BRPI1014505B1 - Proteína de fusão de múltiplos epítopos, método para produzir uma composição, polinucleotídeo, vetor recombinante, célula hospedeira, método para produzir umaproteína de fusão de múltiplos epítopos, kit de teste imunodiagnóstico, composição, e, uso de uma proteína de fusão de múltiplos epítopos - Google Patents

Abstract

proteína de fusão de múltiplos epítopos, método para produzir uma composição, polinucleotídeo, vetor recombinante, célula hospedeira, método para produzir uma proteína de fusão de múltiplos epítopos, kit de teste imunodiagnóstico, composição, e, uso de uma proteína de fusão de múltiplos epítopos a presente invenção se refere a composições e métodos para estimular uma resposta imune contra antigenos de escherichia coli produtora da toxina shiga (stec). as composições incluem uma proteína de fusão de múltiplos epítopos compreendendo mais de um epitopo de uma proteína de stec imunogênica de mais de um serotipo de stec. composições adicionais incluem ao menos duas proteínas de stec purificadas, onde as proteínas de stec são selecionadas de uma proteína de stec de comprimento total, um fragmento imunogênico ou uma variante do mesmo, onde ao menos uma das proteínas de stec gera anticorpos que reagem com stec 0157 e ao menos um outro serotipo de stec.

Description

PROTEÍNA DE FUSÃO DE MÚLTIPLOS EPÍTOPOS, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DE MÚLTIPLOS EPÍTOPOS, KIT DE TESTE IMUNODIAGNÓSTICO, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DE MÚLTIPLOS EPÍTOPOS

Referência a Pedidos Relacionados [0001] Esse pedido reivindica o privilégio relativo a 35 U.S.C §119(e)(1) de U.S. Provisional Application Nos. 611211,989, depositado em 6 de abril de 2009 e 61I216,608, depositado em 19 de maio de 2009, cujos pedidos estão aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.

Campo da Invenção [0002] A presente invenção se refere a composições e métodos para provocar uma resposta imune contra Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC) em mamíferos. Em particular, a invenção se refere ao uso de múltiplos epítopos de efetores elou proteínas estruturais de mais de um serótipo de STEC, bem como epítopos de reatividade cruzada com mais de um serótipo, para tratar e prevenir a doença e colonização de STEC em mamíferos.

Antecedentes da Invenção [0003] A Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC), também chamada de E.coli entero-hemorrágica (EHEC) e E. coli vertotoxigênica (VTEC) são bactérias patogênicas que causam diarréia, colite hemorrágica, síndrome urêmica hemolítica (HUS), falência dos rins e morte em humanos. O gado é o reservatório primário para muitos serótipos de STEC e tem sido implicado na maioria dos surtos de doenças através da contaminação de produtos alimentícios ou do meio ambiente. Muitos serótipos de STEC são capazes de causar doenças em humanos, incluindo os serótipos O157, O26, O103, O111, entre outros.

[0004] Organismos de STEC colonizam o intestino grosso de gado e de humanos através de um mecanismo único no qual uma quantidade de determinantes de virulência são distribuídos a células hospedeiras via um tipo de sistema de secreção (TTSS), incluindo o receptor translocado para intimina, Tir (DeVinney et al., Infect. Immun. (1999) 67:2389). Em particular, esses patógenos secretam determinantes de virulência EspA, EspB, e EspD que

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I 78 permitem a distribuição de Tir para as membranas celulares intestinais. O Tir é integrado à membrana celular hospedeira onde ele serve como receptor para uma outra proteína de membrana externa bacteriana, a intimina. A ligação Tirintimina une o STEC à superfície celular intestinal e desencadeia recombinações de actina citoesquelética sob STEC aderente que resultam em formação pedestal. EspA, EspB, Tir e intimina são essenciais para a bem sucedida colonização do intestino por STEC.

[0005] Embora o STEC colonize o intestino de ruminantes e outros mamíferos, ele geralmente não causa uma doença manifesta nesses animais. No entanto, a contaminação de carne e água por serótipos de STEC é responsável por cerca de 50.000 casos de infecção por STEC em humanos anualmente nos Estados Unidos e no Canadá, que resultam em aproximadamente 500 mortes. Em 1994, o custo econômico associado à infecção por STEC em humanos foi estimado como sendo de mais de 5 bilhões de dólares.

[0006] Ruminantes saudáveis incluindo, mas não limitado a, gado, vacas leiteiras e ovelhas, podem ser infectado por serótipos de STEC. Na verdade, relatórios da USDA indicam que mais de 50% do gado são transmissores de STEC em algum momento das suas vidas e, consequentemente, disseminam STEC em suas fezes.

[0007] Devido ao vultoso processamento de gado abatido e do baixo número de STEC (10-100) necessário para infectar um humano, a colonização do gado saudável por STEC continua sendo um sério problema de saúde. Para atacar esse problema, as pesquisas se concentraram em métodos aperfeiçoados para detectar e subsequentemente matar o STEC no abate, alterando a dieta do gado para reduzir a quantidade de STEC intestinal e imunizando os animais para evitar a colonização por STEC (Zacek D. Animal Health and Veterinary Vaccines, Alberta Research Counsel, Edmonton, Canadá, 1997). Recentemente, a produção recombinante e uso de proteínas de STEC O157:H7 incluindo o recombinante EspA (International Publication No. WO 97I40063), o recombinante TIR (International Publication No. WO 99I24576), o recombinate EspB e a intimina recombinante (Li et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095) foram descritos.

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I 78 [0008] Babiuk et al., Microbial Pathogen. (2008) 45:7-11 descreve a imunização subcutânea e intranasal de um camundongo modelo usando proteínas secretadas tipo III (TTSPs) do serótipo de STEC 0157:H7. U.S. Patent No. 7,300,659 descreve o uso de supernadantes de cultura celular contendo antígenos de STEC para reduzir a colonização por STEC. Potter et al., Vaccine (2004) 22:362-369 relata a decrescente disseminação do serótipo de STEC O157:H& pelo gado após a vacinação com TTSPs. Asper et al., Vaccine (2007) 25:8262-8269 examinou a reatividade cruzada de TTSPs de serótipos O26:H11, O103:H2, O111:NM e O157:H7 e vacinou o gado com TTSPs produzidos a partir de cada um desses serótipos. Os autores descobriram que os animais responderam bem com anticorpos aos TTSPs do serótipo homólogo mas observaram uma reatividade cruzada limitada contra os outros serótipos. Nenhuma reatividade cruzada foi observada contra Tir e EspA do serótipo O157:H7.

[0009] Apesar do visto acima, permanece a necessidade de novas composições e métodos para tratar e prevenir a doença por STEC, bem como para reduzir a colonização por STEC de mamíferos de modo a reduzir a incidência de problemas de saúde associados à carne e à água contaminadas por STEC.

Sumário da Invenção [0010] A presente invenção supre a necessidade acima fornecendo tais composições e métodos. Em particular, os métodos da presente invenção fazem uso de composições incluindo uma combinação de epítopos de um ou mais serótipos de STEC, bem como epítopos que gerem anticorpos que tenham reatividade cruzada com mais de um serótipo de STEC, de modo a provocar uma resposta imune contra um ou mais antígenos de STEC de um ou mais serótipos de STEC, dessa forma tratando eIou prevenindo a infecção por STEC eIou reduzindo a colonização de mamíferos por STEC. Fornecendo múltiplos epítopos derivados de um ou mais serótipos, ou antígenos de STEC de pelo menos um serótipo que gerem anticorpos de reatividade cruzada com outros serótipos STEC, pode-se conseguir uma ampla proteção contra doenças causadas por STEC. As composições podem ser administradas com ou sem um adjuvante co-administrado.

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I 78 [0011] Assim sendo, é objeto da presente invenção fornecer uma vacina eficaz para estimular uma resposta imune contra antígenos de STEC, dessa forma tratando elou prevenindo a doença por STEC em um mamífero.

[0012] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz para reduzir, prevenir elou eliminar a colonização por STEC de um ruminante ou outro mamífero.

[0013] Outro objeto é reduzir o número de animais disseminando STEC no meio ambiente.

[0014] Outro objeto é reduzir a quantidade de STEC disseminado no meio ambiente por um animal infectado.

[0015] Outro objeto é reduzir o período de tempo durante o qual STEC é disseminado no meio ambiente por um animal infectado.

[0016] Outro objeto é reduzir a contaminação do meio ambiente por STEC.

[0017] Outro objeto é reduzir a contaminação de carne elou água por STEC.

[0018] Outro objeto é tratar, prevenir elou reduzir infecções por STEC em humanos.

[0019] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjunto a outros agentes biológicos anti-STEC.

[0020] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjunto a agentes químicos anti-STEC.

[0021] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjunto a agentes anti-STEC biologicamente fabricados.

[0022] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjuvante a agentes anti-STEC baseados em ácido nucléico.

[0023] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjuvante a agentes anti-STEC de proteínas recombinantes.

[0024] Outro objeto é fornecer um programa de vacinação eficaz para reduzir a colonização de um ruminante por STEC.

[0025] Outro objeto é fornecer um programa de vacinação eficaz para reduzir a disseminação de STEC por um ruminante.

[0026] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz para prevenir, reduzir ou eliminar a colonização de STEC O157 do gado, como a colonização de O157:H7 elou O157:NM, bem como outros membros de seropatótipos de

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STEC A e B, assim como, mas não limitado a STEC O26, como o O26:H11, STEC O103, como o O103:H2, STEC O111, como o O111:NM, STEC 121:H19, STEC O145:NM, STEC O104:H21 elou STEC O113:H21.

[0027] Outro objeto é reduzir a disseminação de STEC pelo gado no meio ambiente, assim como a disseminação de O157:H7 elou O157:NM, bem como outros membros de seropatótipos de STEC A e B, tais como mas não limitado a STEC O26, como o O26:H11, STEC O103, como o O103:H2, STEC O111, como o O111:NM, STEC 121:H19, STEC O145:NM, STEC O91:H21, STEC O104:H21 elou STEC O113:H21.

[0028] Outro objeto é reduzir a quantidade de STEC disseminado no meio ambiente pelo gado infectado, como a disseminação de O157:H7 elou O157:NM, bem como outros membros de seropatótipos de STEC A e B, tais como mas não limitado a STEC O26, como o O26:H11, STEC O103, como o O103:H2, STEC O111, como o O111:NM, STEC 121:H19, STEC O145:NM, STEC O91:H21, STEC O104:H21 elou STEC O113:H21.

[0029] Outro objeto é reduzir o período de tempo durante o qual STEC é disseminado no meio ambiente pelo gado infectado, como a disseminação de STEC O157:H7 elou O157:NM, bem como outros membros de seropatótipos de STEC A e B, tais como mas não limitado a STEC O26, como o O26:H11, STEC O103, como o O103:H2, STEC O111, como o O111:NM, STEC 121:H19, STEC O145:NM, STEC O91:H21, STEC O104:H21 elou STEC O113:H21.

[0030] Outro objeto é fornecer uma vacina eficaz como um adjunto a outros agentes anti-STEC O157, O26, O103, elou O111, bem como outros membros de seropatótipos de STEC A e B, tais como, mas não limitado a STEC 121, STEC O145, STEC O91, STEC O104 elou STEC O113.

[0031] Outro objeto é fornecer um programa de vacinação eficaz para reduzir a colonização do gado por STEC O157, O26, O103, elou O111, bem como a colonização do gado com outros membros de seropatótipos de STEC A e B, tais como, mas não limitado a STEC 121, STEC, O145, STEC O91, STEC O104 elou STEC O113.

[0032] Outro objeto é fornecer um programa de vacinação eficaz para reduzir a disseminação pelo gado de STEC O157, O26, O103, elou O111, bem como a disseminação pelo gado de outros membros de seropatótipos de STEC

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A e B, tais como, mas não limitado a STEC 121, STEC O145, STEC O91, STEC O104 elou STEC O113.

[0033] Assim, em uma representação, a invenção é direcionada a uma proteína de fusão de múltiplos epítopos compreendendo mais de um epítopo de uma proteína de Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC) de um ou mais serótipos de STEC. Em certas representações, os serótipos de STEC são selecionados de STEC 0157, STEC O26, STEC 0103 ou STEC O111, como o STEC O157:H7, STEC O26:H11, STEC O103:H2 ou STEC O111:NM.

[0034] Em representações adicionais pelo menos um epítopo na proteína de fusão de múltiplos epítopos é derivada de STEC O157:H7 Tir. Em representações adicionais, os epítopos compreendem epítopos derivados de STEC O157:H7 Tir, STEC O26:H11 Tir, STEC O103:H2 Tir e STEC O111:NM Tir.

[0035] Em outras representações ainda, a proteína de fusão de múltiplos epítopos compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 5B, como uma seqüência pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 5B, ou mesmo 100% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 5B.

[0036] Em qualquer das representações descritas acima, a proteína de fusão de múltiplos epítopos pode ser ligada a uma molécula portadora, como uma toxina RTX. Em determinadas representações, a toxina RTX é um polipeptídeo de leucotoxina, como a LKT 352.

[0037] Em determinadas representações, a proteína compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 6B, como uma seqüência pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 6B, ou mesmo 100% idêntica à seqüência de aminoácidos descrita na Figura 6B.

[0038] Em representações adicionais a invenção é direcionada a uma composição compreendendo uma proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das representações descritas acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0039] Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para produzir uma composição compreendendo combinar qualquer

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I 78 uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos acima com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0040] Em representações adicionais, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de codificação codificando qualquer uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos acima, bem como um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo e elementos controle que são operacionalmente ligados ao polinucleotídeo através do qual a dita seqüência de codificação pode ser transcrita e traduzida em uma célula hospedeira. Em outras representações, a invenção é direcionada a uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante, bem como a métodos para produzir uma proteína de fusão de múltiplos epítopos compreendendo fornecer uma população de células hospedeiras e cultivar a dita população de células sob condições através das quais a proteína codificada pela seqüência de codificação presente no vetor recombinante é expressada.

[0041] Em outras representações, a invenção é direcionada a anticorpos específicos para qualquer uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos acima, tais como, mas não limitado a anticorpos policlonais ou monoclonais.

[0042] Em representações adicionais, a invenção é direcionada a métodos para detectar anticorpos de STEC em uma amostra biológica compreendendo fornecer uma amostra biológica; reagir a amostra biológica com qualquer uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos acima sob condições que permitam que os anticorpos de STEC, quando presentes na amostra biológica, se liguem à proteína de fusão de múltiplos epítopos para formar um complexo anticorpoIantígeno; e detectar a presença ou ausência do complexo, detectando assim a presença ou ausência de anticorpos de STEC na amostra.

[0043] Em outras representações, a invenção é direcionada a um kit de teste imunodiagnóstico pra detectar a infecção por STEC, o kit de teste compreendendo qualquer uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos acima, e instruções para conduzir o teste imunodiagnóstico.

[0044] Em outras representações, a invenção é direcionada a uma composição compreendendo pelo menos duas proteínas purificadas de Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC), na qual as proteínas de STEC são selecionadas de uma proteína STEC completa, um fragmento

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I 78 imunogênico ou sua variante, no qual pelo menos uma das proteínas de STEC gera anticorpos que reagem com STEC O157 e pelo menos um outro serótipo de STEC. Em certas representações, pelo menos uma das proteínas de STEC gera anticorpos que reagem com STEC O157 e pelo menos dois eIou três ou mais serótipos de STEC.

[0045] Em representações adicionais, a composição compreende mais de uma proteína de STEC selecionada de Tir, EspA, EspB, EspD, NleA, Tccp, EspG, NleE e NleH. Em certas representações, as proteínas de STEC são de STEC O157:H7.

[0046] Em outras representações, as composições acima compreendem ainda qualquer uma das proteínas de fusão de múltiplos epítopos descritas acima.

[0047] Em determinadas representações, as composições descritas acima compreendem um adjuvante imunológico.

[0048] Em representações adicionais, a invenção é direcionada a um método para provocar uma resposta imunológica em um animal contra um antígeno de STEC, o método compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas acima. Em certas representações, o mamífero é um ruminante, como um bovino.

[0049] Em outras representações ainda, a invenção é direcionada a um método para reduzir a colonização de STEC em um ruminante, elou um método para reduzir a disseminação de STEC de um ruminante, compreendendo administrar ao ruminante uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas acima.

Breve Descrição dos Desenhos [0050] As Figuras 1A-1B (SEQ ID NOS:44 e 45) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 Tir.

[0051] As Figuras 2A-2B (SEQ ID NOS:46 e 47) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O26:H11 Tir.

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I 78 [0052] As Figuras 3A-3B (SEQ ID NOS:217 e 48) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O103:H2 Tir.

[0053] As Figuras 4A-4B (SEQ ID NOS:49 e 50) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O111:NM Tir.

[0054] As Figuras 5A-5B (SEQ ID NOS:51 e 52) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para uma construção Tir quimérica representativa.

[0055] As Figuras 6A-6B (SEQ ID NOS:53 e 54) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para uma construção Tir quimérica representativa unida a um veículo de leucotoxina.

[0056] A Figura 7 mostra a reatividade de peptídeos de STEC O157:H7 com anti-soros de coelhos produzidos contra STEC O157:H7, O26:H11,

O103:H2 e O111:NM TTSPs.

[0057] As Figuras 8A-8D mostram a reatividade cruzada de anticorpos policlonais de STEC produzidos contra STEC O157:H7, O26:H11, O103:H2 e O111:NM TTSPs com peptídeos O103:H2 Tir (8A); peptídeos O26:H11 Tir (8B); peptídeos O111:NM Tir (8C); e peptídeos O157:H7 Tir (8D).

[0058] As Figuras 9A-9C mostram o esquema de clonagem usado para a construção de uma proteína Tir quimérica representativa. A Figura 9A mostra os fragmentos individuais clonados incluindo locais de restrição e a localização dos espaçadores compostos de resíduos Gly e Ser. A Figura 9B mostra um diagrama de uma construção Tir quimérica representativa. A Figura 9C mostra um diagrama de uma construção Tir quimérica representativa unida a um veículo de leucotoxina LKT 352.

[0059] A Figura 10 descreve a estrutura do Plasmídeo pAA352 no qual tac é o promotor trp::lac hibrido de E. coli; bla representa o gene β-lactamase (resistência a ampicilina); ori é a origem de replicação do plasmídeo baseado em Col-El; lktA é o gene estrutural da leucotoxina P. haemolytica; e lacl é o repressor de operon lac de E. coli. A direção da transcriçãoItradução do gene de leucotoxina é indicada pela seta. O tamanho de cada componente não está desenhado em escala.

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I 78 [0060] As Figuras 11A-11I (SEQ ID NOS:55, 56 e 218) mostram a seqüência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos prevista da leucotoxina 352 (LKT 352) do plasmídeo pAA352. Tanto o gene estrutural para LKT 352 quanto as seqüências das regiões de flanco de vetor são mostradas.

[0061] As Figuras 12A-12J mostram resultados de ELISA usando soros de coelhos vacinados com proteínas Tir quiméricas e peptídeos imunogênicos não-O157 individuais. A Figura 12A mostra os resultados de títulos contra a proteína Tir quimérica. A Figura 12B mostra os resultados de títulos contra a proteína Tir LKT 352Iquimérica. A Figura 12B mostra os resultados de título contra a proteína Tir LKT 352Iquimérica. As Figuras 12C-12H mostram os resultados de título contra peptídeos não-O157 individuais da Tabela 2 dos Exemplos como se segue; Figura 12C, O26 peptídeo 2; Figura 12D, O26 peptídeo 3; Figura 12E, O103 peptídeo 5; Figura 12F, O111 peptídeo 3; Figura 12G, O111 peptídeo 4; Figura 12H, O111 peptídeo 5. A Figura 12I mostra os resultados de título contra o peptídeo SN11 de controle negativo. A Figura 12J mostra os resultados de título contra a proteína Tir de STEC O157:H7.

[0062] A Figura 13 mostra a resposta de anticorpos do soro de gado infectado experimentalmente com STEC O157:H7 contra proteínas secretadas de STEC O157. O Animal 1 é representado pelas barras cinza. O Animal 2 é representado pelas barras pontilhadas.

[0063] A Figura 14 mostra os resultados de ELISA usando amostras de soro humano infectado natural Walkerton contra o antígeno Tir STEC O157:h7.

[0064] A Figura 15 mostra a resposta de anticorpos de soro humano de pacientes HUS contra proteínas secretadas de STEC O157.

[0065] As Figuras 16A e 16B (SEQ ID NOS:197 e 198) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspA.

[0066] As Figuras 17A e 17B (SEQ ID NOS:199 e 200) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspB.

[0067] As Figuras 18A e 18B (SEQ ID NOS:201 e 202) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspD.

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I 78 [0068] As Figuras 19A e 19B (SEQ ID NOS:203 e 204) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 NleA.

[0069] As Figuras 20A e 20B (SEQ ID NOS:205 e 206) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspG.

[0070] As Figuras 21A e 21B (SEQ ID NOS:207 e 208) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 NleE.

[0071] As Figuras 22A e 22B (SEQ ID NOS:209 e 210) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 NleH-1.

[0072] As Figuras 23A e 23B (SEQ ID NOS:211 e 212) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 NleH2-1.

[0073] As Figuras 24A e 24B (SEQ ID NOS:213 e 214) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STE O157:H7 EspF.

[0074] As Figuras 25A e 25B (SEQ ID NOS:215 e 216) mostram a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspRI.

[0075] A Figura 26 mostra a quantidade de E. coli O157 fecal disseminado em camundongos tratados com placebo (); O157 TTSPs (▲) e uma mistura de recombinante O157:H7 EspG, NleH2-1, NleA, EspRI, EspF, EspB, EspD, EspA e o Tir quimérico (▼).

Descrição Detalhada da Invenção [0076] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia DNA recombinante, e imunologia, que estão no âmbito do conhecimento científico. Essas técnicas estão detalhadas na literatura. Ver, ex., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II e III, Segunda edição (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); as séries, Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan

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I 78 eds. Academic Press, Inc); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds. 1986, Blackwell Scientific Publications).

[0077] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui, seja supra ou infra, estão aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.

A. Definições [0078] Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e devem ser definidos como indicado abaixo.

[0079] Deve-se notar que, como utilizadas nessa especificação e nas reivindicações em anexo, as formas no singular de “um”, “uma” e “o,a” incluem os referentes no plural a não ser que o conteúdo especifique claramente em contrário. Assim, por exemplo, a referência à “uma bactéria de STEC” inclui uma mistura de duas ou mais dessas bactérias, e assim por diante.

