop er i stand til å indusere en virusnøytraliserende immunrespons.

Spesielt angår oppfinnelsen følgelig et polypeptid som omfatter en bestemt aminosyresekvens, et protein omfattende slikt polypeptid, en bærer omfattende slikt protein og en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer. Videre angår oppfinnelsen følgelig en nukleinsyre som koder for slikt polypeptid eller slikt protein og en bærer omfattende en slik nukleinsyre. Oppfinnelsen angår også en vaksine og et diagnostisk kit omfattende et slikt polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre.

Fiskevirusene salmon pankreas disease-virus (SPDV) og ”sleeping disease”-virus (SDV) er beskrevet å tilhøre slekten alfavirus, i familien Togaviridae (Villoing et al., 2000, J. of Virol., vol.74, s.173-183). De to akvatiske virusene er nært beslektet og danner en gruppe som ble funnet å være atskilt fra gruppene rundt de Sindbislignende og encefalitt-type alfavirusene (Powers et al., 2001, J. of Virol., vol.75, s.

10118-10131). Derfor er de klassifisert som varianter av artene salmonid alfavirus (SAV) (Weston et al., 2002, J. of Virol., vol.76, s.6155-6163).

SDV har blitt isolert fra ørret i Frankrike og United Kingdom (UK) og SPDV fra laks i Irland og UK. Også fra ørret og laks fra Norge har SPDV-lignende virus blitt isolert. Gjennom genomisk karakterisering ble disse norske isolatene imidlertid funnet å være en distinkt undergruppe. Derfor har en underinndeling av SAV-artene svært nylig blitt foreslått (Weston et al., 2005, Dis. of Aq. Organ., vol.66, s.

105-111; Hodneland et al., 2005, Dis. of Aq. Organ., vol. 66, s.113-120), hvor SAV subtype 1 er dannet av virusene som har likhet med SPDV-isolatene fra Irland og UK; subtype 2 er dannet av SDV-isolatene; og subtype 3 dannes av de norske isolatene av SPDV.

De tre SAV subtypene er karakterisert ved deres referansestammer: - for subtype 1: SPDV isolat F93-125; den genomiske sekvensen er tilgjengelig under GenBank aksesjonsnummer: AJ316244 og dets kappeprotein 2 (E2) som: CAC87722.

- for subtype 2: SDV-isolat S49P; den genomiske sekvensen er tilgjengelig under GenBank aksesjonsnummer: AJ316246 og dets E2-protein som: CAB59730, aminosyrene 357-794.

- for subtype 3: SPDV-isolat N3; den genomiske sekvensen er tilgjengelig under GenBank aksesjonsnummer: AY604237 og dets E2-protein som: AAU01400, aminosyrene 353-790.

De tre SAV subtypene forårsaker alle en alvorlig sykdom i laks og ørret, selv om de spesifikke symptomene og deres alvorlighetsgrad kan variere med subtypen og fiskearten. De forskjellige isolatene er kryssbeskyttende i en viss grad og antistoffer mot én av subtypene viser kryss-reaksjon med de andre subtypene.

En omfattende oversikt over fiskevaksiner for akvakultur finnes fra Sommerset et al., (2005, Expert Rev. Vaccines, vol.4, s.89-101).

Akvakulturindustrien som produserer laks eller ørret, lider betraktelig under utbrudd av SAV, som forårsaker redusert vekst, og en dødelighet på mellom 10-60 prosent av dyrene. Forskning har ført til utvikling av vaksiner (EP 712,926) og Norvax ® Compact PD, en inaktivert SAV subtype 1 virusvaksine, er nå kommersielt tilgjengelig for immunisering av laks mot SPDV. Vaksiner basert på SAV virusproteiner er også beskrevet (EP 1,075,523).

Disse beskrevne SAV-vaksinene krever imidlertid, selv om de er effektive, omhyggelig valg av en fremgangsmåte for inaktivering av viruset som ikke minsker den virale immunogenisiteten. Også omstendelig kvalitetskontroll av virusinaktiverings-prosessen er nødvendig, for å sikre at ingen levende virus er igjen. Det samme gjelder for subenhetvaksiner basert på hele proteiner fra et virus som er isolert fra viruskulturer. Følgelig er produksjon av slike vaksiner ganske kostbar.

Biering et al (Progress in Fish Vaccinology; Dev. Biol. Basel. Karger 2005 vol 121 p 97-113) beskriver en oversikt av virale vaksiner hos fisk og vaksiner mot Salmon Alphavirus (SAV) basert på inaktivert virus.

En forbedring er fremstilling av subenhetvaksiner i et rekombinant ekspresjonssystem, hvor ingen patogene virus blir anvendt. Allikevel er ekspresjon av de ofte store virale proteinene en tung byrde med hensyn til kapasiteten av ekspresjonssystemet, og gjør ekspresjon mindre effektiv. Dette er også ineffektivt ettersom det meste av proteinet uttrykt ikke tilskrives den aktuelle immunaktiveringen. Tvert imot har mange antigener immundominante regioner som ikke er involvert i immunbeskyttelse, men som til og med kan maskere regioner som er immunbeskyttende. Som et resultat er immunisering med protein omfattende slike regioner kontra effektiv: en organismes humorale og/eller cellulære immunsystem blir aktivert mot disse delene av antigenet men dette interfererer ikke med infeksjonen eller replikasjonen ved patogenet eller symptomene på sykdom.

Følgelig er det et behov for alternative SAV-vaksiner som er forbedret og mer effektive, ved at de er basert på små men relevante immunogene deler av SAV virusproteinene per se: de beskyttende epitopene.

Som velkjent er stimulering av en organismes immunsystem gjennom T- og B-lymfocytter basert på molekylær gjenkjennelse av en epitop ved T- eller B-celle reseptoren. Dersom epitoper er lineære, finnes de på et antigen som en kontinuerlig, sekvensiell struktur og er relativt små; f.eks. for protein kan regioner på 8 - 15 aminosyrer bli bundet av MHC I eller II-molekyler for presentasjon for lymfocytt-reseptorene (gjennomgått f.eks. av Germain & Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol.11, s.403-450). Imidlertid kan epitoper også dannes som et resultat av den tredimensjonale foldingen av et antigen, slike epitoper er diskontinuerlige og er sammensatt av f.eks. aminosyrer som ikke er sekvensielle i proteinets aminosyresekvens. Som et resultat er regionen av et antigen som strekker seg over en diskontinuerlig epitop vanligvis større enn den for en lineær epitop.

En epitop er beskyttende dersom den kan indusere en immunrespons som er i stand til å effektivt interferere med omfanget av eller progresjonen av infeksjon eller sykdom.

Av alle mulige beskyttende epitoper, enten de er lineære eller konformasjonelle, er de som forårsaker virusnøytralisering (VN) mest effektive; slike epitoper induserer en humoral immunrespons som nøytraliserer virusinfektivitet og/eller en cellulær immunrespons som fører til lysis av virusinfiserte celler. Virusnøytralisering blir for eksempel utført ved å forhindre at virus bindes til og/eller trenger inn i vertsceller.

Virale VN-epitoper er vanligvis lokalisert på molekyler involvert i essensielle virale prosesser, slik som binding til eller inntrengning i vertsceller. Derfor er deres tilstedeværelse relevant for viruset, og fører til at de opprettholdes. Dette gjør VN-epitoper svært effektive i vaksiner, så vel som i diagnostiske analyser.

Identifikasjon av en epitop i et antigen er en kompleks prosess, selv om moderne teknikker noen ganger kan bidra til predikering av dem: datamaskindrevet predikering kan gi en indikasjon på relevante områder. Slike predikeringer anvender algoritmer som beskriver form og ladning av et protein, for eksempel som utviklet av Hopp & Woods (1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.78, s.3824-3828) og Chou & Fassman (1978, Advances in Enzymology, vol.47, s.45-148). Imidlertid er slike predikeringer nesten utelukkende anvendelige for lineære epitoper. Datamaskin-predikering av diskontinuerlige epitoper med et visst nivå av nøyaktighet er beskrevet (Kulkarni-Kale et al., 2005, Nucl. Acids Res., vol.33, s. W168-W171), men denne teknikken er kun anvendbar for proteiner for hvilke 3D krystallstrukturen er bestemt. Kritisk for alle predikeringsmetoder er å følge opp ved verifisering hvorvidt den antatte epitopen i det hele tatt er immunogen og har beskyttende evne.

Tilsvarende kan den såkalte Pepscan-teknikken anvendes for å identifisere lineære epitoper ved en automatisert screeningsanalyse (Geysen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, s.3998-4002). Igjen, denne kan ikke anvendes for diskontinuerlige epitoper.

Kartlegging og karakterisering av lineære epitoper fra alfaviruser er beskrevet, f.eks. for Semliki forest virus E2: regionene fra aminosyre (aa) 227-243 og 297-310 (Grosfeld et al., 1991, Vaccine, vol.9, s.451-456); regionene 166-185 og 286-305 (Ariel, et al., 1990, Arch. Virol. vol.113, s.99-106); og region 297-352 (Grosfeld, et al., 1992, J. of Virol., vol.66, s.1084-1090).

Frost et al. (Journal of General Virology (1995) 76: 1165-1172) beskriver kartlegging av de nøytraliserende epitopene til infeksiøse pancreatiske nekrosis viruser.

Agapov et al (Archives of Virology (1994) 139: 173-181) beskriver lokalisering av antigene seter i Venezuelan equine encephalomyelitis virus beskyttelse og demonstrerer at spesielt mutasjoner i E1 and E2 glykoproteiner har vært involvert.

Grosfeld et al (Vaccine (1991) vol 9; 1991-2006) beskriver delineæring av beskyttende epitoper på E2-kappe glykoprotein til Semliki Forest Virus.

Epitoper i alfavirus proteiner som kan indusere en VN immunrespons er også beskrevet: aa 170-220 fra Sindbis virus E2-protein (Strauss & Strauss, 1994, Microbiol. Reviews, vol. 58, s.491-562). Pence et al. (1990, Virology, vol.175, s.

41-49), beskriver en diskontinuerlig VN-epitop fra Sindbis virus E2-protein: E2c, som dekker området av aminosyrene 62-159.

Imidlertid, på grunn av den lave sekvenshomologien mellom SAV og de andre alfavirusene, kunne ingen av disse epitopene være lokalisert på SAV-proteinene. Homologier mellom strukturelle proteinsekvenser av SAV og andre alfaviruser er i størrelsesorden 31-33 % (Weston, 2002, supra).

For SAV i seg selv er VN-antistoffer og anvendelse av dem i en serologisk analyse beskrevet (Graham et al., 2003, J. of Fish Dis., vol.26, s.407-413), men disse var polyklonale antistoffer. Selv om de var effektive i analysen beskrevet, er slike antistoffer ikke anvendelige ved identifikasjon av en spesifikk VN-epitop, ettersom slike antistoffer i et dyreserum omfatter en rekke epitoper.

For det formål å identifisere VN-epitoper på virale proteiner, er monoklonale antistoffer nødvendig. Selv om monoklonale antistoffer mot SAV-proteiner har blitt beskrevet (f.eks. Graham et al., 2003, supra), var disse ikke virusnøytraliserende.

Følgelig er hittil ingen VN-epitop fra SAV virusproteiner beskrevet. Ikke desto mindre ville det, for anvendelse på området vaksinasjon og diagnostikk av SAV, være svært fordelaktig å ha en VN-epitop fra et SAV virusprotein.

