JP2019512504A - アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原プラットフォーム及びワクチン、並びに腸管毒素原性下痢の治療におけるそれらの使用 - Google Patents

アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原プラットフォーム及びワクチン、並びに腸管毒素原性下痢の治療におけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対するＭＥＦＡ構築物及びワクチンを提供する。また、本開示は、ＥＴＥＣに関連する下痢の発生率を低下させる方法も提供する。本開示により提供される代表的なアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び代表的な主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩは、１以上のアドヘシン先端、アドヘシンサブユニット、または主要構造サブユニットエピトープが組み込まれたアドヘシン先端骨格または主要サブユニットＣＦＡを有する。本開示により提供されたアドヘシン先端ＭＥＦＡ及びＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩは、有利なことに、ＥＴＥＣ分子が腸管に付着するのを防止する。【選択図】なし

Description

本発明は、アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原プラットフォーム及びワクチン、並びに腸管毒素原性下痢の治療におけるそれらの使用に関する。
下痢は、発展途上国に住む５歳未満の子供の死亡の主要な原因であり続けている。腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、子供及び旅行者の下痢の主要な細菌原因である。ＥＴＥＣ細菌は、上皮細胞の宿主レセプターに付着し、小腸内でコロニーを形成することにより、ＥＴＥＣ関連下痢性疾患を引き起こす。そのため、ＥＴＥＣの付着を防ぐことが、ＥＴＥＣ下痢に対する防御の第１段階であると考えられている。しかしながら、ＥＴＥＣ株は２３種類以上の免疫学的に異種のアドヘシンを産生するため、ＥＴＥＣ細菌付着を広範に防御するワクチンを開発することは困難であった。したがって、ＥＴＥＣに対する防御効果を提供する組成物が求められている。また、複数のＥＴＥＣアドヘシンに対する抗体応答を誘導する組成物が求められている。さらに、ＥＴＥＣの付着を阻害する、低減する、またはさらには防止する組成物が求められている。
本開示は、ＭＥＦＡ（マルチエピトープ融合抗原）アプローチを適用して、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、または他のＥＴＥＣアドヘシンのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープを組み込み、主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ（ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩ）のＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの主要構造サブユニット由来の代表的なアドヘシン先端ＭＥＦＡペプチド（先端ＭＥＦＡ−１、先端ＭＥＦＡ−ＩＩ）またはエピトープを構築することによって、従来技術に内在する問題を解決する。また、各先端ＭＥＦＡまたはＣＦＡ ＭＥＦＡの抗原性をマウス免疫実験で試験し、ＥＴＥＣワクチン開発の潜在的用途について評価した。試験結果のデータは、ＥＴＥＣアドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉで腹腔内免疫されたマウスが、９つのＥＴＥＣアドヘシン（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１−ＣＳ６、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ）の全てに対してＩｇＧ抗体応答を生成したことを示した。さらに、上記の９つのアドヘシンを発現するＥＴＥＣ及び大腸菌は、免疫化マウスの血清と共にインキュベート（培養）した後、Ｃａｃｏ−２細胞に対する付着が有意に減少した。同様に、ＥＴＥＣアドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫されたマウスが、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、及びＥａｅＨの付着に抵抗するＩｇＧ抗体を産生し、主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫されたマウスが、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの付着に抵抗するＩｇＧ抗体を産生した。これらの結果は、アドヘシン先端ＭＥＦＡまたはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡにより誘導された抗アドヘシン抗体が、最も重要なＥＴＥＣアドヘシンの付着を阻害したことを示す。このことは、多価の先端ＭＥＦＡ−Ｉ、先端ＭＥＦＡ−ＩＩ、及びＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩが、ＥＴＥＣ下痢に対して広範に防御する抗アドヘシンワクチンの開発において有用であることを示唆する。
したがって、本開示は、ＭＥＦＡ（マルチエピトープ融合抗原）アプローチを用いて、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ２１、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＥａｅＨ、及びＥｔｐＡアドヘシンのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープを組み込み、少なくとも１つのアドヘシン先端ＭＥＦＡペプチドを構築する。試験結果のデータは、アドヘシン先端ＭＥＦＡで腹腔内または皮下免疫されたマウスが、代表的なＥＴＥＣアドヘシンの全てに対してＩｇＧ抗体応答を生成したことを示した。さらに、上記のアドヘシンを発現するＥＴＥＣ及び大腸菌は、免疫化マウスの血清と共にインキュベートした後、Ｃａｃｏ−２細胞に対する付着が有意に減少した。このＭＥＦＡアプローチはまた、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの主要構造サブユニット由来のエピトープを、ＣＦＡ主要構造サブユニットＭＥＦＡ（ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩ）に組み込むのにも用いられた。また、このＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩの免疫原性をマウス免疫実験で試験した。試験結果のデータは、免疫化マウスが、８つの標的アドヘシンの各々に対して強力なＩｇＧ抗体を産生したことを示した。さらに、誘導された抗体により、上記の８つのアドヘシンの各々を発現するＥＴＥＣ株のＣａｃｏ−２細胞に対する付着が有意に減少した。これらの結果は、各アドヘシン先端ＭＥＦＡまたはＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩにより誘導された抗アドヘシン抗体が、最も重要なＥＴＥＣアドヘシンの付着を阻害したことを示す。このことは、多価の先端ＭＥＦＡ（先端ＭＥＦＡ−１、先端ＭＥＦＡ−ＩＩ）または主要構造サブユニットＭＥＦＡ（ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩ）が、ＥＴＥＣ下痢に対して広範に防御する抗アドヘシンワクチンの開発において有用であることを示唆する。「ＭＥＦＡ」は、アドヘシン先端及び主要構造サブユニットＭＥＦＡの両方を指し、かつそれらを包含する。
本開示は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）のアドヘシン先端、付着サブユニット、または主要構造サブユニット由来のエピトープが組み込まれたコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ）由来のポリペプチド骨格をコードするヌクレオチドフラグメントを含む、少なくとも３つ、好ましくは４つ、より好ましくは５つ、さらに好ましくは６つ、さらにより好ましくは７つ、さらにより好ましくは８つ以上のマルチエピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）を提供する。一実施形態では、ＥＴＥＣのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープは、好ましくは、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、ＥａｅＨ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一実施形態では、ＭＥＦＡに存在するＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの主要構造サブユニット由来のＭＥＦＡに存在する各エピトープの単一または複数の複製が存在し得る。
さらなる態様では、本開示は、ＥＴＥＣのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープが組み込まれたコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ）由来のポリペプチド骨格をコードするヌクレオチドを含むアドヘシン先端ＭＥＦＡを提供する。エピトープが結合される骨格は、これに限定しないが、好ましくは、ＣｆａＥ、ＣＳ１４、またはＣＳ２１から選択される。本開示はまた、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨのＥＴＥＣアドヘシンのアドヘシン主要構造サブユニット由来のエピトープが組み込まれたコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ）由来のポリペプチド骨格をコードするヌクレオチドを構成するアドヘシン主要構造サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩを提供する。
本明細書に開示したアドヘシン先端または主要サブユニットＭＥＦＡは、追加要素をさらに含み得る。そのような追加要素は、これに限定しないが、易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）のアドヘシン由来エピトープ、コレラのエピトープ、ロタウイルスのエピトープ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。本開示の所与のアドヘシン先端ＭＥＦＡには、ＬＴ及び／またはＳＴａの１以上の複製が存在し得る。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子をコードする核酸分子を提供する。
さらに、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子と、薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、担体、及びそれらの任意の組み合わせとを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を提供する。
さらなる態様では、本開示は、ＥＴＥＣに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、この方法は、これに限定しないが、本明細書に記載された１以上のポリペプチドを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。
さらに別の態様では、本開示は、ＥＴＥＣ感染の臨床症状の重症度または発生率を低減する方法を提供する。ＥＴＥＣ感染の臨床症状を低減するこの方法は、これに限定しないが、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。重症度または発生率の低減は、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡの投与を受けていない動物またはヒト、または動物またはヒトの群と比較した場合である。
本開示の別の態様は、下痢を治療する、あるいは下痢の発生率または重症度を低減する方法を含む。この方法は、好ましくは、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。下痢の治療、あるいは下痢の発生率または重症度の低減は、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡの投与を受けていない動物またはヒト、または動物またはヒトの群と比較した場合である。
また、本開示は、ＥＴＥＣ細菌の腸管への付着を減少させる方法を提供する。この方法は、好ましくは、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。ＥＴＥＣ細菌の腸管への付着の減少は、本開示の１以上のポリペプチド及び／またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ及び／またはＣＦＡ主要サブユニットＭＥＦＡの投与を受けていない動物またはヒト、または動物またはヒトの群と比較した場合である。
本明細書で説明される図面は、説明のみを目的としており、本教示の範囲をいかようにも限定することを意図していない。
図１は、構築されたＥＴＥＣアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質の概略図である。各アドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープのアミノ酸配列を上側のパネルに示す。左下のパネルは、マウス抗ＣＦＡ／Ｉ抗血清を用いたウエスタンブロットの結果を示し、９４５０はアドヘシン先端ＭＥＦＡタンパク質（２５μｌ及び３０μｌ）を示し、（−）はＢＬ２１大腸菌由来の全タンパク質を示す。右下のパネルは、再折り畳みした可溶化アドヘシン先端ＭＥＦＡタンパク質のクマシーブルー染色を示す（レーン１：タンパク質マーカー、レーン２：２５μｌの先端ＭＥＦＡタンパク質、レーン３：３０μｌの先端ＭＥＦＡタンパク質）。 図２は、先端ＭＥＦＡ−１で免疫したマウス由来の抗ＣｆａＥ（ＣＦＡ／Ｉ）、抗ＣｏｏＤ（ＣＳ１）、抗ＣｏｔＤ（ＣＳ２）、抗ＣｓｔＨ（ＣＳ３）、抗ＣｓａＥ（ＣＳ４）、抗ＣｓｆＤ（ＣＳ５）、抗ＣｓｓＢ（ＣＳ６）、抗ＬｎｇＡ（ＣＳ２１）、及び抗ＥｔｐＡ（ＥｔｐＡ）の血清ＩｇＧ抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフである。黒ドットは、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質で腹腔内免疫されたマウスの力価を示す。各ドットは個々のマウスのＩｇＧ力価を示す。バーは、各アドヘシンに対して特異的なグループの平均力価を示す。 図３は、アドヘシン相互作用を示す宿主細胞及び細菌細胞を示す図である。 図４は、ＣＳ１４アドヘシン先端サブユニットＣｓｕＤを骨格として有し、２つのＣｓｕＤエピトープを保持し、かつ、４つのエピトープがＣＳ１２（ＣｓｗＦ）、ＣＳ１７（ＣｓｂＤ）、ＣＳ１９（ＣｓｄＤ）、及びＥａｅＨアドヘシンの先端サブユニット由来のエピトープで置換された、アドヘシンＭＥＦＡ−１の遺伝子構造を示す図である。 図５は、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩタンパク質で皮下免疫されたマウス由来の抗ＣＳ１２、抗ＣＳ１４、抗ＣＳ１７、抗ＣＳ１９、及び抗ＥａｅＨ ＩｇＧ抗体の血清ＩｇＧ抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフであり、各ドットは個々のマウスのＩｇＧ力価を示し、バーは平均力価を示す。 図６は、ＣＳ２１主要サブユニットＬｎｇＡを骨格として有し、ＬｎｇＡの表面が露出しており、かつ、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ１９、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの主要サブユニット由来のエピトープを有する、主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩの遺伝子構造を示す図である。 図７は、主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩで皮下免疫されたマウス由来の抗ＣＳ７、抗ＣＳ１２、抗ＣＳ１４、抗ＣＳ１７、抗ＣＳ１９、抗ＣＳ２１、抗ＥａｅＨ、及び抗ＥｔｐＡの血清ＩｇＧ抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフであり、各ドットは個々のマウスのＩｇＧ力価を示し、バーは平均力価を示す。 図８は、本開示のＭＥＦＡを示す図であり、エピトープが骨格内に組み込まれていることを示す。