[0080] Da forma usada aqui, o termo “proteína efetora” de STEC ou uma seqüência de nucleotídeos codificando o mesmo, significa uma proteína ou uma seqüência de nucleotídeos, respectivamente, que é derivada de qualquer um dos vários serótipos de STEC e que é translocada pela ilha de patogenicidade do locus for enterocyte effacement (LEE) (região de apagamento enterócito). Essa região codifica o sistema de secreção Esc-Esp tipo III que é crucial para a virulência da bactéria de STEC. Proteínas efetoras, no entanto, podem ser codificadas dentro ou fora da ilha de patogenicidade LEE. Múltiplas proteínas efetoras de STEC são conhecidas e várias seqüências são descritas aqui e no estado da arte. Ver, ex., Tobe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:14941-14946, bem como o divulgado aqui, para uma discussão sobre as proteínas efetoras de STEC LEE e não-LEE. Exemplos não limitadores de proteínas efetoras de STEC incluem Tir, NleA, TccP, EspM2 e EspB.

[0081] Da forma usada aqui, o termo “proteína estrutural” de STEC ou uma seqüência de nucleotídeos codificando a mesma, significa uma proteína ou uma seqüência de nucleotídeos, respectivamente, que é derivada de qualquer um dos serótipos de STEC e que é parte do complexo físico necessário para a secreção das proteínas efetoras para o interior da célula. Proteínas estruturais são geralmente encontradas em associação com a célula bacteriana. Exemplos dessas proteínas estruturais incluem componentes de

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I 78 agulha, assim como a base e a ponta da agulha; componentes de membrana externa e componentes de filamento. Várias de proteínas estruturais de STEC são conhecidas e as seqüências são descritas aqui e no estado da arte. Exemplos não limitadores de proteínas estruturais de STEC incluem EspA e EspD.

[0082] Da forma usada aqui, uma proteína de STEC recombinante, assim como, mas não limitado a, rTir, rEspA, rEspB, rEspD, rEspF, rEspRI, rNleA, rNleH2-1, rEspM2 e rTccp, bem como rIntimina, significa uma proteína produzida por expressão de um polinucleotídeo recombinante. Em geral, o gene de interesse é clonado e então expressado em organismos transformados, com descrito mais abaixo. O organismo hospedeiro expressa o gene estrangeiro para produzir a proteína sob condições de expressão. Uma proteína “recombinante” se refere à seqüência de polipeptídeos completa, fragmentos da seqüência de referência ou substituições, eliminações eIou adições à seqüência de referência, contanto que as proteínas retenham pelo menos um epítopo específico ou atividade. Geralmente, análogos da seqüência de referência apresentarão pelo menos cerca de 50% de identidade seqüencial, preferivelmente pelo menos cerca de 75% a 85% de identidade seqüencial, e ainda mais preferivelmente cerca de 90% a 95% ou mais de identidade seqüencial, em relação à seqüência de referência completa.

[0083] O termo “proteína de fusão de múltiplos epítopos” significa uma proteína incluindo mais de um epítopo de uma proteína efetora elou estrutural de STEC, na qual os epítopos não são encontrados na ordem em que eles são encontrados na natureza. Dessa forma, uma proteína de fusão de múltiplos epítopos inclui mais de uma repetição do mesmo epítopo, bem como mais de um epítopo da mesma proteína, ou mais de um epítopo de mais de uma proteína. Os epítopos não precisam ser diretamente conectados uns aos outros, não são repetidos na natureza da mesma maneira e, além disso, podem estar presentes em uma seqüência maior que inclui outros aminoácidos que não são epítopos de STEC. Para os objetivos desta invenção, as seqüências de epítopos presentes na fusão podem ser ou uma cópia exata de uma seqüência de epítopos do tipo natural, ou uma seqüência que é “funcionalmente equivalente” a ela, isto é, que provoque uma resposta imunológica substancialmente equivalente ou maior, como definido aqui, se

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I 78 comparado com a resposta provocada com um epítopo de identidade com a molécula completa da qual o epítopo é derivado, ou uma porção imunogênica dela. Adicionalmente, proteínas de fusão de múltiplos epítopos podem incluir as moléculas completas, ou seus fragmentos imunogênicos.

[0084] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” se referem a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a uma extensão mínima do produto. Assim, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, multímeros, e assim por diante, estão incluídos na definição. Tanto as proteínas completas quanto seus fragmentos são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e assim por diante. Além disso, para os objetivos da presente invenção, um “polipeptídeo” se refere à seqüência da proteína natural, bem como a uma proteína que inclui modificações, tais como eliminações, adições e substituições, à seqüência natural, contanto que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese site-direcionada, ou podem ser acidentais, como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação de PCR.

[0085] O termo “peptídeo” como é usado aqui se refere a um fragmento de um polipeptídeo. Assim, um peptídeo pode incluir uma eliminação Cterminal, uma eliminação N-terminal elou uma eliminação interna do polipeptídeo nativo, contanto que a seqüência inteira da proteína não esteja presente. Um peptídeo geralmente incluirá pelo menos cerca de 3-10 resíduos de aminoácidos contíguos da molécula completa, e pode incluir pelo menos aproximadamente 15-25 resíduos de aminoácidos contíguos da molécula completa, ou pelo menos cerca de 20-50 ou mais resíduos de aminoácidos da molécula completa, ou qualquer número entre 3 aminoácidos e o numero de aminoácidos da seqüência completa, contanto que o peptídeo em questão mantenha a capacidade de provocar a resposta biológica desejada.

[0086] Um “peptídeo” de STEC é um polipeptídeo que inclui menos do que a seqüência completa da proteína de STEC. Além disso, um peptídeo de STEC incluirá pelo menos um epítopo de modo que uma resposta imunológica possa ser gerada. Um peptídeo de STEC pode ser derivado de qualquer um dos vários serótipos de STEC, como descrito abaixo.

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I 78 [0087] Da forma usada aqui, “vacina” se refere a uma composição que serve para estimular uma resposta imune a um antígeno de STEC, como uma proteína efetora elou estrutural de STEC. A resposta imune não precisa proporcionar proteção eIou tratamento completo contra a infecção por STEC ou contra a colonização e disseminação de STEC. Até mesmo a proteção parcial contra a colonização e disseminação da bactéria de STEC encontrará uso aqui já que a disseminação e a produção de carne contaminada ainda será reduzida. Em alguns casos, uma vacina incluirá um adjuvante imunológico de modo a aumentar a resposta imune. O termo “adjuvante” se refere a um agente que age de uma maneira não específica para aumentar uma resposta imune a um antígeno em particular ou a uma combinação de antígenos, reduzindo assim a quantidade de antígenos necessária em qualquer vacina, elou a freqüência de injeção necessária para gerar uma resposta imune adequada ao antígeno de interesse. Ver, ex., A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26:619-630. Esses adjuvantes são descritos mais abaixo.

[0088] Da forma usada aqui, “colonização” se refere à presença de STEC no trato intestinal de um mamífero, com um ruminante.

[0089] Da forma usada aqui, “disseminação” se refere à presença de STEC em fezes.

[0090] Da forma usada aqui, “imunização” ou “imunizar” se refere à administração de uma composição de STEC, em uma quantidade eficaz para estimular o sistema imune do animal ao qual a composição é administrada, para provocar uma resposta imunológica contra um ou mais dos antígenos presentes na composição.

[0091] O termo “epítopo” se refere a um local em um antígeno ou hapteno ao qual as células B específicas elou as células T respondem. O termo também é usado de maneira intercambiável com “determinante antigênico” ou “sítio determinante antigênico”. Preferivelmente um epítopo é um peptídeo curto derivado de ou fazendo parte de um antígeno de proteína. Vários diferentes epítopos podem ser carregados por uma única molécula de antígeno. O termo “epítopo” também inclui seqüências modificadas de aminoácidos que estimulam respostas imunes que reconhecem todo o organismo. O epítopo pode ser gerado a partir do conhecimento do aminoácido e correspondentes seqüências de DNA do peptídeo ou polipeptídeo, bem como

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I 78 a partir da natureza de aminoácidos em particular (ex., tamanho, carga, etc.) e do dicionário códon, sem experimentação indevida. Ver, ex., Ivan Roitt, Essencial Immunology, 1988; Kendrew, supra; Janis Kuby, Immunology, 1992 e.g., pp. 79-81.

[0092] Uma “resposta imunológica” a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular eIou mediada por anticorpo à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma “resposta imunológica” inclui, mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células T γδ, direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro apresentará uma resposta imunológica terapêutica ou protetora de modo que a doença de STEC é diminuída ou evitada; é conferida resistência ao intestino à colonização com STEC; o numero de animais disseminando STEC é reduzido; a quantidade de STEC disseminada por um animal é reduzida; eIou o período de tempo de disseminação de STEC por um animal é reduzido.

[0093] Os termos proteína ou polipeptídeo “imunogênico” se refere a uma seqüência de aminoácidos que provoca uma resposta imunológica como descrito acima. Uma proteína ou polipeptídeo “imunogênico”, da forma usada aqui, inclui a seqüência completa da determinada proteína de STEC em questão, seus análogos, agregados, ou seus fragmentos imunogênicos. “Fragmento imunogênico” significa um fragmento de uma proteín a de STEC que inclui um ou mais epítopos e assim provoca a resposta imunológica descrita acima. Esses fragmentos podem ser identificados usando quaisquer técnicas de mapeamento de epítopos, bastante conhecidas. Ver, ex., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por ex., sintetizando ao mesmo tempo grandes quantidades de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, e reagir os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão ligados aos suportes. Essas técnicas são bastante conhecidas e descritas em, ex., U.S. Patent No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:3998-4002;

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Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, todos incorporados aqui na sua totalidade a título de referência. Similarmente, epítopos conformacionais são prontamente identificados ao se determinar a conformação espacial dos aminoácidos como, por ex., por cristalografia por raio x e ressonância magnética nuclear bi-dimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. As regiões antigênicas das proteínas também podem ser identificadas usando diagramas padrão de antigenicidade e hidropatia, como aqueles calculados usando, ex., o programa de software Omiga versão 1.0 disponível em Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método HoppIWoods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar perfis de antigenicidade, e a técnica KyteDoolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para diagramas de hidropatia.

[0094] Fragmentos imunogênicos, para os objetivos da presente invenção, incluirão geralmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-15 aminoácidos, e mais preferivelmente 25 ou mais aminoácidos, da molécula de proteína de STEC de origem. Não existe limite superior crítico para o comprimento do fragmento, que pode compreender quase que toda a extensão da seqüência da proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais epítopos da proteína de STEC em particular.

[0095] Um “antígeno” se refere a uma molécul a, como uma proteína, polipeptídeo, ou seus fragmentos, contendo um ou mais epítopos (seja linear, conformacional ou ambos) que estimularão o sistema imune de um hospedeiro a criar uma resposta antígeno específica humoral elou celular. O termo é usado de maneira intercambiável com o termo “imunogene”. Anticorpos como anticorpos anti-idiotipos, ou seus fragmentos, e peptídeos mimotopes sintéticos, que podem imitar um antígeno ou determinante antigênico, também estão abrangidos sob a definição de antígeno como é utilizada aqui. Similarmente, um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que expresse um antígeno ou determinante antigênico in vivo, como nas aplicações de imunização por DNA, também estão incluídos na definição de antígeno deste pedido.

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I 78 [0096] “Portadora” significa qualquer molécula que quando associada a um antígeno de interesse, confere imunogenicidade ao antígeno.

[0097] O termo toxina “RTX”, como é usado aqui se refere a uma proteína pertencente à família de moléculas caracterizada pela seqüência de aminoácidos de consenso carboxi-terminus Gly-Gly-X-GLY-X-Asp (Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28), onde X é Lys, Asp, Val ou Asn. Essas proteínas incluem, entre outras, leucotoxinas derivadas de P. haemolytica e Actinobacillus pleuropmeumoniae, bem como alfa hemolisina de E. coli (Strathdee et al., Infect. Immun. (1987) 55:3233-3236; Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:S33-S35; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528). Essa família de toxinas é conhecida como a família “RTX” de toxinas (Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:S33-S35). Adicionalmente, o termo toxina “RTX” se refere a um membro da família RTX que é quimicamente sintetizado, isolado de um organismo produzindo o mesmo, ou produzido recombinantemente. Além disso, o termo significa uma proteína imunogênica tendo uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga a uma seqüência de aminoácidos contígua encontrada na molécula de RTX nativa em particular. Assim, o termo inclui tanto as seqüências completas quanto as parciais, bem como as análogas. Embora as toxinas RTX completas apresentem atividade citotóxica, o termo “toxina RTX” também se refere a moléculas que permanecem imunogênicas, mas sem o caráter citotóxico das moléculas nativas. Nas quimeras produzidas de acordo com a presente invenção, uma seqüência de polipeptídeos RTX selecionada confere maior imunogenicidade a uma proteína de STEC fundida ou proteína de fusão de múltiplos epítopos.

[0098] O termo “polipeptídeo de leucotoxina” ou “polipeptídeo LKT” significa uma toxina RTX derivada de P. haemolytica e Actinobacillus pleuropmeumoniae, entre outras, como definido acima. As seqüências de nucleotídeos e as seqüências de aminoácidos correspondentes para varias leucotoxinas são conhecidas. Ver, ex., U.S. Patents Nos. 4,957,739 e 5,055,400; Lo et al., Infect. Immun. (1985) 50:667-67; Lo et al., Infect. Immun.(1987) 55:1987-1996; Strathdee et al., Infect. Immun. (1987) 55:32333236; Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528. Uma seqüência de polipeptídeos de leucotoxina selecionada

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I 78 confere maior imunogenicidade a uma proteína de STEC fundida ou proteína de fusão de múltiplos epítopos.

[0099] Uma proteína de STEC que é ligada a um portador apresenta “maior imunogenicidade” quando possui uma maior capacidade de provocar uma resposta imune do que a proteína correspondente sozinha. Essa maior imunogenicidade pode ser determinada através da administração de um determinado complexo proteínaIportador e proteína controle a animais e comparando os títulos de anticorpos com os dois usando testes padrão como radioimunoensaio e ELISA, bastante conhecidos.

[0100] O termo “purificado” se refere ao isolamento de uma substância (composto, polinucleotídeo, proteína, polipeptídeo, composição de polipeptídeo) em que a substância compreende a maior parte da amostra na qual ela reside. Tipicamente em uma amostra, um componente purificado compreende 50%, preferivelmente 80%-85%, mais preferivelmente 90-95% da amostra. Está expressamente excluída dessa definição de purificado um componente de um supernadante de cultura celular que contem uma mistura de antígenos de STEC que foram secretados no meio de crescimento, assim como descrito em U.S. Patent No. 7,300,659. As técnicas para purificar polinucleotídeos e polipeptídeos de interesse são bastante conhecidas e incluem, por exemplo, cromatografia por troca de íon, cromatografia por afinidade e sedimentação de acordo com a densidade.

[0101] “Isolado” significa, quando em relação a um polipeptídeo, que a molécula indicada é separada e discreta do organismo todo com o qual a molécula é encontrada na natureza ou está presente na ausência substancial de outras macro-moléculas biológicas do mesmo tipo. O termo “isolado” e m relação a um polinucleotídeo significa uma molécula de acido nucléico desprovida, no todo ou em parte, de seqüências normalmente associadas a ela na natureza; ou uma seqüência, como existe na natureza, mas tendo seqüências heterólogas em associação com ela; ou uma molécula desassociada do cromossomo.

[0102] Um “anticorpo” significa uma molécula que “reconhece”, i.e., se liga especificamente a um epítopo de interesse presente em um antígeno. “Se liga especificamente” significa que o anticorpo interage com o epítopo em um tipo de interação fechadura-e-chave para formar um complexo entre o antígeno

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I 78 e o anticorpo, em oposição à ligação não específica que pode ocorrer entre o anticorpo e, por exemplo, componentes em uma mistura que inclui a substância de teste com a qual o anticorpo é reagido. Assim, por exemplo, um anticorpo efetor anti-STEC é uma molécula que se liga especificamente a um epítopo da proteína efetora de STEC em questão. O termo anticorpo como é usado aqui inclui anticorpos obtidos tanto de preparações policlonais quanto monoclonais, bem como, o seguinte: moléculas de anticorpos (quiméricos) híbridos (ver, por exemplo, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; e U.S. Patent No. 4,816,567; fragmentos F(ab')2 e F(ab); moléculas Fv (heterodímeros não covalentes, ver, por exemplo, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; e Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096); moléculas Fv de cadeia única (sFv) (ver, por exemplo, Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:5879-5883); construções de fragmentos de anticorpos diméricos e triméricos; minicorpos (ver, ex., Pack et al., Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B:120-126); moléculas de anticorpos humanizados (ver, por exemplo, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; e U.K. Patent Publication No GB 2,276,169, publicada em 21 de setembro de 1994); e, quaisquer fragmentos funcionais obtidos de tais moléculas, nas quais esses fragmentos retenham propriedades de ligação imunológica com a molécula de anticorpo de origem.

[0103] Como é usado aqui, o termo “anticorpo monoclonal” se refere a uma composição de anticorpo tendo uma população de anticorpos homogênea. O termo não é limitado em relação à espécie ou fonte do anticorpo, nem pretende estar limitado pela maneira pela qual é feito. O termo abrange todas as imunoglobulinas bem como fragmentos tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros fragmentos, bem como populações de anticorpos homogêneos quiméricos e humanizados, que apresentam propriedades de ligação imunológica com a molécula de anticorpo monoclonal de origem.

[0104] Proteínas ou polipeptídeos “nativos” se referem às proteínas ou polipeptídeos isolados da fonte nas quais as proteínas naturalmente ocorrem. Polipeptídeos “recombinantes” se referem a polipeptídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante; i.e., produzidos a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógena codificando o polipeptídeo

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I 78 desejado. Polipeptídeos “sintéticos” são aqueles preparados por síntese química.

[0105] “Homologia” se refere à identidade percentual entre dois polinucleotídeos ou duas metades de polipeptídeos. Seqüências de dois ácidos nucléicos ou de dois polipeptídeos são “substancialmente homólogas” uma à outra quando as seqüências apresentam pelo menos cerca de 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%-98% de identidade seqüencial por uma extensão definida das moléculas. Como é usado aqui, substancialmente homólogo também se refere a seqüências apresentando identidade total com a seqüência especificada.

[0106] Em geral, “identidade” se refere a uma correspondência exata nucleotídeo-a-nucleotídeo ou aminoácido-a-aminoácido de duas seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, respectivamente. A identidade percentual pode ser determinada por uma comparação direta da informação de seqüência entre duas moléculas (a seqüência de referência e uma seqüência com % de identidade desconhecido em relação à seqüência de referência) pelo alinhamento das seqüências, pela contagem do exato número de semelhantes entre as duas seqüências alinhadas, dividindo pela extensão da seqüência de referência e multiplicando o resultado por 100. Programas de computador facilmente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, assim como ALIGN, Dayhoff, M.O. em Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para análise de peptídeos. Programas para determinar a identidade da seqüência de nucleotídeos estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível de Genetics Computer Group, Madison WI) por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também se baseiam no algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são facilmente utilizados com os parâmetros padrão recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package mencionado acima. Por exemplo, a identidade percentual de uma seqüência de nucleotídeos em particular em relação a uma seqüência de

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I 78 referência pode ser determinada usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de pontuação padrão e uma falha de lacuna de seis posições de nucleotídeos.

[0107] Outro método para estabelecer a identidade percentual no contexto da presente invenção é usando o pacote de programas MPSRCH registrado pela Universidade de Edinburgh, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir desse conjunto de programas o algoritmo Smith-Waterman pode ser empregado onde os parâmetros padrão são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, falha de abertura de lacuna de 12, falha de extensão de lacuna de um, e uma lacuna de seis). A partir dos dados gerados o valor de “Semelhança” reflete a “identidade de seqüência”. Outros programas apropriados para calcular a identidade percentual ou similaridade entre seqüências são geralmente conhecidos, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados com os seguintes parâmetros padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; cordão = ambos; corte = 60; expectativa = 10; matriz = BLOSUM62; descrições = 50 seqüências; classificação por = HIGH SCORE; banco de dados = não-redundante, Gen Bank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traduções + proteína Suíça + Spupdate + PIR. Detalhes desses programas estão facilmente disponíveis.

[0108] Alternativamente, a homologia pode ser determinada pela hibridização de polinucleotídeos sob condições que formem duplas estáveis entre regiões homólogas, seguido pela digestão com nuclease(s) específica de único cordão, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. As seqüências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigorosas, como definido para esse sistema em particular. A definição de condições apropriadas de hibridização está dentro do estado da arte. Ver, ex., Sambrook et al., supra; DNA Cloning; supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

[0109] “Recombinante” como é usado aqui para descrever uma molécula de acido nucléico significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, viral, semi-sintética ou sintética que, em virtude de sua origem ou manipulação

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I 78 não está associada com o todo ou uma parte do polinucleotídeo com o qual ela está associada na natureza.

[0110] O termo “transformação” se refere à inserção de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para essa inserção. Por exemplo, captação direta, transdução ou f-acasalamento estão incluídos. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou alternativamente, pode ser integrado ao genoma hospedeiro.

[0111] “Células hospedeiras recombinantes”, “células hospedeiras”, “células”, “linhas celulares”, “culturas celulares”, e outros termos semelhantes denotando microorganismos ou linhas celulares eucarióticas mais altas cultivadas como entidades unicelulares se referem a células que podem ser, ou foram, usadas como recipientes para um vetor recombinante ou outro DNA transferido, e incluem a descendência original da célula original que foi transfectada.

[0112] Uma “seqüência de codificação” ou uma seqüência que “codifica” um polipeptídeo selecionado, é uma molécula de acido nucléico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de seqüências regulamentares apropriadas (ou “elementos controle”). Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon inicial na terminação 5' (amino) e um códon terminal de tradução na terminação 3' (carboxi). Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não está limitada a, cDNA de mRNA vira, procariótico ou eucariótico, seqüências de DNA genômico de DNA viral ou procariótico, ou mesmo seqüências de DNA sintético. Uma seqüência de terminação de transcrição pode estar localizada a 3' da seqüência de codificação.