Det er derfor et formål ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe, for første gang, en virusnøytraliserende epitop fra et salmonid alfavirus-protein som muliggjør utvikling av vaksiner og diagnostikk som forbedrer effektiviteten og spesifisiteten av de kjent hittil.

Overraskende ble det nå funnet at et polypeptid som dekker aminosyreregionen mellom aa 158 og 252 av SAV E2-proteinet, omfatter en konformasjonell, virusnøytraliserende epitop av SAV E2-proteinet.

Denne VN-epitopen kan nå anvendes for fremstilling av effektive vaksiner og diagnostisk analyse. Den største fordelen er at VN-epitopen er svært liten i forhold til det fullstendige SAV-E2-proteinet, som er 438 aa i størrelse, mens den fortsatt omfatter den essensielle immunogene delen av SAV E2-proteinet.

Dette har flere fordelaktige effekter: ekspresjon av SAV E2 VN-epitopen i et rekombinant ekspresjonssystem er mye mer effektiv enn den av den fullstendige SAV E2, ved at den ikke unødvendig opptar kapasiteten og ressursene for ekspresjon av en stor masse av protein som ikke direkte angår å tilveiebringe den essensielle immunresponsen. I kvantitative termer er effektiviteten av ekspresjon av VN-epitopen fremfor den fullstendige E2 forbedret med 4,6 ganger (95 aminosyrer versus 438); i tillegg blir en kvalitativ forbedring oppnådd: ved å ikke overbelaste ekspresjonssystemets kapasitet for ekspresjon og post-translasjonell prosessering, og derfor ikke indusere prematur cellelysis og påfølgende proteolyse, er VN epitop-proteinet fremstilt av bedre kvalitet enn E2-proteinet ville være.

Fremlagt på en annen måte, når prøver av SAV E2 VN-epitop-protein og av fullengde SAV E2-protein av samme mengde blir sammenlignet, så er den immunogene potensen av prøven av VN epitop-protein mer enn 5 ganger høyere enn den av E2-protein. Dette er en overraskende og svært relevant forbedring av effektiviteten av ekspresjon av SAV E2-subenheter.

En annen viktig fordel som er et resultat av den lille størrelsen av SAV E2 VN-epitopen ifølge oppfinnelsen, er dens forbedrede mulighet til å bli uttrykt av en levende rekombinant bærer (LRC); slike LRC’er, replikerer i den vaksinerte verten og kan ofte bare inkorporere en begrenset mengde av fremmed nukleinsyre inn i sine genom. Fordelaktig kan en nukleinsyre som koder for VN-epitopen ifølge oppfinnelsen som måler mindre enn 300 nukleotider, inkorporeres i de fleste slike levende rekombinante bærere, mens en nukleinsyre som koder for fullengde E2-proteinet, som måler mer enn 1300 nukleotider, fører til problemer ved replikasjon, transkripsjon og sammensetting og f.eks. reduserer den replikative kapasiteten av LRC.

Alternativt, når en LRC tillater større fremmede inserts, tillater den lille størrelsen av SAV E2 VN-epitopen nå insersjon av flere inserts. Slike multiple inserts kan inserteres i fusjon, det vil si alle bak én promoter eller hvert insert med en egen promoter.

Forbedret effektivitet av en slik LRC er svært relevant for vaksinasjon i akvakultur: på grunn av metodene for husdyrbruk anvendt og antallet av dyr som skal vaksineres, er individuell håndtering av dyr upraktisk og svært arbeidskrevende. Derfor er anvendelse av et selvreplikerende immunogen, slik som en LRC som gjør effektive metoder for massevaksinering mulig, en viktig effektivitetsforbedring.

SEKV ID NR: 1 - 3 representerer aa region 158 - 252 av SAV E2-protein av referansestammene: F93-125, S49P og N3 henholdsvis.

For oppfinnelsen skal uttrykk som angir en aminosyresekvens-region av SAV E2-proteinet, slik som 158-252 tolkes til å bety: starter med aa 158, opptil og omfattende aa 252.

Ved inkorporering av én av sekvensene ifølge SEKV ID NR: 1 - 3, omfatter polypeptidet heri regionen av aminosyrene 158 - 252 av SAV E2-protein, hvilken region omfatter den diskontinuerlige VN-epitopen av SAV E2-protein.

Lengden og posisjonen av SEKV ID NR’ene beskrevet her er presentert grafisk i Figur 1, relativt til fullengde SAV E2.

For oppfinnelsen blir betegnelsen “polypeptid” anvendt kun for klarhet ved referanse og er lik “protein”; et “protein” er ment å omfatte en molekylær kjede av aminosyrer. Et protein i seg selv er ikke av en spesifikk lengde, struktur eller form og kan om nødvendig, være modifisert in vivo eller in vitro, ved, f.eks. glykosylering, amidering, karboksylering, fosforylering eller endringer i romlig folding. Også protein-salter, -amider og -estere (spesielt C-terminale estere) og Nacyl-derivater er innenfor omfanget av oppfinnelsen. Bl.a. er peptider, oligopeptider og polypeptider omfattet innenfor definisjonen av protein, så vel som forløper-, pre-pro- og modne former av proteinet. Et protein kan være av biologisk og/eller av syntetisk opprinnelse. Et protein kan være et kimært eller fusjonsprotein, dannet ved fusjon ved biologiske, fysiske eller kjemiske prosesser, av to eller flere proteinfragmenter.

Betegnelsen “aminosyreidentitet” refererer til graden av identitet mellom aminosyresekvensene av to eller flere proteiner. Prosent aminosyreidentitet for et protein med et protein ifølge oppfinnelsen, må bestemmes ved aminosyresammenstilling av den regionen av proteinet som svarer til aminosyresekvensen av hvilke som helst av SEKV ID NR: 1 - 3.

For oppfinnelsen må slik aminosyresammenstilling bestemmes ved dataprogrammet "BLAST 2 SEQUENCES" ved å velge under-programmet:

"BlastP" (Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol.174, s.247-250), som kan nås gjennom internettadressen www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Sammenligningsmatrisen som skal anvendes er: "Blosum62", med standardparametrene: åpen gap straff: 11; utvidelse gap straff: 1 og gap x_dropoff: 50. Dette datamaskinprogrammet rapporterer prosentdelen av aminosyrer som er identiske, det vil si teller kun nøyaktige matcher som “Identiteter”.

SAV E2-fragmenter inneholdende denne regionen av aa 158-252 av SAV E2, ble funnet å inneholde VN-epitopen ifølge oppfinnelsen. Dette er åpenbart fra de eksperimentelle resultatene oppnådd; de positive VN-scorene er også angitt i Figur 1 og disse og andre resultater er beskrevet i den eksperimentelle delen.

Det ble nå funnet at ved multippel sammenstilling av aminosyreregionen 158-252 fra mange SAV E2-proteiner, omfattende isolater fra hver av de tre SAV subtypene, varierte nivået av aminosyreidentitet funnet mellom 90 og 100 %. Dette er representert i Tabell 1 nedenfor og i Figur 2. Dette svært høye nivået av konservering indikerer at variasjoner i aminosyresekvensidentitet på 90 %, er innenfor den naturlige variasjonen av aminosyresekvensene som er funnet i denne regionen av E2-proteinet av SAV. Derfor er proteiner som har aminosyreidentiteter innenfor dette område på 90 - 100 % med polypeptider ifølge oppfinnelsen, tilsynelatende naturlige varianter og er derfor innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Tabell 1: Prosentdel aminosyreidentitet av aminosyreregionene 158-252 fra SAV E2-proteiner sammenlignet med én referansesekvens:

Resultater ble bestemt ved anvendelse av Align+ ® programmet (SE Central), med innstillinger til “global sammenstilling mot en referansesekvens”, ved anvendelse av nøyaktige matcher, en scoringsmatrise = Blosum 62 og andre parametere innstilt ved standardverdi. Referansesekvensen var den fra SAV isolat N3 (aksesjon nr: AAU01400,1)

I en foretrukket utførelsesform omfatter polypeptidet i henhold til dette aspektet ifølge oppfinnelsen en aminosyresekvens som har minst 90 % aminosyresekvensidentitet med hvilken som helst av SEKV ID NR: 1 - 3. Mer foretrukket er et polypeptid som har 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller til og med 100 % aminosyresekvensidentitet med hvilken som helst av SEKV ID NR: 1 - 3, i denne rekkefølge med hensyn til preferanse.

Fortrinnsvis overstiger ikke størrelsen av et polypeptid i henhold til dette aspektet ifølge oppfinnelsen 166 aminosyrer. Dette svarer til lengden av regionen fra aa 139 - 304 av SAV E2-protein.

Som en følge kan polypeptider i henhold til dette aspektet av oppfinnelsen avledes fra SAV E2-proteinet fra hvor som helst mellom aa 87 (som er posisjon 252 minus 166) og aa 323 (som er posisjon 158 pluss 166), gitt at de har en maksimumslengde på 166 aminosyrer. Slike polypeptider omfatter fortsatt en aminosyresekvensregion svarende til SAV E2-regionen av aa 158-252 som inneholder VN-epitopen ifølge oppfinnelsen, og på grunn av den naturlige variasjonen som eksisterer i SAV E2-sekvenser i denne regionen, er deres prosentdel av aminosyreidentitet med SEKV ID NR: 1 - 3 på mellom 90 og 100 %.

Teknikker for å oppnå polypeptidene ifølge oppfinnelsen er velkjent på området. Fortrinnsvis blir teknikker for genetisk konstruksjon og rekombinant DNA ekspresjonssystemer anvendt for å uttrykke nøyaktig de ønskede fragmentene.

Nukleinsyresekvensene som kan anvendes for å kode for et polypeptid ifølge oppfinnelsen er beskrevet her og/eller er offentlig tilgjengelige. Slike sekvenser kan oppnås, manipuleres og uttrykkes ved standard molekylærbiologiske teknikker som er velkjent for fagfolk og som er detaljert forklart i standard lærebøker som: Molecular cloning: a laboratory manual (Sambrook & Russell: 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN:

0879695773) og: Current protocols in molecular biology (Ausubel et al., 1988 oppdateringer, Greene Publishing Assoc., New York; ISBN: 0471625949).

For å konstruere en nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen blir foretrukket DNA-fragmenter i form av plasmider anvendt. Slike plasmider er anvendelige f.eks. for å forøke mengden av et DNA-insert, for anvendelse som en probe og som verktøy for ytterligere manipulasjoner.

Eksempler på slike plasmider for kloning er plasmider fra pET, pBR, pUC, pGEM og pcDNA plasmid-seriene, alle disse er lett tilgjengelige fra mange kommersielle leverandører.

For å oppnå det ønskede polypeptidet, blir de riktige nukleinsyresekvensene konstruert f.eks. ved anvendelse av kløyving med restriksjonsenzym, ved seterettede mutasjoner eller foretrukket ved polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikker. Standard teknikker og fremgangsmåter for gjennomføring av PCR er for eksempel i stor utstrekning beskrevet i: PCR primers: a laboratory manual (Dieffenbach & Dveksler, 1995, CSHL Press, ISBN 879694473). Ved for eksempel å velge en PCR-primer som hybridiserer ved et spesielt sted på et SAV E2-kodende gen, blir det fremstilt rekombinante DNA-fragmenter som koder for polypeptider som starter eller stopper ved den ønskede aminosyren av SAV E2.