本開示は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ：Enterotoxigenic Escherichia coli）のアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープを有するポリペプチドを含むマルチエピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ：Multi Epitope Fusion Antigen）を提供する。一実施形態では、ＥＴＥＣのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープは、好ましくは、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、ＥａｅＨ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。一実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２種類のエピトープ、少なくとも３種類のエピトープ、少なくとも４種類のエピトープ、少なくとも５種類のエピトープ、少なくとも６種類のエピトープ、少なくとも７種類のエピトープ、少なくとも８種類のエピトープ、少なくとも９種類のエピトープ、少なくとも１０種類のエピトープ、少なくとも１１種類のエピトープ、少なくとも１２種類のエピトープ、少なくとも１３種類のエピトープ、少なくとも１４種類のエピトープ、または、少なくとも１５種類のエピトープを含む。
本開示の目的のためのＣＳ１エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ１ゲノムは、好ましくは、配列番号４７をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ１エピトープヌクレオチド配列は、配列番号３または配列番号４から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号５５である。別の実施形態では、ＣＳ１エピトープヌクレオチド配列は、配列番号３または配列番号４から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ１エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ１由来のエピトープは、配列番号３７をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ２エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ２ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ２ゲノムは、好ましくは、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ２エピトープヌクレオチド配列は、配列番号５または配列番号６から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号５６である。別の実施形態では、ＣＳ２エピトープは、配列番号５または配列番号６から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ２エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ２由来のエピトープは、配列番号４２をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ３エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ３ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ３ゲノムは、好ましくは、配列番号４９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ３エピトープヌクレオチド配列は、配列番号７または配列番号８から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号５７である。別の実施形態では、ＣＳ３エピトープは、配列番号７または配列番号８から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ３エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ３由来のエピトープは、配列番号３６をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ４エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ４ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ４ゲノムは、好ましくは、配列番号５０をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号５０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ４エピトープヌクレオチド配列は、配列番号９または配列番号１０から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号５８である。別の実施形態では、ＣＳ４エピトープは、配列番号９または配列番号１０から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ４エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ４由来のエピトープは、配列番号４１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ５エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ５ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ５ゲノムは、好ましくは、配列番号５１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号５１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ５エピトープヌクレオチド配列は、配列番号１１または配列番号１２から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号５９である。別の実施形態では、ＣＳ５エピトープは、配列番号１１または配列番号１２から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ５エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ５由来のエピトープは、配列番号３５をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ６エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ６ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ６ゲノムは、好ましくは、配列番号５２をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号５２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ６エピトープヌクレオチド配列は、配列番号１５または配列番号１６から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号６０、あるいは、配列番号６０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。
別の実施形態では、ＣＳ６エピトープは、配列番号１３または配列番号１４から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ６エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ６由来のエピトープは、配列番号３８をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ２１エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ２１ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＣＳ２１ゲノムは、好ましくは、配列番号５３をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＣＳ２１エピトープヌクレオチド配列は、配列番号１５または配列番号１６から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号６１である。別の実施形態では、ＣＳ２１エピトープは、配列番号１５または配列番号１６から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ２１エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＣＳ２１由来のエピトープは、配列番号３９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＥｔｐＡエピトープは、ＥＴＥＣ由来のＥｔｐＡゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。ＥｔｐＡゲノムは、好ましくは、配列番号２をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する任意の配列である。一実施形態では、ＥｔｐＡエピトープヌクレオチド配列は、配列番号１７または配列番号３４から選択されたプライマーから生成される。このような好ましいヌクレオチド配列の１つは、配列番号６２である。別の実施形態では、ＥｔｐＡエピトープは、配列番号１７または配列番号３４から選択されたプライマーから生成した配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＥｔｐＡエピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。一実施形態では、ＥｔｐＡ由来のエピトープは、配列番号４０をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ７エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ７ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ７エピトープは、配列番号２２をコードするヌクレオチド配列、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号６８をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ７エピトープは、配列番号２２をコードするヌクレオチド配列、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号６８をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ７エピトープは、配列番号２２、配列番号２９、あるいは、配列番号６８をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ７エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
本開示の目的のためのＣＳ１２エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１２ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１２エピトープは、配列番号２４をコードするヌクレオチド配列、配列番号３０をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号６９をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１２エピトープは、配列番号２４をコードするヌクレオチド配列、配列番号３０をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号６９をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１２エピトープは、配列番号２４、配列番号３０、あるいは、配列番号６９をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ１２エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
本開示の目的のためのＣＳ１４エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１４ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１４エピトープは、配列番号２１をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列、配列番号２６をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７０をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１４エピトープは、配列番号２１をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７０をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１４エピトープは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２６、あるいは、配列番号７０をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ１４エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