[0113] Típicos “elementos controle” incluem, mas não estão limitados a, promotores de transcrição, elementos para aumentar a transcrição, sinais de terminação de transcrição, seqüências de poliadenilação (localizadas a 3' do códon de termino de tradução), seqüências para a otimização da iniciação da tradução (localizadas a 5' da seqüência de codificação), e seqüências de terminação de tradução.

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I 78 [0114] Uma molécula de “acido nucléico” pode incluir, mas não está limitada a, seqüências procarióticas, mRNA eucariótico, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico de DNA eucariótico (ex., mamíferos), e mesmo seqüências de DNA sintético. O termo também abrange seqüências que incluem qualquer um dos conhecidos análogos base de DNA e RNA.

[0115] “Operacionalmente ligado” se refere a uma disposição de elementos onde os componentes assim descritos são configurados de modo a desempenhar a sua função usual. Assim, um determinado promotor operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação é capaz de efetuar a expressão da seqüência de codificação quando as enzimas certas estiverem presentes. O promotor não precisa ser contíguo à seqüência de codificação, contanto que funcione para direcionar a sua expressão. Assim, por exemplo, seqüências intervenientes não traduzidas mas transcritas podem estar presentes entre a seqüência promotora e a seqüência de codificação e a seqüência promotora ainda pode ser considerada “operacionalmente ligada” à seqüência de codificação.

[0116] “Codificado por” se refere a uma seqüência de acido nucléico que codifica para uma seqüência de polipeptídeo, na qual a seqüência de polipeptídeo de uma porção sua contem uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 3 a 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 8 a 10 aminoácidos, e mais preferivelmente ainda pelo menos 15 a20 aminoácidos de um polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucléico. Também abrangidas estão seqüências de polipeptídeo que são imunologicamente identificáveis com um polipeptídeo codificado pela seqüência.

[0117] O termo “transfecção” é usado para se referir à apropriação de DNA estrangeiro por uma célula. Uma célula foi “transfectada” quando DNA exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas. Ver, ex., Graham et al., (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, e Chu et al., (1981) Gene 13:197. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais metades de DNA exógeno em células hospedeiras apropriadas. O termo se refere tanto à

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I 78 captação estável quanto à transiente do material genético, e inclui captação de DNAs ligados a peptídeos ou anticorpos.

[0118] Um vetor é capaz de transferir seqüências de genes a células alvo (ex., vetores virais, vetores não-virais, veículos particulados, e lipossomas). Tipicamente, “construção de vetor”, “vetor de expressão” e “vetor de transferência de gene”, significam qualquer construção de acido nucléico capaz de direcionar a expressão de um gene de interesse e que pode transferir seqüências de genes a células alvo. Dessa forma, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais.

[0119] Como é usado aqui, uma “amostra biológica” se refere a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um paciente, incluindo, mas não limitado a, por exemplo, sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, bile, fluido espinhal, fluido linfático, amostras da pele, secreções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e genitourinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, órgãos, biópsias e também amostras de constituintes de cultura celular in vitro incluindo mas não limitado a meio condicionado resultante do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, ex., células recombinantes e componentes celulares.

[0120] Como são usados aqui, os termos “rótulo” e “rótulo detectável” se referem a uma molécula capaz de detecção, incluindo, mas não limitado a isótopos radioativos, fluorescers, quimioluminescers, enzimas, substratos de enzimas, cofatores de enzima, inibidores de enzima, cromóforos, corantes, íons de metal, sols de metal, ligantes (ex., biotina ou haptenos) e assim por diante. O termo “fluorescer” se refere a uma substância ou uma porção dela que é capaz de exibir fluorescência em um limite detectável. Exemplos particulares de rótulos que podem ser usados na invenção incluem fluoresceína, rodamina, dansyl, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, NADPH e α-β-galactosidase.

[0121] O termo “tratamento” como é usado aqui se refere ou (i) à prevenção de infecção ou re-infecção (profilaxia), ou (ii) à redução ou eliminação dos sintomas da doença de interesse (terapia). O tratamento também abrange a prevenção ou redução da colonização de STEC em um mamífero como um ruminante; eIou a redução da quantidade de STEC disseminado por um animal; eIou reduzir o período de tempo da disseminação de STEC por um animal.

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I 78 [0122] Como usado aqui, “quantidade terapêutica”, “quantidade eficaz” e “quantidade eficaz para” se referem a uma quantidade de vacina eficaz para provocar uma resposta imune contra um antígeno de STEC presente em uma composição, dessa maneira reduzindo ou evitando a doença por STEC, elou colonização por STEC de um mamífero como um ruminante; elou reduzindo o numero de animais disseminando STEC; elou reduzindo a quantidade de STEC disseminado por um animal; elou reduzindo o período de tempo de STEC disseminado por um animal.

[0123] “Mamífero” significa qualquer membro da classe dos mamíferos, incluindo humanos e outros animais possuidores de glândulas mamárias (tanto machos quanto fêmeas), tais como ruminantes, incluindo, mas não limitado a, espécies dos bovinos, suínos, e ovinos (ovelhas e cabras). O termo não denota uma idade em particular. Assim, adultos, recém nascidos, e fetos estariam englobados.

B. Métodos Gerais [0124] Fundamental para a presente invenção é a descoberta de que proteínas de fusão de múltiplos epítopos incluindo mais de um epítopo de STEC de mais de um serótipo de STEC, produzem uma resposta imune em animais aos quais elas são administradas. Alem disso, epítopos de proteínas efetoras e estruturais de STEC que geram anticorpos que reagem com proteínas de mais de um serótipo de STEC foram descobertos. As construções quiméricas e proteínas de STEC de reatividade cruzada são utilizadas em composições de vacinas para fornecer ampla proteção e tratamento da infecção por STEC, assim como a proteção contra a colonização. Dessa maneira, epítopos derivados de várias proteínas efetoras e estruturais de STEC de múltiplos serótipos de STEC encontrarão uso nas presentes composições e métodos. Esses epítopos podem ser fornecidos individualmente em uma ou mais subunidades de composições de vacinas, ou podem ser convenientemente fornecidos como uma proteína quimérica, expressada recombinantemente como uma proteína de fusão ou expressada individualmente e subsequentemente fundida.

[0125] Em certas representações, as composições compreendem uma proteína de fusão de múltiplo epítopo incluindo mais de um epítopo de mais de um serótipo de STEC, tais como múltiplos epítopos de Tir de múltiplos

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I 78 serótipos de STEC. Em outras representações, as composições compreendem uma mistura de proteínas efetoras elou estruturais de STEC purificadas, proteínas essas que geram anticorpos que reagem com proteínas de mais de um serótipo de STEC, assim como, mas não limitado a, proteínas de STEC selecionadas de EspA, EspB, EspD, EspG, EspF, EspRI, NleA, NLeH2-1, Tccp, Tir elou uma proteína de fusão de epítopo múltiplo como uma proteína com múltiplos epítopos Tir.

[0126] Em algumas representações, as construções de STEC ou proteínas de STEC purificadas são ligadas a moléculas portadoras para aumentar a imunogenicidade. Um adjuvante farmaceuticamente aceitável também pode ser administrado com as composições. As composições são administradas em uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune a um ou mais dos antígenos, dessa forma reduzindo ou eliminando a infecção por STEC. Em algumas instâncias, a colonização por STEC do animal é reduzida ou eliminada. Em representações preferíveis, o animal é uma vaca ou uma ovelha ou outro ruminante.

[0127] A imunização com as composições da invenção estimula o sistema imune do animal imunizado a produzir anticorpos contra um ou mais antígenos de STEC, tais como EspA, EspB, EspD, EspG, EspF, EspRI, NleA, NLeH2-1, Tccp elou Tir, que bloqueiam a fixação de STEC nas células epiteliais intestinais, interferem com a colonização por STEC e, consequentemente, reduzem a disseminação de STEC pelo animal. Essa redução da disseminação de STEC resulta em uma redução da contaminação de água e alimento por STEC e uma redução nas doenças causadas por STEC em humanos. Além disso, a capacidade da imunização de evitar, reduzir e eliminar a colonização e disseminação de STEC pelo gado supre uma antiga necessidade da medicina, e proporciona um importante benefício para os humanos.

[0128] Adicionalmente, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir as infecções por STEC em outros mamíferos como os humanos. O uso de antígenos purificados, como proteínas produzidas recombinantemente, permitem o controle dos antígenos presentes, ex., composições que não tem uma ou ambas as toxinas Shiga 1 e 2 de modo a reduzir a toxidade.

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I 78 [0129] A eficácia terapêutica das composições de STEC pode ser aumentada pela utilização de veículos naturais ou sintéticos, adjuvantes elou administrando as composições antes, ao mesmo tempo, ou após outro agente anti-STEC. Tais agentes incluem, mas não estão limitados a, agentes antiSTEC biológicos, biologicamente produzidos, químicos, baseados em acido nucléico e de proteína recombinante.

[0130] De modo a promover um melhor entendimento da invenção, é fornecida abaixo uma descrição mais detalhada referente a proteínas STEC e quimeras, suas produções, composições compreendendo as mesmas, e métodos de utilização de tais composições no tratamento ou prevenção de infecção, bem como no diagnóstico da infecção.

I. Polipeptídeos para uso em Construções Quiméricas e Vacinas de Combinação [0131] Como foi explicado acima, as proteínas da presente invenção fornecem ampla proteção contra mais de um serótipo de STEC em virtude do uso de construções quiméricas incluindo mais de um epítopo de uma ou mais proteínas efetoras eIou estruturais de STEC de um ou mais serótipo. Em representações alternativas, composições podem incluir proteínas de STEC purificadas, fragmentos imunogênicos eIou suas variantes, que geram anticorpos que reagem com antígenos de um ou mais serótipo de STEC.

[0132] Proteínas e epítopos para uso com a presente invenção podem ser obtidos de qualquer um dos vários serótipos de STEC, incluindo, sem limitação, serótipos de STEC dos serogrupos 0157, 0158, 05, 08, 018, 026, 045, 048, 052, 055, 075, 076, 078, 084, 091, O103, 0104, 0111, 0113, 0114, 0116, 0118, 0119, 0121, 0125, 028, 0145, 0146, 0163, 0165. Esses serótipos de STEC são facilmente obtidos de soros de animais infectados. Métodos para isolar STEC são bastante conhecidos. Ver, ex., Elder et al., Proc. Natl Acad. ScL USA (2000) 97:2999; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (1999) 40:332; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714. Geralmente, tais métodos acarretam a direta blindagem em agar MacConkey sorbitol suplementada com cefixima e telurito ou enriquecimento imunomagnético seguido de blindagem no mesmo meio. Além disso, as proteínas e epítopos de STEC podem ser obtidos de serótipos de STEC que tenham sido geneticamente produzidos para suprimir a expressão das toxinas Shiga 1 eIou 2, de modo a reduzir a toxidade.

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I 78 [0133] Proteínas de proteínas de fusão de múltiplos epítopos e composições compreendendo proteínas de STEC podem incluir qualquer uma das várias proteínas estruturais de STEC, bem como qualquer dos conhecidos efetores LEE e não-LEE. Tais proteínas incluem sem limitação, EspA, EspD, Tir, NIeA, EspB, TccP, Ler, Orf2, CesAIB, Orf4, Orf5, EscS, EscT, Rorfl3, GrIR, GrIA, CesD, EscC, SepD, EscJ, Orf8, SepZ, Orfl2, EscN, Orfl6, SepQ, EspH, CesF, Map, CesT, EscD, SepL, CesD2, EscF, Orf29, EspF, EspG, NIeB, NleB2-l, NIeC, NIeE, NIeF, NIeG, NIeH, NleHl-2, NleH2-l, NIel, NleG2-l, NleG22, NleG3, NleG5-l, NleG6-l, NleG8-2, NleG9, EspK, EspL2, EspM2, EspRl, EspV, EspW, EspX2, EspX7, EspYl, EspY2 e ESpY3.

[0134] As seqüências para várias proteínas de STEC são conhecidas elou estão descritas aqui. Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005594, AE005595, AP002566, AE005174, NC 002695, NC_002655, bem como U.S. Patent No. 6,855,814, aqui incorporados na sua totalidade a título de referência, para a seqüência completa do genoma E. coli 0157:H7, que inclui as seqüências das várias proteínas estruturais e efetoras O157:H7; ver GenBank Acessos Nos. AJ277443 e AJ303141, para as seqüências das ilhas de patogenicidade LEE de STEC O26:H11 e O103:H2, respectivamente, que inclui as seqüências de várias proteínas de STEC; ver GenBank Acesso No. AF025311 para as seqüências de STEC O111:H tir, intimina e uma chaperona.

[0135] Ver, ex., International Publication No. WO 97I40063, bem como GenBank Acessos Nos. AE005174, Y13068, U80908, U5681, Z54352,

AJ225021, AJ225020, AJ225019, AJ225018, AJ225017, AJ225016, AJ225015, AF022236, AF200363, NCJ)1 1601, NC_002695, BA000007 e AJ3O3141 para as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de EspA para um número de serótipos de E. coli. As Figuras 16A-16B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 EspA.

[0136] Ver, ex., Figuras 1A-1B para a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para STEC O157:H7 Tir; Figuras 2A-2B para a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para STEC O26:H11 Tir; Figuras 3A-3B para a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para STEC O103:H2 Tir; Figuras 4A-4B para a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de

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I 78 aminoácidos, respectivamente, para STEC O111:NM Tir; bem como International Publication No. WO 99I24576, bem como GenBank Acessos Nos. AF125993, AF132728, AF045568, AF022236, AF70067, AF070068, AF013122, AF200363, AFl 13597, AF070069, AB036053, AB026719, U5904 e U59502, para as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de Tir de um número de serótipos de E. coli.

[0137] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. U32312, U38618, U59503,

U66102, AF081 183, AF081182, AF130315, AF339751, AJ308551, AF3O1O15, AF329681, AF319597, AJ275089-AJ275113 para as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de Intimina de um número de serótipos de E. coli.

[0138] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005174, U80796, U65681, Yl 3068, Y13859, X96953, X99670, X96953, Z21555, AF254454, AF254455,

AF254456, AF254457, AF054421, AF059713, AF144008, AF144009, NCJ)11601, NCJ)02695, BA000007 e AJ303141 para as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de EspB de um número de serótipos de E. coli. As Figuras 17A-17B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 EspB.

[0139] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005174, Y13068, Y13859, Y17875, Y17874, Y09228, U65681, AF054421, AF064683, NCJ)11601,

NCJ)02695, BA000007 e A J303141 para as seqüências de nucleotídeos e seqüências de aminoácidos de EspD de um número de serótipos de E. coli. As Figuras 18A-18B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 EspD.

[0140] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005174, BAF9651, CAMl

1325, CAMl 1324, CAMl 1323, CAMl 1322, CAMl 1321, CAMl 1320, CAMl 1319, CAMI nIS5 CAMI nIT5 CAMI nIo5 CAMI nIS5 CAMI nM, CAMl 1313 e NC Ol 1601 para as seqüências de NIeA de um número de serótipos de E. coli. As Figuras 19A-19B mostra seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 NIeA.

[0141] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005174, AB356000,

AB355999, AB355998,AB355997, AB355996, AB355995, AB355659,

AB253549, AB253548, AB253547, AB253546, AB253545, AB253544,

AB253543, AB253542, AB253541, AB253540, AB253539, AB253538,

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I 78

AB253537, DQ206456, para as seqüências de Tccp de um número de serótipos de E. coli.

[0142] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AE005174, NC O 11601, NC_002695, BA000007 e AJ303141 para as seqüências de EspG, NIeE e NIeH de um número de serótipos de E. coli. As Figuras 20A-20B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 EspG. As Figuras 21A-21B, mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 NIeE. As Figuras 22A-22B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157.H7 NIeHl-I.

[0143] Ver, ex., GenBank Acessos Nos. AF022236; AJ303141;

NP_290250.1; YP_002331392.1; NP_310742.1; AAG58814.1 para as seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de EspF de um número de serótipos de E. coli. As Figuras 24A -24B mostram a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, para um representativo STEC O157:H7 EspF.

[0144] Ver, ex., Figuras 23A-23B para a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de um representativo STEC O157:H7 EspRI.

[0145] Epítopos de reatividade cruzada para uso nas composições bem como para uso nas quimeras da presente invenção podem ser facilmente identificadas pelo alinhamento das seqüências de proteínas STEC de, por ex., dois ou mais dos serótipos de STEC listados abaixo, e procurando pelas regiões varáveis e conservadas. Normalmente, é desejável incluir epítopos das regiões variáveis das moléculas de STEC de modo a conferir ampla proteção contra uma variedade de bactérias. Epítopos úteis também podem ser identificados, por ex., em serótipos STEC não-O157 que tenham divergido de STEC O157, mas sejam ainda reconhecidos pelo sistema imune hospedeiro. Por exemplo, no caso de Tir, porções abrangendo aminoácidos de 259 a 363 são de particular interesse já que se viu que esses aminoácidos estão expostos na superfície das células epiteliais do hospedeiro, tornando-as um alvo principal para o desenvolvimento da vacina.

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I 78 [0146] Epítopos adicionais podem ser identificados usando-se técnicas bastante conhecidas, assim como usando gráficos padrão de antigenicidade e hidropatia, por exemplo, aqueles calculados usando o programa de software Omiga versão 1.0 disponível de Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método HoppIWoods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar perfis de antigenicidade, e a técnica Kyte-Doolitle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para gráficos de hidropatia. Esse programa pode ser usado com os seguintes parâmetros: medir resultados em uma janela de 7; determinar probabilidade de superfície de acordo com Emini; flexibilidade de cadeia de acordo com Karplus-Schulz; índice de antigenicidade de acordo com Jameson-Wolf; estrutura secundária de acordo com Garnier-Osguthorpe-Robson; estrutura secundária de acordo com Chou-Fasman; e identificar locais previstos de glicosilação. Qualquer um que conheça o assunto pode facilmente usar a informação obtida em combinação com os ensinamentos da presente especificação para identificar regiões antigênicas que podem ser empregadas nas composições da invenção.

[0147] Em representações particularmente preferíveis, as composições contem proteínas de STEC ou seus fragmentos imunogênicos que geram anticorpos que reagem com STEC O157, tais como STEC O157:H7 elou O157:NM, e pelo menos um outro serótipo de STEC, preferivelmente pelo menos dois outros serótipos de STEC e mais preferivelmente ainda pelo menos três outros serótipos de STEC, como o STEC O26, ex., O26:H11, STEC O103, como o O103:H2 elou STEC O111, como o O111:NM, ou qualquer um dos serótipos de STEC descritos acima, em adição ao STEC O157. Como descrito nos exemplos, cada Tir, EspA, EspB, EspD, NleA e Tccp de STEC O157:H7 geram anticorpos que reagem com STEC O157:H7, bem como STEC O26:H11, STEC O103:H2 e STEC O111:NM (ver Tabela 5). Adicionalmente, cada EspG, NleE e NleH de STEC O157:H7 geram anticorpos que reagem com STEC O157:H7, bem como STEC O103:H2 e STEC O111:NM (ver Tabela 5).

[0148] Em certas representações, a invenção é direcionada a proteínas de fusão de múltiplos epítopos que incluem mais de um epítopo de um ou mais efetores de STEC elou proteínas estruturais. Os epítopos podem ser do mesmo serótipo de STEC E. coli, ou preferivelmente, de múltiplos serótipos de STEC. Adicionalmente, os epítopos podem ser derivados da mesma proteína

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I 78 de STEC ou de diferentes proteínas de STEC do mesmo ou de diferentes serótipos de STEC.

[0149] Mais particularmente, as quimeras podem compreender múltiplos epítopos, um número de diferentes proteínas de STEC do mesmo ou de um diferente serótipo, bem como repetições múltiplas ou conjugadas de seqüências de STEC selecionadas, repetições múltiplas ou conjugadas de epítopos de STEC selecionados, ou qualquer de suas combinações concebíveis. Os epítopos podem ser identificados usando técnicas como as descritas acima, ou fragmentos de proteínas de STEC podem ser testados para a imunogenicidade e fragmentos ativos usados em composições no lugar do polipeptídeo inteiro, com descrito nos exemplos. Os epítopos podem ser separados por espaçadores. O uso estratégico de varias seqüências de espaçadores entre polipeptídeos de STEC selecionados podem conferir maior imunogenicidade ás construções do sujeito. Dessa forma, na invenção, uma seqüência de espaçadores selecionados pode codificar uma ampla variedade de metades de um ou mais aminoácidos em extensão. Grupos de espaçadores selecionados também podem fornecer locais de divisão de enzimas de modo que a quimera expressada possa ser processada por enzimas proteolíticas in vivo (por APC's e assim por diante) para produzir um número de peptídeos.adicionalmente, seqüências de espaçadores podem ser construídas de modo a fornecer antigenicidade de célula T, tais como aquelas seqüências que são geralmente reconhecidas como fornecedoras de epítopos de célula T de auxílio imunogênico. Se incluídas, a escolha de epítopos de célula T em particular a serem fornecidos por essas seqüências de espaçadores podem variar dependendo das espécies em particular a serem vacinadas.

[0150] Particularmente preferíveis são as seqüências de espaçadores de aminoácidos. Esses espaçadores tipicamente incluirão de 1-500 aminoácidos, preferivelmente de 1-100 aminoácidos, mais preferivelmente de 1-50 aminoácidos, preferivelmente de 1-25 aminoácidos, e mais preferivelmente de 1-10 aminoácidos, ou qualquer número entre 1-500. Os aminoácidos espaçadores podem ser os mesmos ou diferentes entre os vários epítopos. Aminoácidos particularmente preferíveis para uso como espaçadores são aminoácidos com pequenos grupos laterais, tais como serina, alanina, glicina e valina.

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I 78 [0151] Embora determinadas quimeras sejam exemplificadas aqui e que incluem seqüências de espaçadores, deve-se notar que um ou mais dos epítopos presentes nas construções de fusão podem estar diretamente adjacentes a outro epítopo, sem uma seqüência de espaçadores interveniente.