For kloningsformål, proteinrensing, deteksjon eller forbedring av ekspresjonsnivå, kan ytterligere sekvenser tilføyes, fortrinnsvis allerede inkorporert i PCR-primerene anvendt.

DNA som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan f.eks. klones fra PCR-produktet inn i en ekspresjonsvektor. I slike ekspresjonsvektorer er nukleinsyren som koder for det ønskede fragmentet av SAV E2 operabelt bundet til en transkripsjonsregulerings-sekvens slik at den kan kontrollere transkripsjonen av nukleinsyresekvensen. Egnede ekspresjonsvektorer er, blant andre, plasmider, kosmider, virus og YAC'er (kunstige gjærkromosomer) som omfatter de nødvendige kontrollregionene for replikasjon og ekspresjon.

Transkripsjonsregulerings-sekvenser er velkjent på området og omfatter bl.a.. promotere og enhancere. Fagfolk på området er klar over at valg av en promoter strekker seg til hvilken som helst eukaryot, prokaryot eller viral promoter som er i stand til å dirigere gentranskripsjon, forutsatt at promoteren er funksjonell i ekspresjonssystemet som skal anvendes.

Transkripsjonsregulerings-sekvenser som er egnet for anvendelse i et ekspresjons DNA-plasmid omfatter promotere slik som (human) cytomegalovirus immediate early promoter og Rous sarkomavirus LTR-promoteren (Ulmer et al., 1993, Science, vol.259, s.1745-1748) og major late promoter fra Adenovirus 2 og β-aktin-promoteren (Tang et al., 1992, Nature, vol.356, s.152-154).

Reguleringssekvensene kan også omfatte terminator og polyadenyleringssekvenser, slik som den velkjente bovin veksthormon polyadenyleringssekvensen, SV40 polyadenyleringssekvensen og de humane cytomegalovirus terminator og polyadenylerings-sekvensene.

Bakterielle, gjær, fungale, insekt og virveldyrecelle ekspresjonssystemer blir svært ofte anvendt. Slike ekspresjonssystemer er velkjent på området og generelt tilgjengelig, f.eks. gjennom Invitrogen (Nederland).

En vertscelle anvendt for ekspresjon av et polypeptid eller protein (som beskrevet nedenfor) ifølge oppfinnelsen, kan være en celle av bakteriell opprinnelse, f.eks. fra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. eller Caulobacter crescentus eller de akvatiske bakteriene Yersinia ruckeri og Vibrio anguillarum, alle i kombinasjon med anvendelse av bakterieavledete plasmider eller bakteriofager for å uttrykke sekvensen som koder for polypeptidet eller proteinet (som beskrevet nedenfor) ifølge oppfinnelsen. Vertscellen kan også være av eukaryot opprinnelse, f.eks. gjærceller (f.eks. Saccharomyces eller Pichia) i kombinasjon med gjærspesifikke vektor-molekyler; insektceller i kombinasjon med rekombinante baculo-virale vektorer f.eks. Sf9 og pVL1393 (Luckow et al.,1988, Bio-technology, vol.6, s.47-55); planteceller, i kombinasjon med f.eks. Ti-plasmid-baserte vektorer eller plantevirus-vektorer (Barton, et al., 1983, Cell, vol.32, s.1033-1043); eller mammalske celler også med passende vektorer eller rekombinante virus, slik som Hela-celler, CHO, CRFK eller BHK-celler eller fiskeceller slik som Chinook lakseembryo (CHSE-214)-celler, cellelinjer fra atlanterhavslaks og regnbueørret cellelinjer.

Ved siden av disse ekspresjonssystemene er ekspresjon i organismer slik som alger eller planter attraktive ekspresjonssystemer, ettersom disse kan inkorporeres i fôret og anvendes som oral vaksine. Ved fôring av fisk som skal vaksineres med slike materialer blir effektiv massevaksinasjon oppnådd.

Teknikken for in vivo homolog rekombinasjon, velkjent på området, kan anvendes for å innføre en rekombinant nukleinsyresekvens inn i genomet til en bakterie, virus eller foretrukket organisme.

Ekspresjon kan også utføres i såkalte cellefrie ekspresjonssystemer. Slike systemer omfatter alle essensielle faktorer for ekspresjon av en passende rekombinant nukleinsyre, operabelt bundet til en promoter som er i stand til ekspresjon i det spesielle systemet. Eksempler er E. coli lysat-systemet (Roche, Basel, Sveits) eller kanin retikulocytt lysat-systemet (Promega corp., Madison, USA).

Foreliggende oppfinnelse angår polypeptid omfattende en aminosyresekvens som har minst 90 % aminosyre identitet med hvilken som helst én av SEKV ID NR: 1 - 3 over deres fulle lengde og hvor aminosyresekvensen som fremkaller en neutraliserende immunrespons mot salmonid alfaviruser, karakterisert ved at polypeptidet er minst 95 og maksimalt 166 aminosyrer i størrelse.

Slike proteiner ifølge oppfinnelsen er fusjons- og bærerproteiner omfattende polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Et fusjons- eller bærerprotein blir dannet gjennom en sammensetting av to eller flere tråder av aminosyrer, som gir en kombinasjon som ikke forekommer naturlig. Trådene kan være av lik eller ulik lengde. Kombinasjonen av trådene kan oppnås ved mange metoder, f.eks.:

- kjemisk; ved kobling, konjugering eller kryssbinding, gjennom dehydratisering, forestring, osv, av aminosyresekvensene enten direkte eller gjennom en intermediær struktur.

- fysisk; ved kobling gjennom oppfanging i eller på en makromolekylær struktur - ved molekylærbiologisk fusjon; gjennom kombinasjon av rekombinante nukleinsyremolekyler som omfatter fragmenter av nukleinsyre som er i stand til å kode for hver av de to, slik at et enkelt kontinuerlig ekspresjonsprodukt til slutt blir fremstilt.

Teknikker for anvendelse av disse koblingene og fusjonene er velkjent på området og er for eksempel beskrevet i håndbøkene fra Sambrook & Russel og fra Ausubel, som beskrevet ovenfor.

Anvendelse av slike fusjons- eller bærerproteiner har mange fordeler, for eksempel:

- lettere håndtering; for eksempel ved rensing og deteksjon,

- økt immunogenisitet; for eksempel ved generell immunstimulering komparabel med en adjuvans eller ved spesifikk manipulering av immunsystemet i en bestemt retning (f.eks. Th1 eller Th2), til et bestemt nivå av respons (høyere eller lavere enn ellers) eller for å oppnå en viss timing av immunresponsen.

- økt ekspresjonsnivå; for eksempel ved å øke nivået av ekspresjon per se, f.eks. ved å øke transkripsjon eller translasjonsnivåer i et spesielt ekspresjonssystem eller ved å forbedre stabiliteten av det produserte mRNA eller av proteinet, både intra- og ekstracellulært.

- tilveiebringe en linker- eller spacer-region for enda et annet fusjons- eller bærerprotein, osv.

Eksempler på slike bærer- eller fusjonsproteiner er velkjent, for eksempel:

- for rensing eller deteksjon: His-merke, v-Myc-merke, ß-galaktosidase (ß-gal), maltose bindingsprotein, grønt fluorescerende protein (GFP), glutation S-transferase, streptavidin, biotin, immunglobulin-avledete domener (f.eks. Fabfragmenter), osv.

- for forbedret eller tilpasset immunrespons: bovint eller ovint serumalbumin, keyhole limpet haemocyanin, hsp70, tetanustoksoid og: interleukiner, cytokiner og hormoner som er biologisk aktive i salmonid fisk.

Mange av disse eksemplene har mer enn en enkelt effekt, for eksempel ved å binde GFP, blir både deteksjon og ekspresjon forbedret.

SEKV ID NR: 4 er konsensus-sekvensen avledet fra den multiple sammenstilling av fragmentene aa 158-252 fra SAV E2-proteiner, allerede beskrevet ovenfor i Tabell 1. Sammenstillingen og konsensus-sekvensen er vist i Figur 2.

SEKV ID NR: 5 og 6 er konsensussekvenser avledet på en lignende måte fra SAV E2-proteiner, som dekker aa 139-290 og 111-304 henholdsvis. De underliggende multiple sammenstillingene er vist i Figurene 3 og 4 henholdsvis.

Et slikt polypeptid ifølge oppfinnelsen omfatter en del av SAV E2-proteinet som er lik eller større enn SEKV ID NR: 4, men ikke større enn SEKV ID NR: 6. Slike polypeptider omfatter fortsatt den diskontinuerlige VN-epitopen fra SAV E2-protein, gjennom inkorporeringen av SEKV ID NR: 4.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen har en størrelse på mellom 95 og 194 aminosyrer (henholdsvis lengden av SEKV ID NR: 4 og 6) og er valgt fra sekvensen av denne regionen av SAV E2.

Fordi SEKV ID NR: 4 og 6 er konsensussekvenser, er et visst nivå av variabilitet i aminosyresekvensen av polypeptidene heri. Disse konsensussekvensene har minst 85 % aminosyreidentitet med regionen av aa 158-252 fra hvilken som helst av de tre SAV-subtypene.

Ett eksempel på et protein i henhold til dette aspektet av oppfinnelsen er SEKV ID NR: 5, som går fra aa 139 - 290 relativt til sekvensen av SAV E2.

I en foretrukket utførelsesform omfatter polypeptidet i henhold til dette aspektet SEKV ID NR: 4, med et økt nivå av aminosyresekvensidentitet, oppnådd ved å erstatte én eller flere av de variable aminosyrene (angitt ved symbolet X eller Xaa, som representerer hvilken som helst aminosyre) ved en bestemt posisjon i SEKV ID NR: 4, svarende til en bestemt posisjon i SAV E2, med én av aminosyrene angitt for denne posisjonen i Tabell 2:

Tabell 2: Foretrukne utførelsesformer av SEKV ID NR: 4; aminosyrer for å erstatte de variable aminosyrene i SEKV ID NR: 4.

En lignende tabell kan settes opp for hver av SEKV ID NR: 5 eller 6, ved å avlede de foretrukne aminosyrene fra de multiple sammenstillingene ifølge Figur 3 eller 4, henholdsvis.

For begge alternativer av polypeptidet heri gjelder det at de nøyaktige grensene for VN-epitopen fra SAV E2 kan defineres ytterligere av fagfolk basert på informasjonen gitt her, ved anvendelse av velkjente teknikker. De gjeldende grensene er satt ved aa 158-252, mens det ble funnet at fragmenter fra aa 139-242 (SEKV ID NR: 7, fra SAV subtype 3, isolat N3) og fra aa 170-252 (SEKV ID NR: 8, fra SAV subtype 3, isolat N3) ikke har en funksjonell VN-epitop. Følgelig er grensene for den mest eksakte regionen som omfatter VN-epitopen, på den N-terminale siden: mellom aa 158 og 170 og på den C-terminale siden: mellom 242 og 252.

I en utførelsesform angår oppfinnelsen et protein omfattende et polypeptid ifølge krav 1, hvorved nevnte protein ikke omfatter en del på mer enn 166 aminosyrer i størrelse av et salmonid alfavirus (SAV) E2 protein omfattende nevnte polypeptid.

I en utførelsesform angår oppfinnelsen videre et polypeptid omfattende en del av et SAV E2 protein, karakterisert ved at nevnte del har minst 95 aminosyrer av aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 4 og maksimalt 194 aminosyrer av aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 6.