本開示の目的のためのＣＳ１７エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１７ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１７エピトープは、配列番号２５をコードするヌクレオチド配列、配列番号３１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７１をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１７エピトープは、配列番号２５をコードするヌクレオチド配列、配列番号３１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７１をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１７エピトープは、配列番号２５、配列番号３１、あるいは、配列番号７１をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ１７エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
本開示の目的のためのＣＳ１９エピトープは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１９ゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１９エピトープは、配列番号２７をコードするヌクレオチド配列、配列番号３２をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７２をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１９エピトープは、配列番号２７をコードするヌクレオチド配列、配列番号３２をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７２をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１９エピトープは、配列番号２７、配列番号３２、あるいは、配列番号７２をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＣＳ１９エピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
本開示の目的のためのＥａｅＨエピトープは、ＥＴＥＣ由来のＥａｅＨゲノムに関連するヌクレオチド配列によってコードされた任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＥａｅＨエピトープは、配列番号２８をコードするヌクレオチド配列、配列番号３３をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７３をコードするヌクレオチド配列から選択される。別の実施形態では、ＥａｅＨエピトープは、配列番号２８をコードするヌクレオチド配列、配列番号３３をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号７３をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＥａｅＨエピトープは、配列番号２８、配列番号３３、あるいは、配列番号７３をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。好ましくは、ＥａｅＨエピトープは、アドヘシン先端または付着サブユニットである。
さらなる態様では、本開示は、アドヘシン先端ＭＥＦＡであって、ＥＴＥＣのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープをコードするポリペプチドを含み、そのポリペプチドが、上記のエピトープが結合されるコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ：colonization factor antigen）骨格をコードする、該アドヘシン先端ＭＥＦＡを提供する。骨格は、好ましくは、これに限定しないが、ＣｆａＥ、ＣｆａＡ、ＣｆａＢ、ＣｆａＣ、ＣＳ１４、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。特に好ましい実施形態では、骨格は、ＣｆａＥ、ＣＳ１４、及びＣＳ２１から選択される。
本開示の目的のためのＣｆａＥ骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣｆａＥゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、ＥＴＥＣ由来のＣｆａＥゲノムに関連するヌクレオチド配列から生成された産物、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣｆａＥ骨格は、配列番号１８または配列番号１９のプライマーから生成された配列から選択される。別の実施形態では、ＣｆａＥ骨格は、配列番号１８または配列番号１９のプライマーから生成された配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。いくつかの好適な形態では、ＣｆａＥ骨格は、配列番号４６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する。別の実施形態では、ＣｆａＥ骨格のアミノ酸配列は、配列番号４６である。さらなる実施形態では、ＣｆａＥ骨格は、ＣｆａＥの１以上のエピトープを保持する。このようなＣｆａＥエピトープは、好ましくは、配列番号４３をコードするヌクレオチド配列、配列番号４４をコードするヌクレオチド配列、配列番号４５をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号４３、配列番号４４、または配列番号４５をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
さらなる態様では、本開示は、アドヘシン主要サブユニットＭＥＦＡであって、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨのアドヘシン先端または付着サブユニット由来のエピトープをコードするポリペプチドを含み、そのポリペプチドが、上記のエピトープが結合されるコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ）骨格をコードする、該アドヘシン主要サブユニットＭＥＦＡを提供する。好適な態様では、ＣＳ１２骨格は、２つのエピトープを保持する。
本開示の目的のためのＣＳ１４骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１４ゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいは、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１４ゲノムに関連するヌクレオチド配列から生成された産物、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１４骨格は、配列番号２１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号２１をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１４骨格は、配列番号２１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。さらなる実施形態では、ＣＳ１４骨格は、１以上のエピトープを保持する。このようなＣＳ１４エピトープは、好ましくは、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列、配列番号２６をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号２３または配列番号２６をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ７骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣＳ７ゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ７骨格は、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ７骨格は、配列番号２９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ１２骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１２ゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１２骨格は、配列番号３０をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３０をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１２骨格は、配列番号３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ１７骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１７ゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１７骨格は、配列番号３１をコードするヌクレオチド配列、あるいは、配列番号３１をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１７骨格は、配列番号３１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示の目的のためのＣＳ１９骨格は、ＥＴＥＣ由来のＣＳ１９ゲノムに関連する任意のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、あるいは、それらの任意の断片または部分を含む。一実施形態では、ＣＳ１９骨格は、配列番号３２をコードするヌクレオチド配列、または、配列番号３２をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。別の実施形態では、ＣＳ１９骨格は、配列番号３２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列から選択される。
本開示のアドヘシン先端ＭＥＦＡは、追加要素であって、これに限定しないが、易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）のアドヘシン由来エピトープ、コレラのエピトープ、ロタウイルスのエピトープ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、該追加要素をさらに含む。一実施形態では、易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、またはそれらの任意の組み合わせの１以上の複製が存在し得る。
本発明の目的のために、本開示アドヘシン先端ＭＥＦＡは、ＥＴＥＣ由来の少なくとも１つのエピトープが挿入された、ＥＴＥＣ由来のコロニー形成因子抗原（ＣＦＡ）の骨格をコードする任意のヌクレオチドから構成され得る。このようなアドヘシン先端ＭＥＦＡの１つの非限定的な例は、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号２０のアミノ酸配列である。なお、本開示は、これに限定されるものではなく、当業者であれば理解できるように、様々な組み合わせが可能である。一実施形態では、本開示の完全アドヘシン先端ＭＥＦＡは、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列である。別の実施形態では、本開示の完全アドヘシン先端ＭＥＦＡは、配列番号６３のヌクレオチド配列または配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列である。別の実施形態では、本開示の完全アドヘシン先端ＭＥＦＡは、配列番号６５のヌクレオチド配列または配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性または配列相同性を有する配列である。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子をコードする核酸分子を提供する。
さらに、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、好ましくは、これに限定しないが、大腸菌、サルモネラ、またはそれらの組み合わせから選択される。
本開示の目的のために好適に使用される大腸菌は、これに限定しないが、Ｈ１０４０７、ＴＨＫ／３８／ｐＥＵ４０５、ＤＨ５α／ｐＥＵ５８８、Ｅ１１６（Ｅ１９４４６）、Ｅ１０６（Ｅ１１８８１／９）、ＵＭ７５６８８、ＪＦ２４２３ ＥＴＰ９８０６６、ＪＦ２１０１、ＪＦ２３１８ ＥＴＰ０５０００８、ＣＦＡ／Ｉノックアウト、９５７３、９４７４、９４７５、９５０５、９５０４、９５３３、９５０６、９４６８、９５０７、９４５０、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されたポリペプチド分子をコードする１以上のアドヘシン先端ＭＥＦＡと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を提供する。１以上のポリペプチド分子は、互いに同一のポリペプチドの複数の複製、または互いに異なる構造を有する複数のポリペプチドであり得る。本開示の免疫原性組成物またはワクチン中に含まれるポリペプチド分子をコードするアドヘシン先端ＭＥＦＡの様々な組み合わせが存在することを理解されたい。
一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物またはワクチンは、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ２１、及びＥｔｐＡのエピトープを有する骨格、好ましくはＣｆａＥ骨格をコードするポリペプチドを含むアドヘシン先端ＭＥＦＡを含む。
さらなる実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物またはワクチンは、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１７、ＣＳ１４、ＣＳ１９、及びＥａｅＨのエピトープを有する骨格、好ましくはＣＳ１４骨格をコードするポリペプチドを含むアドヘシン先端ＭＥＦＡを含む。
さらに別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物またはワクチンは、２つのアドヘシン先端ＭＥＦＡを含む。互いに異なるエピトープを有する複数の骨格の任意の組み合わせが、本開示において考えられることを理解されたい。１つの好ましい実施形態では、第１のアドヘシン先端ＭＥＦＡが、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ２１、及びＥｔｐＡのエピトープを有するＣｆａＥ骨格をコードするポリペプチドを含み、第２のアドヘシン先端ＭＥＦＡが、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１７、ＣＳ１４、ＣＳ１９、及びＥａｅＨのエピトープを有するＣＳ１４骨格をコードするポリペプチドを含む。