[0152] As seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de uma determinada proteína de fusão de múltiplos epítopos de STEC é mostrada nas Figuras 5A e 5B (SEQ ID NOS:51 e 52), respectivamente, e uma representação diagramática da seqüência é mostrada na Figura 9B. Como mostrado nas Figuras 9A e 9B, essa proteína inclui epítopos derivados da proteína efetora Tir de quatro diferentes serótipos de STEC. A seqüência de DNA inclui a seqüência de codificação completa para STEC O157:H7, bem como 240 pares de base de STEC O111:NM Tir, 165 pares de base de STEC O26:H11 Tir e 90 pares de base de O103:H2 Tir. Essas seqüências são separadas por espaçadores compreendendo várias combinações de aminoácidos Gly e Ser.

[0153] A proteína inclui em N-terminal para a ordem de C-terminal a seqüência completa O157 Tir (aminoácidos 1 a 558 da Figura 5B), seguido pelo ligante Gly-Ser-Gly-Ser, seguido pelos aminoácidos 279 a 358 de O111 Tir (correspondente aos aminoácidos 565 a 644 na Figura 5B), seguido pelo ligante Ser-Gly-Ser-Gly, seguido pelos aminoácidos243 a 296 de O26 Tir (correspondente aos aminoácidos 651 a 705 na Figura 5B), seguido pelo ligante Ser-Ser-Gly-Gly, seguido pelos aminoácidos 318 a 347 de O103 (correspondente aos aminoácidos 712 a 741 na Figura 5B). Os aminoácidos 559-564, 645-650 e 706-711 na Figura 5B representam locais de restrição usados para inserir os fragmentos Tir.

II. Conjugados de Proteína [0154] De modo a aumentar a imunogenicidade das proteínas de STEC e moléculas de fusão de múltiplos epítopos, eles podem ser conjugados com um portador. “Portador” significa qualquer molécula que quando associada a um antígeno de interesse, confere imunogenicidade ao antígeno. Exemplos de portadores apropriados incluem grandes macromoléculas lentamente metabolizadas tais como: proteínas, polissacarídeos, como a sefarose, agarose, celulose, contas de celulose e assim por diante; aminoácidos poliméricos como o ácido poliglutâmico, polilisina, e assim por diante;

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I 78 copolímeros de aminoácidos; partículas de vírus inativos; toxinas bacterianas como toxóide do tétano, albuminas séricas, hemocianina de lapa californiana, tiroglobulina, ovalbumina, mioglobina de esperma de baleia, e outras proteínas bastante conhecidas. Outros portadores apropriados para os antígenos da presente invenção incluem polipeptídeos VP6 de rotavírus, ou seus fragmentos funcionais, como divulgado em U.S. Patent No. 5,071,651.

[0155] Esses portadores podem ser usados na sua forma nativa ou o seu conteúdo de grupo funcional pode ser modificado, por exemplo, por sucinilação de resíduos de lisina ou reação com Cis-tiolactona. Um grupo sulfidril também pode ser incorporado ao portador (ou antígeno), por exemplo, por reação das funções amino com 2-imithiolane ou o N-hdroxisucinimida ester de 3-(ditiopiridil propionato. Portadores apropriados também podem ser modificados para incorporar braços espaçadores (tais como hexametileno diamina ou outras moléculas bifuncionais de tamanho similar) para anexação de peptídeos.

[0156] Proteínas de STEC e moléculas de fusão de múltiplos epítopos também podem ser conjugados com um membro da família de toxinas RTX (como descrito mais abaixo) como o polipeptídeo de leucotoxina (LKT) Pasteurella haemolytica. Ver, por exemplo, International Publication No. WO 93I08290, publicado em 29 de abril de 1993, bem como U.S. Patent Nos. 5,238,823; 5,273,889; 5,723,129; 5,837,268; 5,422,110; 5,708,155; 5,969,126; 6,022,960; 6,521,746 e 6,797,272, todas incorporadas aqui a título de referência na sua totalidade.

[0157] Portadores de polipeptídeo de leucotoxina são derivados de proteínas pertencentes à família de moléculas caracterizada pela seqüência de aminoácidos de consenso carboxi-terminus Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28), onde X é Lys, Asp, Val ou Asn. Essas proteínas incluem, entre outras, leucotoxinas derivadas de P. haemolytica e Actinobacillus pleuropneumoniae, bem como alfa hemolisina E. coli (Stradhdee et al., Infect. Immun. (1987) 55:3233-3236; Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:S33S35; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528). Essa família de toxinas é conhecida como a família de toxinas “RTX” (Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:S33-S35). As seqüências de nucleotídeos e seqüências de aminoácidos correspondentes para várias leucotoxinas são conhecidas. Ver, por exemplo,

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U.S. Patent Nos. 4,957,739 e 5,055,400; Lo et al., Infect. Immun. (1985) 50:667-67; Lo et al., Infect. Immun. (1987) 55:3233-3236; Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528. Exemplos particulares de polipeptídeos de leucotoxina imunogênica para utilização aqui incluem LKT 342, LKT 352, LKT 111, LKT 326 e LKT 101 que estão descritas mais detalhadamente abaixo.

[0158] “LKT 352” significa uma proteína que é derivada do gene IktA presente no plasmídeo pAA352 (Figura 10) e descrita em U.S. Patent No. 5,476,657, aqui incorporada a título de referência na sua totalidade. LKT 352 tem um entroncamento N-terminal da seqüência de leucotoxina nativa e inclui os aminoácidos 38-951 da molécula nativa. Assim, o gene no plasmídeo pAA352 codifica uma leucotoxina truncada, tendo 914 aminoácidos que não tem a porção citotóxica da molécula. As seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de LKT 352 são mostradas nas Figuras 11A-11I.

[0159] “LKT 111” significa um polipeptídeo de leucotoxina que é derivado do gene lktA presente no plasmídeo pCB111. A seqüência de plasmídeo e nucleotídeo desse gene e a correspondente seqüência de aminoácidos estão descritas em U.S. Patent Nos. 5,723,129 e 5,969,126, aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. O gene codifica uma versão encurtada da leucotoxina que foi desenvolvida a partir do gene de leucotoxina recombinante prsente no plasmídeo pAA352 pela remoção de um fragmento interno de DNA de aproximadamente 1300 bp de comprimento. O polipeptídeo LKT 111 tem um peso molecular estimado de 52 kDa (em comparação com o 99 kDa do polipeptídeo LKT 352), mantém a capacidade de atuar como uma molécula transportadora, e contém locais de restrição convenientes para uso na produção das proteínas de fusão da presente invenção.

[0160] “LKT 101” significa um polipeptídeo de leucotoxina que é derivado do gene lktA presente no plasmídeo pAA101. O plasmídeo e seqüência de LKT 101 é descrito em U.S. Patent No. 5,476,657 (ver Figura 3), aqui incorporada a título de referência na sua totalidade. O polipeptídeo LKT 101 é expressado a partir de uma forma truncada C-terminalmente do gene lktA que contém a terminação 5' do gene até o local único de endonucle ase de restrição Pst1. Assim, LKT 101 inclui os primeiros 377 aminoácidos da leucotoxina P. haemolytica nativa, completa.

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I 78 [0161] “LKT 342” significa um polipeptídeo de leucotoxina que é derivado do gene IktA presente no plasmídeo pAA342, descrito em U.S. Patent No. 5,476,657, aqui incorporado na sua totalidade. LKT 342 tem um entroncamento N-terminal e C-terminal da seqüência de leucotoxina nativa e inclui os aminoácidos 38-334 da leucotoxina nativa.

[0162] As várias moléculas de LKT descritas acima são representativas e outras moléculas de leucotoxina que aumentam a imunogenicidade das proteínas de STEC e fusões também encontrarão uso aqui. Além disso, as moléculas de leucotoxina não precisam ser fisicamente derivadas da seqüência presente nos plasmídeos correspondentes, mas precisam ser geradas de uma maneira qualquer, incluindo, por exemplo, síntese química ou produção recombinante, como descrito abaixo.

[0163] Adicionalmente, as proteínas de STEC e moléculas de fusão de múltiplos epítopos podem ser fundidas aos terminais carboxil ou amino, ou à molécula portadora, ou a locais internos ao portador.

[0164] Portadores podem ser fisicamente conjugados às proteínas de interesse, usando reações de acoplamento padrão. Alternativamente, moléculas quiméricas podem ser preparadas recombinantemente para uso na presente invenção, assim como fundindo um gene codificando um portador de polipeptídeo apropriado a uma ou mais cópias de um gene, ou fragmento dele, codificando para proteínas de STEC selecionadas ou moléculas de fusão de múltiplos epítopos de STEC.

[0165] As seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de uma construção quimérica exemplar incluindo um portador de leucotoxina são mostradas nas Figuras 6A e 6B, respectivamente, e uma representação diagramática da seqüência é mostrada na Figura 9C. Essa construção é idêntica à construção Tir quimérica descrita acima, com a exceção de que uma molécula portadora de leucotoxina está presente no N-terminus.

[0166] A proteína inclui na ordem N-terminal para C-terminal uma curta seqüência vetor de pAA352 (correspondente aos aminoácidos 1-9 da Figura 6B), LKT 352 (correspondente aos aminoácidos 10-923 da Figura 6B), uma curta seqüência vetor de pAA352 (aminoácidos 924-926 da Figura 6B), aminoácidos 2 a 558 de Tir O157 (correspondente aos aminácidos 927 a 1483 na Figura 6B), seguido pela ligação Gly-Ser-Gly-Ser, seguido pelos

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I 78 aminoácidos279 a 358 de Tir O111 (correspondente aos aminoácidos 1490 a 1569 na Figura 6B), seguido pela ligação Ser-Gly-Ser-Gly, seguido pelos aminoácidos 243 a 296 de Tir O26 (correspondente aos aminoácidos 1576 a 1630 na Figura 6B), seguido pela ligação Ser-Ser-Gly-Gly, seguido pelos aminoácidos 318 a 347 de O103 (correspondente aos aminoácidos 1635 a 1666 na Figura 6B). Os aminoácidos 1484-1489, 1570-1575 e 1631-1634 na Figura 6B representam locais de restrição usados para inserir os fragmentos de Tir.

III. Produção de Proteínas de STEC, Construções de Fusão de Múltiplos Epítopos e Conjugados [0167] As proteínas de STEC e seus fragmentos imunogênicos, e conjugados com moléculas portadoras, podem ser preparados de qualquer maneira apropriada (ex., expressão recombinante, purificação de cultura celular, síntese química, etc.) e de várias formas (nativa, mutante, fusões, etc.). Os modos de preparação dessas proteínas e conjugados são bastante conhecidos. Proteínas e conjugados são preferivelmente preparados na forma substancialmente pura (i.e. substancialmente livre de outra célula hospedeira ou proteínas não sendo de célula hospedeira).

[0168] As proteínas e seus conjugados podem ser convenientemente sintetizados quimicamente, por qualquer uma das várias técnicas que são conhecidas na ciência dos peptídeos. De maneira geral, esses métodos empregam a adição seqüencial de um ou mais aminoácidos a uma crescente cadeia de peptídeos. Normalmente, o grupo amino ou o carboxil do primeiro aminoácido é protegido por um grupo protetor apropriado. O aminoácido protegido ou derivatizado pode ser ou anexado a um suporte sólido inerte ou utilizado em solução adicionando o aminoácido seguinte na seqüência tendo o grupo (amino ou carboxil) complementar apropriadamente protegido, sob condições que permitam a formação de uma ligação de amida. O grupo protetor é então removido do resíduo de aminoácido recém adicionado e o aminoácido seguinte (apropriadamente protegido) é então adicionado, e assim por diante. Após os aminoácidos desejados terem sido ligados na seqüência correta, quaisquer grupos protetores remanescentes (e qualquer suporte sólido, se forem usadas técnicas de síntese de fase sólida) são removidos sequencialmente ou simultaneamente, para proporcionar o polipeptídeo final.

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Com a simples modificação desse procedimento geral, é possível adicionar mais de um aminoácido a uma cadeia crescente, por exemplo, acoplando (sob condições que não racemizem centros quirais) um tripeptídeo protegido com um dipeptídeo apropriadamente protegido para formar, após a desproteção, um pentapeptídeo. Ver, por exemplo, J.M Stewart e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) e G. Barany e R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross e J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), pp. 3-254, para técnicas de síntese de peptídeos de fase sólida; e M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlim 1984) e E. Gross e J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, para síntese de solução clássica.

[0169] Típicos grupos protetores incluem t-butyloxycarbonyl (Boc),9fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) benzyloxycarbonyl (Cbz); p-toluenesulfonyl (Tx); 2,4-dinitrophenyl; benzyl (BzI); biphenylisopropyloxycarboxy-carbonyl, tamyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, o-bromobenzyloxycarbonyl, cyclohexyl, isopropyl, acetyl, o-nitrophenylsulfonyl e assim por diante. Típicos suportes sólidos são suportes poliméricos de ligação cruzada. Eles podem incluir divinylbenzene cross-linked-styrene-based polymers, por exemplo, divinylbenzene-hydroxymethylstyrene copolymers, divinylbenzenechloromethylstyrene copolymers and diviny lbenzenebenzhydrylaminopolystyrene copolymers.

[0170] As proteínas e conjugados da presente invenção também podem ser quimicamente preparados por outros métodos assim como pelo método de síntese de peptídeos múltiplos simultâneos. Ver, por exemplo, Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:5131-5135; U.S. Patent No. 4,631,211.

[0171] Alternativamente, as proteínas e conjugados acima descritos podem ser produzidos recombinantemente. Ver, por exemplo, International Publication Nos. WO 97I40063 e WO 99I24576, e U.S. Patent No. 7,300,659, para uma descrição da produção de proteínas de STEC recombinantes representativas, cujas publicações e patente estão aqui incorporadas a título de referência na sua totalidade. As proteínas da invenção opcionalmente tem, mas não precisam sempre incluir, uma metionina N-terminal para expressão.

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I 78 [0172] Uma vez que as seqüências de codificaçãos para as proteínas desejadas tenham sido isoladas ou sintetizadas, elas podem ser clonadas em qualquer vetor apropriado ou replicon para expressão. Numerosos vetores de clonagem são conhecidos, e a seleção de um vetor de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Uma variedade de sistemas de expressão bacterianos, de levedura, plantas, mamíferos e insetos estão disponíveis e qualquer desses sistemas de expressão pode ser usado. Opcionalmente, um polinucleotídeo codificando essas proteínas pode ser traduzido em um sistema de tradução livre de célula. Esses métodos são bastante conhecidos.

[0173] Exemplos de vetores de DNA recombinante para clonagem e células hospedeiras que eles podem transformar incluem b acteriophage λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGVl 106 (bactérias gram-negativas), pLAFRl (bactérias gram-negativas), pME290 (bactérias gram-negativas não-E. coli), pHV14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp 19 (Saccharomyces) e papilloma virus bovino (células de mamíferos). Ver, geralmente, DNA Cloning: VoIs. I & II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra.

[0174] Sistemas de expressão de células de insetos, como os sistemas baculovirus, também podem ser usados e são bastante conhecidos e são descritos, por exemplo, em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovirusIcélula de inseto estão comercialmente disponíveis em, entre outros, Invitrogen, San Diego Califórnia (kit “MaxBac”).

[0175] Sistemas de expressão de plantas também podem ser usados para produzir as proteínas imunogênicas. Geralmente, esses sistemas são vetores baseados em vírus para transfectar células de plantas com genes heterólogos. Para uma descrição desses sistemas, ver, por exemplo, Porta et al., Mol. Biotech. (1996) 5:209-221; e Hackiand et al., Arch. Virol. (1994) 139:122.

[0176] Sistemas virais, como o sistema de infecçãoItransfecção baseado em vaccinia, como descrito em Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026 e Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113, também encontrarão uso na presente invenção. Nesse sistema, as células são primeiramente transfectadas

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I 78 in vitro com um recombinante do vírus vaccinia que codifica a bacteriophage T7 RNA polimerase. Essa polimerase apresenta uma certa especificidade já que apenas transcreve modelos com promotores T7. Após a infecção, as células são transfectadas com o DNA de interesse, conduzido por um promotor T7. A polimerase expressada no citoplasma do recombinante do vírus vaccinia transcreve o DNA transfectado em RNA que é então traduzido em proteína pela maquinaria translacional hospedeira. O método proporciona produção citoplásmica de alto nível e transiente de grandes quantidades de RNA e seus produtos de tradução.

[0177] A seqüência de codificação pode ser colocada sob o controle de um local de ligação de ribosoma, promotor (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador (chamado aqui coletivamente de elementos “controle”), de modo que a seqüência de DNA codificando o peptídeo imunogênico desejado é transcrito em RNA na célula hospedeira transformada por um vetor contendo essa construção de expressão. A seqüência de codificação pode ou não conter um peptídeo de sinal ou seqüência líder. Seqüências líder podem ser removidas pelo hospedeiro em um processo póstranslacional. Ver, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 4,431,739; 4,425,437;

4,338,397.

[0178] Outras seqüências reguladoras também podem ser desejáveis e permitem a regulação da expressão das seqüências de peptídeos em relação ao crescimento da célula hospedeira. Essas seqüências reguladoras são bastante conhecidas e exemplos incluem aquelas que causam que a expressão de um gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores também podem estar presentes no vetor, por exemplo, seqüências intensificadoras.

[0179] As seqüências controle e outras seqüências reguladoras podem ser ligadas à seqüência de codificação antes da inserção em um vetor. Alternativamente, a seqüência de codificação pode ser clonada diretamente em um vetor de expressão que já contenha as seqüências controle e um local de restrição apropriado.

[0180] Em alguns casos pode ser necessário modificar a seqüência de codificação de modo que ela possa ser anexada às seqüências controle com a

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I 78 orientação apropriada; i.e., manter a estrutura de leitura adequada. Também pode ser desejável produzir mutantes ou análogos das proteínas imunogênicas. Mutantes ou análogos podem ser preparados pela supressão de uma parte da seqüência que codifica a proteína, pela inserção de uma seqüência, elou pela substituição de um ou mais nucleotídeos dentro da seqüência. As técnicas para modificar seqüências de nucleotídeos, tais como a mutagênese site-direcionada, são bastante conhecidas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I e II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

[0181] O vetor de expressão é então usado para transformar uma célula hospedeira apropriada. Uma quantidade de linhas de células de mamíferos são bastante conhecidas e incluem linhas de células imortalizadas disponíveis de American Type Culture Collection (ATCC), assim como, mas não limitado a, células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rins de hamster bebê (BHK), células de rins de macacos (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (ex., Hep G2), assim como outras. Similarmente, hospedeiros bacterianos como E. coli, Bacillus subtilis, e Streoptococus spp., encontrarão uso com as construções da presente expressão. Hospedeiros de levedura úteis na presente invenção incluem, entre outros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillepmondu, Pichia pastor is, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. Células de insetos para uso com vetores de expressão do baculovirus incluem, entre outros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni.

[0182] Dependendo do sistema de expressão e hospedeiro selecionado, os peptídeos da presente invenção são produzidos pelo crescimento das células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão descrito acima sob condições pelas quais a proteína de interesse é expressada. A seleção das condições apropriadas de crescimento é do conhecimento científico. As células são então quebradas, usando meios químicos, físicos ou mecânicos, que lisam as células mas mantém os peptídeos substancialmente intactos. Proteínas intracelulares também podem ser obtidas pela remoção de componentes da parede celular ou membrana, ex., pelo uso de detergentes ou solventes

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I 78 orgânicos, de modo que ocorra o vazamento de polipeptídeos imunogênicos. Esses métodos são bastante conhecidos e estão descritos em, por exemplo, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E.L.V. Harris e S. Angal, Eds., 1990).

[0183] Por exemplo, métodos de quebra de células para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a: sonicação ou ultrasonicação; agitação; extrusão liquida ou sólida; tratamento por calor; congelamento-descongelamento; dessecação; descompressão explosiva, choque osmótico; tratamento com enzimas líticas incluindo proteases como a tripsina, neuraminidase e lisosima; tratamento alcalino; e o uso de detergentes e solventes como os sais de bile, dodecilsulfato de sódio, Triton, NP40 e CHAPS. A técnica particular usada para quebrar as células é na maior parte das vezes uma questão de escolha e dependerá do tipo de célula na qual o polipeptídeo é expressado, condições de cultura e qualquer pré-tratamento utilizado.

[0184] Após a quebra das células, os restos celulares são removidos, geralmente por centrifugação, e a proteína produzida intracelularmente é então purificada, usando técnicas padrão de purificação tais como, mas não limitadas a, cromatografia por coluna, cromatografia por troca de íon, cromatografia por tamanho-exclusão, eletroforese, HPLC, técnicas imunoabsorventes, cromatografia por afinidade, imunoprecipitação, e assim por diante.

[0185] Por exemplo, um método para se obter a proteína intracelular da presente invenção envolve purificação por afinidade, assim como através de cromatografia por imunoafinidade usando anticorpos específicos. A escolha de uma resina de afinidade apropriada é do conhecimento científico. Após a purificação por afinidade, o peptídeo pode ser então purificado através de técnicas convencionais bastante conhecidas, assim como por qualquer uma das técnicas descritas acima.

IV. Anticorpos de STEC [0186] As proteínas de STEC e as proteínas de fusão de múltiplos epítopos da presente invenção podem ser usadas para produzir anticorpos para propósitos terapêuticos, de diagnóstico e de purificação. Esses anticorpos podem ser preparações de anticorpos policlonais ou monoclonais, anti-soros monoespecíficos, anticorpos humanos, ou podem ser anticorpos híbridos ou

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I 78 quiméricos, tais como anticorpos humanizados, anticorpos alterados, fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab), fragmentos Fv, anticorpos de domínio único, construções com fragmentos de anticorpos diméricos ou triméricos, minicorpos, ou seus fragmentos funcionais que ligam ao antígeno em questão. Os anticorpos são produzidos com técnicas científicas bastante conhecidas e divulgadas em, por exemplo, U.S Patent Nos. 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380; e 4,372,745.

[0187] Por exemplo, as proteínas podem ser usadas para produzir anticorpos policlonais e monoclonais STEC-específicos para uso em testes de diagnóstico e detecção, para purificação e para uso como terapêutica, como para imunização passiva. Esses anticorpos policlonais e monoclonais ligam especificamente às proteínas de STEC em questão. Em particular, as proteínas de STEC podem ser usadas para produzir anticorpos policlonais através da administração das proteínas a um mamífero, como um camundongo, um rato, um coelho, um bode ou um cavalo. O soro do animal imunizado é coletado e os anticorpos são purificados do plasma por, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, seguido de cromatografia, preferivelmente cromatografia por afinidade. As técnicas para produzir e processar anti-soros policlonais são do conhecimento científico.