I en utførelsesform angår oppfinnelsen videre et protein omfattende et polypeptid ifølge krav 3, hvorved nevnte protein ikke omfatter en del av et SAV E2 protein omfattende nevnte polypeptid og som er større i størrelse enn nevnte polypeptid.

I likhet med de fordelaktige anvendelsene av proteinet ifølge det alternative aspektet ifølge oppfinnelsen, tilveiebringer disse proteinene nå fusjons- eller bærerproteiner omfattende VN-epitopen av SAV E2-protein som tillater for eksempel: lettere håndtering, økt immunogenisitet eller et økt ekspresjonsnivå av VN-epitopen.

Teknikker for fremstilling av slike fusjons- eller bærerproteiner, som beskrevet før, er velkjent på området.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen en bærer.

Slike bærere i henhold til dette aspektet er organiske eller anorganiske (multi-) molekylære strukturer som fordelaktig kan anvendes for eksempel for å forbedre stabiliteten, immunogenisiteten, leveringen eller nytten som et diagnostisk middel, av proteinet ifølge oppfinnelsen. Eksempler på bærermolekyler anvendelige for vaksinasjon og immunstimulering er: proteiner, lipider, karbohydrater; vesikler slik som miceller, liposomer, ISCOM’er, dendromerer, niosomer, bio-mikrokapsler, mikro-alginater, makrosoler; anorganiske forbindelser slik som aluminium-hydroksid, -fosfat, -sulfat eller -oksid, silika, Kaolin ® og Bentonite ®; og vertsceller og levende rekombinante bærere.

Bærere, anvendelige for diagnostiske formål omfatter for eksempel partikler av silika, lateks eller gull; membraner av nylon, PVDF, nitrocellulose eller papir; og gjenstander slik som en silisium-chip eller mikro-titrerings-anordninger.

Teknikker for inkorporering, kobling og binding av et protein ifølge oppfinnelsen til slike bærere er velkjent på området. Alle slike utførelsesformer er beskrevet mer detaljert nedenfor.

Utforminger av bærerproteiner, omfatter omtrent de samme eksemplene som beskrevet ovenfor, og gir nå for eksempel: lettere håndtering, økt immunogenisitet eller et økt ekspresjonsnivå av proteinene omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Karbohydrater og lipider som bærer for et protein ifølge oppfinnelsen, er for eksempel lektiner, glukaner, glykaner og lipopolysakkarider, slik som lipid A.

Teknikker for kobling av et protein ifølge oppfinnelsen med slike molekyler er velkjent på området (f.eks. Kubler et al., 2005, J. Org. Chem., vol.70, s.6987-6990; Alving, 1991, J. Immunol. Methods, vol.140, s.1-13).

Bærer-vesikler tjener multiple formål, for eksempel som stabiliseringsmiddel, som leverings-vehikkel og som immunstimulant. For eksempel er ISCOM’er velkjente immunstimulerende partikler (WO 96/11711), bestående av en blanding av saponin, et fosfolipid og kolesterol, inn i hvilke et antigen slik som et protein ifølge oppfinnelsen kan inkorporeres. Alternativt kan Iscom-matriks-partikler fremstilles. Disse er Iscom-lignende partikler hvor subenhet-antigenet ikke er integrert men adsorbert.

Bærere for anvendelse i oral vaksinasjon, gir både levering og immunstimulering. Eksempler er metaboliserbare substanser slik som alfacellulose eller forskjellige oljer av vegetabilsk eller animalsk opprinnelse.

Anvendelse av levende fôrorganismer som bærere er også en attraktiv metode; når slike organismer har tatt opp eller adsorbert proteinet ifølge oppfinnelsen kan de mates til mål-fisken. Spesielt foretrukne fôr-bærere for oral levering av proteinet ifølge oppfinnelsen er levende fôrorganismer som kan innkapsle proteinet. Egnede levende fôrorganismer omfatter plankton-lignende ikke-selektive filterspisere, fortrinnsvis medlemmer av Rotifera, Artemia og lignende. Svært foretrukket er saltvannsreken Artemia sp..

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av en fôr-bærer er å tilføre vertsceller eller celler fra et ekspresjonssystem, omfattende proteinet ifølge oppfinnelsen, til planktonlignende ikke-selektive filterspisere fortrinnsvis medlemmer av Rotifera, Artemia og lignende. Proteinet blir tatt opp av den levende fôr-bæreren slik som planktonlignende ikke-selektive filterspisere og disse blir deretter administrert oralt til fisken som skal beskyttes mot SAV-infeksjon og sykdom.

En levende rekombinant bærer (LRC) er en mikroorganisme slik som f.eks. bakterier, parasitter og virus, inn i hvilken ytterligere genetisk informasjon er insertert, i dette tilfellet en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyl, som er i stand til å kode for et protein ifølge oppfinnelsen (som vil bli beskrevet nedenfor). Fordi LRC replikerer in vivo i mål-dyret, er det kun nødvendig å anvende relativt lite inokulum, sammenlignet med mengden av antigent protein nødvendig for en ”klassisk” vaksinasjon. På denne måten uttrykker LRC det valgte antigenet direkte i mål-dyret eller i dets celler. Dette gir en fordelaktig presentasjon for vertens immunsystem. Alternativt kan LRC’er tjene som en bærer for den genetiske informasjonen som koder for det ønskede antigenet, med andre ord: som en leverings-konstituent for en nukleinsyrevaksine til cellene av mål-dyret.

Mål-organismer inokulert med slike LRC'er produserer en immunogen respons mot immunogenene fra bæreren så vel som mot det heterologe proteinet(proteinene) for hvilke(t) den genetiske koden i tillegg er klonet inn i LRC, f.eks. en nukleinsyre som er i stand til å kode for en SAV E2 VN-epitop omfattet i et polypeptid eller et protein ifølge oppfinnelsen. Immunresponsen indusert mot antigener fra bærer-mikroorganismen boostrer responsen på proteinet ifølge oppfinnelsen.

En LRC med en insersjon danner også effektivt en kombinasjonsvaksine, hvilket gir multippel beskyttelse ved én vaksinasjon.

Når LRC er et virus, blir slike virus også betegnet bærer- eller vektor-virus. Virus som fordelaktig kan anvendes som LRC heri er virus i stand til å replikere i salmonid fisk, for hvilke tilstrekkelig molekylærbiologisk informasjon er tilgjengelig til å tillate kloning og manipulering. Foretrukne virale LRC’er er Alfavirus og virus fra slekten Novirhabdo-virus, spesielt artene viral hemorragisk septikemi-virus og infeksiøs hematopoetisk nekrose-virus (IHNV). For eksempel er IHNV en patogen for ørret, for hvilken et attenuert viralt ekspresjons- og leveringssystem for anvendelse i salmonider har blitt beskrevet. (WO 03/097090; Biacchesi et al., 2000, J. of Virol., vol.74, s.11247-11253). Delesjon av NV-proteinet fra IHNV-genomet attenuerer viruset og skaper plass for insersjon av et fremmed gen. En foretrukket LRC er en rekombinant IHNV som bærer en nukleinsyrekonstruksjon som er i stand til å kode for et polypeptid eller protein ifølge oppfinnelsen. En slik LRC blir deretter administrert til mål-fisk for eksempel ved immersjonsvaksinering.

En vertscelle omfattende et polypeptid, protein, nukleinsyre eller LRC kan også anvendes som bærer. For eksempel kan cellene av ekspresjonssystemet som ble anvendt for å fremstille polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen eller cellene anvendt for å fremstille en LRC ifølge oppfinnelsen formuleres til en farmasøytisk sammensetning, slik som en vaksine og administreres til mål-fisken. Som med LRC’er vil antigener fra vertscellen gi en viss ytterligere immunstimulering, som har en adjuvanseffekt.

Anorganiske bærere kan belegges med eller kan adsorbere et peptid eller protein ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av velkjente teknikker. Slik ladede bærere blir deretter anvendt i vaksineformuleringer for anvendelse på mål-fisk eller for anvendelse i diagnostisk analyse. For eksempel er aluminiumhydroksid en velkjent vaksineadjuvans. Tilsvarende er partikler av silika (glasskuler) eller gull vanlig anvendt i diagnostisk analyse.

Bærere omfattende et polypeptid eller protein ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i diagnostisk analyse. For eksempel kan membraner eller strips av et egnet materiale, slik som nylon, PVDF, nitrocellulose eller papir fremstilles ved adsorbering, belegging eller blotting av polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen. Teknikker for f.eks. blotting ved anvendelse av en væskestrøm eller elektrisk strøm er velkjent på området. Slike membraner blir deretter inkorporert i en testanordning eller diagnostisk kit. Gjenstander kan også tjene som bærer: for eksempel kan en silisium-chip for anvendelse i BIAcore-utstyr eller en mikrotitrerings anordning med brønner belagt med polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen, fordelaktig anvendes.

En diagnostisk analyse ved anvendelse av en slik bærer er svært fordelaktig for spesifikk deteksjon av SAV. Spesielt fordi VN-epitopen fra SAV E2 omfattet i et polypeptid, protein eller bærer ifølge oppfinnelsen tillater spesifikk deteksjon av alle tre subtypene av SAV; som beskrevet her er VN-epitopen av SAV E2 høyst konservert mellom de tre subtypene, og har aminosyreidentiteter på mellom 90 og 100 %.

Slik spesifikk identifikasjon av SAV er for eksempel svært anvendelig ved bestemmelse av årsaken til sykdom; f.eks. det akvatiske Birnaviruset infeksiøs pankreasnekrose virus (IPNV) forårsaker også sykdom og dødelighet hos salmonid fisk. Ettersom symptomene på SPDV og IPNV kan være vanskelige å skjelne, vil det å ha en sensitiv og spesifikk diagnostisk test for SAV tilgjengelig sterkt forbedre mulighetene for å anvende de korrekte målene for dyrehold og helseomsorg.

Det er én av fordelene ifølge oppfinnelsen at polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen, også kan anvendes for å produsere spesifikke antistoffer mot SAV E2 VN-epitopen. Som et resultat er det nå for første gang mulig å produsere antistoffer, monoklonale eller polyklonale, som er nesten utelukkende rettet mot SAV E2 VN-epitopen. Slike antistoffer er svært spesifikke for SAV og svært effektive ved for eksempel passive immuniseringer og diagnostiske analyser (som vil bli beskrevet nedenfor). Slike antistoffer blir deretter anvendt f.eks. for terapi, for diagnostikk eller for kvalitetssikringsformål.

Fremgangsmåter for fremkalling og produksjon av antistoffer eller antisera omfattende antistoffer, så vel som konseptet for “spesifikk binding” ved et antistoff, er velkjent på området. For eksempel kan antistoffer eller antiserum mot polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen oppnås raskt og lett ved vaksinasjon av f.eks. griser, fjærkre eller kaniner med polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen i f.eks. en vann-i-olje-emulsjon fulgt, etter 2 - 6 uker, av tapping, sentrifugering av det koagulerte blodet og dekantering av sera.

En annen kilde for antistoffer er blod eller serum fra ørret eller laks som er (naturlig) infisert med SAV.

Andre metoder for fremstilling av antistoffer, som kan være polyklonale, monospesifikke eller monoklonale (eller derivater derav) er velkjent på området. Dersom polyklonale antistoffer er ønsket, er teknikker for å fremstille og prosessere polyklonale sera velkjent på området (f.eks. Mayer og Walter eds., 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London).