本開示の免疫原性組成物は、防腐剤、安定剤、担体、アジュバント、及び／または医薬品ビヒクルをさらに含み得る。本明細書で使用するとき、「アジュバント（補助剤）」は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サボニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、ケンブリッジ・バイオテック社（Cambridge Biotech Inc.）製）、ＧＰＩ−０１００（米国アラバマ州バーミンガム、ガレニカ・ファーマスーティカルズ社（Galenica Pharmaceuticals, Inc.）製）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含むことができる。エマルジョンは、特に、軽質液状パラフィン油（欧州薬局タイプ）、イソプレノイド油（例えばスクアランまたはスクアレンなど）、アルケン（特にイソブテンまたはデセン）のオリゴマー化により得られる油、直鎖アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル（より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリラート／カプラート）、グリセリルトリ（カプリラート／カプラート）、またはプロピレングリコールジオレアート）、分枝鎖脂肪酸またはアルコールのエステル（とりわけイソステアリン酸エステル）、に基づくことができる。これらの油を乳化剤と組み合わせて使用することにより、エマルジョンが形成される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、とりわけ、ソルビタン、マンニド（例えばアンヒドロマンニトールオレアート）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、またはヒドロキシステアリン酸（これらは任意選択でエトキシル化される）とのエステル、並びに、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンコポリマーブロック、とりわけプルロニック社の製品（特にＬ１２１）である。「Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)」を参照されたい。
例えば、「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995」の１４７ページに記載されているＳＰＴエマルジョン及び同書の１８３ページに記載されているエマルジョンＭＦ５９が使用可能である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、または、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。好適なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーと呼ばれている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者であれば、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置換されたポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許第２，９０９，４６２号明細書も参照することができる。好ましいラジカルは、２ないし４個の炭素原子を含有するラジカルであり、例えば。ビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体が、他の置換基、例えばメチルを含有し得る。カルボポル（米国オハイオ州、ＢＦグッドリッチ（BF Goodrich）社製）という名称で販売されている製品が特に好適である。カルボポル（Carbopol）は、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。その中では、カルボポル９７４Ｐ、カルボポル９３４Ｐ、及びカルボポル９７１Ｐが好適である。カルボポル９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーの中では、無水マレイン酸及びエチレンのコポリマーであるコポリマーＥＭＡ（モンサント（Monsanto）社製）が好適である。これらのポリマーを水に溶解させると酸性液が生じるが、その酸性液は、アジュバント溶液に免疫原性、免疫学的、またはワクチン組成物を組み込むために、生理学的なｐＨに中和することが好ましい。
さらなる適切なアジュバントには、これに限定しないが、ＲＩＢＩアジュバントシステム（リビ（Ribi）社製）、ブロックコポリマー（米国ジョージア州アトランタ、サイトレックス（SytRx）社製）、ＳＡＦ−Ｍ（米国カリフォルニア州エメリービル、シロン（Chiron）社製）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の易熱性エンテロトキシン（組換え型または他のもの）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、またはムラミルジペプチドが含まれる。最も好ましくは、易熱性エンテロトキシン突然変異体がアジュバントとして使用される。
さらなる態様では、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法が提供される。好ましくは、この方法は、これに限定しないが、本明細書に記載された１以上のポリペプチドを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。
また、ＥＴＥＣ感染症の臨床症状の発生率または重症度を低減する方法が、本開示により提供される。ＥＴＥＣ感染症の臨床症状の発生率または重症度を低減するこの方法は、これに限定しないが、本明細書に開示された１以上のポリペプチドを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。一実施形態では、ＥＴＥＣ感染症の臨床症状の重症度または発生率は、アドヘシン先端ＭＥＦＡの投与を受けていないヒトまたは動物、またはヒトまたは動物の群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低減する。マルチエピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）は、好ましくは、５０マイクログラム未満の投与量で投与され、投与量としては、例えば、１−３０マイクログラム、１０−３０マイクログラム、１０−２０マイクログラム、１０−５０マイクログラム、２０−５０マイクログラム、３０−５０マイクログラム、４０−５０マイクログラム、１マイクログラム、５マイクログラム、１０マイクログラム、１５マイクログラム、２０マイクログラム、２５マイクログラム、３０マイクログラム、３５マイクログラム、４０マイクログラム、４５マイクログラム、または５０マイクログラムが想定される。投与経路は、好ましくは、皮内、筋肉内、または皮下免疫から選択される。
また、下痢を治療する、あるいは下痢の発生率または重症度を低減する方法が、本開示により提供される。この方法は、好ましくは、本開示のアドヘシン先端ＭＥＦＡの１以上を、それを必要とするヒトまたは動物、またはヒトまたは動物の群に対して投与するステップを含む。一実施形態では、下痢の発生率または重症度は、アドヘシン先端ＭＥＦＡの投与を受けていないヒトまたは動物、またはヒトまたは動物の群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低減する。
また、ＥＴＥＣの腸管への付着を減少させる方法が、本開示により提供される。この方法は、好ましくは、本開示の１以上のアドヘシン先端ＭＥＦＡを、それを必要とするヒトまたは動物に対して投与するステップを含む。一実施形態では、腸管への付着は、アドヘシン先端ＭＥＦＡの投与を受けていないヒトまたは動物、またはヒトまたは動物の群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％減少する。
本明細書で使用される「マルチエピトープ融合抗原」（ＭＥＦＡ）は、ワクチンまたは免疫原性組成物を作製するために融合ストラテジー及びエピトープストラテジーを組み合わせることによって産生される分子を指す。ＭＥＦＡを産生する方法は、追加要素だけでなく、骨格分子の使用、及び任意の抗原性要素または同定された病原性因子の追加を可能にする。本開示では、ＭＥＦＡは、任意の１つの成分の単一の複製または複数の複製を有し得る。「アドヘシン先端ＭＥＦＡ」は、ＭＥＦＡが、ゲノムの「先端」または末端、あるいは遺伝子の「先端」上にあるサブユニットを使用して産生されることを意味する。
本開示の目的のために、「アドヘシン先端」は、ＥＴＥＣ細菌アドヘシンの先端に位置するサブユニットタンパク質を指す。
本開示の目的のために、「付着サブユニット」は、先端に位置していないが、宿主レセプターへの細菌付着に関与するＥＴＥＣアドヘシンのサブユニットタンパク質を指す。
本開示の目的のために、「配列同一性」は、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち基準配列とその基準配列と比較される所与の配列との間の関係を指す。配列同一性は、所与の配列及び基準配列を最高度の配列類似性が得られるように最適にアライメントさせた後に、所与の配列を基準配列と比較することにより決定される（これらの配列のストリング間の一致によって決定される）。このようにアライメントした後、配列同一性は１つ１つの位置毎に確認される。例えば、特定の位置においてヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合は、その配列はその位置において「同一」である。このような位置同一性を有する位置の総数を基準配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割り算することにより、配列同一性のパーセントが決定される。配列同一性は、これに限定しないが、「Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)」、「Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)」、「Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)」、「Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)」、「Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)」、及び「Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)」に記載された公知の方法を用いて容易に算出することができる（これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。配列同一性を決定する好適な方法は、検査される配列間で最大の一致が得られるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定することができる公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。このようなプログラムの例には、これに限定しないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）が含まれる（これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、この教示は、参照により本明細書に含まれる）。これらのプログラムは、デフォルトギャップ重み付けを用いて所与の配列と基準配列とを最適にアライメントさせることにより、所与の配列と基準配列との間の最高レベルの配列同一性を得る。
本開示の目的のために、「配列相同性」は、２つの配列の関連性を判定する方法を指す。配列相同性を決定するために、２以上の配列が最適にアライメントされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定するときには、保存アミノ酸置換は一致として数えられる。換言すれば、基準配列に対して９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るためには、基準配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％が別のアミノ酸もしくはヌクレオチドと一致するかまたは保存的置換を含まなければならない。あるいは、基準配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチド（保存的置換は含まない）の総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までのアミノ酸またはヌクレオチドが基準配列中に挿入され得る。
本開示の目的のために、「エピトープ」は、抗体応答を誘導するために抗原分子として機能する短鎖ペプチドを指す。
本開示の目的のために、「骨格」は、安定したタンパク質構造を維持するために、また、目的の外来エピトープを提示するために、分子の支持体としての役割を果たすタンパク質を指す。
本発明のＭＥＦＡは、人工的に構築されたものであり、天然に存在するヌクレオチドまたはアミノ酸配列ではない。そのため、本発明のＭＥＦＡは、天然に存在するものとは大きく異なる。２０１４年に米国特許庁により規定された米国特許法第１０１条（３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１０１）に基づき特許性のある主題の天然ベース産物の例についての例５と同様に、本発明のＭＥＦＡは、そのＭＥＦＡ遺伝子が、天然に存在するＥＴＥＣ細菌とは機能的に異なる特徴を提供するエピトープのような追加要素を有するため、上記の例の請求項２と同様である。とりわけ、本発明のＭＥＦＡは、天然に存在するＥＴＥＣ細菌とは大きく異なり、腸管に付着しない。
本明細書において提供される全ての範囲は、その範囲内の各値及び全ての値、並びに、その範囲内の全てのサブ範囲を含む。さらに、本開示の全ての態様及び実施形態は、本明細書に開示される任意の態様または実施形態、または態様及び実施形態の組み合わせを含むか、またはそれらから本質的になるか、またはそれらからなる。
実施例
以下の実施例は、単に本発明をさらに説明することを意図するものである。したがって、本発明は、これらの実施例の詳細のいずれにも限定されるべきではない。
実施例１
材料及び方法
細菌株及びプラスミド：ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１−ＣＳ６、ＣＳ２１、及びＥｔｐＡアドヘシンのアドヘシン先端または付着サブユニット遺伝子のＰＣＲ増幅、及びインビトロ抗体付着阻害アッセイのためのＤＮＡ鋳型として使用される大腸菌及び腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）株と、アドヘシン先端、付着サブユニットタンパク質、及びアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質を各々発現する組換え大腸菌株とを下記の表１に示す。アドヘシン先端、付着サブユニット、及びアドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉタンパク質を発現させるために、プラスミドｐＥＴ２８α（米国ウィスコンシン州マディソンのノバジェン社（Novagen））、及び大腸菌株ＢＬ２１（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥヘルスケア社（GE Healthcare））を使用した。
表１
この研究で使用した大腸菌株のリスト。大腸菌株及びＥＴＥＣ株を、アドヘシン先端遺伝子を増幅するための鋳型として使用し、また、抗体付着阻害アッセイにも使用した。この研究で構築した各アドヘシン先端を発現する組換え大腸菌株も下記のリストに示す。
アドヘシン先端、付着サブユニット、及びアドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉのクローニング及び発現：ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、及びＣＳ５のアドヘシン先端遺伝子、並びに、ＣＳ６、ＣＳ２１、及びＥｔｐＡの付着サブユニット（付着に関与する主要構造サブユニット）遺伝子を増幅するために使用したＰＣＲプライマーを表２に示す。ＰＣＲ増幅アドヘシン先端または付着サブユニット遺伝子産物を制限酵素ＥａｇＩ及びＮｃｏＩまたはＮｈｅＩ（米国マサチューセッツ州イプスウィッチのニューイングランド・バイオラボ社（New England BioLabs Inc））で消化した。消化産物をベクターｐＥＴ２８αにクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１において発現させた。
表２
この研究でアドヘシン先端サブユニットを増幅するのに使用したＰＣＲプライマー。フォワードプライマーの制限部位、ＮｈｅＩ、またはＮｃｏＩ、及びリバースプライマーのＥａｇＩには下線を付してある。
アドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉ遺伝子を構築するために、まず、ウェブベースのＢ細胞エピトープ予測ソフトウェアを使用して、６つのアドヘシン（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１−ＣＳ５）のアドヘシン先端及び３つのアドヘシン（ＣＳ６、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ）の付着サブユニット由来のＢ細胞エピトープをインシリコ（in silico）で同定した。次いで、ＣＦＡ／ＩチップＣｆａＥ遺伝子（ｃｆａＥ）を骨格として適用し、その後、ＤＮＡ配列決定によって確認されるように、表面が露出しているが抗原性の低いペプチドをコードする８個のヌクレオチド断片を切り取った。そして、他の８個のアドヘシン先端または付着サブユニットの抗原性の高いエピトープをコードするヌクレオチド断片を、ｃｆａＥ遺伝子の切り取り位置に挿入した。エピトープ提示のインシリコでの最適化後、このアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１遺伝子を合成した（遺伝子合成は米国ニュージャージー州サウスプレインフィールのジーンウィズ社（Genewiz）が実施した）。合成遺伝子を酵素ＮｃｏＩ及びＥａｇＩで消化し、ベクターｐＥＴ２８αにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１において発現させた。
各組換え株由来の単一コロニーを、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）が添加されたルリア−ベルターニ（ＬＢ：Luria-Bertani）ブロス５ｍｌ中で３７℃にて一晩インキュベートした。一晩増殖した培養物を、２００ｍｌの２×ＹＴ培地（２×酵母エキス トリプトン）に添加した。光学密度（ＯＤ）が０．６に達した後、細菌を０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ社（Sigma）のＩＰＴＧ）で誘導し、さらに４時間増殖させた。１２，０００−１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細菌を収集した。凍結及び融解後のペレットを、ボルテックスを使用して、１０ｍｌの細菌タンパク質抽出試薬（米国イリノイ州ロックフォードのピアス（Pierce）社のＢ−ＰＥＲ）中で懸濁させた。室温で３０分間静置した後、細菌溶解物を１２，０００−１３，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠心分離した。激しく攪拌することによりペレットを１０−２０ｍｌのＢ−ＰＥＲ中で懸濁し、２０ｍｌのシリンジでピペッティングし、２００−４００μｌの新たに調製したリゾチーム（Ｂ−ＰＥＲ中で１０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。懸濁液を遠心分離した。得られたペレットを懸濁させた後、リゾチームと共に再度インキュベートした。遠心分離後、ペレットを１００ｍｌの１：１０希釈Ｂ−ＰＥＲ中で懸濁し、攪拌し、遠心分離した。ペレットを１００ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、激しく攪拌し、１２，０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離した。最終的なペレットを１０ｍｌのＰＢＳに溶解させた。
次いで、抽出したタンパク質を、製造業者のプロトコル（Novagen）に従ってタンパク質リフォールディングキットを使用して再折り畳みした。再折り畳みした可溶化タンパク質を、分子多孔膜チューブ（米国カリフォルニア州ランチョドミンゲスのスペクトラム・ラボラトリーズ社（Spectrum Laboratories, Inc））に移し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５（０．１ｍＭのＤＴＴを添加した）中で、４℃にて透析した。３−４時間後、タンパク質サンプルを、ＤＴＴを含まない透析緩衝液に移し、その後、緩衝液をさらに２回交換した。４℃にて１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより可溶化タンパク質（上清中）を収集し、−８０℃にて保存した。
アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１によるマウス免疫化を、以下のステップにより実施した。マウス免疫化に使用する前に、２５または３０μｌの再折り畳みした可溶化アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）を、マウス抗ＣＦＡ／Ｉ抗血清（１：３０００）を用いた１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試験した。ＩＲＤｙｅ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００；米国ネブラスカ州リンカーンのＬＩ−ＣＯＲ社）を二次抗体として使用した。ＬＩ−ＣＯＲ社のオデッセイプレミアム（Odyssey premium）赤外線ゲルイメージングシステムを使用して、結合タンパク質を可視化した。加えて、クマシーブルー染色を使用して、抽出したアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質の純度を評価した。
７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（米国マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インターナショナル社（Charlies River Laboratories International, Inc.））をマウス免疫化に使用した。８匹のマウス群を、アジュバントとして１ｍｇのｄｍＬＴ（ＬＴＲ１９２Ｇ／Ｌ２１１Ａ；米国メリーランド州シルバースプリングのウォルター・リード陸軍研究所（Walter Reed Army Institute of Research）から提供された）と共に、上記で生成した１５０μｇ（２００μｌのＰＢＳ中）のアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１タンパク質で腹腔内免疫した。免疫化マウスに対して、２回のブースター（追加免疫）注射を、一次免疫と同じ用量で、２週間間隔で腹腔内投与した。２回目の追加免疫の２週間後、マウスを犠牲にした。免疫していない８匹のマウス群を対照群として用いた。
一次免疫の１週間前及び最後の追加免疫の２週間後に、各マウスから血清サンプルを採取し、使用するときまで−８０℃で保存した。マウス免疫化研究は、全米研究評議会（National Research Council）の１９９６年の指針に基づく米国動物福祉法（American Welfare Act）に準拠し、カンザス州立大学機関動物管理委員会の承認を受けた。
マウス抗ＣＦＡ ＩｇＧ抗体の滴定を、以下のステップにより実施した。この研究において、マウス血清抗−ＣｆａＥ（ＣＦＡ／Ｉ）抗体、抗ＣｏｏＤ（ＣＳ１）抗体、抗ＣｏｔＤ（ＣＳ２）抗体、抗ＣｓｔＨ（ＣＳ３）抗体、抗ＣｓａＥ（ＣＳ４）抗体、抗ＣｓｆＤ（ＣＳ５）抗体、抗ＣｓｓＢ（ＣＳ６）抗体、抗ＬｎｇＡ（ＣＳ２１）抗体、及び抗ＥｔｐＡ ＩｇＧ抗体を滴定するために、組換えアドヘシン先端及び付着サブユニットタンパク質をそれぞれＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原として使用した。一次免疫の前及び最後の追加免疫の２週間後に各マウスから採取した血清サンプルを、最初は１：４００に希釈し、次いで２倍に希釈して、１：５１，２００まで希釈した。イムロン（Immulon）２ＨＢ ９６ウェルプレート（米国ニューヨーク州ロチェスターのサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific））の各ウェルに、１００μｌのコーティング緩衝液（４１）中の各アドヘシン先端またはサブユニット組換えタンパク質を４００ナノグラム添加した。プレートを３７℃にて１時間、次いで４℃にて一晩インキュベートした。コーティングされたプレートをＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、コーティングされていない部位を５％脱脂乳で３７℃にて１時間ブロックした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェルをマウス血清希釈液と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：３０００；シグマ社）と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ウェルを３，３´、５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウェル（Microwell）ペルオキシダーゼ基質（米国メリーランド州ゲイザースバーグのＫＰＬ社）の１００μｌと共に室温にて３０分間インキュベートし、波長６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。バックグラウンド読み取り（ＯＤ×希釈）を差し引いた後に０．３を上回る読み取りが得られた最大希釈のＯＤ読み取り値を抗体力価に換算し、ｌｏｇ１０スケールで表した。
マウス血清抗体付着阻害アッセイを、以下のステップにより実施した。マウス血清のインビトロ抗体付着阻害アッセイを実施した。簡単に説明すると、免疫化マウスまたは対照マウスからプールした３０μｌの血清を、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４／ＣＳ６、ＣＳ５／ＣＳ６、ＣＳ６、ＣＳ２１、またはＥｔｐＡを発現するＥＴＥＣまたは大腸菌（４．５×１０６ＣＦＵ；１５０μｌのＰＢＳ中）に添加した。振とう機（５０ｒｐｍ）上で室温にて１時間インキュベートし、血清／細菌混合物をＰＢＳで３００μｌにし、Ｃａｃｏ−２細胞（３×１０５細胞、７００μｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中；１細胞に対して１５細菌の感染多重度）に添加した。ＣＯ２培養機（５％ＣＯ２）中で３７℃にて１時間インキュベートした後、Ｃａｃｏ−２細胞をＰＢＳで３回穏やかに洗浄して非付着性細菌を除去し、次いで０．５％トリトンＸ（３００μｌ／ウェル；３７℃室温で２０分間）により除去した。付着した細菌（及び除去されたＣａｃｏ−２細胞）を遠心分離で収集し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させ、連続的に希釈し、ＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、ＣＦＵをカウントした。
統計的分析：抗体付着阻害アッセイのデータを、ＭＩＸＥＤプロシジャ（ノースカロライナ州ケーリーのＳＡＳインスティチュート社（SAS Institute）のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＡＳ、バージョン８）を用いて分析した。結果は、平均±標準偏差で表した。スチューデントのｔ検定を用いて、免疫化群と対照群との差異を比較した。両側分布及び２サンプル不等分散でアッセイ結果を比較した場合、ｐ＜０．０５であれば差異は有意であると見なされた。
結果及び結論
アドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉタンパク質は、９つのアドヘシン先端またはサブユニットのエピトープを担持した。「ＱＦＴＥＫＲＳＬＩＫＲ」（ＣＳ１／配列番号３７）、「ＳＱＳＩＥＭＲＦＱＤＤＳＱ」（ＣＳ２／配列番号４２）、「ＮＩＴＬＤＫＮＡＧＮＴ」（ＣＳ３／配列番号３６）、「ＦＹＬＲＫＩＮＤＤＴＫ」（ＣＳ４／配列番号４１）、「ＤＩＧＲＬＱＳＤＡＥＹ」（ＣＳ５／配列番号３５）、「ＹＤＳＤＰＫＬＤＳＱ」（ＣＳ６／配列番号３８）、「ＶＡＭＫＤＡＹＱＲＤＧＫＹＰＤＦ」（ＣＳ２１／配列番号３９）、及び「ＶＥＧＥＫＳＰＲＲＧＶ」（ＥｔｐＡ／ＳＥＱＩＤ番号４０）のエピトープは、ＣＳ１のＣｏｏＤ、ＣＳ２のＣｏｔＤ、ＣＳ３のＣｓｔＨ、ＣＳ４のＣｓａＥ、ＣＳ５のＣｓｆＤ、ＣＳ６のＣｓｓＢ、ＣＳ２１のＬｎｇＡ、及びＥｔｐＡのＥｔｐＡからインシリコでそれぞれ予測した。ＣＦＡ／Ｉ：「ＴＥＫＲＳＬＩＫＲＥＬＱＩＫ」（配列番号４３）、「ＱＤＤＮＳＫＳＤＧＫＦＹＬＫＫＩＮＤＤＳＫＥ」（配列番号４４）、及び「ＲＬＱＬＤＡＫＶＫＮＰＥＡ」（配列番号４５）のＣｆａＥ由来の３つのエピトープが、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１（図１）に保持された。この３６２アミノ酸ポリペプチドは、マウス抗ＣＦＡ／Ｉ抗血清によって発現され、抽出され、認識された（図１）。
アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１で腹腔内免疫されたマウスは、９つのアドヘシンの全てに対する免疫応答を生成したことが分かった。アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１組換えタンパク質で腹腔内免疫された８匹のマウスの全てが、９つのアドヘシン先端または付着サブユニットのそれぞれに対する抗体反応を生成した（図２）。免疫化マウスにおける抗ＣｆａＥ、抗ＣｏｏＤ、抗ＣｏｔＤ、抗ＣｓｔＨ、抗ＣｓａＥ、抗ＣｓｆＤ、抗ＣｓｓＢ、抗ＬｎｇＡ、及び抗ＥｔｐＡのＩｇＧ抗体力価は、それぞれ、３．１±０．３６、３．８±０．１０、３．２±０．１９、３．５±０．１４、３．８±０．１３、３．５±０．１９、４．０±０．１６、３．９±０．０４、及び４．０±０．１３（ｌｏｇ１０）であった。これらのアドヘシン先端またはサブユニット抗原に対する抗体力価は、対照マウスの血清サンプル、または一次免疫の前に収集された血清中に検出されなかった。
マウス血清抗体が、これらの９つのアドヘシンを発現するＥＴＥＣまたは大腸菌の付着を阻害することがさらに見出された。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ３、ＣＳ４／ＣＳ６、ＣＳ５／ＣＳ６、ＣＳ６、ＣＳ２１、またはＥｔｐＡを発現するＥＴＥＣ細菌、ＥｔＰＡを発現するＨ１０４０７ＣｆａＥノックアウト変異体、及びＣＳ１またはＣＳ２を発現する組換え大腸菌株は、免疫化マウスのプールされた血清サンプルと共にインキュベートした後、対照マウスのプール血清と共にインキュベートした同一の細菌と比較して、Ｃａｃｏ−２細胞に対する付着の有意な減少を示した。
考察
この研究で作製されたアドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉは、９種類のＥＴＥＣアドヘシン由来のエピトープを担持し、それらの９種類の各アドヘシンに対する抗体応答を誘導した。このことは、免疫学的に異種の病原体に対して安全かつ広範に防御するワクチンを開発するためのエピトープワクチン学の概念を活性化させるであろう。複数のエピトープを線状ペプチド抗原にスタックさせ、しばしば劣った免疫原性または防御をもたらす概念的エピトープワクチンストラテジーとは異なり、本開示は、ＭＥＦＡ（マルチエピトープ融合抗原）アプローチを適用して、バックボーン（骨格）タンパク質を使用すると共に、バックボーンタンパク質の表面露出ペプチドを外来抗原のエピトープと置換する。このＭＥＦＡアプローチによって、目的の抗原性エピトープをより良く提示するタンパク質が得られる。今後のタンパク質構造研究は、このＭＥＦＡ−１タンパク質の抗原性トポロジーを理解するのに役立つだろう。
本開示は、このアドヘシン先端ＭＥＦＡ構築においてＣＳ６アドヘシンに対応するＣｓｓＢエピトープを含む。ＣｓｓＡ及びＣｓｓＢは両方とも主要構造サブユニットであり、ＣＳ６アドヘシン付着において重要な役割を果たす。ＣｓｓＡエピトープ「７２ＱＶＴＶＹＰＶ７８」（配列番号５４）が、ＣＳ６アドヘシン付着に対するインビトロ防御抗体を誘導できることが見出された。この研究のデータは、ＣｓｓＢエピトープ「ＹＤＳＤＰＫＬＤＳＱ」（配列番号５２）も、Ｃａｃｏ−２細胞に対するＣＳ６の付着を阻害する抗体を誘導することを示した。