[0188] Os anticorpos monoclonais de camundongos elou ratos direcionados contra epítopos presentes no antígeno da superfície celular também podem ser facilmente produzidos. De modo a produzir esses anticorpos monoclonais, o mamífero de interesse, como o coelho ou camundongo, é imunizado, como por exemplo por mixagem ou emulsificando o antígeno em solução salina, preferivelmente em um adjuvante completo de Freund (“FCA”), e injetando uma mistura ou emulsão parenteralmente (geralmente na forma subcutânea ou intramuscular). O animal recebe geralmente uma dose de reforço 2-6 semanas depois com uma ou mais injeções do antígeno em solução salina, preferivelmente usando o adjuvante incompleto de Freund (“FIA”).

[0189] Anticorpos também podem ser gerados por imunização in vitro, usando métodos científicos conhecidos. Ver, por exemplo, James et al., J. Immunol. Meth. (1987) 100:5-40.

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I 78 [0190] Anti-soros policlonais são então obtidos do animal imunizado. Entretanto, ao invés de sangrar o animal para extrair o soro, o baço (e opcionalmente vários grandes nodos linfáticos) é removido e desassociado em células únicas. Se desejado, as células do baço (esplenócitos) podem ser examinadas (após a remoção de células não-especificamente aderentes) aplicando-se uma suspensão celular a uma placa ou poço revestido com o antígeno. Células-B, expressando imunoglobulina de ligação com membrana específica para o antígeno, se ligarão à placa, e não são levadas com o resto da suspensão. Células-B resultantes, ou todos os esplenócitos desassociados, são então induzidos a se fundir com células de uma linha celular imortalizada (também chamada de “parceiro de fusão”), para formar hibridomas. Tipicamente, o parceiro de fusão inclui uma propriedade que permite a seleção dos hibridomas resultantes usando meios específicos. Por exemplo, parceiros de fusão podem ser hypoxanthinalaminopterinaltimidina (HAT)-sensitivo.

[0191] Se forem desejados hibridomas coelho-coelho, a linha celular imortalizada será de um coelho. Esses parceiros de fusão coelho-derivados são conhecidos e incluem, por exemplo, células de origem linfóide, como as células de um plasmacitoma de coelho como descrito em Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1995) 92:9348-9352 e U.S. Patent No. 5,675,063, ou o parceiro de fusão TP-3 descrito em U.S. Patent No. 4,859,595, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade. Se um hibridoma coelhocamundongo ou um hibridoma rato-camundongo ou camundongocamundongo, e assim por diante, for desejado, o parceiro de fusão do camundongo será derivado de uma linha celular imortalizada de um camundongo, como uma célula de origem linfóide, tipicamente de uma linha celular de mieloma de camundongo. Várias dessas linhas celulares são conhecidas e estão disponíveis de ATCC.

[0192] A fusão é realizada usando técnicas bastante conhecidas. Substâncias químicas que promovem a fusão são comumente chamadas de fusogens. Esses agentes são extremamente hidrofílicos e facilitam o contato da membrana. Um método particularmente preferível de fusão celular usa polietileno glicol (PEG). Outro método de fusão celular é a eletrofusão. Nesse método, as células são expostas a uma descarga elétrica pré-determinada que altera a membrana celular potencial. Métodos adicionais para fusão celular

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I 78 incluem métodos de fusão por ponte. Nesse método, o antígeno é biotinilado e o parceiro de fusão é avidinilado. Quando as células são unidas, uma ponte antígeno-reativa célula B-antígeno-biotina-avidina-parceiro de fusão é formada. Isso permite a fusão específica de uma célula antígeno-reativa com uma célula imortalizadora. O método pode adicionalmente empregar meios químicos ou elétricos para facilitar a fusão celular.

[0193] Após a fusão, as células são cultivadas em um meio seletivo (ex., meio HAT). De modo a aumentar a secreção de anticorpos, um agente que tenha efeitos de estimulação de secreção pode ser opcionalmente usado, como o IL-6. Ver, por exemplo, Liguori et al., Hybridoma (2001) 20:189-198. Os hibridomas resultantes podem ser blindados por diluição limitante, e são analisados em relação à produção de anticorpos que ligam especificamente ao antígeno imunizador (e que não ligam a antígenos não-relacionados). Os hibridomas monoclonais secretadores de anticorpos selecionados são então cultivados ou in vitro (ex., em frascos de cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ou in vivo (ex. ascites em camundongos). Por exemplo, hibridomas produzindo proteína - específica de STEC podem ser identificados usando RIA ou ELISA e isolados por clonagem em agar semi-sólido ou por diluição limitante. Os clones produzindo os anticorpos desejados podem isolados por outra rodada de exames.

[0194] Uma técnica alternativa para gerar os anticorpos monoclonais da presente invenção é o método de anticorpos de linfócito selecionado (SLAM). Esse método envolve identificar um único linfócito que está produzindo um anticorpo com a especificidade ou função desejada dentro de uma grande população de células linfóides. A informação genética que codifica a especificidade do anticorpo (i.e., a imunoglobulina VH e VL DNA) é então recuperada e clonada. Ver, por exemplo, Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:7843-7848, para uma descrição desse método.

[0195] Para outras descrições de anticorpos monoclonais de coelhos e métodos para fazer o mesmo a partir de fusões coelho-coelho e coelhocamundongo, ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,675,063 (coelho-coelho); 4,859,595 (coelho-coelho); 5,472,868 (coelho-camundongo); e 4,977,081 (coelho-camundongo). Para uma descrição da produção de anticorpos

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I 78 monoclonais convencionais de camundongos, ver, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256:495-497.

[0196] Pode ser desejável fornecer anticorpos quiméricos. “Anticorpos quiméricos” se refere a anticorpos que são preferivelmente derivados usando técnicas recombinantes e que compreendem tanto componentes humanos (incluindo espécies imunologicamente “relacionadas”, ex., chimpanzés) quanto não humanos. Esses anticorpos também são chamados de “anticorpos humanizados”. Preferivelmente, os anticorpos humanizados contêm uma seqüência mínima derivada de seqüências de imunoglobulina não humana. Na maioria das vezes, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) cujos resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) como um camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejada especificidade, afinidade e capacidade. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762;

5,859,205. Em algumas instâncias, resíduos estruturais da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes (ver, por exemplo, U.S. Patents 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762). Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar mais ainda o desempenho do anticorpo (ex., para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes ver Jones et al., Nature (1986) 331:522-525; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. (1992) 2:593-596.

[0197] Também abrangidos estão anticorpos xenogenéicos ou modificados produzidos em um hospedeiro mamífero não humano, mais particularmente um camundongo transgênico, caracterizado por loci de

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I 78 imunoglobulina endógena desativada (Ig). Nesses animais transgênicos, genes endógenos competentes para a expressão de subunidades leves e pesadas de imunoglobulinas de hospedeiro são tornados não funcionais e substituídos pelos loci de imunoglobulina humana análoga. Esses animais transgênicos produzem anticorpos humanos na ausência substancial de subunidades de imunoglobulina leves ou pesadas de hospedeiro. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5,939,598.

[0198] Fragmentos de anticorpos que mantêm a capacidade de reconhecer a proteína de interesse, também encontrarão uso aqui. Vários fragmentos de anticorpos são conhecidos e compreendem locais de ligação de antígeno capazes de exibir propriedades de ligação imunológica de uma molécula de anticorpo intacta. Por exemplo, fragmentos de anticorpos funcionais podem ser produzidos pela divisão de uma região constante, não responsável por ligação de antígeno, da molécula de anticorpo, usando, por exemplo, pepsina para produzir fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos conterão dois locais de ligação de antígeno, mas não tem uma parte da região constante de cada uma das cadeias pesadas. Similarmente, se desejado, fragmentos Fab, compreendendo um único local de ligação de antígeno, podem ser produzidos, por exemplo, pela digestão de anticorpos policlonais e monoclonais com papaína. Fragmentos funcionais, incluindo somente as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, também podem ser produzidos, usando técnicas padrão como a produção recombinante ou divisão proteolítica preferencial de moléculas de imunoglobulina. Esses fragmentos são conhecidos como FV. Ver, por exemplo, Inbar et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1972) 69:2659-2662; Hochman et al., Biochem. (1976) 15:2706-2710; e Erlich et al., Biochem. (1980) 19:4091-4096.

[0199] Um sistema phage-display pode ser usado para expandir populações de moléculas de anticorpos in vitro. Saiki et al., Nature (1986) 324:163; Scharf et al., Science (1986) 233:1076; U.S. Patent Nos. 4,683,195 e 4,683,202; Yang et al., J Mol Biol. (1995) 254:392; Barbas, III et al., Methods: Comp. Meth Enzymol. (1995) 8:94; Barbas, III et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:7978.

[0200] Uma vez gerada, a biblioteca phage-display pode ser usada para melhorar a afinidade de ligação imunológica das moléculas Fab usando

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I 78 técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Figini et al., J. Mol. Biol. (1994) 239:68. As seqüências de codificação para as partes de cadeia leve e pesada das moléculas Fab selecionadas da biblioteca phage-display podem ser isoladas ou sintetizadas, e clonadas em qualquer vetor apropriado ou replicon para expressão. Qualquer sistema de expressão apropriado pode ser usado, incluindo aqueles descritos acima.

[0201] Anticorpos de cadeia única também podem ser produzidos. Um polipeptídeo Fv (“sFv” ou “scFv”) de cadeia única é um heterodímero VH -VL covalentemente ligado e que é expressado a partir de uma fusão de gene incluindo genes de codificação VH- e VL- ligados por um ligante de codificação de peptídeo. Huston et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883. Uma quantidade de métodos tem sido descritos para discernir e desenvolver estruturas químicas (ligantes) para converter cadeias de polipeptídeos leves e pesadas, naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas, de uma região V de anticorpo em uma molécula sFv que se dobrará em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um local de ligação de antígeno. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,091,513; 5,132,405 e 4,946,778. As moléculas sFv podem ser produzidas usando-se métodos descritos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Huston et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883; U.S. Patent Nos. 5,091,513; 5,132,405 e 4,946,778. Critérios de projeto incluem determinar a extensão apropriada para cobrir a distância entre o C-terminus de uma cadeia e o N-terminus da outra, na qual o ligante é geralmente formado de pequenos resíduos hidrofílicos de aminoácidos que não tendem a enrolar ou formar estruturas secundárias. Esses métodos são descritos no estado da técnica. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,091,513; 5,132,405 e 4,946,778. Ligantes apropriados geralmente compreendem cadeias de polipeptídeos de conjuntos alternados de resíduos de glicina e serina, e podem incluir acido glutâmico e resíduos de lisina inseridos para aumentar a solubilidade.

[0202] “Mini-anticorpos” ou “minicorpos” também encontrarão uso com a presente invenção. Minicorpos são cadeias de polipeptídeos sFv que incluem domínios de oligomerização nos seus C-termini, separados do sFv por uma região de dobradiça. Pack et al., Biochem. (1992) 31:1579-1584. O domínio de oligomerização compreende α-hélices auto-associativas, ex. zíperes de leucina,

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I 78 que podem ser ainda estabilizadas por ligações de dissulfureto adicionais. O domínio de oligomerização é projetado para ser compatível com dobradura vetorial através de uma membrana, um processo que deve facilitar a dobradura in vivo do polipeptídeo em uma proteína de ligação funcional. Geralmente, minicorpos são produzidos usando métodos recombinantes conhecidos. Ver, por exemplo, Pack et al., Biochem. (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J. Immunology (1992) 149B:120-126.

[0203] Seqüências de polinucleotídeo codificando os anticorpos e seus fragmentos imunoreativos, descritos acima, são facilmente obtidas usando técnicas padrão, bastante conhecidas, como aquelas técnicas descritas acima com relação à produção recombinante das proteínas de STEC.

[0204] Para pacientes que sabidamente têm a doença de STEC, um anticorpo de proteína anti-STEC pode ter um beneficio terapêutico e pode ser usado para conferir imunidade passiva ao individuo em questão.

Alternativamente, os anticorpos podem ser usados em aplicações diagnósticas, descritas mais abaixo, bem como para purificação das proteínas de STEC.

V. Composições Imunogênicas [0205] Uma vez que as proteínas, conjugados e anticorpos acima e, se desejado, proteínas recombinantes elou purificadas adicionais sejam produzidas, elas são formuladas em composições para administração a um mamífero. Os componentes ativos são tipicamente misturados com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Veículos apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, e assim por diante, e suas combinações. Além disso, o veículo pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umedecedores ou emulsificadores, agentes tamponadores de pH, ou adjuvantes no caso de composições de vacinas, que aumentam a eficácia da vacina. Adjuvantes apropriados são descritos mais abaixo. As composições da presente invenção também podem incluir substâncias auxiliares, como agentes farmacológicos, citocinas, ou outros modificadores de resposta biológicos.

[0206] De acordo com o explicado acima, as composições de vacina da presente invenção podem incluir adjuvantes para aumentar ainda a imunogenicidade de um ou mais dos antígenos de STEC. Esses adjuvantes incluem qualquer composto ou compostos que agem para aumentar uma

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I 78 resposta imune a um antígeno de STEC ou combinação de antígenos, reduzindo assim a quantidade de antígeno necessária na vacina, elou a freqüência da injeção necessária de modo a gerar uma resposta imune adequada. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, emulsificantes, muramil dipeptídeos, avridine, adjuvantes aquosos como o hidróxido de alumínio, adjuvantes baseados em quitosana, e quaisquer das várias saponinas, óleos, e outras substâncias conhecidas, tais como Amphigen, LPS, extratos da parede celular bacteriana, DNA bacteriano, oligonucleotídeos e suas combinações (Schijns et al., Curr. Opi. Immunol. (2000) 12:456), extrato da parede celular de Mycobacterial phlei (M. phlei) (MCWE) (U.S. Patent No. 4,744,984), complexo da parede celular de M. phlei DNA (M-DNA), M-DNA- M. phlei (MCC). Por exemplo, compostos que podem servir como emulsificantes aqui incluem agentes emulsificantes naturais e sintéticos, bem como compostos aniônicos, catiônicos e noniônicos. Entre os compostos sintéticos, os agentes emulsificantes aniônicos incluem, por exemplo, sais de potássio, sódio e amônio de acido láurico e oléico, os sais de cálcio, magnésio e alumínio de ácidos graxos (i.e., sabões metálicos), e sulfonatos orgânicos como o lauril sulfato de sódio. Agentes catiônicos sintéticos incluem, por exemplo, brometo de cetiltrimetilamônio, enquanto que agentes noniônicos sintéticos são exemplificados por ésteres de glicerol (ex., monoestearato de glicerol), ésteres e éteres de polioxietileno glicol, e os ésteres de ácidos graxos de sorbitano (ex., monopalmitato de sorbitano) e seus derivativos de polioxietileno (ex., monopalmitato de polioxietileno sorbitano). Agentes emulsificantes naturais incluem acácia, gelatina, lecitina e colesterol.

[0207] Outros componentes apropriados podem ser formados com um componente de óleo, como um óleo único, uma mistura de óleos, uma emulsão água-em-óleo, ou uma emulsão óleo-em-água. O óleo pode ser um óleo mineral, um óleo vegetal, ou um óleo animal. Óleo mineral, ou emulsões óleoem-água nas quais o componente de óleo seja óleo mineral são preferíveis. Sob este aspecto, um “óleo mineral” é definido aqui como uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos do petrolato através de uma técnica de destilação; o termo é sinônimo de “parafina líquida”, “petrolato líquido” e “óleo mineral branco”. O termo também pretende incluir “óleo mineral leve”, i.e., um óleo que é similarmente obtido por destilação do petrolato, mas que tem uma

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I 78 gravidade específica ligeiramente mais baixa do que o óleo mineral branco. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Um componente de óleo particularmente preferível é a emulsão óleo-em-água vendida sob o nome comercial de EMULSIGEN PLUSTM (compreendendo um óleo mineral leve bem como 0,05% de formalina, e 30 mcgImL de gentamicina como preservativos), disponível de MPV Laboratories, Ralston, Nebraska. Outro adjuvante preferido para uso aqui é um adjuvante conhecido como “VSA3” que é uma forma modificada do adjuvante EMULSIGEN PLUSTM que inclui DDA (ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5,951,988, aqui incorporada a título de referência na sua totalidade). Óleos animais apropriados incluem, por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleo de linguado gigante, óleo de savelha, óleo de laranja azeda e óleo de fígado de tubarão, todos eles disponíveis comercialmente. Óleos vegetais apropriados incluem, sem limitação, óleo de canola, óleo de amêndoas, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de soja, e assim por diante.

[0208] Alternativamente, várias bases nitrogenadas de alifáticos podem ser usadas como adjuvantes com as formulações de vacinas. Por exemplo, adjuvantes imunológicos conhecidos incluem aminos, compostos de amônio quaternário, guanidinas, benzamidinas e thiouroniums (Gall, D. (1966) Immunology 11:369-386). Compostos específicos incluem brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) (disponível de Kodak) e N,N-dioctadecil-N,Nbis(2-hidroxietil)propanediamina (avridina). O uso de DDA como um adjuvante imunológico já foi descrito; ver, por exemplo, o Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(l):l-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J Immunol. Methods 97(2): 159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); e Int. Arch. Allergy Appl Immunol. 68(3):201-208 (1982). A avridina também é um adjuvante bastante conhecido. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 4,310,550 de Wolff, III et al., que descreve o uso de N,N-higher alkyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl) propane diaminas em geral, e avridina em particular, como adjuvantes de vacina. U.S. Patent No. 5,151,267 de Babiuk, and Babiuk et al. (1986) Virology 159:57-66, também se refere ao uso de avridina como um adjuvante de vacina.

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I 78 [0209] As composições de vacina podem ser preparadas associando-se uniforme e intimamente as preparações de proteína de STEC e o adjuvante usando técnicas bastante conhecidas incluindo, mas não limitado a, mixagem, sonicação e microfluidificação. O adjuvante compreenderá preferivelmente cerca de 10 a 50% (vIv) da vacina, mais preferivelmente cerca de 20 a 40% (vIv) e mais preferivelmente cerca de 20 a 30% ou 35% (vIv), ou qualquer número entre esses limites.

[0210] As composições da presente invenção são normalmente preparadas como injetáveis, seja em soluções líquidas ou suspensões, ou como formas sólidas que são apropriadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção. A preparação também pode ser preparada na forma sólida, emulsificada ou o ingrediente ativo encapsulado em veículos de lipossoma ou outros transportadores particulados usados para administração sustentada. Por exemplo, a vacina pode ser na forma de uma emulsão oleosa, emulsão água em óleo, emulsão água-em-óleo-em-água, emulsão de local específico, emulsão de longa permanência, emulsão adesiva, microemulsão, nanoemulsão, lipossoma, micropartícula, microsfera, nanosfera, nanopartícula e vários polímeros naturais ou sintéticos, tais como polímeros impermeáveis não reabsorvíveis como copolímeros de etileno-acetato de vinila e copolímeros Hytrel7, polímeros expansíveis como os hidrogéis, ou polímeros reabsorvíveis como o colágeno e certos poliácidos ou poliésteres como aqueles usados para suturas reabsorvíveis, que permitem uma liberação continuada da vacina.

[0211] Além disso, os polipeptídeos podem ser formulados em composições ou na forma neutra ou na de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados os grupos amino livres dos polipeptídeos ativos) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e assim por diante. Sais formados de grupos carboxi livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e assim por diante.

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I 78 [0212] Métodos atuais para preparar essas formas de dosagem são conhecidos, ou se tornarão claros, para os especialistas na matéria. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18^a edição, 1990.

[0213] A composição é formulada para conter uma quantidade eficaz da proteína de STEC desejada ou fusão de múltiplo epítopo, a quantidade exata sendo facilmente determinada por quem seja especialista na matéria, e cuja quantidade depende do animal a ser tratado e da capacidade do sistema imune do animal de sintetizar anticorpos. A composição ou formulação a ser administrada conterá uma quantidade de um ou mais dos antígenos de STEC aqui descritos adequados para se alcançar o estado desejado no individuo sendo tratado. Para os objetivos da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo as proteínas de STEC com ou sem recombinante adicionado eIou antígenos de STEC purificados, contem cerca de 0,05 a 1500 pg da proteína de STEC, preferivelmente cerca de 10 a 1000 pg da proteína, mais preferivelmente cerca de 30 a 500 pg e mais preferivelmente cerca de 40 a 300 pg, assim como 50 a 200 pg, ou qualquer número entre esses valores. Formas de administração incluem, mas não estão limitadas a, oral, tópica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica, transdérmica e subdérmica. Dependendo da forma de administração, o volume por dose é preferivelmente de cerca de 0,001 a 10 ml, mais preferivelmente de cerca de 0,01 a 5 ml, e mais preferivelmente de cerca de 0,1 a 3 ml. A vacina pode ser administrada em um tratamento de dose única ou em tratamentos de doses múltiplas (reforços) em um calendário e durante um período de tempo apropriado à idade, peso e condição do paciente, a formulação da vacina usada em particular, e a forma de administração.

[0214] Qualquer meio de administração farmaceuticamente aceitável pode ser empregado para administrar as composições ao paciente vertebrado. Por exemplo, seringas de agulha convencionais, injetores de mola ou gás (ar) comprimido (U.S. Patent Nos. 1,605,763 de Smoot; 3,788,315 de Laurens; 3,853,125 de Clark et al.; 4,596,556 de Morrow et al.; and 5,062,830 de Dunlap), injetores de jato líquido (U.S. Patent Nos. 2,754,818 de Scherer; 3,330,276 de Gordon; e 4,518,385 de Lindmayer et al.), e injetores de

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I 78 partículas (U.S. Patent Nos. 5,149,655 de McCabe et al. e 5,204,253 de Sanford et al.) são todas apropriadas para administração das composições.

[0215] Se for usado um injetor de jato, um único jato da composição da vacina líquida é ejetado sob alta pressão e velocidade, ex., 1200-1400 PSI, criando assim uma abertura na pele e penetrando em profundidades adequadas para imunização.