Monoklonale antistoffer, reaktive mot polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å immunisere innavlede mus ved teknikker også kjent på området (Kohler & Milstein, 1975, Nature, vol.256, s.495-497).

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en nukleinsyre som koder for polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen.

Betegnelsen “nukleinsyre” er ment å omfatte en molekylær kjede av desoksy- eller ribonukleinsyrer. En nukleinsyre er ikke av en spesifikk lengde, derfor er polynukleotider, gener, åpne leserammer (ORF’er), prober, primere, linkere, spacere og adaptere, bestående av DNA og/eller RNA, omfattet innenfor definisjonen av nukleinsyre. En nukleinsyre kan være av biologisk og/eller syntetisk opprinnelse. Nukleinsyren kan være i enkeltrådet eller dobbeltrådet form. Den enkeltrådete kan være i sense eller anti-sense orientering. Modifikasjoner i basene av nukleinsyren kan foretas og baser slik som Inosin kan inkorporeres. Andre modifikasjoner kan omfatte, for eksempel modifikasjoner av ryggraden.

Med betegnelsen “som koder for” menes: gi mulighet for proteinekspresjon, bl.a. gjennom transkripsjon og/eller translasjon når brakt inn i den rette sammenhengen. Den rette sammenhengen refererer til promoteren, celler, buffer, reaksjonsbetingelser, osv.

En nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan når brakt inn i den rette sammenhengen, kode for et polypeptid eller et protein ifølge oppfinnelsen.

Eksempler på nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen er beskrevet ovenfor.

Metoder for å isolere en nukleinsyre som er i stand til å kode for et polypeptid eller protein ifølge oppfinnelsen er beskrevet ovenfor og er velkjent på området. For eksempel kan SAV E2 VN-epitopen inneholdt i polypeptider som vist i SEKV ID NR: 1 - 3 anvendes for å fremstille eller isolere prober eller primere. Disse blir deretter anvendt til å screene biblioteker av genomiske sekvenser eller mRNA-sekvenser ved PCR eller hybridisering seleksjon. Fra en positiv klon eller koloni, blir det VN epitop-inneholdende fragmentet deretter isolert, subklonet og anvendt f.eks. i et ekspresjonssystem.

Alternativt kan E2 VN-epitopene, fra andre SAV-isolater nå hensiktsmessig identifiseres ved datastyrte sammenligninger av SEKV ID NR:1 - 3 in silico med andre SAV-sekvenser som kan omfattes i en datamaskin database. For dette formål er mange datamaskinprogrammer offentlig tilgjengelige. For eksempel kan settet av BLAST-programmer (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., vol.25, s.

3389-3402) anvendes for å sammenligne SEKV ID NR: 1 - 3 med uttrykte sekvens tags (EST)- og genomisk sekvens-databaser.

Nukleinsyrene kan også omfatte nukleinsyrer som har variasjoner i nukleotidsekvensen når sammenlignet med SEKV ID NR: 1 - 6. “Variant” nukleinsyrer kan være naturlige eller ikke-naturlige varianter. Naturlige varianter eksisterer i de forskjellige isolatene av SAV; ikke-naturlig forekommende varianter kan dannes ved rekombinant DNA-teknikker.

Det er velkjent på området at mange forskjellige nukleinsyrer kan kode for ett og samme protein. Dette er et resultat av det som er kjent innen molekylærbiologi som “slingring” (”wobble”) eller “degenerasjon av den genetiske koden”, hvor mange forskjellige kodoner eller tripletter av mRNA vil føre til at samme aminosyre blir bundet til kjeden av aminosyrer som vokser i ribosomet under translasjon. Den er mest utbredt i den andre og spesielt den tredje basen av hver triplett som koder for en aminosyre. Dette fenomenet kan resultere i en heterologi på ca.30% for to forskjellige nukleinsyrer som fortsatt koder for samme protein. Følgelig kan to nukleinsyrer som har en nukleotidsekvensidentitet på ca.

70 % fortsatt kode for ett og samme protein.

Nukleinsyrer som koder for et polypeptid eller protein ifølge oppfinnelsen, kan oppnås, manipuleres og uttrykkes ved standardteknikker innen molekylærbiologi, som beskrevet ovenfor. Verktøyet for slike manipulasjoner og ekspresjoner er bærere for nukleinsyren ifølge oppfinnelsen.

Det kan dannes et DNA-fragment omfattende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen.

En foretrukket bærer er et DNA-plasmid.

Den foretrukne metoden for å oppnå et DNA-fragment er ved revers transkripsjon av isolert mRNA ved anvendelse av RT-PCR. PCR-teknikker er vanlig kjent, som beskrevet ovenfor.

En isolert cDNA-sekvens kan være ufullstendig på grunn av ufullstendig transkripsjon fra det korresponderende mRNA eller kloner kan oppnås inneholdende fragmenter av det fullstendige cDNA. Forskjellige teknikker er kjent på området for å fullføre slike partielle cDNA-sekvenser, slik som RACE (rask amplifisering av cDNA-ender).

Det kan konstrueres et rekombinant DNA-molekyl omfattende en nukleinsyre eller et DNA-fragment ifølge oppfinnelsen, hvor nukleinsyren eller DNA-fragmentet er funksjonelt bundet til en promoter.

For å konstruere et rekombinant DNA-molekyl, kan DNA-plasmider som omfatter promotere fordelaktig anvendes, som beskrevet ovenfor.

Det kan dannes en levende rekombinant bærer (LRC) omfattende en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyl. LRC’s er beskrevet i detalj ovenfor.

DNA-fragmentet, det rekombinante DNA-molekylet eller LRC heri kan i tillegg omfatte andre nukleotidsekvenser slik som immunstimulerende oligonukleotider som har umetylerte CpG dinukleotider eller nukleotidsekvenser som koder for annet antigent protein eller adjuvans cytokiner.

I enda en annen foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen nukleinsyre som koder for et polypeptid i henhold til hvilket som helst et av kravene 1 eller 3 eller et protein i henhold til hvilket som helst et av kravene 2 eller 4.

I enda en annen foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen bærer omfattende en nukleinsyre ifølge krav 6, hvorved nevnte bærer er valgt fra gruppen bestående av en DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyl, en levende rekombinant bærer og en vertscelle.

En vertscelle heri kan omfatte en slik nukleinsyre, DNA-fragment, rekombinant DNA-molekyl eller LRC ifølge oppfinnelsen, stabilt integrert i dens genom eller på en ekstrakromosomal del som replikerer autonomt.

Eksempler på vertsceller som bærer, eller for formålet av ekspresjon av et polypeptid eller protein ifølge oppfinnelsen er beskrevet ovenfor. Ved anvendelse som en vaksine, kan vertscellen være levende eller inaktivert, avhengig av den ønskede effekten. Mange fysiske og kjemiske metoder for inaktivering av celler er kjent på området; eksempler på fysisk inaktivering er ved oppvarming eller ved stråling, f.eks. med UV, røntgen eller gamma-stråling. Eksempler på inaktiverende kjemikalier er ß-propiolakton, glutaraldehyd, ß-etylen-imin og formaldehyd. Når en metode for inaktivering skal anvendes, vet fagfolk at dette krever optimering, for å ikke forstyrre immunogenisiteten av polypeptidet, proteinet, bæreren eller nukleinsyren som skal leveres, omfattet i vertscellen, til mål-dyret.

Foretrukket anvendelse av en nukleinsyre, et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyl, en LRC eller en vertscelle er ved ekspresjon og levering av SAV E2 VN-epitopen. En måte å oppnå dette på er gjennom DNA-vaksinasjon. DNA-plasmider som omfatter en nukleinsyre, et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyl kan administreres til en salmonid fisk som beskrevet ovenfor. Slike metoder er velkjent på området.

Nukleinsyrevaksiner (eller gen- eller genetiske vaksiner som de blir betegnet) kan kreve en målretting- eller en leveringskonstituent forskjellig fra en LRC for å målrette eller beskytte den, eller for å bidra ved dens opptak ved (cellene av) verten. Slike konstituenter kan være biologiske eller syntetiske og er for eksempel bakteriofager, viruslignende partikler, liposomer eller mikro-, pulvereller nanopartikler.

DNA-vaksiner kan lett administreres gjennom intradermal applisering f.eks. ved anvendelse av en nålfri injektor slik som en GeneGun ®. Denne metoden for administrering leverer DNA direkte inn i cellene til dyret som skal vaksineres. En foretrukket mengde av en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, omfattet i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen (som beskrevet nedenfor) er i området mellom 10 pg og 1000 µg. Fortrinnsvis blir mengder i området mellom 0,1 og 100 µg anvendt. Alternativt kan fisk nedsenkes i løsninger omfattende f.eks. mellom 10 pg og 1000 µg/ml av DNA som skal administreres. Alle disse er velkjent på området.

Tilsvarende er en målrettings- eller leverings-vehikkel omfattende en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen innenfor omfanget av en bærer ifølge oppfinnelsen.

Disse anvendelsene vil føre til at nukleinsyre blir levert eller at protein blir uttrykt inne i mål-organismen eller dens celler.

De medisinske anvendelsene av et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge oppfinnelsen er beskrevet ovenfor. I hovedsak er dette vaksinasjon av fisk mot SAV, for å forebygge eller forbedre, infeksjon eller sykdom, ved å påvirke etableringen og/eller progresjonen av en SAV-infeksjon eller progresjonen av kliniske symptomer på SAV-indusert sykdom.

Disse medisinske anvendelsene blir praktisert i akvatisk dyrehelse omsorg f.eks. ved å administrere til en salmonid fisk et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge oppfinnelsen.

Det er mulig å danne en farmasøytisk sammensetning omfattende polypeptidet, proteinet, bæreren eller nukleinsyren ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det er mulig å vaksinere fisk ved å administrere til slik organisme et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, i en farmasøytisk effektiv mengde og i en farmasøytisk akseptabel bærer.

En “farmasøytisk effektiv mengde” er beskrevet i detalj nedenfor.

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en metode for å produsere salmonid alfavirus neutraliserende antistoffer, omfattende trinnene

a) inokulering av et polypeptid i henhold til hvilket som helst et av kravene 1 eller 3, et protein ifølge hvilket som helst av kravene 2 eller 4 inn i et ikke-humant dyr og

b) isolering av antistoffer fra nevnte inokulerte pattedyr.

En “farmasøytisk akseptabel bærer” kan f.eks. være vann, saltoppløsning eller en buffer egnet for formålet. I en mer kompleks form kan formuleringen omfatte en emulsjon som i seg selv omfatter andre forbindelser, slik som et cytokin, en adjuvans, et ytterligere antigen, osv.

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen vaksine omfattende et polypeptid i henhold til hvilket som helst et av kravene 1 eller 3, et protein i henhold til hvilket som helst av kravene 2 eller 4, en bærer ifølge krav 7 eller en nukleinsyre ifølge krav 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Vaksinen ifølge oppfinnelsen kan anvendes både for profylaktisk og for terapeutisk behandling.

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen et diagnostisk sett omfattende et polypeptid i henhold til hvilket som helst et av kravene 1 eller 3, et protein i henhold til hvilket som helst av kravene 2 eller 4, en bærer ifølge krav 7 eller en nukleinsyre ifølge krav 6.