ＣｓｔＨは主要構造サブユニットであり、またＣＳ３アドヘシンのための付着サブユニットでもある。このアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１のＣｓｔＨエピトープ「ＮＩＴＬＤＫＮＡＧＮＴ」（配列番号４９）は、強力な抗ＣｓｔＨ抗体応答を誘導することができた。主要サブユニットＭＥＦＡ−Ｉ及びこのアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１由来の抗体力価の比較は、抗体滴定ＥＬＩＳＡでは互いに異なるコーティング抗原が使用されたため、あまり有益ではないであろう。インビトロ抗体付着阻害アッセイは、これらの２つのＣｓｔＨエピトープに対して誘導された抗体が、Ｃａｃｏ−２細胞に対するＣＳ３アドヘシンの付着の阻害と同様の割合を示す（抗ＣＦＡ ＭＥＦＡ−１抗体と抗アドヘシン先端ＭＥＦＡ−１抗体は、５０％対５８％）ことを示唆した。ＥＴＥＣアドヘシン先端または主要サブユニットのための最適なエピトープを同定するための今後の研究は、ワクチン候補の有効性を改善するのに役立つであろう。
この研究の結果は、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−Ｉが、アドヘシン先端または付着サブユニットエピトープを担持し、９つのＥＴＥＣアドヘシンに対する抗体応答を誘導し、誘導された抗体が、これらの９つのアドヘシンを発現する大腸菌及びＥＴＥＣ細菌のＣａｃｏ−２細胞に対する付着を阻害したことを示した。抗原の抗原性及びＥＴＥＣ下痢に対するワクチンの潜在的な用途をさらに特徴付けるために、様々な免疫経路、様々な動物、及びチャレンジ実験を用いる今後の研究が必要となるであろう。
実施例２
材料及び方法
上述した方法を、本開示の別の実施形態、アドヘシン先端ＭＥＦＡ（ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１７、ＣＳ１４、ＣＳ１９、及びＥａＥＨのエピトープを有するＣＳ１４の骨格を用いたアドヘシン先端ＭＥＦＡ−１）に対して実施した。
表３：この表は、完全ＭＥＦＡ−ＩＩ配列の配列、及びその構成要素を示す。
アドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩ（６つのアドヘシンの最終産物）（配列番号２０）
ＭＮＫＩＬＦＩＦＴＬＦＦＳＳＶＬＦＴＦＡＶＳＡＱＥＧＳＳＮＲＡＫＩＤＱＴＧＤＹＴＮＩＦＧＰＲＤＲＮＥＳＳＰＫＨＮＩＬＮＤＹＩＴＡＹＳＥＳＨＴＬＹＤＲＭＩＦＬＣＬＳＳＱＮＴＬＮＧＡＣＰＴＳＥＮＰＳＳＳＳＶＳＧＥＴＮＩＴＬＱＦＴＥＫＲＳＬＩＫＲＥＬＱＩＫＧＹＫＲＬＬＦＫＧＡＮＣＰＳＹＬＴＬＮＳＡＨＹＮＫＤＧＥＧＶＳＰＧＧＡＳＬＹＬＹＩＰＡＧＥＬＫＮＬＰＦＧＧＩＷＤＡＴＬＫＬＲＶＫＲＲＹＤＱＴＹＧＴＹＴＩＮＩＴＶＫＬＴＤＫＧＮＩＱＩＷＬＰＱＦＫＳＤＡＲＶＤＬＮＬＳＦＱＡＰＲＱＤＲＳＶＱＳＧＲＮＳＶＤＭＣＦＹＤＧＹＳＴＮＳＳＳＬＥＬＲＦＱＤＮＮＰＫＳＤＧＫＦＹＬＲＫＩＮＤＤＴＫＥＩＡＹＴＬＳＬＬＬＡＧＫＳＡＧＮＫＫＰＩＷＥＮＱＳＣＤＮＩＡＤＡＡＳＬＥＩＮＷＮＲＩＴＡＶＴＭＰＥＩＳＶＰＶＬＣＷＰＧＲＬＱＬＤＡＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲＰＡＮＧＹＭＧＮＩＮＩＴＦＴＰＳＳＱＴＬ
注記：下線を付したアミノ酸は、６つのアドヘシン由来のエピトープである。
ＣＳ１４−ＣｓｕＤ骨格：
ＣＳ１４アミノ酸（３８６）（配列番号２１）
ＭＮＫＩＬＦＩＦＴＬＦＦＳＳＶＬＦＴＦＡＶＳＡＤＫＩＰＧＤＥＮＩＴＮＩＦＧＰＲＤＲＮＥＳＳＰＫＨＮＩＬＮＤＹＩＴＡＹＳＥＳＨＴＬＹＤＲＭＩＦＬＣＬＳＳＱＮＴＬＮＧＡＣＰＴＳＥＮＰＳＳＳＳＶＳＧＥＴＮＩＴＬＱＦＴＥＫＲＳＬＩＫＲＥＬＱＩＫＧＹＫＲＬＬＦＫＧＡＮＣＰＳＹＬＴＬＮＳＡＨＹＴＣＮＲＮＳＡＳＧＡＳＬＹＬＹＩＰＡＧＥＬＫＮＬＰＦＧＧＩＷＤＡＴＬＫＬＲＶＫＲＲＹＤＱＴＹＧＴＹＴＩＮＩＴＶＫＬＴＤＫＧＮＩＱＩＷＬＰＱＦＫＳＤＡＲＶＤＬＮＬＲＰＴＧＧＧＴＹＩＧＲＮＳＶＤＭＣＦＹＤＧＹＳＴＮＳＳＳＬＥＬＲＦＱＤＮＮＰＫＳＤＧＫＦＹＬＲＫＩＮＤＤＴＫＥＩＡＹＴＬＳＬＬＬＡＧＫＳＬＴＰＴＮＧＴＳＬＮＩＡＤＡＡＳＬＥＩＮＷＮＲＩＴＡＶＴＭＰＥＩＳＶＰＶＬＣＷＰＧＲＬＱＬＤＡＫＶＥＮＰＥＡＧＱＹＭＧＮＩＮＩＴＦＴＰＳＳＱＴＬ
予測エピトープ：２３−３３、８４−９９、１４１−１５０、２２１−２３１、２５５−２６４、２８９−２９９、３３６−３４６。
上記の予測エピトープに代替される置換エピトープ。
ＣＳ７：ＱＥＧＳＳＮＲＡＫＩＤＱＴＧＤＹ ２４−３９（配列番号２２）
ＣＳ１４：ＰＴＳＥＮＰＳＳＳＳＶＳＧＥＴＮ ９１−１０６（骨格から保持された）（配列番号２３）
ＣＳ１２：ＮＫＤＧＥＧＶＳＰＧ １４９−１５８（配列番号２４）
ＣＳ１７：ＳＦＱＡＰＲＱＤＲＳＶＱＳ ２３１−２４３（配列番号２５）
ＣＳ１４：ＱＤＮＮＰＫＳＤＧＫ； ２６８−２７７（配列番号２６）
ＣＳ１９：ＡＧＮＫＫＰＩＷＥＮＱＳＣＤ ３０３−３１６（配列番号２７）
ＥａＥＨ：ＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲＰＡＮＧ ３５５−３７０（配列番号２８）
ＣＳ１４先端ＣＳｕＤ骨格ヌクレオチド配列（配列番号１０９）
ＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＧＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＣＡＣＴＴＡＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＴＴＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＡＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＴＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＧＴＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＡＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＴＡＧ
ＣＳ７−ＣｓｇＢ（配列番号２９）
ＭＫＮＫＬＬＦＭＭＬＴＩＬＧＡＰＧＩＡＡＡＡＧＹＤＬＡＮＳＥＹＮＦＡＶＮＥＬＳＫＳＳＦＮＱＡＡＩＩＧＱＡＧＴＮＮＳＡＱＬＲＱＧＧＳＫＬＬＡＶＶＡＱＥＧＳＳＮＲＡＫＩＤＱＴＧＤＹＮＬＡＹＩＤＱＡＧＳＡＮＤＡＳＩＳＱＧＡＹＧＮＴＡＭＩＩＱＫＧＳＧＮＫＡＮＩＴＱＹＧＴＱＫＴＡＩＶＶＱＲＱＳＱＭＡＩＲＶＴＱＲ
エピトープ［７３−８８（１６）］：ＱＥＧＳＳＮＲＡＫＩＤＱＴＧＤＹ（配列番号２２）
ＣＳ１２−ＣｓｗＦ（配列番号３０）
ＭＬＫＲＩＳＣＩＩＦＶＦＦＳＧＬＩＹＡＡＥＩＴＮＱＩＥＬＳＶＫＶＮＩＳＫＰＭＣＫＬＮＳＧＴＱＴＩＤＦＧＤＦＤＶＬＤＩＩＴＥＮＲＫＬＮＧＨＡＴＦＫＦＴＥＣＳＳＶＫＮＭＫＩＫＦＫＱＡＧＱＮＰＡＬＤＩＶＮＮＹＩＰＮＳＫＧＤＲＭＡＫＧＶＡＶＫＬＬＤＤＫＫＱＥＩＱＬＮＫＥＭＮＶＩＶＥＥＳＬＴＦＫＤＬＴＬＮＡＱＶＩＳＩＮＫＤＧＥＧＶＳＰＧＬＬＱＴＡＩＧＭＥＩＳＹＥ
エピトープ（１５５−１６４）：ＮＫＤＧＥＧＶＳＰＧ（配列番号２４）
ＣＳ１２−ＣｓｗＦヌクレオチド配列（配列番号１１０）
抗体滴定ＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原用のセグメントを増幅するためのプライマー：
ＲＮ−ＣＳ１２−Ｆ：ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＧＡ（配列番号１１４）
ＲＮ−ＣＳ１２−Ｒ：ＡＴＣ ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＧＴ ＡＧＣ（配列番号１１５）
ＣＳ１７−ＣｓｂＤ（配列番号３１）
ＭＫＫＩＦＩＦＬＳＩＩＦＳＡＶＶＳＡＧＲＹＰＥＴＴＶＧＮＬＴＫＳＦＱＡＰＲＱＤＲＳＶＱＳＰＩＹＮＩＦＴＮＨＶＡＧＹＳＬＳＨＮＬＹＤＲＩＶＦＬＣＴＳＳＳＮＰＶＮＧＡＣＰＴＬＧＴＳＧＶＱＹＧＴＴＴＩＴＬＱＦＴＥＫＲＳＬＩＫＲＮＩＮＬＡＧＮＫＫＰＩＷＥＮＱＳＣＤＴＳＮＬＭＶＬＮＳＫＳＷＳＣＧＨＹＧＮＡＮＧＴＬＬＮＬＹＩＰＡＧＥＩＮＫＬＰＦＧＧＩＷＥＡＴＬＩＬＲＬＳＲＹＧＥＶＳＳＴＨＹＧＮＹＴＶＮＩＴＶＤＬＴＤＫＧＮＩＱＶＷＬＰＧＦＨＳＮＰＲＶＤＬＮＬＨＰＩＧＮＹＫＹＳＧＳＮＳＬＤＭＣＦＹＤＧＹＳＴＮＳＤＳＭＶＩＫＦＱＤＤＮＰＴＹＳＳＥＹＮＬＹＫＩＧＧＴＥＫＬＰＹＡＶＳＬＬＭＧＥＫＩＦＹＰＶＮＧＱＳＦＴＩＮＤＳＳＶＬＥＴＮＷＮＲＶＴＡＶＡＭＰＥＶＮＶＰＶＬＣＷＰＡＲＬＬＬＮＡＤＶＮＡＰＤＡＧＱＹＳＧＱＩＹＩＴＦＴＰＳＶＥＮＬ
エピトープ（３２−４４）：ＦＱＡＰＲＱＤＲＳＶＱＳ（配列番号２５）
ＣＳ１７ ＣｓｂＤヌクレオチド配列（配列番号１１１）
抗体滴定ＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原用のセグメントを増幅するためのプライマー：
ＲＮ−ＣＳ１７−Ｆ：ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＴＴＴ（配列番号１１６）
ＲＮ−ＣＳ１７−Ｒ：ＧＧＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＧＡＡ（配列番号１１７）
ＣＳ１９−ＣｓｄＤ（配列番号３２）
ＭＫＫＩＦＩＦＬＳＩＩＦＳＡＶＶＳＡＧＲＹＰＥＴＴＶＧＮＬＴＫＳＦＱＡＰＲＬＤＲＳＶＱＳＰＩＹＮＩＦＴＮＨＶＡＧＹＳＬＳＨＲＬＹＤＲＩＶＦＶＣＴＳＳＳＮＰＶＮＧＡＣＰＴＩＧＴＳＲＶＥＹＧＴＴＴＩＴＬＱＦＴＥＫＲＳＬＩＫＲＮＩＮＬＡＧＮＫＫＰＩＷＥＮＱＳＣＤＴＳＮＬＭＶＬＮＳＫＳＷＳＣＧＡＬＧＮＡＮＧＴＬＬＮＬＹＩＰＡＧＥＩＮＫＬＰＦＧＧＩＷＥＡＴＬＩＬＲＬＳＲＹＧＥＶＳＳＴＨＹＧＮＹＴＶＮＩＴＶＤＬＴＤＫＧＮＩＱＶＷＬＰＧＦＨＳＮＰＲＶＤＬＮＬＨＰＩＧＮＹＫＹＳＧＳＮＳＬＤＭＣＦＹＤＧＹＳＴＮＳＤＳＭＶＩＫＦＱＤＤＮＰＴＮＳＳＥＹＮＬＹＫＩＧＧＴＥＫＬＰＹＡＶＳＬＬＭＧＧＫＩＦＹＰＶＮＧＱＳＦＴＩＮＤＳＳＶＬＥＴＮＷＮＲＶＴＡＶＡＭＰＥＶＮＶＰＶＬＣＷＰＡＲＬＬＬＮＡＤＶＮＡＰＤＡＧＱＹＳＧＱＩＹＩＴＦＴＰＳＶＥＮＬ
エピトープ（１１５−１２８）：ＡＧＮＫＫＰＩＷＥＮＱＳＣＤ（配列番号２７）
ＣＳ１９−ＣｓｄＤ（配列番号１１２）ヌクレオチド配列
抗体滴定ＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原用のセグメントを増幅するためのプライマー：
ＲＮ−ＣＳ１９−Ｆ：ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＡＣ（配列番号１１８）
ＲＮ−ＣＳ１９−Ｒ：ＧＧＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＧＡＡ（配列番号１１９）
ＥａｅＨ（配列番号３３）
エピトープ（２２２−２３７）：ＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲＰＡＮＧ（配列番号２８）
ＥａｅＨヌクレオチド配列（配列番号１１３）
ＡＴＧＴＣＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＴ
ＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣ
ＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡ
ＡＡＴＧＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＣＧＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＡＣＧＴＡ
ＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣ
ＴＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＣＣＧ
ＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＣＡＧＴ
ＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＧＡ
ＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＣＣＣＧＴＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＣＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧ
ＡＧＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＣＣ
ＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴ
ＧＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴ
ＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣ
抗体滴定ＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原用のセグメントを増幅するためのプライマー：
ＲＮ−ＥａＥＨ−Ｆ：ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＡ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＧＴ ＧＣＧ ＣＡＧ ＣＡＴ（配列番号１２０）
ＲＮ−ＥａＥＨ−Ｒ：ＴＴＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ（配列番号１２１）
結果及び結論
４０μｇのアドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩ、２μｇのｄｍＬＴ（二重突然変異ＬＴ、ＬＴＲ１９２Ｇ／Ｌ２１１Ａ）アジュバント、１回の一次免疫及び２週間間隔での２回の追加免疫により皮下免疫した成体雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、及びＥａｅＨアドヘシンに対する免疫応答を生成した（図５）。対照マウスには、抗原特異的抗体応答は検出されなかった。
図５は、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫したマウスが産生した抗ＣＳ１２抗体、抗ＣＳ１４抗体、抗ＣＳ１７抗体、及び抗ＥａｅＨ ＩｇＧ抗体の血清ＩｇＧ抗体力価（ｌｏｇ１０）を示す。図５の各ドットは個々のマウスのＩｇＧ力価を表し、バーは平均ＩｇＧ力価を示す。
ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、またはＥａｅＨを発現するＥＴＥＣ野生型分離株は、アドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫したマウスＳＣの血清と共にインキュベートした後は、対照マウスの血清と共にインキュベートしたＥＴＥＣ株と比較して、ＣＥＣＯ−２細胞に対する付着の有意な減少を示した。このことは、免疫化マウスの血清抗体は中和活性を示し、上記の５つのアドヘシンのいずれかを発現するＥＴＥＣ細菌の付着を阻害することを示唆する。
表４：マウス血清抗体インビトロ付着阻害アッセイの結果。Ｃａｃｏ−２細胞（５×１０５）を、互いに異なるアドヘシンを発現する各ＥＴＥＣ細菌株（ＰＢＳ中）、対照マウスの血清と予め混合したＥＴＥＣ細菌、またはアドヘシン先端ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫したマウスの血清と予め混合したＥＴＥＣバクテリアを発現するＥＴＥＣ細菌と共にインキュベートした。
実施例３
本開示の別の実施形態である、ＣＳ１９、ＣＳ１７、ＥｔｐＡ、ＣＳ１４、ＣＳ７、ＣＳ１２、及びＥａｅＨのエピトープを有するＣＳ２１の骨格を含む主要サブユニットＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩに対して、上記の実施例１に記載した方法を実施した。
材料及び方法
このＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩは、ＣＳ２１主要サブユニットＬｎｇＡを骨格として使用し、ＬｎｇＡの表面に露出した抗原性の低いエピトープを、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨアドヘシンの主要サブユニット由来の抗原性の高いエピトープで置換した。このため、ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩは、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の８つのアドヘシンの抗原性要素を担持し、これらの８つのＥＴＥＣアドヘシン（ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨ）の全てに対する抗体を誘導することができる。実施例３のＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩの構造を図６に示す。
ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩ アミノ酸配列（配列番号６７）
ＭＳＬＬＥＶＩＩＶＬＧＩＩＧＴＩＡＡＧＶＶＩＬＡＱＲＡＦＤＳＲＡＶＴＤＬＥＡＡＰＰＥＡＧＮＹＴＶＲＶＡＭＫＤＡＹＱＲＤＧＫＹＰＤＦＶＤＰＬＳＬＴＡＮＴＩＫＴＤＴＳＧＩＰＡＡＱＬＶＱＬＧＫＡＤＴＱＧＴＡＰＥＡＧＮＹＩＳＧＤＦＩＡＩＧＧＡＶＥＧＥＫＳＰＲＲＧＶＫＫＧＦＡＩＥＬＮＧＬＴＳＧＴＡＰＳＡＧＫＹＱＥＱＣＲＳＩＬＧＱＶＧＡＧＳＰＶＴＲＳＤＴＴＳＷＥＹＶＡＧＳＮＧＱＡＮＮＮＤＡＳＱＶＤＭＳＶＡＡＳＴＴＶＬＲＳＬＧＮＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲＴＡＤＫＩＬＳＴＣＴＡＱＶＮＳＩＴＬＧＳＲ
ＣＳ７エピトープ：ＡＧＳＰＶＴＲＳＤＴＴＳ（配列番号６８）
ＣＳ１２エピトープ：ＧＳＮＧＱＡＮＮＮＤＡＳＱ（配列番号６９）
ＣＳ１４エピトープ：ＴＳＧＴＡＰＳＡＧＫＹＱ（配列番号７０）
ＣＳ１７エピトープ：ＡＤＴＱＧＴＡＰＥＡＧＮＹ（配列番号７１）
ＣＳ１９エピトープ：ＥＡＡＰＰＥＡＧＮＹ（配列番号７２）
ＥｔｐＡエピトープ：ＶＥＧＥＫＳＰＲＲＧＶ（配列番号４０）
ＥａｅＨ エピトープ：ＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲ（配列番号７３）
ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩ ＤＮＡ配列（配列番号７４）
ＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＴＴＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＣＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣ（ＣＳ１７エピトープ）ＡＴＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＧＴＡＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＡＧＣＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＡＡ
ＣＳ７主要サブユニット（ＣｓｖＡ）（配列番号７５）
アミノ酸配列
ＭＫＫＫＬＬＩＡＳＶＬＡＭＡＴＶＳＧＳＶＬＡＡＶＴＮＧＱＬＴＦＮＷＱＧＶＶＰＳＡＰＶＴＫＮＴＷＡＦＶＮＧＬＤＩＰＦＴＰＧＴＥＱＬＮＩＴＬＧＡＤＫＧＩＴＡＲＳＶＫＰＹＤＦＦＩＶＰＶＴＧＴＶＴＡＧＳＰＶＴＲＳＤＴＴＳＭＮＳＶＫＡＦＬＳＳＥＰＶＳＮＧＦＶＧＮＫＱＬＴＬＳＴＴＡＥＡＶＴＧＱＶＡＩＴＬＮＧＱＰＬＫＶＧＳＡＮＡＴＴＶＡＭＤＴＮＫＫＥＳＨＩＳＩＤＭＮＡＫＡＳＡＳＤＶＡＥＧＳＡＩＮＦＶＡＰＶＴＦＡＶＤＩ
エピトープ：９５−１０６（１２ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号７６）
ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＧＴＡＧＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＡＡＣＣＣＧＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＣＴＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴＧＴＡＧＣＴＣＣＧＧＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗原としての遺伝子セグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＳ７−ＣｓｖＡ−Ｆ：ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＣＧＴ ＡＴＣ ＡＧ（ＮｃｏＩ）（配列番号７７）
ＣＳ７−ＣｓｖＡ−Ｒ：ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＧＡ ＡＧＣ ＡＣＴ Ｔ（ＥａｇＩ）（配列番号７８）
ＣＳ１２主要サブユニット（ＣｓｗＡ）（配列番号７９）
アミノ酸配列
ＭＲＫＩＴＳＬＩＭＡＶＴＬＭＮＳＳＡＦＡＡＩＧＳＮＧＱＡＮＮＮＤＡＳＱＡＥＬＨＦＴＧＫＬＴＳＳＬＣＱＶＡＴＳＤＶＫＫＥＩＤＬＧＥＬＳＫＡＡＬＩＡＳＧＲＧＰＳＱＳＦＳＶＳＬＶＮＣＤＰＴＩＮＴＩＳＹＡＬＱＤＫＮＧＳＶＧＮＹＬＶＮＱＳＧＤＴＭＡＫＧＶＧＶＹＩＥＮＮＬＮＳＰＬＫＶＤＧＳＬＮＴＶＧＶＱＫＤＧＡＴＡＬＰＤＱＶＩＰＬＴＡＹＩＧＳＴＴＰＧＡＶＡＤＦＡＴＶＴＰＧＬＶＤＡＮＡＶＭＴＩＲＡＳＡＰ
エピトープ：２３−３５（１３ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号８０）
ＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＣＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＡＧＣＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＡＡＡＣＧＧＣＡＧＴＧＴＡＧＧＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＡＡＡＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＡＴＧＡＣＴＡＴＴＣＧＴＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としての遺伝子セグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＡ１２−ＣｓｗＡ−Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＣＡ（ＮｃｏＩ）（配列番号８１）
ＣＡ１２−ＣｓｗＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＡＧＴＧＡＡ（ＥａｇＩ）（配列番号８２）
ＣＳ１４主要サブユニット（ＣｓｕＡ）（配列番号８３）
アミノ酸配列
ＭＫＬＫＫＴＩＧＡＭＡＬＳＴＩＦＶＡＶＳＡＳＡＶＥＫＮＩＴＶＴＡＳＶＤＰＴＩＤＩＬＱＡＮＧＳＡＬＰＴＡＶＤＬＴＹＬＰＧＡＫＴＦＥＮＹＳＶＬＴＱＩＹＴＮＤＰＳＫＧＬＤＶＲＬＶＤＴＰＫＬＴＮＩＬＱＰＴＳＴＩＰＬＴＶＳＷＡＧＫＴＬＳＴＳＡＱＫＩＡＶＧＤＬＧＦＧＳＴＧＴＡＧＶＳＮＳＫＥＬＶＩＧＡＴＴＳＧＴＡＰＳＡＧＫＹＱＧＶＶＳＩＶＭＴＱＳＴＤＴＡＡＰＶＰ
エピトープ：１４６−１５７（１２ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号８４）
ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡＡＣＣＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＡＣＣＧＡＡＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＴＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＣＧＴＣＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのセグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＡ１４−ＣｓｕＡ−Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡ ＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧ（ＮｃｏＩ）（配列番号８５）
ＣＡ１４−ＣｓｕＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡ（ＥａｇＩ）（配列番号８６）
ＣＳ１７主要サブユニット遺伝子（ＣｓｂＡ）（配列番号８７）
アミノ酸配列
ＭＫＬＫＫＴＩＧＡＭＡＭＡＴＬＦＡＴＭＡＡＳＡＶＥＫＮＩＴＶＲＡＳＶＤＰＫＬＤＬＬＱＡＤＧＴＳＬＰＤＳＩＡＬＴＹＳＳＡＳＮＮＦＥＶＹＳＬＮＴＡＩＨＴＮＤＫＳＫＧＶＶＶＫＬＳＡＳＰＶＬＳＮＩＭＫＰＮＳＱＩＰＭＫＶＴＬＧＧＫＴＬＮＴＴＤＴＥＦＴＶＤＴＬＮＦＧＴＳＧＶＥＮＶＳＳＴＱＱＬＴＩＨＡＤＴＱＧＴＡＰＥＡＧＮＹＱＧＩＩＳＬＩＭＴＱＫＴ
エピトープ：１４４−１５６（１３ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号８８）
ＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＧＴＴＧＡＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡＣＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのセグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＡ１７−ＣｓｂＡ−Ｆ：ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡ（Ｎｈｅ Ｉ）（配列番号８９）
ＣＡ１７−ＣｓｂＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡ（ＥａｇＩ）（配列番号９０）
ＣＳ１９主要サブユニット（ＣｓｄＡ）（配列番号９１）
アミノ酸配列
ＭＫＬＫＫＴＩＧＡＭＡＭＡＴＬＦＡＴＭＡＡＳＡＶＥＫＮＩＴＶＲＡＳＶＤＰＫＬＤＬＬＱＡＤＧＴＳＬＰＤＳＩＡＬＴＹＳＳＡＳＮＮＦＥＶＹＳＬＮＴＡＩＨＴＮＤＫＴＫＡＶＶＶＫＬＳＡＰＡＶＬＳＮＩＭＫＰＳＳＱＩＰＭＫＶＴＬＧＧＫＴＬＳＴＡＤＡＥＦＡＡＤＴＬＮＦＧＡＳＧＶＥＮＶＳＳＶＱＱＬＴＩＨＡＥＡＡＰＰＥＡＧＮＹＱＧＶＩＳＬＩＭＴＱＫＴ
エピトープ：１４５−１５４（１０ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号９２）
ＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＧＴＴＧＡＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのサブユニットセグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＡ１９−ＣｓｄＡ−Ｆ：ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡ（Ｎｈｅ Ｉ）（配列番号９３）
ＣＡ１９−ＣｓｄＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＣ（ＥａｇＩ）（配列番号９４）
ＣＳ２１主要サブユニット（ＬｎｇＡ）（配列番号９５）
アミノ酸配列
ＭＳＬＬＥＶＩＩＶＬＧＩＩＧＴＩＡＡＧＶＶＩＬＡＱＲＡＦＤＳＲＡＶＴＤＬＶＴＮＴＮＴＶＲＶＡＭＫＤＡＹＱＲＤＧＫＹＰＤＦＶＤＰＬＳＬＴＡＮＴＩＫＴＤＴＳＧＩＰＡＡＱＬＶＱＬＧＫＩＴＰＤＥＶＲＮＮＩＳＧＤＦＩＡＩＧＧＡＬＴＳＮＧＡＱＶＫＫＧＦＡＩＥＬＮＧＬＳＱＥＱＣＲＳＩＬＧＱＶＧＮＮＷＥＹＶＡＩＧＴＳＡＳＧＳＹＡＭＴＡＴＧＶＤＭＳＶＡＡＳＴＴＶＬＲＳＬＧＮＧＧＱＴＴＬＴＡＤＫＩＬＳＴＣＴＡＱＶＮＳＩＴＬＧＳＲ
エピトープ：４９−６０（１２ａａ）６９−８１（１３ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号９６）
ＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＴＴＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＴＡＡＣＴＡＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＣＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのＬｎｇＡ遺伝子セグメントを増幅するためのプライマー：
ＣＡ２１−ＬｎｇＡ−Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＴＴＧＴＴ（ＮｃｏＩ）（配列番号９７）
ＣＡ２１−ＬｎｇＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＡＧ（ＥａｇＩ）（配列番号９８）
ＥｔｐＡ付着サブユニット
アミノ酸配列（配列番号９９）
ＶＳＥＩＴＴＧＶＧＮＡＫＡＴＧＳＶＥＧＥＫＳＰＲＲＧＶＲＡＭＡＬＳＬＬＳＧＭＭＩＭＡＨＰＡＭＳＡＮＬＰＴＧＧＱＩＶＡＧＳＧＳＩＱＴＰＳＧＮＱＭＮＩＨＱＮＳＱＮＭＶＡＮＷＮＳＦＤＩＧＫＧＮＴＶＱＦＤＱＰＳＳＳＡＶＡＬＮＲＶＶＧＧＧＥＳＱＩＭＧＮＬＫＡＮＧＱＶＦＬＶＮＰＮＧＶＬＦＧＥＧＡＳＶＳＴＳＧＦＶＡＳＴＲＤＩＫＮＤＤＦＭＮＲＲＹＴＦＳＧＧＱＫＡＧＡＡＩＶＮＱＧＥＬＴＴＮＡＧＧＹＩＶＬＡＡＤＲＶＳＮＳＧＴＩＲＴＰＧＧＫＴＶＬＡＡ
エピトープ：１７−２７（１１ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号１００）
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抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのセグメントを増幅するためのプライマー：
ＥｔｐＡ−Ｆ：ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧ（ＮｈｅＩ）（配列番号１０１）
ＥｔｐＡ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＡ（Ｅａｇ Ｉ）（配列番号１０２）
ＥａｅＨサブユニット
アミノ酸配列（配列番号１０３）
ＭＳＨＹＫＴＧＨＫＱＰＲＦＲＹＳＶＬＡＲＣＶＡＷＡＮＩＳＶＱＶＬＦＰＬＡＶＴＦＴＰＶＭＡＡＲＡＱＨＡＶＱＰＲＬＳＭＧＮＴＴＶＴＡＤＮＮＶＥＫＮＶＡＳＦＡＡＮＡＧＴＦＬＳＳＱＰＤＳＤＡＴＲＮＦＩＴＧＭＡＴＡＫＡＮＱＥＩＱＥＷＬＧＫＹＧＴＡＲＶＫＬＮＶＤＫＤＦＳＬＫＤＳＳＬＥＭＬＹＰＩＹＤＴＰＴＮＭＬＦＴＱＧＡＩＨＲＴＤＤＲＴＱＳＮＩＧＦＧＷＲＨＦＳＧＮＤＷＭＡＧＶＮＴＦＩＤＨＤＬＳＲＳＨＴＲＩＧＶＧＡＥＹＷＲＤＹＬＫＬＳＡＮＧＹＩＲＡＳＧＷＫＫＳＰＤＩＥＤＹＱＥＲＰＡＮＧＷＤＩＲＡＥＧＹＬＰＡＷＰＱＬＧＡＳＬＭＹＥＱＹＹＧＤＥＶＧＬＦＧＫＤＫＲＱＫＤＰＨＡＩＳＡＥＶＴＹＴＰＶ
エピトープ：２２２−２３３（１２ａａ）
ヌクレオチド配列（配列番号１０４）
ＡＴＧＴＣＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＣＧＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＡＣＧＴＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＣＣＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＣＡＧＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＣＣＣＧＴＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＣＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＴＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＣＧＴＣＧＧＧＴＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＧＣＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＣＴＴＧＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＴＡＣＧＡＴＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＣＡＣＧＧＣＧＴＴＡＡＣＧＣＴＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＧＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＡＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＴＣＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＧＴＧＴＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＧＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＧＧＧＴＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＣＧＧＴＴＴＣＴＴＣＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＧＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＡＴＴＡＣＴＣＴＣＧＧＣＴＣＴＡＣＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＧＴＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＧＴＣＡＴＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＡＴＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＧＧＡＡＣＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＴＣＴＡＣＧＴＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＡＣＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＣＧＡＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＴＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＡＡＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＣＴＡＴＣＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＣＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＡＡＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＡＡＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＣＡＴＴＴＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＴＡＣＧＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＧＧＴＡＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＴＡＡ
抗体滴定ＥＬＩＳＡコーティング抗原としてのセグメントを増幅するためのプライマー：
ＥａｅＨ−Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣ（ＮｃｏＩ）（配列番号１０５）
ＥａｅＨ−Ｒ：ＧＡＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴ（ＥａｇＩ）（配列番号１０６）
１グループ当たり１０匹の成体雌マウスを、２μｇのｄｍＬＴアジュバントと共に、４０μｇの組換えＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩタンパク質で皮下（ＳＣ）免疫した。免疫したマウスに対して、２回の追加免疫を２週間間隔で行った。２回目の追加免疫の２週間後、マウスを麻酔し、血液を採取した。免疫していない１０匹のマウスの群を対照として用いた。マウス血清サンプルを抗体滴定及び抗体付着阻害アッセイに使用した。
組換えサブユニットタンパク質をコーティング抗原（１ウェル当たり４００ｎｇ）として使用して、抗体滴定ＥＬＩＳＡを実施した。免疫したグループの各マウスの血清サンプルからは、抗ＣＳ７抗体、抗ＣＳ１２抗体、抗ＣＳ１４抗体、抗ＣＳ１７抗体、抗ＣＳ１９抗体、抗ＣＳ２１抗体、抗ＥａｅＨ抗体、及び抗ＥｔｐＡ ＩｇＧ抗体の大きな抗体力価が検出された。
結果及び結論
免疫したグループの全てのマウスは、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥａｅＨ、及びＥｔｐＡに対して特異的な抗体を産生した。対照マウスの血清サンプルからは、抗原特異的抗体は検出されなかった。さらに、ＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫したマウスＳＣ由来の血清サンプルは、抗体中和活性を示した。ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥａｅＨ、またはＥｔｐＡアドヘシンを発現するＥＴＥＣ細菌は、免疫化マウスの血清サンプルと共にインキュベートした後、対照マウスの血清サンプルと共にインキュベートした細菌と比較して、Ｃａｃｏ−２細胞に対する付着の有意な減少を示した。これらの結果を図７に示す。図７では、各マウスのＩｇＧ抗体力価を示しており、各ドットは個々のマウスのＩｇＧ力価を表し、バーは平均力価を表す。
表５：マウス血清抗体インビトロ付着阻害アッセイの結果。Ｃａｃｏ−２細胞（５×１０５）を、互いに異なるアドヘシンを発現する各ＥＴＥＣ細菌株（ＰＢＳ中）、対照マウスの血清と予め混合したＥＴＥＣ細菌、またはＣＦＡ ＭＥＦＡ−ＩＩで免疫したマウスの血清と予め混合したＥＴＥＣバクテリアを発現するＥＴＥＣ細菌と共にインキュベートした。

Claims (32)

  1. アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨからなる群より選択される３以上の互いに異なるエピトープを有するＣｆａＥ骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  2. アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨからなる群より選択される３以上の互いに異なるエピトープを有するＣＳ１４骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  3. 主要サブユニットＣＦＡマルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２１、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨからなる群より選択される３以上の互いに異なるエピトープを有するＣＳ２１骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  4. 請求項１に記載のマルチエピトープ融合抗原を含む免疫原性組成物。
  5. 請求項２に記載のマルチエピトープ融合抗原を含む免疫原性組成物。
  6. 請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原を含む免疫原性組成物。
  7. 請求項２に記載のマルチエピトープ融合抗原をさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  8. 請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原をさらに含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
  9. 請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原をさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  10. 請求項２に記載のマルチエピトープ融合抗原と、請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原とをさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  11. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項１に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
  12. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項２に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
  13. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
  14. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項７に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、方法。
  15. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項８に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、方法。
  16. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項９に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、方法。
  17. 腸管毒素原性大腸菌の臨床症状を軽減する方法であって、
    請求項１０に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、方法。
  18. アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ２１、及びＥｔｐＡのエピトープを有するＣｆａＥ骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  19. アドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＳ１２、ＣＳ１７、ＣＳ１９、及びＥａｅＨのエピトープを有するＣＳ１４骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  20. 主要サブユニットＣＦＡマルチエピトープ融合抗原であって、
    ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＥｔｐＡ、及びＥａｅＨのエピトープを有するＣＳ２１骨格を含む、マルチエピトープ融合抗原。
  21. 易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）のアドヘシン由来エピトープ、コレラのエピトープ、ロタウイルスのエピトープ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項１に記載のアドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原。
  22. 易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）のアドヘシン由来エピトープ、コレラのエピトープ、ロタウイルスのエピトープ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項２に記載のアドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原。
  23. 易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴａ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）のアドヘシン由来エピトープ、コレラのエピトープ、ロタウイルスのエピトープ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項３に記載の主要サブユニットＣＦＡマルチエピトープ融合抗原。
  24. 薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、担体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項１に記載のアドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原。
  25. 薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、担体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項２に記載のアドヘシン先端マルチエピトープ融合抗原。
  26. 薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、担体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される追加要素をさらに含む、請求項３に記載の主要サブユニットＣＦＡマルチエピトープ融合抗原。
  27. 前記マルチエピトープ融合抗原を投与する前記ステップが、皮内投与、筋肉内投与、または皮下投与を含む、請求項１１に記載の方法。
  28. 前記マルチエピトープ融合抗原を投与する前記ステップが、皮内投与、筋肉内投与、または皮下投与を含む、請求項１２に記載の方法。
  29. 前記マルチエピトープ融合抗原を投与する前記ステップが、皮内投与、筋肉内投与、または皮下投与を含む、請求項１３に記載の方法。
  30. 腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の腸管への付着を減少させる方法であって、
    請求項１に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
  31. 腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の腸管への付着を減少させる方法であって、
    請求項２に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
  32. 腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の腸管への付着を減少させる方法であって、
    請求項３に記載のマルチエピトープ融合抗原を投与するステップを含む、方法。
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