VI. Métodos de Imunização baseados em Ácido Nucléico [0216] Geralmente, as vacinas baseadas em ácido nucléico para uso com a presente invenção incluem regiões relevantes codificando a desejada proteína de STEC ou fusão, com seqüências controle apropriadas e, opcionalmente, seqüências de nucleotídeos terapêuticos auxiliares. As moléculas de acido nucléico são preparadas na forma de vetores que incluem os elementos necessários para direcionar a transcrição e tradução em uma célula recipiente, como está descrito acima.

[0217] De modo a aumentar uma resposta imune em um paciente imunizado, as moléculas de acido nucléico podem ser administradas em conjunção com substancias auxiliares, tais como agentes farmacológicos, adjuvantes, ou em conjunção com a administração de vetores codificando modificadores de resposta biológica como as citoquinas e assim por diante.

[0218] Uma vez preparadas, as composições de vacina de acido nucléico podem ser administradas ao paciente usando métodos bastante conhecidos. Sob esse aspecto, varias técnicas para imunização com DNAs de codificação antígenos tem sido descritas. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5,589,466 de Feigner et al.; Tang et al. (1992) Nature 358:152; Davis et al. (1993) Hum. Molec. Genet. 2:1847; Ulmer et al. (1993) Science 258:1745; Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156; Eisenbraun et al. (1993) DNA Cell Biol. 12:791; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:12476; Fuller et al. (1994) AIDS Res. Human Retrovir. 10:1433; and Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519. Métodos gerais para distribuir moléculas de ácido nucléico para células in vitro, para a subseqüente reintrodução no hospedeiro, também podem ser usados, tais como a transferência de gene mediado por lipossoma. Ver, por exemplo, Hazinski et al. (1991) Am. J Respir. Cell MoI. Biol. 4:206-209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219A; e Nabel et al. (1990) Science

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I 78

249:1285-1288. Assim, as composições de vacinas de ácido nucléico podem ser administradas na forma líquida ou particulada, usando uma variedade de técnicas conhecidas. Típicas composições de vacinas são descritas abaixo.

VI. Testes para Determinar a Eficácia de uma Resposta Imune [0219] Uma forma de avaliar a eficácia do tratamento terapêutico e prevenção envolve a monitoração de respostas imune contra as proteínas de STEC e fusões nas composições da invenção após a administração da composição. Outra maneira de avaliar a eficácia envolve a monitoração da infecção após a administração de uma composição da invenção. Além disso, a eficácias das composições pode ser determinada avaliando-se se a redução da quantidade de STEC no trato intestinal do paciente foi alcançada, reduzindo assim a transmissão da doença pela redução da quantidade de disseminação fecal de bactérias, eIou a redução do período de tempo da disseminação de STEC por um animal.

[0220] Outra maneira de avaliar a imunogenicidade das proteínas das composições imunogênicas da presente invenção é expressar as proteínas recombinantemente e testar os soros do paciente por imunoblot. Uma reação positiva entre a proteína e o soro indica que o paciente fixou previamente uma resposta imune à proteína em questão e assim a proteína é um imunogene. Esse método também pode ser usado para identificar proteínas elou epítopos imunodominantes.

[0221] Outra maneira de checar a eficácia envolve a monitoração da infecção após a administração das composições da invenção. Uma maneira de checar a eficácia envolve monitorar as respostas imune tanto sistemicamente (monitorando o nível de produção de IgG1 e IgG2a) quanto mucosalmente (monitorando o nível de produção de IgA) contra os antígenos nas composições da invenção após a administração da composição. Tipicamente, respostas de anticorpos soro-específicas são determinadas pós-imunização mas pré-desafio enquanto que as respostas corporais de anticorpo específico da mucosa são determinadas pós-imunização e pós-desafio.

[0222] As composições imunogênicas da presente invenção podem ser avaliadas em modelos de animais in vitro e in vivo antes da administração ao hospedeiro.

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I 78 [0223] A eficácia das composições imunogênicas da invenção também pode ser determinada in vivo desafiando-se modelos de infecção animal com as composições imunogênicas. As composições imunogênicas podem ser ou não derivadas das mesmas cepas que as cepas de desafio. Preferivelmente as composições imunogênicas são deriváveis das mesmas cepas que as cepas de desafio.

[0224] A resposta imune pode ser uma ou pode ser ambas as respostas imune TH1 e TH2. A resposta imune pode ser uma resposta imune aperfeiçoada, aumentada ou alterada. A resposta imune pode ser uma ou ambas as respostas imune sistêmica e de mucosa. Preferivelmente a resposta imune é uma resposta sistêmica elou mucosal aumentada.

[0225] Uma imunidade sistêmica elou mucosal aumentada é refletida em uma resposta imune de TH1 elou TH2 aumentada. Preferivelmente, a resposta imune aumentada inclui um aumento na produção de IgG1 elou IgG2a elou IgA. Preferivelmente, a resposta imune mucosal é uma resposta imune de TH2. Preferivelmente, a resposta imune mucosal inclui um aumento na produção de IgA.

[0226] Células TH2 ativadas aumentam a produção de anticorpos e consequentemente tem valor em relação a respostas a infecções extracelulares. Células TH2 ativadas podem secretar um ou mais de um de IL4, IL-5, IL-6, e IL-10. A resposta imune de TH2 pode resultar na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória para proteção futura.

[0227] Uma resposta imune de TH2 pode incluir um ou mais de um aumento de uma ou mais das citoquinas associadas com uma resposta imune de TH2 (assim como IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10), ou um aumento na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória. Preferivelmente, a resposta imune de TH2 aumentada incluirá um aumento na produção de IgG1.

[0228] A resposta imune de TH1 pode incluir um ou mais de um aumento em CTLs, um aumento em uma ou mais das citoquinas associadas com uma resposta imune de TH1 (tais como IL-2, IFNy, e TNFP), um aumento em macrófagos ativados, um aumento na atividade de NK, ou um aumento na produção de IgG2a. Preferivelmente, a resposta imune de TH1 aumentada incluirá um aumento na produção de IgG2a.

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I 78 [0229] As composições imunogênicas da invenção preferivelmente induzirão anticorpos duradouros (ex. neutralizantes) e uma imunidade mediada por célula que pode responder rapidamente quando da exposição a um ou mais antígenos infecciosos. A título de exemplo, a evidência de anticorpos netralizantes em amostras de sangue do paciente é considerada um parâmetro substituto para proteção.

VII. Testes de Diagnóstico [0230] Como está explicado acima, a proteína de STEC, suas variantes, fragmentos imunogênicos e fusões, também podem ser usados como diagnóstico para detectar a presença de anticorpos reativos de STEC, em uma amostra biológica de modo a determinar a presença de infecção. Por exemplo, a presença de anticorpos reativos com uma proteína de STEC pode ser detectada usando-se técnicas de eletroforese e de imunodiagnóstico padrão incluindo imunoensaios como os tipos competição, reação direta e sanduíche. Esses testes incluem, mas não estão limitados a, Western blots; testes de aglutinação; imunoensaios rotulados e mediados por enzima, como os ELISAs; testes tipo biotinalavidina; radioimunoensaios; imunoeletroforese; imunoprecipitação, etc. As reações geralmente incluem a revelação de rótulos tais como rótulos fluorescentes, quimiluminescentes, radioativos, enzimáticos, ou moléculas corante, ou outros métodos para detectar a formação de um complexo entre o antígeno e o anticorpo ou anticorpos que reagem a ele.

[0231] Os testes acima mencionados geralmente envolvem a separação de anticorpos não acoplados em uma fase líquida de um suporte de fase sólida ao qual os complexos antígeno-anticorpo estão ligados. Os suportes sólidos que podem ser usados na prática da invenção incluem substratos tais como nitrocelulose (ex., em forma de poço de membrana ou microtítulo); cloreto de polivinila (ex., poços de folhas ou microtítulo); poliestireno látex (ex., contas ou placas de microtítulo); fluoreto de polivinilideno; papel diazotizado; membranas de nylon; contas ativadas, contas magneticamente responsivas, e assim por diante. Tipicamente, um suporte sólido é primeiramente reagido com um componente de fase sólida (ex., uma ou mais proteínas de STEC ou fusões) sob condições apropriadas de ligação de modo que o componente seja suficientemente imobilizado no suporte. Algumas vezes, a imobilização do antígeno no suporte pode ser aumentada acoplando-se primeiramente o

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I 78 antígeno a uma proteína com melhores propriedades de ligação. Proteínas de acoplamento apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, macromoléculas tais como albuminas de soro incluindo albumina de soro bovino (BSA), keyhole limpet hemocianina, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, e outras proteínas bastante conhecidas. Outras moléculas que podem ser usadas para ligar os antígenos ao suporte incluem polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, e assim por diante. Essas moléculas e métodos para acoplar essas moléculas aos antígenos são bastante conhecidos. Ver, por exemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al, J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; e Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124.

[0232] Após reagir o suporte sólido com o componente de fase sólida, quaisquer componentes de fase sólida não imobilizados são removidos do suporte através de lavagem, e o componente ligado ao suporte é então colocado em contato com uma amostra biológica suspeita de conter metades ligantes (ex., anticorpos em direção aos antígenos imobilizados) sob condições de ligação apropriadas. Após lavar para remover qualquer ligante não aglutinado, uma segunda metade de ligação é adicionada sob condições de ligação apropriadas, em que o aglutinante secundário é capaz de se associar seletivamente ao ligante aglutinado. A presença do aglutinante secundário pode então ser detectada usando técnicas já conhecidas.

[0233] Mais particularmente, um método ELISA pode ser usado, em que os poços de uma placa de microtítulo são revestidos com uma proteína de STEC ou fusão. Uma amostra biológica contendo ou suspeita de conter moléculas de imunoglobulina anti-S. Enteritidis é então adicionada aos poços revestidos. Após um período de incubação suficiente para permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno imobilizado, a(s) placa(s) podem ser lavadas para remover metades não aglutinadas e adicionada uma molécula de ligação secundária detectavelmente rotulada. A molécula de ligação secundária pode reagir com quaisquer anticorpos de amostra capturados, a placa lavada e a presença da molécula de ligação secundária detectada usando métodos já conhecidos.

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I 78 [0234] Assim, em uma representação em particular, a presença de ligantes de aglutinação anti-STEC de uma amostra biológica podem ser facilmente detectados usando um aglutinador secundário compreendendo um anticorpo direcionado contra os ligantes de anticorpos. Uma quantidade de moléculas de imunoglobulina (Ig) são conhecidas e podem ser facilmente conjugadas a um rótulo de enzima detectável, tais como peroxidase horseradish, fosfatase alcalina ou uréase, usando métodos já conhecidos. Um substrato de enzima apropriado é então usado para gerar um sinal detectável. Em outras representações relacionadas, técnicas de ELISA tipo-competitivo podem ser praticadas usando métodos já conhecidos.

[0235] Os testes também podem ser conduzidos em solução, de modo que as proteínas de STEC e anticorpos específicos para essas proteínas formem complexos sob condições de precipitação. Em uma representação em particular, as proteínas de STEC podem ser ligadas a uma partícula de fase sólida (ex., uma conta de agarose ou equivalente) usando técnicas de acoplamento já conhecidas, tais como por química direta ou acoplamento indireto. A partícula revestida de antígeno é então colocada em contato sob condições de ligação apropriadas com uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos para as proteínas de STEC. A ligação cruzada entre anticorpos aglutinados causa a formação de agregados de complexo partículaantígeno-anticorpo que podem ser precipitados e separados da amostra usando lavagem eIou centrifugação. A mistura de reação pode ser analisada para determinar a presença ou ausência de complexos anticorpo-antígeno usando qualquer um dos vários métodos padrão, tais como os métodos de imunodiagnóstico descritos acima.

[0236] Ainda em outra representação, uma matriz de imunoafinidade pode ser fornecida, em que uma população policlonal de anticorpos de uma amostra biológica suspeita de conter moléculas anti-STEC é imobilizada a um substrato. Sob esse aspecto, uma purificação de afinidade inicial da amostra pode ser realizada usando antígenos imobilizados. A preparação da amostra resultante irá então conter apenas metades anti-STEC, evitando potenciais propriedades de ligação não específicas no suporte de afinidade. Uma quantidade de métodos de imunoglobulinas imobilizadoras (seja intactas ou em fragmentos específicos) de alta produção e boa retenção de atividade de

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I 78 ligação de antígeno já é conhecida. Não estando limitada por qualquer método em particular, a proteína A imobilizada ou proteína G pode ser usada para imobilizar imunoglobulinas.

[0237] Da mesma forma, uma vez que as moléculas de imunoglobulina tenham sido imobilizadas para fornecer uma matriz de imunoafinidade, proteínas de STEC rotuladas são colocadas em contato com os anticorpos aglutinados sob condições de ligação apropriadas. Depois que qualquer antígeno não especificamente aglutinado tenha sido lavado do suporte de imunoafinidade, a presença de antígeno aglutinado pode ser determinada através do teste de rótulo usando métodos já conhecidos.

[0238] Adicionalmente, anticorpos criados para as proteínas de STEC, ao invés das próprias proteínas, podem ser usados nos testes acima descritos de modo a detectar a presença de anticorpos para as proteínas em uma determinada amostra. Esses testes são realizados essencialmente como foi descrito acima e já são bastante conhecidos.

IX. Kits [0239] A invenção também fornece kits compreendendo um ou mais recipientes de composições da invenção. As composições podem ser na forma líquida ou podem ser liofilizadas, como podem ser os antígenos individuais. Recipientes apropriados para as composições incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, incluindo vidro ou plástico. Um recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

[0240] O kit pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, assim como um tampão fosfato salino, solução de Ringer, ou solução de dextrose. Também pode conter outros materiais úteis para o usuário final, incluindo outras soluções de formulação farmaceuticamente aceitáveis tais como tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas ou outro dispositivo de administração. O kit pode ainda incluir um terceiro componente compreendendo um adjuvante.

[0241] O kit pode também compreender um pacote suplementar contendo instruções escritas para métodos para induzir a imunidade ou para

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I 78 tratar infecções. O pacote suplementar pode ser um esboço de pacote suplementar não aprovado ou pode ser um pacote suplementar aprovado pelo Food and Drug Administration ou outro órgão regulador.

[0242] A invenção também fornece um dispositivo de administração précheio com as composições imunogênicas da invenção.

[0243] Similarmente, anticorpos podem ser fornecidos em kits, com instruções adequadas e outros reagentes necessários, de modo a conduzir imunoensaios como descrito acima. O kit pode também conter, dependendo do imunoensaio usado em particular, rótulos apropriados e reagentes e materiais embalados (i.e. tampões de lavagem e outros). Imunoensaios padrão, como aqueles descritos acima, podem ser conduzidos usando estes kits.

C. Experimental [0244] Abaixo estão exemplos de representações específicas para a realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos somente com propósitos ilustrativos, e não pretendem limitar de forma alguma o escopo da presente invenção.

[0245] Foram feitos esforços para garantir a precisão em relação aos números utilizados (ex., quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais, naturalmente, devem ser levados em consideração.

Exemplo 1

Construção e Identificação de Epítopos TIR [0246] De modo a identificar epítopos TIR, vinte e dois peptídeos 30-mer com cinco sobreposições de aminoácidos para a proteína Tir STEC O157:H7 foram construídos (ver Tabela 1). Antisoros policlonais de coelho foram criados contra TTSPs de STEC O157:H7 e TTSPs não-O157 (O26:H11, O103:H2 e O111:NM) e testados em uma diluição de 1I20 contra os vinte e dois peptídeos Tir O157:H7. Como é mostrado na Figura 7, muito poucos peptídeos foram reconhecidos pelos soros não-O157. Anti-O103:H2 foram os únicos soros que reconheceram múltiplos peptídeos.

[0247] De modo a construir uma proteína Tir quimérica, epítopos foram identificados na proteína Tir de serótipos STEC não-O157 que tinham divergido de STEC O157:H7, mas que ainda foram reconhecidos pelo sistema imune hospedeiro. Foi de particular interesse a porção de Tir que abrangeu os aminoácidos de 259 a 363. Percebeu-se que esses aminoácidos estavam

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63/78 expostos na superfície das células epiteliais hospedeiras, tornando-os um alvo principal para o desenvolvimento da vacina. No total sete peptídeos 30-mer foram construídos para cada um dos serótipos EHEC não-0157 (026:1-111, 0103:1-12 e 0111:NM) (Tabela 1). A reatividade cruzada dos anticorpos policlonais de STEC contra TTSPs dos vários serótipos foi testada como o descrito acima.

[0248] O anticorpo policlonal TTSPs não-0157 e o 0157:1-17 contra os peptídeos não-0157 apresentou um padrão similar ao visto com os peptídeos STEC O157:H7. Os soros homólogos apresentaram os melhores resultados (Figuras 8A-8D). O peptídeo número três dos vários serótipos apresentou a maior reatividade contra os soros não-0157. Esses resultados demonstram a variabilidade que é encontrada na proteína Tir nos serótipos STEC. No entanto, uma quantidade de peptídeos foi reconhecida pelos sopros homólogos que nenhum outro serótipo reconheceu.

Tabela 1

0157	SED ID NO	Peptídeo
1-MPIGNLGHNPNVNNSIPPAPPLPSQTDGAG	1	Tir 0157 AA 1-30
2-TDGAGGRGQLINSTGPLGSRALFTPVRNSM	2	Tir O157 AA 26-55
3-VRNSMADSGDNRASDVPGLPVNPMRLAASE	3	Tir 0157 AA 51-80
4-LAASEITLNDGFEVLHDHGPLDTLNRQIGS	4	Tir 0157 AA 76-105
5-RQIGSSVFRVETQEDGKHIAVGQRNGVETS	5	Tir 0157 AA 101-130
6-GVETSVVLSDQEYARLQSIDPEGKDKFVFT	6	Tir 0157 AA 126-155
7-KFVFTGGRGGAGHAMVTVASDITEARQRIL	7	Tir 0157 AA 151-180
8-RQRILELLEPKGTGESKGAGESKGVGELRE	8	Tir 0157 AA 176-205
9-GELRESNSGAENTTETQTSTSTSSLRSDPK	9	Tir 0157 AA 201-230
10-RSDPKLWLALGTVATGLIGLAATGIVQALA	10	Tir O157 AA 226-255
11 -VQALALTPEPDSPTTTDPDAAASATETATR	11	Tir 0157 AA 251-280
12-ETATRDQLTKEAFQNPDNQKVNIDELGNAI	12	Tir O157 AA 276-305
13-LGNAIPSGVLKDDVVANIEEQAKAAGEEAK	13	Tir 0157 AA 301-330
14-GEEAKQQAIENNAQAQKKYDEQQAKRQEEL	14	Tir O157 AA 326-355
15-RQEELKVSSGAGYGLSGALILGGGIGVAVT	15	Tir 0157 AA 351-380
16-GVAVTAALHRKNQPVEQ I I I I I I I I I I I SA	16	Tir O157 AA 376-405
17-TTTSARTVENKPANNTPAQGNVDTPGSEDT	17	Tir 0157 AA 401-430
18-GSEDTMESRRSSMASTSSTFFDTSSIGTVQ	18	Tir O157 AA 426-455
19-IGTVQNPYADVKTSLHDSQVPTSNSNTSVQ	19	Tir 0157 AA 451-480

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20-NTSVQNMGNTDSVVYSTIQHPPRDTTDNGA	20	Tir O157 AA 476-505
21-TDNGARLLGNPSAGIQSTYARLALSGGLRH	21	Tir 0157 AA 501-530
22-GLRHDMGGLTGGSNSAVNTSNNPPAPGSHRFV	22	Tir O157 AA 526-558
026
1-RADPKLWLSLGTIAAGLIGMAATGIAQAVA	23	Tir 026 AA 218-247
2-AQAVALTPEPDDPITTDPDAAANTAEAAAK	24	Tir 026 AA 243-272
3-EAAAKDQLTKEAFQNPDNQKVNIDENGNAI	25	Tir 026 AA 268-297
4-NGNAIPSGELKDDWAQIAEQAKAAGEQAR	26	Tir 026 AA 293-322
5-GEQARQEAIESNSQAQQKYDEQHAKREQEM	27	Tir 026 AA 318-347
6-REQEMSLSSGVGYGISGALILGGGIGAGVT	28	Tir 026 AA 343-372
7-GAGVTAALHRKNQPAEQTITTRTVVDNQPT	29	Tir 026 AA 368-397
0103
1-RADPKLWLSLGTIAAGLIGMAATGIAQAVA	30	Tir O103 AA 218-247
2-AQAVALTPEPDDPTTTDPDTAASTAEAATK	31	Tir O103 AA 243-272
3-EAATKDRLTQEAFQDPDKQKVNIDENGNAI	32	Tir O103 AA 268-297
4-NGNAIPSGELIDDVVAQIAEQAKAAGEQAR	33	Tir O103 AA 293-322
5-GEQARQEAIESNSQAQKKYDEQHAKREQEM	34	Tir O103 AA 318-347
5-GEQARQEAIESNSQAQKKYDEQHAKREQEM	35	Tir O103 AA 343-372
7-GAGVTAALHRKNQPAEQTITTRTVVDNQPT	36	Tir O103 AA 368-397
O111
1-RSDPKFWVSIGAIAAGLAGLAATGITQALA	37	Tir O111 AA 229-258
2-TQALALTPEPDDPTTTDPEQAASAAESATR	38	Tir O111 AA 254-283
3-ESATRDQLTQEAFKNPENQKVSIDEIGNSI	39	Tir O111 AA 279-308
4-IGNSIPSGELKDDVVAKIEEQAKEAGEAAR	40	Tir O111 AA 304-333
5-GEAARQQAVESNAQAQQRYDTQYARRQEEL	41	Tir O111 AA 329-358
6-RQEELELSSGIGYSLSSALIVGGGIGAGVT	42	Tir O111 AA 354-383
7-GAGVTTALHRRNQPAEQI I I I I I HTVVQQQ	43	Tir O111 AA 379-408

Tabela 1. Seqüência de peptídeos STEC O157:H7 Tir e não-0157 Tir construídos.

Os peptídeos sublinhados na seção 0157 representam o domínio de ligação da intimina.

Exemplo 2

Construção de Proteínas Tir Quiméricas [0249] Dos peptídeos testados no Exemplo 1, seis peptídeos únicos não0157 30-mer, específicos a cada serótipo foram escolhidos. Ver Tabela 2.