I en foretrukket utførelsesform omfatter vaksinen ifølge oppfinnelsen i tillegg en adjuvans.

En adjuvans er en immunstimulerende substans som boostrer immunresponsen hos verten på en uspesifikk måte. Mange forskjellige adjuvanser er kjent på området. Eksempler på adjuvanser ofte anvendt i fiskeoppdrett er muramyldipeptider, lipopolysakkarider, flere glukaner og glykaner og Carbopol ® (en homopolymer). En omfattende oversikt over adjuvanser egnet for fiskevaksiner er gitt i oversiktsartikkelen ved Jan Raa (1996, Reviews in Fisheries Science, vol.

4, s.229-288).

Egnede adjuvantia er f.eks. vann i olje (vann/olje)-emulsjoner, olje/vannemulsjoner og vann/olje/vann doble-emulsjoner. Olje adjuvantia egnet for anvendelse i vann/olje-emulsjoner er f.eks. mineraloljer eller metaboliserbare oljer. Mineraloljer er f.eks. Bayol<®>, Marcol<®>og Drakeol<®>; metaboliserbare oljer er f.eks. vegetabilske oljer, slik som jordnøttolje og soyaolje eller animalske oljer slik som fiskeoljene squalan og squalen. Alternativt kan vitamin E (tokoferol) solubilisat som beskrevet i EP 382,271 fordelaktig anvendes.

Svært egnede olje/vann-emulsjoner blir f.eks. oppnådd ved å starte fra 5-50 % vekt/vekt vannfase og 95-50 % vekt/vekt olje adjuvans, mer foretrukket blir 20-50 % vekt/vekt vannfase og 80-50 % vekt/vekt olje-adjuvans anvendt.

Mengden av adjuvans tilsatt avhenger av typen av adjuvansen i seg selv og informasjon med hensyn til slike mengder gitt av produsenten.

I en foretrukket utførelsesform omfatter vaksinen ifølge oppfinnelsen i tillegg et stabiliseringsmiddel.

Et stabiliseringsmiddel kan tilsettes til en vaksine ifølge oppfinnelsen f.eks. for å beskytte den mot nedbrytning, for å forøke lagringstiden eller for å forbedre frysetørkings-effektivitet. Anvendelige stabiliseringsmidler er bl.a. SPGA (Bovarnik et al., 1950, J. Bacteriology, vol.59, s.509), skummet melk, gelatin, bovint serumalbumin, karbohydrater f.eks. sorbitol, mannitol, trehalose, stivelse, sukrose, dekstran eller glukose, proteiner slik som albumin eller kasein eller nedbrytningsprodukter derav og buffere, slik som alkalimetall fosfater.

I tillegg kan vaksinen omfatte én eller flere egnede overflateaktive forbindelser eller emulgeringsmidler, f.eks. Span ® eller Tween ®.

Vaksinen kan også omfatte en såkalt "konstituent". En konstituent er en forbindelse til hvilken polypeptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen adhereres, uten å bli kovalent bundet til den. Slike konstituenter er bl.a. bio-mikrokapsler, mikro-alginater, liposomer og macrosol, alle kjent på området. En spesiell form av en slik konstituent er en Iscom, beskrevet ovenfor.

Det sier seg selv at blanding av andre stabiliseringsmidler, bærere, fortynningsmidler, emulsjoner og lignende vaksiner ifølge oppfinnelsen også er innenfor omfanget av oppfinnelsen. Slike additiver er for eksempel beskrevet i velkjente håndbøker slik som: “Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) og: “Veterinary vaccinology” (P.

Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681).

Av f.eks. stabilitets- eller økonomiske årsaker kan en sammensetning ifølge oppfinnelsen frysetørkes. Generelt vil dette muliggjøre forlenget lagring ved temperaturer over null ° C, f.eks. ved 4°C. Metoder for frysetørking er kjent for fagfolk på området, og utstyr for frysetørking ved forskjellig målestokk er kommersielt tilgjengelig.

Derfor er, i en foretrukket utførelsesform, vaksinen ifølge oppfinnelsen i en frysetørket form.

For å rekonstituere en frysetørket sammensetning blir den suspendert i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel. Et slikt fortynningsmiddel kan f.eks. være så enkelt som sterilt vann eller en fysiologisk saltoppløsning. I en mer kompleks form kan den frysetørkede vaksinen suspenderes i en emulsjon f.eks. som beskrevet i EP 1,140,152.

En vaksine ifølge oppfinnelsen kan ha hvilken som helst form som er egnet for administrering i sammenheng med oppdrettsnæring og som er tilpasset den ønskede metoden for applisering og ønsket effekt. Fremstilling av en vaksine ifølge oppfinnelsen blir utført ved metoder konvensjonelle for fagfolk.

Fortrinnsvis blir vaksinen ifølge oppfinnelsen formulert i en form egnet for injeksjon eller for immersjonsvaksinering, slik som en suspensjon, løsning, dispersjon, emulsjon og lignende. Vanligvis blir slike vaksiner fremstilt sterilt.

Mål-dyr for vaksinen ifølge oppfinnelsen er en fisk, fortrinnsvis en salmonid fisk, mer foretrukket en regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) eller en Atlanterhavslaks (Salmo salar L.)

Doseringskjema for applisering av en vaksine ifølge oppfinnelsen til målorganismen kan være i enkelt eller multiple doser, som kan bli gitt samtidig eller sekvensielt, på en måte kompatibel med dosen og formuleringen og i en slik mengde som vil være immunologisk effektiv.

Det er innenfor fagfolks evne å bestemme hvorvidt en behandling er “immunologisk effektiv”, for eksempel ved å administrere en eksperimentell provokasjon infeksjon til vaksinerte dyr, og deretter bestemme et mål-dyrs kliniske tegn på sykdom, serologiske parametere eller ved å måle reisolering av patogenet.

Hva som utgjør en “farmasøytisk effektiv mengde” for en vaksine ifølge oppfinnelsen som er basert på et polypeptid, et protein, en bærer eller en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, er avhengig av den ønskede effekten og av målorganismen. Bestemmelse av den effektive mengden er innenfor kunnskapsområdet til en vanlig utøver.

En foretrukket mengde av et polypeptid eller et protein ifølge oppfinnelsen, omfattet i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen, er mellom 1 ng og 1 mg pr. dose til dyr. Mer foretrukket er mengden mellom 10 ng og 100 μg/dose, enda mer foretrukket mellom 100 ng og 10 μg/dose. En dose på mer enn 1 mg vil, selv om den er immunologisk svært egnet, være mindre attraktiv av kommersielle årsaker.

En foretrukket mengde av en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, omfattet i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen, er beskrevet ovenfor.

En foretrukket mengde av en levende rekombinant bærer ifølge oppfinnelsen, omfattet i en vaksine ifølge oppfinnelsen, er avhengig av egenskapene av bærermikroorganismen anvendt. En slik mengde blir uttrykt for eksempel som plakkdannende enheter (”plaque forming units”) (pfu), kolonidannende enheter (cfu) eller vevskultur infektiv dose (”tissue culture infective dose”) 50% (TCID50), avhengig av hva som er en hensiktsmessig måte for kvantifisering av LRC-organismen. For eksempel kan det for en levende viral vektor fordelaktig anvendes et doseområde på mellom 1 og 10<10>plakkdannende enheter (pfu) pr. dose til dyr; fortrinnsvis et område på mellom 10<2>og 10<6>pfu/dose.

En foretrukket mengde av en vertscelle ifølge oppfinnelsen, omfattet i en vaksine ifølge oppfinnelsen, er mellom 1 og 10<9>vertsceller pr. dose til dyr. Mer foretrukket blir mellom 10 og 10<7>celler/dose anvendt.

Mange metoder for administrering kan anvendes, alle kjent på området. Vaksinene ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis administrert til fisken gjennom injeksjon, immersjon, neddypping eller pr. oral. Fremgangsmåten for administreringen kan optimaliseres i henhold til standard vaksinasjonspraksis. En oversikt over fiskevaksinasjon ved Bowden et al. (Fisheries Research Service Marine Laboratory, Aberdeen, Skottland) er tilgjengelig som en Industry Report fra 27-3-2003, fra www.intrafish.com.

Foretrukket blir vaksinen administrert gjennom immersjon eller oralt. Dette er spesielt effektivt i tilfelle anvendelse av slike vaksiner i settingen med kommersiell oppdrettsnæring.

Foretrukne utførelsesformer av anvendelse av bærere ved oral vaksinasjon er beskrevet ovenfor.

Alderen, og derfor vekten, av fisken som skal vaksineres er ikke kritisk, selv om det øyensynlig er fordelaktig å vaksinere mot SAV så tidlig som mulig for å forhindre en felt infeksjon. Juvenile salmonider kan vaksineres allerede ved 0,2 gram og men før de når en vekt på 5 gram. Fisk som har en vekt på mindre enn 0,5 gram er imidlertid antatt å være utilstrekkelig immunkompetente. Derfor ville en, i praksis, prøve å vaksinere fisk som har en vekt på mellom 0,5 og 5 gram. Siden det er én av fordelene ifølge foreliggende oppfinnelse at det nå er mulig å utføre tidlig diagnose av SAV, kan kontrollmålinger slik som hygienisering utvikles for å forsinke eller redusere utbrudd i det geografiske området, inntil fisk er vaksinert.

Det er svært effektivt å formulere en vaksine ifølge oppfinnelsen som en kombinasjonsvaksine, det vil si å kombinere et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, med minst én annen fiskepatogen mikroorganisme eller virus, med et antigen fra slik mikroorganisme eller virus eller med en nukleinsyre som koder for et slikt antigen.

Fordelen med en kombinasjonsvaksine er at den ikke bare gir beskyttelse mot SAV, men også mot andre sykdommer, mens kun én vaksinasjons manipulering er nødvendig, hvilket derved forhindrer unødig stress for dyrene så vel som tids- og arbeidskostnader.

Kombinasjonsvaksinen kan omfatte minst én annen mikroorganisme eller virus som er patogen for fisk, fortrinnsvis mot salmonider eller ett annet antigen fra et virus eller mikroorganisme patogen for fisk eller en nukleinsyre som koder for nevnte andre antigen.

Derfor er kombinasjonsvaksinen heri, den andre mikroorganismen eller viruset eller antigenet eller nukleinsyren som koder for nevnte andre antigen, valgt fra gruppen bestående av Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, Vibrio anguillarum, V. anguillarum serovar O1 og serovar O2, V. salmonicida, Moritella viscosa (=V. viscosus), Photobacterium damselae underart piscicidae, Tenacibaculum maritimum, Yersinia ruckeri, Piscirickettsia salmonis, Renibacterium salmoninarum, Lactococcus garvieae, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, infeksiøs pankreasnekrose virus, Infeksiøs lakseanemivirus, Nervous Necrosis Virus og Hjerte og skjelettmuskel inflammasjon (”Heart and skeletal muscle inflammation”).

Sykdommen Hjerte og skjelettmuskel inflammasjon (HSMI) er en nylig beskrevet salmonid sykdom av viral opprinnelse (Kongtorp et al., 2004, J. of Fish diseases, vol.27, s.351-358).