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I 78

	Alvos de peptide não-O157 de E. coli
Sorotipos
Peptideos	O103:H2	O26:H11	O111:NM
1
2		X
3		X	X
4			X
5	X		X
6
7

Tabela 2. Alvos selecionados para serem fundidos com a proteína Tir STEC O157:H7 [0250] O DNA codificando esses peptídeos não-O157 foi ligado à terminação 3' do DNA codificando a proteína Tir STEC O157. Primers e locais de restrição são mostrados na Tabela 3. Cada peptídeo foi designado para ser separado por quatro aminoácidos selecionados de Gly e Ser para aumentar a flexibilidade da proteína (Ver Figuras 9A e 9B). A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da proteína Tir quimérica são mostradas nas Figuras 5A e 5B, respectivamente (SEQ ID NOS:51 e 52). A proteína inclui na ordem Nterminal para C-terminal a seqüência Tir O157 completa (aminoácidos 1 a 558 da Figura 5B), seguido pelo aglutinante Gly-Ser-Gly-Ser, seguido pelos aminoácidos 279 a 358 de Tir O111 (correspondente aos aminoácidos 565 a 644 na Figura 5B), seguido pelo aglutinante Ser-Gky-Ser-Gly, seguido pelos aminoácidos 243 a 297 de Tir O26 (correspondente aos aminoácidos 651 a 705 na Figura 5B), seguido pelo aglutinante Ser-Ser-Gly-Gly, seguido pelos aminoácidos 318 a 347 de O103 (correspondente aos aminoácidos 712 a 741 na Figura 5B). Os aminoácidos 559-564, 645-650 e 706-711 na Figura 5B representam locais de restrição usados para inserir os fragmentos Tir.

(l) TirO157-PEP-F kpnl CGGGGTACCCCTATTGGTAATCTTGGTCATAATCCCAATGTGAATAATTC (SEQ ID NO:189)

TirO157-PEP-F GSGS-Agel-Pstl AAAACTGCAGACCGGTGGAGCCAGAACCGACGAAACGATGGGATCCCG

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I 78 (SEQ ID NO:190) (2) TirOlll-PEP-F Agel

GGCTACCGGTGAAAGTGCGACAAGAGATCAGTTAACGCAAGAAGCATTCA AG (SEQ ID NO:191)

TirOlll-PEP-R SGSG-Spel-GS-HindIII CCCAAGCTTAGAACCACTAGTCCCCGATCCTGATAATTCCTCCTGACGTCT GGCATAC (SEQ ID NO:192) (3) TirO26-PEP-F Spe l

GGACTAGTGCACAGGCTGTTGCGTTGACTCCAGAGCCGGATG (SEQ ID NO:193)

TirO26-PEP-R SSGG-NsiI

CCAATGCATTCCGCCGGATGAAATTGCATTTCCGTTCTCATCG (SEQ ID NO:194) (4) TirO103-PEP-F NsiI

CCAATGCATGGGGAACAGGCCAGACAGGAAG (SEQ ID NO:195)

TirlO3-PEP-R HindIII

CCCAAGCTTCATTTCCTGTTCGCGTTTAGC (SEQ ID NO:196)

Tabela 3. Primers de oligonucleotídeo usados para a amplificação de peptídeos Tir STEC e Tir não-O157. A seqüência de nucleotídeo é 5' a 3' [0251] Esses peptídeos também foram usados para construir uma segunda proteína quimérica que era idêntica à primeira exceto por ter sido fundida ao portador de leucotoxina LKT 352 (Figura 9C). Para isso, a construção Tir quimérica descrita acima foi ligada no plasmídeo pAA352 como descrito em nas Patentes US Nos. 5.476.657; 5.422.110; 5.723.129 e

5.837.268, aqui incorporados a título de referência nas suas totalidades. O plasmídeo pAA352 é descrito na Figura 10 e expressa a LKT 352, cuja seqüência é descrita na Figura 11. LKT 352 é derivada do gene lktA da leucotoxina Pasteurella haemolytica e é uma molécula de leucotoxina truncada, tendo 914 aminoácidos e um peso molecular estimado de cerca de 99 kDa, que

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I 78 não possui a porção citotóxica da molécula. A proteína de fusão Tir quimérica foi expressada como uma fusão C-terminal da proteína Lkt.

[0252] A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da proteína de fusão Tir LKTIquimérica são mostradas nas Figuras 6A e 6B (SEQ ID NOS:53 e 54). A proteína inclui na ordem N-terminal para C-terminal uma seqüência vetora curta de pAA352 (correspondente aos aminoácidos 1-9 da Figura 6B), LKT 352 (correspondente aos aminoácidos 10-923 da Figura 6B, uma seqüência vetora curta de pAA352 (aminoácidos 924-926 da Figura 6B), aminoácidos 2 a 558 de Tir O157 (correspondente aos aminoácidos 927 a 1482 na Figura 6B), seguido pelo aglutinante Gly-Ser-Gly-Ser, seguido pelos aminoácidos 279 a 358 de Tir O111 (correspondente aos aminoácidos 1490 a 1569 na Figura 6B), seguido pelo aglutinante Ser-Gly-Ser-Gly, seguido pelos aminoácidos 243 a 297 de Tir O26 (correspondente aos aminoácidos 1576 a 1630 na Figura 6B), seguido pelo aglutinante Ser-Ser-Gly-Gly, seguido pelos aminoácidos 318 a 347 de O103 (correspondente aos aminoácidos 1635 a 1666 na Figura 6B). Os aminoácidos 1484-1489, 1570-1575 e 1631-1634 na Figura 6B representam locais de restrição usados para inserir os fragmentos Tir.

[0253] Ambas as proteínas foram purificadas, passadas em um gel tinto Coomassie a 12% SDS-PAGE e usados em um Western blot contra um anticorpo monoclonal anti-Tir STEC O157:H7 para confirmar que a proteína certa foi purificada.

Exemplo 3

Imunogenicidade de Proteínas Tir Quiméricas [0254] De modo a testar a imunogenicidade das proteínas Tir quiméricas e determinar se a seroconversão ocorreria em resposta às proteínas, grupos separados de coelhos foram vacinados com (1) a construção Tir quimérica, (2) a fusão LKT 352ITir quimérica, (3) Peptídeo #2 O26 da Tabela 2, (4) Peptídeo #3 O26 da Tabela 2, (5) Peptídeo #5 O103 da Tabela 2, (6) Peptídeo #3 O111 da Tabela 2, (70 Peptídeo #4 O111 da Tabela 2, (8) Peptídeo #5 O111 da Tabela 2, (9) a proteína Tir de STEC O157:H7 e (10) Peptídeo SN11 como um controle negativo. Os coelhos receberam três reforços (21° dia, 42° dia e 57° dia). A vacina incluiu 50 microgramas de cada proteína em uma formulação

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I 78 que incluiu 30% de EMULSIGEN D (MPV Laboratories, Ralston, NE) como um adjuvante.

[0255] Duas semanas após o reforço final, os animais foram sangrados e os soros foram usados em ELISAs para determinar a seroconversão. Como se pode ver nas Figuras 12A-12J, os coelhos responderam bem às proteínas quiméricas totais e também foram responsáveis por responder aos peptídeos não-O157 individuais. Parece que os coelhos responderam melhor ao Peptídeo #5 O111 e ao Peptídeo #5 O103 na proteína Tir quimérica do que a fusão LKT 352ITir.

Exemplo 4

Clonagem, Expressão e Purificação das Proteínas Secretadas STEC

O157:H7 [0256] Usando um ensaio de fixação de inibição in vitro, foi mostrado que os anticorpos policlonais TTSPs anti-O157:H7 foram capazes de inibir STEC O157:H7 de se fixar às células epiteliais HEp-2. Entretanto, quando os anticorpos policlonais anti-Tir O157:H7 ou concentrações da proteína Tir purificada foram testados, nenhum foi capaz de bloquear a fixação de STYEC O157:H7 às células HEp-2. Anticorpos policlonais anti-EspA O157:H7 também foram testados e produziram os mesmos resultados que os anticorpos policlonais anti-Tir O157:H7.

[0257] Esses resultados mostram que existe algo presente nos anticorpos policlonais TTSPs anti-O157:H7 que é capaz de inibir a colonização. Tir e EspA que reagem com anticorpos policlonais TTSPs anti-O157:H7 em um Western blot, não foram capazes de inibir a colonizaçãode STEC O157:H7 para as células HEp-2 quando os anticorpos policlonais anti-Tir O157:H7 e anticorpos policlonais anti-EspA O157:H7 foram testados. Sem se ater a uma teoria em particular, a inibição da colonização pelos anticorpos policlonais TTSPs anti-O157:H7 pode se dever ou a uma combinação ou a uma proteína não identificada secretada no meio.

[0258] O STEC TTSPs O157:H7 usado para criar o anticorpo foi um coquetel formado na maior parte de proteínas não identificadas no meio mínimo M9. Inicialmente, acreditou-se que a maior parte das proteínas secretadas vinha da Ilha de Patogenicidade do lócus de apagamento enterócito (LEE). No entanto, recentemente foram identificadas várias proteínas

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I 78 chamadas de efetoras não-LEE que são secretadas através de TTSS, mas não estão localizadas na Ilha LEE. Tobe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:14941-14946 relatou que 39 efetores não-LEE foram secretados através de TTSS.

[0259] Quarenta proteínas de genes encontrados na Ilha de Patogenicidade LEE (excluindo a intimina), bem como 29 efetores não-LEE foram super-expressados e purificados de modo a testar as proteínas em ELISAs e Western blots contra anticorpos policlonais TTSPs anti-O157:H7 e anticorpos policlonais TTSPs anti não-O157.

[0260] Em particular, todos os 69 genes foram clonados e seqüenciados usando o sistema de clonagem de vetores Qiagen pQE-30 HIS-tagged (primers e locais de restrição encontrados na Tabela 4). Agarose Ni-NTA foi usada para purificação de proteínas 6xHis-tagged por cromatografia gravidade-fluxo. Sessenta e seis dessas proteínas foram purificadas. As três remanescentes são proteínas de membrana que foram difíceis de purificar. Essas três proteínas são membros do complexo interno de membranas do dispositivo de secreção. Entretanto, essas proteínas podem não ser relevantes para a identificação das proteínas imunogênicas secretadas com base na sua localização e papel.

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LEE genes	Bum HL
ler	F	CGCGGATCCCGGAGATTATTTATTATOAATATOGAAAATAATTCAC (SEQ ID NQ57)
	R	CCCAAGCrrTTAAATATrnTCAGCGGTATTATTI Cn CnCAG lO lOC (SEQ IDNO:53)	Hitidin
	F	CGCGGATCCArAACGATAACTGAGCTGGAAGAIü(SEQ ÍD NO:39)	BamHI
	R.	CCCAAGCrTCTATTTATTATTAATCCTGATTCGC (SEQ IDNO60)	Hindi []
	F	CGCGGaTCCAGTATTGTGAGCCAAACAAGAAATAAAG(SEQ ID ΝΟιβΙ)	BamHI
	R	CCCAAGC1TFCA1AGTATTTTTCTATTATTTCTATTCCG (SEQ ID NO:62)	1 Lindlll
orf4	F	CGCGGATCCACAATTTTTAATAAAATAGAC (SEQ 1D ΝΟτόΐ)	Bam HI
	R	CCCAAGCTTTCATAAAGTTTCATAAGGC (SEQ IDNO:64)	1 LindllL
orfS	F	CGCGGATCCCTTACAGA AG A ΤΑ TOA 1 ACCAGAGG (SEQ ID ΝΟ:ή5)	LlamNI
	R	CCCAAüCTTTCATTCCTGAATAATGCTAAG (SEQ ID NO:66)	Hinddl
«cS*	F	CGCüGATCCCCüTTATCüülATrATTATTAüTCTGG($EQ ID NO-ST)	RamHI
	R	ACGCGTCGACTTAGCCGTTCACCTTCGGAATC (SEQ IDNO68)	Sall
sscT	F	CGCGGATCCAATGAGATAATGACGGTCATAGTAIC(SEQ ID NO:6«)	BumHI
	R	CCCAAGCTTTCACTCATTAATCATGCTCGGTAAC (SEQ ID NO :70)	1 lindlll
rnrfl,1	F	CGCGGATCCAAAAAAATAATACTCrAGCATCATTCTC (SEQ ID NO:71)	BamHI
	R	CGCGGATCCAaAAAAATAATACTGAGCATCATTCTC (SEQ ID NO:72)	Hindi ίί
eriR	F	CGCGGATCCATTATGAAGGATGGCATCTATAGC (SEQ ID NO:73)	EkimHI
	R	CCCAAGC 1 J J IATTTT.AAATAAACI ΙΟ Γ<1 CjCATTCCTGTG ($FQ FD NQ:7d)	Hindi El
	F	CGCGGATCCGAATCTAAAAATAAAAATGGCGAC (SEQ ]D NO:75)	Earn HI
	R	fXGGGATCCGAATCTAAA A ATAAAAATGGCGAC (SEQ ID NO:?6)	Hindi!!
ccsD	F	C’GCGGATCXAGCAOOAAATTTAGCTCTCTAG (SEQ ]D NO: 77)	DamHL
	R	CCCAAGCTTTTaCTCTGTATTACCTAAC (SEQ JD NO178)	Hmdlir
escC	F	L’GCGG ATCC A A A A A A AT A AGTTTTTTT A TTTTTACAGCACTATTT i GCrGQAGTGCACAAGCTGCCCC (SEQ ID NO 79)	BainHt
	R	CCCAAGCT’TTI A I’l CGCTAGA I GCAGATTTTATCQGGGTTGCTTT AATTAAAAAGAGTCGAACAAC (SEQ ID ΝΟ;»0)	Hiridll!
ÍepD	F	CGCGOATCCAACAAΤΑ A1 AATGGCATAGCAAACA ATG (SEQ J D NO:81)	Rani Hi
	Ft	CCCAAGCTTTTaCACAATTCGTCCTaTA] QAGAAAAC(SEQ (D NO:fi2)	Hindll!
csçj	F	CGQGGATCCAAAAAACACATTAAAAACCTríTTTTATTCrCrC ! GC (SEQ ID NO: 83)	BatnHl
	R	CCCAAGC[ΤΠ ACCCGTCCTGTCCTGAGGATGACTTGATAACAAC (SEQ ID	Hindll! :

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		N0:M)
ítrfS	F	CGCGGATCCGATGTATTATGCCCIIGCCTCTTTCaTAAAAAG (SEQ IDNOftS)	BamHI
	R	CGCGGáTCCGATGTATTATGCCCTTGCCTCTTI CATAAAAAG (SEQ ID NO:Í6)	Hindi Π BamHp
wpZ	F	CGCGGATCCGAAGCAGCAAATTTAAGTCCTlC (SEQ IU N0:&7)
	R	CCCAAÜCTrn AGGCAIA .TTTCATCGCTAATGCÂC (SEQ ΙΟΝΟβί)	Hind! IL
. orfl2	F	CGCGGATCCAATCTTTTAGTTAA A AG AAACGTTG (SEQ [Π NO:S9)	Bajtilll
	R	CCCAAGCTTTCATGATGTCAIVC1 GCGAACG (SFQ ID NO:9fl)	1 Lindlll
escN	F	CGCGGATCCATTTCAGAGCATGATTCTGTATTG (SEQ1D ΙΜΟΛΙ)	RamH]
	R	CGCGGATCCAmVAGAGCA JGA J Ί CTGTATTG (SEQ JD NO; 92)	Pstl
nrfl5	F	CGCGGATCCTTGGACAGAATTTTATCTATIXíGT (SEQ ]L> NOW)	BátnHJ
	R	CCCAAGCTTCTAGTCAAAGTAATGTTCCTTTATGGC (SEQ IDNO:94)	Hindlll
orfl6	F	CGUGGATCCGCTTCTI^ATGGAAGAGATTGTTTTACTCCTCGGG (SEQ ID NO;95}	BamJII
	R	CCCAAGCTTTTAATTTTCATATTCAATTGTGAACTCAATGGC (SEQ IDNÍW-I	Hindlll
sepQ	F	CGCÜÜATCUAAGCCATTGAG rrCACAATTG (SEQ IDNO97)	BarttHL
	R	CCCAAGCrTTTAATCACATACTATGCTAACAG (SEQ 1D NO:9S)	Hindlll
cspH	F	CGGGGA RX’ 1 CG í‘]ATCAGGAGCGGTaTTCAâG (SÉQ ID NO :99)	BamHI
	R	CCCAAGCTTTCATAA.TACGCTATAAGAGGAAGQ (SEQ ID NO; 100}	Hindi IL
cesF	F	CGCGGATCCAATGAGAAA1TTCGCACAGACCTTG (SEQ ID NO: 1 Oi)	Hamill
	R	CCCAAGCTTTCAAGGTAAAAAATCTGTAGGTCTGG (SEQ ID NO: 102)	Hindlll
map	F	CGGGGTACCTTTâGTCCAATGACAATGGCAGGC (SEQ ID NOJO?)	KpnL
	R	CCCAAGCTTCTACAATCGGGTATCCTGTACATG (SEQ ID NO; 104)	Hindlll
tin	F	CGGGG ] ACGCCTATTGGTAA 1'CTlGGTCATAATC (SEQJD NO; 105)	Kpnl
	R	CCCAAGCTTTTAGACGAAACGATGGG.ATCCC (SEQ ] D NO; 106)	Hindi U
cvsT	F	CGCGGATCClVATVAAGATCTGAAClTITATiAG (SEQ (D NO: 10 7)	BamHI
	R	CCCAAGCTTTTATCTTCCGGCGTAATAATG (SEQ (D NOilOB)	Llindin
rscD	F	CGCGGATCCTTATOCtCaTàTAAAATAAAAC (SEQ 1Π NÔ:10Q)	BamHL
R	CGCGGATCCTTATCCTCATATAAAATAAAAC (SEQ ]D NO;110)	Hindlll
sepL	F	CGCGGATCCGCTAATGGTATTGAATTTAATC (SEQ ID NO: 111}	' Ϊ Bam HI
	R	AAACTGCAGTCAAATAATTTCCTCCTTATAGTCG (SEQ (D NO112)	PslT
espA	F	CGCGGATCCGATACATCAAATGCAACATCCGTTG (SEQ ID NO: 111)	Bam til
	R	AAACTGCAGTTATTTACCAAGGGATATTGCTG (SEQ ID NO: 114)	Psll BamHI
espD	F	CGCGGATCCCTTAACGTAAATAACGaTaCCCTG (SEQ ID NO:115)
	R	CGGGGTACCTTAAÁTTCüGtX AC I AACAA I ACG (SEQ IDNOil L6)	KpnL
espB	F	CGCGGATCCAATACTAI TGA I AA I AGUE A AGTAACGATGG (SEQ (D NO;117)	BamHI
	R	AAACTGCAGTTACCCAGO AAGCGACÜCGAΙΊ GCCCC (SEQ ID NO: 11 8)	ΡΐΐΙ
cesD2	F	CGGGGATCCGTCGAl ACGTTTAATGATGAAGTG (SEQ LD NOd 19)	BamHL
	R	AAACTGCAGTTAACTATrTACGTTCATTACGAACC(SRQ 115 NQ:120)	PStl
eseF	F	CGOGGATCCAATTTATQTG A A ATTAQTCA AC (SEQ 1D NO: L 21)	BamHL
	R	CCCAAGCTnTAAAAACTACGGTrAGAAATGG (SEQ IP NO; 122)	Hinilll]
orf29	F	CGCGGATCCGTTAATGA I ATTTCTüCTAÂTAAGATACrGG (SEQ ]DNO:I23)	BamHI
	R	AAACTGCAGTTAAAATCCTCGTACCCAGCCACTACC (SEQ LD NO: 124)	Pstl