Vaksinene ifølge oppfinnelsen, beskrevet ovenfor, bidrar til aktiv vaksinasjon, dvs. de trigger vertens forsvarssystem. Alternativt kan virusnøytraliserende antistoffer fremkalles mot polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen, som beskrevet ovenfor. Slike VN antistoffer kan deretter administreres til fisken. Denne metoden for vaksinasjon, såkalt passiv vaksinasjon, er den vaksinasjonen som foretrekkes når et dyr allerede er infisert og det ikke er tid til å la den naturlige immunresponsen trigges. Det er også den foretrukne metoden for vaksinering av dyr som er tilbøyelige til plutselig høyt infeksjonstrykk. De administrerte VN-antistoffene nøytraliserer SAV, som har den store fordelen at de reduserer eller stanser etableringen eller progresjonen av en SAV-infeksjon nesten umiddelbart, uavhengig av fiskens immunstatus.

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen, i et alternativt aspekt, en vaksine. En vaksine kan også fremstilles ved anvendelse av antistoffer fremstilt fra egg fra kyllinger som er vaksinert med en vaksine ifølge oppfinnelsen (IgY antistoffer).

Fortrinnsvis blir det fremstilt en vaksine for oral administrering av antistoffene, hvor antistoffene er blandet med en spiselig bærer slik som fiskefôr.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen et diagnostisk testsett omfattende et protein, en bærer eller en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen.

Som nevnt ovenfor kan dødelighet etter SAV-infeksjon være opptil 60 %. Følgelig er, for effektiv beskyttelse og kontroll-mål mot SAV og dens induserte sykdom, en rask og spesifikk diagnose av SAV viktig.

Derfor er det et annet formål ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe diagnostisk verktøy egnet for deteksjon av SAV.

Et diagnostisk testsett for deteksjon av antigent materiale omfattende en SAV E2 VN-epitop ifølge oppfinnelsen er egnet og spesifikk for deteksjon av alle SAV subtyper.

En slik test kan f.eks. omfatte en standard antigen ELISA-test, hvor brønnene av en ELISA-plate er belagt med et antistoff rettet mot SAV E2 VN-epitopen. Slike antistoffer er reaktive med SAV E2 VN-epitopen som omfattet i polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen og kan oppnås som beskrevet ovenfor. Etter inkubering med materialet som skal testes, blir merkede antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen tilsatt til brønnene. En fargereaksjon avslører deretter tilstedeværelsen av bundet antigent materiale av SAV. Metoder for merking av antistoffer ved kobling av en fluorescerende gruppe til immunglobulinet eller en annen markør, er velkjent på området. Se f.eks. http://www.ihcworld.com/protocol_database.htm.

Likeså er et diagnostisk testsett for deteksjon i en prøve eller i et dyreserum av antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen egnet og spesifikt for deteksjon av en immunrespons mot SAV av hvilke som helst av subtypene.

En slik test kan f.eks. omfatte en standard antistoff ELISA-test. I en slik test kan brønnene av en ELISA-plate f.eks. belegges med SAV E2 VN-epitopen omfattet i et polypeptid, et protein eller en bærer ifølge oppfinnelsen. Etter inkubering med materialet som skal testes, blir merkede antistoffer reaktive med immunglobulinene fra test-prøven (dersom til stede) tilsatt til brønnene. En fargereaksjon avslører deretter tilstedeværelsen i test-prøven av antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen heri.

Derfor angår oppfinnelsen i en utførelsesform diagnostisk testsett for deteksjon av antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen. Slike testsett omfatter nukleinsyren, proteinet eller bæreren ifølge oppfinnelsen.

Utformingen av en slik immunanalyse kan variere. For eksempel kan immunanalysen også være basert på konkurranse, i stedet for direkte binding.

Videre kan slike tester også anvende partikulært eller cellulært materiale, i stedet for den faste bæreren av en anordning. Deteksjon av antistoff-antigen-komplekset dannet i testen kan omfatte anvendelse av merkede antistoffer, hvor merkene for eksempel kan være enzymer eller fluorescerende, kjemiluminiscerende, radioaktive eller fargestoff-molekyler.

Egnede metoder for deteksjon av antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen ifølge oppfinnelsen i en prøve omfatter enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescens test (IFT) og Western blot-analyse.

En rask og lettvint diagnostisk test for diagnostisering av nærvær eller fravær av SAV er en PCR-test som beskrevet ovenfor, omfattende primere som spesifikt hybridiserer til en nukleinsyre i en test-prøve som er lik en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. Slike primere er for eksempel de følgende to, som gir et produkt på 188 nukleotider, fra innenfor SAV E2 VN-epitopen ifølge oppfinnelsen:

FWD: 5’- TTGACGTGTACGACGCTCTG -3’ (SEKV ID NR: 9)

REV: 5’- AACCGGCTCCTCACACGTAAAC -3’ (SEKV ID NR: 10)

Nukleinsyren, DNA-fragment, eller bærer ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes i slik PCR-test som en positiv standard.

Alternativt kan en slik diagnostisk test anvende nukleinsyren, DNA-fragmentet, rekDNA-molekylet eller bæreren ifølge oppfinnelsen, i en oppsetting som anvender hybridisering uten amplifisering til f.eks. en membran eller en anordning.

Oppfinnelsen vil nå bli ytterligere beskrevet med referanse til de følgende eksempler.

Eksempler

Eksempel 1: Kloning

En SPDV E3E2-sekvens ble oppnådd fra et SAV subtype 3 isolat: en SPDV-infisert Atlanterhavslaks ble innsamlet fra et akvakulturanlegg i Norge (Mølsvik). Fra dens hjertevev ble et totalt RNA-ekstrakt fremstilt ved anvendelse av et “Absolutely RNA miniprep kit” (Stratagene), i henhold til produsentens instruksjoner. Fra cDNA fremstilt, ble den totale E3E2-kodende regionen amplifisert med RT-PCR primere. Primerene anvendt var:

For revers transkripsjon ble den følgende primeren anvendt:

RTE2: 5’- CCGCGCGAGCCCCTGGTATGCAACACAGTGC -3’ (SEKV ID NR: 11)

Deretter ble høy nøyaktighets PCR-amplifisering utført, ved anvendelse av pfu turbo polymerase (Stratagene), med primer-settet:

RT-E2 XhoI: 5’- ATACCAGGGGCTCGCGCCTCGAGACCCTACTTG -3’ (SEKV ID NR: 12)

PCR-E3 HindIII: 5’- GATGCCATAAGCTTGACACGCGCTCCGGCCCTC -3’ (SEKV ID NR: 13)

Til slutt ble sekvensen av E3E2-genet bestemt ved sekvensering med disse to PCR-primerene og to indre primere:

PD5: 5’- CGTCACTTTCACCAGCGACTCCCAGACG -3’ (SEKV ID NR: 14)

PD3: 5’- GGATCCATTCGGATGTGGCGTTGCTATGG -3’ (SEKV ID NR: 15)

Sekvensering ble utført med Big Dye 3.1 ® (Applied Biosystems), i henhold til produsentens instruksjoner.

Den fullstendige nukleotidsekvensen av den E2-kodende regionen fra Mølsvik SAV-isolatet vil bli publisert under aksesjonsnummer DQ 195447, men for oppfinnelsen er alle relevante sekvenser angitt her.

Straks det var verifisert ved sekvensering, ble E3E2 PCR-produktet kløyvet natten over med restriksjonsenzymene XhoI og HindIII og klonet i de korresponderende unike setene av pET30a(+)-vektor (Novagen) hvilket fører til konstruksjonen pET30a/E3E2.

Subkloning av regioner avledet fra SAV E2:

Fra Mølsvik SAV E2-sekvensen, ble forskjellige kortere sekvenser oppnådd ved anvendelse av en subkloningsstrategi, hvor PCR av et sett av primere som hybridiserer ved forskjellige posisjoner på E2-genet ble anvendt. PCR-primerene anvendt for å amplifisere fragmenter av den SAV E2-kodende regionen (ved anvendelse av konstruksjonen pET30a/E3E2 som templat) er listet opp i Tabell 3 og ble utformet som følger:

- foroverprimere start med 3-5 tilfeldige A eller T nukleotider, fulgt av et NdeI restriksjonssete. Deretter kommer 16 til 20 matchende nukleotider, lengden er optimalisert avhengig av den spesifikke lokale sekvensen og valgt til å starte PCR-fragmentet ved et ønsket nukleotid. Primere er 24 til 30 nukleotider totalt. - reversprimere omfatter også 3 - 5 tilfeldige nukleotider, men blir fulgt av et NcoI restriksjonssete og deretter 16-20 spesifikke nukleotider.

Tabell 3: Primere anvendt her, for fremstilling av fragmenter av SAV E2.

Fragmenter fremstilt ved PCR ble kløyvet natten over med NdeI og NcoI og klonet inn i pET30a(+) bakterielle ekspresjonsplasmider (Novagen).

Fordi NdeI-restriksjonssetet omfatter et ATG startkodon, startet ekspresjon ved dette Metionin.

Klonede sekvenser ble verifisert ved DNA-sekvensering ved anvendelse av standard pET-T7 promoter-primeren: 5’- AATACGACTCACTATAGGG -3’ (SEKV ID NR: 25) og standard T7 terminator-primer: 5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG -3’ (SEKV ID NR: 26) for å oppnå overlappende sammenhengende sekvenser som dekker hele den klonede sekvensen.

Subklonede fragmenter av SAV E2 ble uttrykt i E. coli og proteinfragmentene produsert ble anvendt i in vivo og in vitro-forsøk for å undersøke SAV E2 VN-epitopen ifølge oppfinnelsen.

Rekombinante proteiner ble også uttrykt som fusjonsproteiner ved anvendelse av pET30a(+)-plasmidene, ved å klone disse i ramme med et 6x Hismerke eller et ß-gal-gen (LacZ), insertert i et pET30a(+)-plamid.

For å konstruere pET30a/LacZ-vektoren, ble lacZ-genet inneholdt i vektoren pVAX1/LacZ (Invitrogen) amplifisert ved PCR ved anvendelse av primerene:

LacZ'_NcoI: 5’- GTATGCCCATGGAACGTCGTTTTACAACGTCGTG -3’

SEKV ID NR: 27 LacZ'_XhoI: 5’- GTCTCGCTCGAGTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG -3’ SEKV ID NR: 28

Etter kløyving over natten med NcoI og XhoI, ble det kløyvede PCR-produktet klonet inn i de korresponderende restriksjonssetene i pET30a(+) plasmidet. Kløyving av denne pET30a/LacZ-konstruksjonen med NdeI/NcoI tillot insersjon i leseramme av de beskrevne E2-subfragmentene kløyvet med NdeI/NcoI.

Eksempel 2: Ekspresjon

Ekspresjon av de forskjellige E2-fragmentene ble utført i BL21 Rosetta 2 E. coliceller.

pET3a-plasmidene inneholdende de forskjellige E2 gen-fragmentene ble anvendt for å transformere Rosetta 2-celler (Novagen), i henhold til leverandørens instruksjoner. En over natten for-kultur (20 ml) av transformert E. coli, ble anvendt dagen etter til å inokulere 800 ml kulturer med 5 ml for-kultur. Når OD600 var på omtrent 0,7, så ble IPTG tilsatt til 1 mM endelig konsentrasjon for induksjon av ekspresjon. Dette ble dyrket i ytterligere 2 timer. Deretter ble kulturer sentrifugert ved 7000 rpm i 5 min og bakteriecelle-pellet ble holdt ved -80 °C inntil anvendelse.