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espF	F	CGCGGA irCC lTAATGGAArrAGTAACGCTGC (SEQ [D NO: 125)	RarrtHI
	R	CCCAAGCrm ACCCTTTClTCGA |TGCrCATA<rG (SEQ ID NO: 12«)	Hindllí
orfP	F	CGCGGATCCCCTCACCTCAAGAACACTCACTTTC (SEQ !DNO:!27)	D am HI
	R	ACGOGTCGACTTAC Π AΙΊ AüüüACAAATlTCISEQJD NO: 128)	Sall
espG	F	CGCGG ATCCATACTTGTTOCCAAATTGTTC (SEQ IO NGr 1291	DarnHl
	R	AAACTGCAGTTAAGTGTTTTGTAAGTACGTTTCAGATGCGG (SEQ IO KO;130)	HindFll
non-LEE
nleA	F	GGAAÍiAim AACA DTCAACCüACCATACAáTC (SEQ ID NO: 13!)	Bfelll
	R	1CCCCCCGGGTTAGACTCTTGTTTCTTGG (SEQ !D NO; 132)	Xmjl
nleB	F	CGCGGATCCTTATCTTCATTAA ATGTCCT TCAATUCAÜC (SEQ 1D NO: 133)	PtamMr
	R	CCCAAGCTTTTACCATGAACTGC AGGTATACATACTG (SEQ 1D NQ:134)	tllndlil
nteB-l	F	CGCGGATOCCTTTCACCGATAAGGACAACTTTC (SEQ ID NO; 135)	BamHI
1-------------------------- j nlêC	|A F	CGÜÜÜ I ACCn ACCATGAAC FGCATÜTATACrG (SEQ 1ί)ΝΌ:136)______ CGCGGATCCAAAATTCCCTCATTACAGTCCAAC (SEQ ID ΝΟΊ 37)	Kpni BamHI
J	R	CCCAAGC-n-FCAlTGCJGATmTG-n-rGTOCAC (SEQ IO NO: 138)	Rindlll
1 nleD	F	CGCGGATCCCGCCCTACGTCCCTCAACTTGGTATTAC (SEQ ID NO;139)	BamHI
		CCCAAGCnCTAAAGCAATGGATGCAGKTTACCTG (SEQ IDNO I40)	HindJII
Γ 1 nhE	F	CGCCGATCCATÍA ATCCTGTTAC TA ATACTCAGGGCGTGTCCCC TATAAATACTAAATATGCTGAACATG (SEQ IQ NO; 141)	AamHi
	*	CCCAAGCnC) ACTCAATiTrAGAAAC.lTl A .-[ΤΑΤΓΤ atgtattt CAI ATAACTGTCTA111 CCCCAGGC (SEQ ID NO: 142)	Hindi)!
Ü1!êE__ >	LF.	CGCGGATCCTTACCAACAAGTGGTTCTTCAGC (SEQ ID NO: 143)	BamHI
R	CCCAAGCITrCATCCACATrüTAAAGATCCTTTG (SEQ ID NO: 144}	] [indTJI
j nleG	F	CGCGGATCCCCTGTCATÀTTAAACTTTTCGAGTG (SEQ ID NO;!45)	BamHI
j	K	CCCAAGCITPCAAA |TC FAG 1GCA ΓΑ1A1T1TGTGTGÜC (SEQ ID NO; 146)	Hindi!
í tiIeHI-2	F	CGCGGATCCTTATCGCCCTCrtCl ATAAA1T1GGGATG7 1CATGG (SEQ JD NO:|47)	BamHi
I	R	CCCAAGCrm-ATATC1 TACrrAATACTACACTAATAAGATCC AGC (SEQ ID NO; 148)	Hindi!!
nlél	F	CGCGCATCCCAGGITCn CG iXjCrCAAATGG (SEQ ID NO: 149)	Bam] [1
	R	CCCAAGCTTTCATAAATACATTGTTCTTGAC (SEQ ID NO:150)	Hindi 11
nleG2-t	F	CÜCGGATCCAATGTCCTTCGAGCTCAAGTAGCATCTAG (SEQ ID NO; !51)	BamHi
	R	CCCAAGCTTTTAACTATC iTlTAl AATüAAGTrTCCC (SEQ [D NQ: 152)	llindlll
nlsG2-2	F	CGCGGATCCCCATTAACCTCAGATA ΓΓΑΟΑΤΟΑΟ (SEQ ID NO: 15 J)	BamHi
	R	CCCAAGCTTTCAATTACCCrn ATAACGAAGTTl CC (SEQ ID NO 154)	1 lihdill
nieGJ	F	CGCGGATCCGTAATGCCTGGATTAGTATCÍSfíQ ID AO· 155)	BjlmHJ
]--------------------------	R	CCCAAGCnTl AArcCAATTGAAATAAATAAG (SEQ [D NO; 156)	HindMI
1 nleG5-l	F	CGCGGATCCCCTGTAGATTTAACíjCCTTA I A IT1TACCTGGG (SEQ ID NO: 157)	BamHi Hindi)!
		CCCÃAGCTTTTAATTTTTTAAAAGGAAGTI ACCTCTGTCAGGÜ (SEQ ÍD NO: 158)
hIeG^I	F	CGCGGATCCCCTGTTACCACCTT.AAGl ATCCC (SEQ ID N0:159)	BamHi
	R	CGGGGT ACCTCACrrAC A AC A A A A AGCTTCTC (SEQ ID NO: 160)	Kpnl

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nleGÍ-2	F	CGCGOATCCCCAüTCAl ΑΤΙ ΑΑΑΪ iTrTCTAÁTGGAAGTG (SEQ ID NCtl 6L)	BíttiHI
	ft	CCCAAGCTTTTAAATACTGTTITGTTGAAGTGGG 1 ATATG ($EQ ID NO: 162)	Hindil!
nleGí	F	CGCGGATCCGACGCTTTTATTGTAGATCCTGTTC(SEQ [D NO; 163)	BamHl
	ft	CCCAAGCTTCTACACTGAATAACAATCACTCC (£EQ ID NO: 164)	Hindi Π
cífiK	F	CGCGGATCCATGCTTCCTACATCGCAATTACGAC (SEQ ID N 0:165)	HamHI
	R	CCCAAGCTTrTAAGAATArrTATATGTGGAACCAGAG (SEQ ID NO: 166)	Hind! II
çspL2	p	CGGATCCCCAATAATAAACAAATCGGCATCAAATTATÜ (SEQ ID NO: 167)	13 am HI
	R	CCCAAGCTTTCAATIGCAAI AA l‘AAΠ ATATACA1CGAGG (SFQ1D NO: 16«)	Hindlli
1 cspM2	H	CÜCCOATCCCCGATGAATACTACAGGTATGTC (SEQ ID NO: 169)	BamH]
1	R	CCCAAGCTTTCATCCCTGTATAGCACGCA I C (SEQ 10 NO; 170)	Hind ill
1 ! e$pR]	F	CGCGGATCCAAATTCCCTTCAATATTTAACAAAATAAAACC(SEQ [D NOííTI)	BamHl
1—	R	CGGGGTACCTTAGTGATAAAAAÜGCCAI GAGCI GGAGü (SEQ ID NO: 172)	Kpnl
tcçp	F	CGCGGaTCCaTTAACAATGTTTCTTCaCTTTTTCC (SEQ1D NO:173)	BamHl
	R	GCCAAGCTTTCACGA<jCGCTTàGATGTATTAATG($EQ ID NO174)	Hindll!
espV	F	CGCGGATCCAGCGGAACCTCAGGTTCCTCG (SEQ ID NOU 75)	Band il
	ft	CCCAAGCTTTCACAAAAAAGA1TGGGGAGG (SEQ JD NO: 176)	HmdllL
	F	CGCGGA1CCCCCAAAATATCATCAG [TGTATCA1C (SEQ ID NQ: 177)	BamHl
	R	CCCAAGCTTTTaATTTCTaACCAAGGGGTCCCATG (SEQ !D NO: 175)	Hindlli
espXj	F	CGCGGATCOGATTGTTCAAAATGCAATGGTTATG (SEQ ID NO: 179)	BamHl
	ft	CCCAAGCTTTTACAGCCATGCGTCTGGCGTCCAC (SEQ !D NO: 180)	Hindlli
=5flX7	F	CüCGGAl CCAAACATATAGAAGG1TCCmccro (SEQ 11) NO;1 S1)	BamHi
	R	CGGGGTACCTCAACGCCACGCAACAGGATAATAC (SEQ 1DNOJ82)	Kpn]
espVI	F	CGCGG ATCC A A AGT A TC AGTTCCAGGCATGC (SEQ ID Nil i83)	HamHI
	R	CCCAAGCTTTCAITCAATAATTÜCGTTGTCAG (SEQ ID NO: 184)	Hindlli
esp¥2	F	CGCGGA1 CCAAAGTAAGAAACCCAüAACAGA ΙΊ AG (SEQ ID NO; 185)	BamHl
	R	CCCAAüCTTTCAGTCATACCAACGGCTATTGTTCG (SEQ ID NO: 186)	Hindll!
	LZ	CGCGGATCCATÜAAAACCàTCACCAAACáACOGíSEQ 10 NO;187)	BamHl
	R | CCCAAGCTTTCAGTCGACGAACTCATAATAATTGCTC(SEQIDNO:l«8)	Hindlli

Tabela 4. Primers de oligonucleotídeos usados para a amplificação de genes LEE e nào-LEE.

[0261] A seqüência de nucleotídeos é de 5’ para 3’. Locais de restrição incorporados aos primers estão listados. *=GST genes fundidos.

Exemplo 5

Western Blot e ELISAs usando Soros Anti-TTSP STEC 0157:1-17 e NãoO157:H7 [0262] As proteínas purificadas do Exemplo 4 foram então testadas em Western blots usando soros criados contra TTSP de serótipos STEC 0157:1-17 e não-0157. Os Western blots foram realizados tanto nas proteínas da Ilha de Patogenicidade LEE quanto nas proteínas purificadas não-LEE usando antiTTSPs STEC 0157:1-17 de coelho, anti-TTSPa STEC Ο157Ή& bovino e anticorpos monoclonais anti-His-tag. Western blots também foram realizados usando soros contra TTSPs de STEC 026, 0111 e 0103. Todas as proteínas foram passadas em géis a 12% SDS-PAGE.

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74/78 [0263] Um total de 20 proteínas reagiu com o soro de pelo menos urn serótipo. Um sumário das proteínas reativas encontra-se na Tabela 5A.

Tabela 5. Sumário de STEC 0157 TTSPs recombinate reativo contra soros específicos de coelho 026, 0103, 0111 e 0157, e soros de gado 0157experímentaimente infectado e 0157-vacinado. A) proteínas LEE e não_LEE que reagiram contra soros específicos 026, 0103, 0111 e 0157. O157:H7 = anticorpos policlonais TTSPs anti-0157; soros (Pré) preimunes; 026:1-111 = anticorpos policlonais TTSPs anti-026 de coelho; 0103:1-12 = anticorpos policlonais TTSPs anti-0103 de coelho; 0111:NM = anticorpos policlonais TTSPs anti-0111 de coelho. B) proteínas LEE e não LEE que reagiram contra soros de gado 0157-experimentalmente infectado e 0157vacinado. As caixas cinza representam a reatividade positiva.

[0264] Proteínas de STEC 0157:1-17 purificadas recombinantes também foram testadas em ELISAs usando soros criados contra TTSP de serótipos de STEC 0157:1-17 e não-0157 para confirmar os resultados dos Western blots.

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Todas as amostras foram feitas em triplicata. A maioria das proteínas produziu resultados idênticos aos dos Western blots (positivo baseado em uma diferença de 2-log em título comparado ao preimune) (Tabela 6). No entanto uma quantidade de proteínas não produziu resultados semelhantes ou apenas demonstrou uma diferença de 1 -log comparado ao preimune. Proteínas Map e NleG6-1 foram usadas como controle negativo já que essas proteínas deram resultado negativo em Western blots. Esses resultados misturados poderíam estar relacionados ao nível de desnaturação pelo que passam as proteínas em Western blots comparado a ELISAs.

	1ST	pre	28	103	111
NleE	G36S1131	ftsitfle	13*21295	23*21*9*	50*64325
EspO	41055611-03710	227*6	57*211»	3340131152955	26*134159212
E*pRi	163555*38061	29671078	65631333	359511610	07**1023
EtpYI		1820*56	73601195	656013340	0*931334
Tir	568 738111321	*25*2*	51βΜ2ι15*32	109199*11176	4908331376*5
EspF	930179	335*10	06051130	3012*13074	6*4 6011*660
NW	582511 99	41'2131	2356*985	23108*6355	52241230
EscC	¢7214270	1539*75	2263*11585	7120*438	17998*10*7
NlaH		41B51192	@9301191	1Β9Β411(Μ3	55ff7tfl17
TctP	1*47*81	368114	132*29144*22	37261*1063	5075407
EepMi	65224707	9214725	4723111337	67054122
EepA	0375001102373	23*129	2970*6153120	2966*0*133*01	395028*1*921 '
EspB	5113631139707	179127	997184734	*7*60513983	4B71D412SB44
EspG	ááâKàiai.jtí	39714	56*3435?	1123*69	43039*47561
HIpA	*«6074)4720	1201*	838*11094	5W01M3319	3000212*11
HleF	1302156	31*133	392123	51222915133*	41551015
	*566*518	39819	2567*1955	121235*31162	S503±»l
rleÇ22	H719t5£7	953*586	2573*1422	84860112521	702746
SapD	64531 3»	265120	7ffl*4*S	187773**7*68	13611*9
NleGS-1	444Pd;137	07*4*64	13571186	1475*125	1*08479
Map	*0171161	385*15	470114	1268491	16771105

Tabela 6. Resultados de títulos de ELISAs completados usando soros anti-TTSP STEC O157:H7e não-0157 contra proteínas STEC O157:H7 purificadas recombinantes. Dados mostrados como média ± desvio padrão.

(157) Anticorpos policlonais TTSPs anti-0157 de coelho; (Pre) soros preimunes; (26) Anticorpos policlonais TTSPs anti-026 de coelho; (103) Anticorpos policlonais TTSPs anti-0103 de coelho; (111) Anticorpos policlonais TTSPs anti-0111 de coelho.

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Exemplo 6

Western Blot e ELISAs usando Soros de Gado Experimentalmente Infectado com STEC O157:H7 [0265] Soros de gado experimentalmente infectado também foram testados contra as proteínas STEC O157:H7 purificadas recombinantes do Exemplo 4. Um total de seis proteínas reagiu com os soros experimentalmente infectados consistindo de Tir, EspA, EspD, EspB, EspM2 e TccP (Tabela 5B). As proteínas STEC O157:H7 purificadas recombinantes também foram testadas em ELISAs usando soros de gado experimentalmente infectado. Diluições de soros em um único poço foram usadas para cada proteína. Soros de gado preimune foram usados para calcular valores de antecedentes contra cada proteína. O valor OD de ELISA foi medido subtraindo-se o valor preimune do valor do gado infectado. Valores duplicados foram medidos e três desvios padrão foram calculados antes da subtração.

[0266] De todas as sessenta e seis proteínas testadas, cinco proteínas deram resultados positivos. Ver Figura 13. Proteínas negativas não mostradas na Figura 13 incluem Ler, Orf2, CesAIB, Orf4, Orf5, EscS, EscT, Rorfl3, GrIR, GrIA, CesD, EscC, SepD, EscJ, Orf8, SepZ, Orfl2, EscN, Orfl6, SepQ, EspH, CesF, Map, CesT, EscD, SepL, CesD2, EscF, Orf29, EspF, EspG, NIeB, NleB2-l, NIeC, NIeE, NIeF, NIeG, NIeHl -2, NIeI, NleG2-l, NleG2-2, NleG3, NleG5-l, NleG6-l, NleG8-2, NleG9, EspK, EspL2, EspM2, EspRl, TccP, EspV, EspW, EspX2, EspX7, EspYl, EspY2 e ESpY3.

[0267] Quatro de cinco proteínas positivas para ELISAs também foram positivas em Western blots (Tir, EspB, EspD e EspA).

Exemplo 7

Resultados de ELISA usando Soros de Pacientes HUS Humanos

A) Dezesseis amostras de soro de pacientes humanos positivos e negativos coletadas do surto de Walkerton em 2000. As amostras foram coletadas dois anos pós-surto. As amostras foram testadas contra um antígeno imunogênico (Tir) que se correlaciona com a infecção por STEC O157:H7 (Figura 14). Um conjunto de amostras negativas também foi coletado e usado como um conjunto extra de amostras negativas. De modo geral, nenhuma diferença significativa foi observada com os três conjuntos de soros,

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B) Em um segundo experimento, o soro de seis pacientes adicionais que desenvolveram HUS da infecção por STEC O157:H7 foi testado contra as sessenta e seis proteínas O157:H7 E. coli purificadas recombinantes. Um total de 12 proteínas das 66 testadas reagiu contra os soros humanos. Diluições de soros humanos a 1:500 em poço único foram usadas para cada proteína. Soros humanos ingênuos foram calculados para medir os antecedentes de cada proteína. O valor OD de ELISA foi medido subtraindo-se o valor ingênuo dos soros humanos positivos HUS. Valores duplicados foram medidos e três desvios padrão calculados antes da subtração.

[0268] Em geral quatro proteínas reagiram consistentemente com a maioria dos soros testados (Tir, EspD, EspA e NleA). Ver Figura 15. Interessantemente, essas são as mesmas proteínas que reagiram contra o soro do gado experimentalmente infectado no Exemplo 6. Proteínas negativas não mostradas na Figura 15 incluem Ler, Orf2, CesAIB, Orf4, Orf5, EscT, Rorfl3, GrIR, GrIA, CesD, EscC, SepD, EscJ, Orf8, SepZ, Orfl2, EscN, Orfl ó, EspH, CesF, Map, CesT, EscD, SepL, CesD2, EscF, Orf29, EspF, NIeB, NleB2- 1 , NIeC, NIeE, NIeG, NIeHl -2, NIeI, NleG2-2, NleG3, NleG5-l, NleG6-l, NleG8-2, NleG9, EspK, EspL2, EspRl, TccP, EspV,EspW, EspX2, EspX7, EspYl, EspY2 e ESp Y3.

Exemplo 8

Vacinação de Camundongos usando Proteínas STEC Recombinantes [0269] Três grupos de 10 camundongos (ver abaixo) foram vacinados da seguinte maneira.

Grupo 1 - placebo (0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) Grupo 2 - TTSPs O157:H7 (TTSPs secretados em um meio M9 que é um coquetel de proteínas naõ-identificadas na sua maior parte) em 30% de EMULSIGEN D (MVP Laboratories, Ralston, NE);

Grupo 3 - Recombinante O157:H7 EspG, NleH2-1, NleA, EspRI, EspF, EspB, EspD, EspA e o Tir quimérico descrito acima mais 30% de EMULSIGEN D.

[0270] Camundongos foram inicialmente vacinados sucutaneamente com 0,5 pg de amostras de antígeno e sangue coletadas. Vinte e um dias após, os camundongos foram novamente vacinados como acima e amostras de

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I 78 sangue foram coletadas. Dezenove dias após, os camundongos foram tratados com água contendo 5gIL de estreptomicina durante 24 horas para remover a flora intestinal normal. Os camundongos então ficaram sem comida e água por 18 horas. Amostras de sangue foram novamente coletadas e os camundongos foram desafiados com uma dose oral de 109 CFUIml da cepa de nalr E. coli O157 em 20% de sacarose. Começando dois dias depois, amostras fecais foram coletadas a cada dois dias por duas semanas e a disseminação fecal de STEC foi examinada.

[0271] Em particular, uma pelota de uma amostra fecal de camundongo (aproximadamente 0,1 g) foi combinada com 1 ml de caldo Luria e incubada a temperatura ambiente por 2-4 horas para permitir que a pelota amaciasse. A amostra foi turbilhonada para dispersar a pelota e a amostra diluída em PBS e 25 pl de pontos foram chapeados em triplicata em placas de agar CT-SMAC (Mackonkey agar + Cefiximina 0,05 mgIL + Telurito 2,5 mgIL + ácido nalidíxico 15 mgIL). As placas foram incubadas durante a noite a 37°C, as colonias foram contadas e a presença de E. coli O157 foi confirmada por testes de aglutinação.

[0272] Os dados foram somados por um tempo. As somas não foram normalmente distribuídas de modo que elas foram log-transformadas e ANOVA de uma só direção seguido pela comparação de Tukey e teste de meio. Os resultados são mostrados na Figura 26. Medianos de dados brutos foram usados como ponto de dados. Houve diferenças significativas entre os grupos (P<0,00001). As primeiras amostras tomadas dos Grupos 2 e 3 tinham significativamente menos disseminação fecal do que no Grupo 1.

[0273] Assim, as composições e métodos para tratar e prevenir a colonização de mamíferos por E. coli enterohemorrágica foram divulgados. Embora representações preferíveis da invenção tenham sido descritas em detalhe, fica entendido que variações óbvias podem ser feitas sem que se afaste do espírito e escopo da invenção como definido nas reivindicações em anexo.

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Proteína de fusão de múltiplos epítopos caracterizado por compreender epítopos de STEC 0157:H7 Tir, STEC 026:H11 Tir, STEC O103:H2 Tir ou STEC 0111:NM Tir, onde a proteína compreende a sequencia completa de STEC 011:NM Tir correspondendo aos aminoácidos 1-558 de SEQ ID NO:52; um epitopo de STEC 0111:NM Tir compreendendo uma sequencia de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 565-644 de SEQ ID NO:52; um epitopo de STEC 026:H11 Tir compreendendo uma sequencia de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 651-705 de SEQ ID NO:52; e um epitopo de STEC 0103:H2 Tir compreendendo uma sequencia de amoniácidos correspondendo aos aminoácidos 712-741 de SEQ ID NO:52.
2. 2. Proteína de fusão de múltiplos epítopos de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a proteína compreender a sequencia de aminoácidos descrita na Figura 5B (SEQ ID NO:52).
3. 3. Proteína de fusão de múltiplos epítopos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por ser ligada a uma molécula transportadora.
4. 4. Proteína de fusão de múltiplos epítopos de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a molécula transportadora ser uma toxina RTX.
5. 5. Proteína de fusão de múltiplos epítopos de acordo coma reivindicação 4, caracterizado por a toxina RTX ser um polipeptídeode leucotoxina.
6. 6. Proteína de fusão de múltiplos epítopos de acordo coma reivindicação 5 caracterizado por a proteína compreender a sequenciade aminoácidos descrita na Figura 6B (SEQ ID NO:54).
7. 7. Composição caracterizado por compreender a proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das reivindicações 1-6 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Método para produzir uma composição caracterizado por compreender a combinação da proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das reivindicações 1-6 com um veículo farmaceuticamente aceitável.

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9. 9. Polinucleotídeo caracterizado por compreender uma seqüência codificadora que codifica a proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das reivindicações 1-6.
10. 10. Vetor recombinante caracterizado por compreender:

    (a) um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9; e (b) elementos controle que são operacionalmente ligados ao dito polinucleotídeo com o que a dita sequência codificadora pode ser transcrita e traduzida em uma célula hospedeira.
11. 11. Célula hospedeira, excluídas as células animais e vegetais, caracterizado por ser transformada com o vetor recombinante da reivindicação 10.
12. 12. Método para produzir uma proteína de fusão de múltiplos epítopos caracterizado por compreender:

    (a) fornecer uma população de células hospedeiras da reivindicação 11; e, (b) cultivar a dita população de células hospedeiras sob condições pelas quais a proteína codificada pela sequência codificadora presente no dito vetor recombinante seja expressada.
13. 13. Kit de teste imunodiagnóstico para detectar infecção por STEC, caracterizado por o dito teste compreender uma proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das reivindicações 1-6, e instruções para conduzir o teste imunodiagnóstico.
14. 14. Composição caracterizado por compreender (a) pelo menos duas proteínas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) imunogênicas purificadas, na qual as proteínas são selecionadas de Tir, EspA, EspB, EspD, EspRI, NIeA, Tccp, EspG, EspF, NleE, NleA, NleH e NleH2-1, onde as proteínas de STEC são selecionadas de uma proteína STEC completa, um fragmento imunogênico ou sua variante, na qual pelo menos uma das proteínas de STEC gere anticorpos que reajam com STEC 0157 e pelo menos um outro sorotipo de STEC; e, (b) a proteína de fusão de múltiplos epítopos de qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender ainda um adjuvante imunológico.

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16. 16. Uso de uma proteína de fusão de múltiplos epítopos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado por o uso ser para detectar anticorpos contra STEC em uma amostra biológica de forma a determinar a presença de infecção.
17. 17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 14 ou 15 caracterizado por ser para uso na redução de colonização de STEC em ruminantes ou para uso na redução da liberação de STEC de um ruminante.