Rensing:

For å rense inklusjonslegemene ble to buffere anvendt:

buffer A = 50 mM tris/HCl pH8,00 2 mM EDTA

buffer B = buffer A 1 % (endelig konsentrasjon) Triton X-100

Deretter, for cellepelleten fra en 800 ml kultur: cellepelleten ble resuspendert i 50 ml buffer A og tilsatt nyfremstilt lysozym (fra en stock ved 10 mg/ml) til en endelig konsentrasjon på 100 µg/ml.25 ml buffer B ble deretter tilsatt og 10 µl Benzonase ® (MERCK). Dette ble inkubert ved 30 °C i 15 min. med forsiktig risting for fjerning av DNA.

Deretter ble 100 ml buffer B tilsatt og blandingen ble sonikert i 4 x 30 sekunder. Den sonikerte blandingen ble sentrifugert ved 12,000 xg i 20 min. ved 4°C. Inklusjonslegeme-pelleten ble vasket med 250 ml buffer B og med 200 ml PBS. Til slutt ble pelleten inneholdende rek E2 protein-fragmentene resuspendert i 40 ml (4x10 ml) PBS og holdt ved -80°C inntil anvendelse.

Rekombinant E. coli-proteiner ble kvantifisert ved scanning og analyse av prøver kjørt på SDS-PAA-geler som var blitt merket med Coomassie bb., i relasjon til brønner med markørprotein, i henhold til standardprosedyrer.

Eksempel 3: Testing og anvendelse

Monoklonalt antistoff:

For testing av de rekombinante SAV E2 protein-fragmentene, ble et SAV-nøytraliserende monoklonalt antistoff anvendt. Dette hadde blitt produsert ved immunisering av Balb/c-mus med 10<10>SAV virusstamme S49P i Freund’s complete adjuvans, oppnådd fra en polyetylenglykol-konsentrert CHSE-214 cellekultursupernatant. Booster injeksjoner ble gitt, med Freund’s incomplete adjuvans og uten adjuvans, ved anvendelse av standardteknikker. Mus miltceller ble fusjonert med Sp2O tumorceller og resulterende hybridomer ble selektert i HAT-medium. Monoklonale antistoffer (Mab’s) produsert ble selektert for binding til SAV-virus på SAV-infiserte CHSE-214-celler ved immunfluorescens ved anvendelse av standardteknikker. Positive ble testet i et virusnøytraliseringsforsøk. Hybridomcellene som produserer VN-positive Mab’s ble skalert opp ved å fremstille ascites i mus ved anvendelse av standardmetoder.

Immunfluorescensanalyse (IFA):

IFA ble utført på SAV-infiserte CHSE-214-celler og på pET plasmid-transfektert E. coli-celler som uttrykker det rekombinante proteinet av interesse, med passende positive og negative kontroller. Celler ble fiksert i etanol 96%:aceton 1:1 ved -20 °C i 30 minutter og skyllet 3 ganger med PBST (PBS 1x 0,05% Tween 20. Det primære antistoffet, fortynnet i PBST ble tilsatt og inkubert 1 time ved romtemperatur. Deretter ble plater skyllet med PBST og det andre antistoffet ble applisert: et FITC-konjugert anti-mus antistoff. Etter inkubering og vasking, ble hver brønn scoret gjennom observasjon med et immunfluorescensmikroskop med passende UV-lysfilter. De infiserte cellene som reagerer positivt med det primære antistoffet fremsto fluorescerende.

Immunoblotting:

For Western blotting ble prøver kjørt på 10 % SDS/PAA-geler (NuPAGE ®, Novex) og blottet på nitrocellulose i henhold til produsentens instruksjoner. For dot blot ble 5 µl prøver spottet på membraner direkte med en pipette og fikk tørke i 5-10 minutter. Deretter ble membranen blokkert med Tris-bufret saltoppløsning 0,05 % Tween 20 (TBST) 5% skummet melk, O/N ved 4°C. Membranen blir inkubert med det primære antistoffet, fortynnet til passende konsentrasjon i TBST+1% skummet melk, i 1 time ved romtemperatur. Deretter blir membranen etter 3 vaskinger i TBST, inkubert med det sekundære antistoffet, en alkalisk fosfatase-konjugert Geit anti-mus IgG i TBST. Etter vasking med TBST ble alkalisk fosfatase fargereaksjon utført med Alkalisk Fosfatase Konjugat Substrat Kit i henhold til produsentens instruksjoner (BioRad). Reaksjon ble stanset med destillert vann, membraner ble tørket og kvantifisert.

Resultater av immunoblotting med polypeptidene og proteinene ifølge oppfinnelsen er presentert i Figurene 5 og 6:

Figur 5 viser et dot blot av forskjellige polypeptider og proteiner ifølge oppfinnelsen, merket med en SAV-nøytraliserende monoklonal.

Positiv gjenkjennelse ble funnet for:

- den positive kontrollen, fullengde SAV E2-protein,

- polypeptidene F1R1, F1R2, F1R3 og F2R3*

Negativ respons ble detektert for:

- den negative kontrollen SAV E1-protein

- polypeptidene F1R4 og F3R3

Dette forholdet av positive og negative ble observert både når prøvene hadde blitt denaturert i en prøvebuffer inneholdende ß-merkaptoetanol og ditiotreitol og ble kokt før spotting (øvre panel), og når prøvene ble tatt opp i en ikke-denaturerende prøvebuffer og ikke ble kokt (nedre panel).

Figur 6 viser et Western blot av et polypeptid ifølge oppfinnelsen fremstilt med primerene F1 og R3, hvilket følgelig dekker området av SAV E2 fra aa 139-290; og av et protein ifølge oppfinnelsen, SAV E2-fragmentet fremstilt med primerne F2 og R3, som følgelig strekker seg over aa 158-252, i en fusjonskonstruksjon med ß-gal protein. Blotet ble inkubert med en SAV-nøytraliserende Mab og mange spesifikke bånd ble detektert.

Bånd detektert i F1R3-brønnene er ved 22 og 44 kDa, sannsynligvis en monomer og en dimer form av polypeptidet.

NB: selv om den beregnede vekten av polypeptidet kun er 15 kDa, går dette bandet langsommere på gelen, mest sannsynlig på grunn av tilstedeværelsen av disulfidbroer som ikke var fullstendig denaturert i prøvepreparatet.

F2R3-ßgal-brønnene viser et band på omtrent 126 kDa, som representerer fusjonsproteinet av F2R3 (10 kDa) og ß-gal (116 kDa).

VN analyse:

Like volumer av en fortynning av det SAV-nøytraliserende Mab og av 100 TCID50 av en SAV-prøve i EMEM dyrkningsmedium med 2% serum, ble blandet i en mikro titrerings plate og inkubert 2 timer ved 20°C. SAV-isolater fra alle subtypene ble anvendt i VN forsøk (F93-125 [subtype 1], S49P [2] og PD03-08 [3]). Deretter ble CHSE-214-celler i EMEM dyrkningsmedium med 5% serum tilsatt til en tetthet på 2,5x10<5>/ml. Platene ble inkubert i CO2-inkubatorer i 5-7 dager ved 15 °C.

Etter 5-7 dager ble platene avlest ved lysmikroskopi, som identifiserer celler med cytopatisk effekt (cpe), som indikerer fortynningen av Mab som ikke er i stand til å fullstendig nøutralisere test-viruset. Cpe var positiv når klumper av celler ble observert som var blitt avrundet og var mer lysbrytende.

Alternativt ble celler fiksert i etanol/aceton, skyllet med PBST og merket i IFA som beskrevet, mens det ble anvendt som primært antiserum, et polyklonalt kanin antiserum fremkalt mot SPDV E1-protein (serum AB06).

I et typisk forsøk viste resultatene av en VN test på F93-195 og PD03-08, avlest ved cpe fullstendig viral nøytralisering ved de SAV-nøytraliserende Mab ascites opptil en fortynning på 32,000. Dette ble bekreftet ved IFA.

Dyreforsøk:

I et dyreforsøk ble juvenil atlanterhavslaks vaksinert med proteiner ifølge oppfinnelsen. Proteiner anvendt var F2R3 fusjonert med ß-gal og F1R3 fusjonert med et 6x Histidin-merke. I korthet:

proteiner ble uttrykt i E. coli og renset som beskrevet. Protein ble formulert til 30 % vann-i-olje emulsjon med Montanide ISA 763A. Dyr ble vaksinert med 150 µg/dose og boostret med 100 µg/dose. Positiv kontroll var den kommersielle inaktiverte SPDV-vaksinen Norvax ® Compakt PD. Negative kontroller var: saltoppløsning, emulsjon uten protein og ß-gal uten fusjon.

Testdyr var atlanterhavslaks smolt på circa 40 gram, som ble akklimatisert i test-området 1 uke og deretter ble vaksinert intra-peritonealt ved anvendelse av standard metode. Vanlig blodprøvetaking ble anvendt. Etter 5 uker mottok fisken booster vaksinasjonen og etter ytterligere 3 uker vil fisken bli utsatt for provokasjon ved anvendelse av en dose på 10<3>TCID50/dyr av PD03-08 (SAV subtype 3).

Beskyttende evne vil bli scoret ved å analysere kliniske tegn på sykdom, serologi, total patologi og histologi.

Antistoff Elisa:

En Elisa-test ble satt opp, for å detektere anti-SAV antistoffer i lakseserum.

Generell fremgangsmåte var som beskrevet ovenfor; i korthet: en SAV-nøytraliserende Mab ble belagt på mikrotitrerings brønner, inkubert med en standard SPDV-prøve og vasket. Lakseserum ble applisert i PBST 1 % skummet melk, i en seriefortynning in duplo. Passende positive og negative kontroller ble applisert. Inkubering var natten over ved 4 °C. Deretter ble platene vasket og inkubert med et kanin polyklonalt anti-laks serum. Til slutt blir et tredje antistoff inkubert: geit anti-kanin, konjugert til HRP. Til slutt ble kolorimetrisk deteksjon utført ved anvendelse av et HRPsubstrat og H2O2, i henhold til produsentens instruksjoner.

Typisk kunne SAV-antistoffer detekteres med god spesifisitet og sensitivitet i sera fra SPDV-infisert laks.

Forklaring til figurene:

Figur 1:

Grafisk representasjon av lengden og posisjonen av de forskjellige proteinsekvensene beskrevet her, relativt til de tilsvarende regionene av fullengde SAV E2-proteinet.

Figurene 2, 3, 4:

Multippel sammenstilling av regionene av aa 158-252, 139-290 eller 111-304 henholdsvis, fra mange SAV E2-proteiner. Oppføringer er identifisert ved aksesjonsnummer og er beskrevet i Tabell 1. Referansestamme er SPDV-isolat N3 (aksesjon nr: AAU01400,1). Konsensus-sekvensen fra den multiple sammenstillingen av disse regionene er lik SEKV ID NR: 4, 5 eller 6.

Tall over sekvensene indikerer antall aminosyrene svarende til SAV E2; tall under konsensus-sekvensene indikerer den totale lengden av polypeptidene.

Figur 5:

Dot blot av mange polypeptider og proteiner, merket med et SAV-nøytraliserende monoklonalt antistoff. Øvre panel: denaturerte prøver, nedre panel: ikke-denaturert.

Figur 6:

Western blot av polypeptid F1R3 og av protein F2R3-ßgal, merket med et SAV-nøytraliserende monoklonalt antistoff.