基于IL-6的抗原表位及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及基于IL-6的抗原表位及其应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis)属于最常见的自身免疫病之一。该疾病是一种由于机体的免疫系统对于人体的关节部位的异常的攻击所造成的关节部位的的长期的慢性炎症。治疗类风湿性关节炎(RA)的药物研究已经开展有很多年。以往的策略是首先服用消炎药,一旦临床检测出有关节损坏的症状,便会开始使用控制类风湿药物。控制类风湿疾病的药物一般被分为异源生物体制剂以及生物工程制剂两类。异源生物体制剂是一类不能由自然的状态的机体产生、合成的分子化合物,比如常见的环孢菌素、甲氨喋呤(Methotrexate)、氯奎宁等。其中甲氨喋呤是目前最重要以及有效的控制性抗风湿药物。通常氯奎宁被认为是毒性最低的改善类风湿病情的药物,但是它的药性有限,对于很多重症病人,它无法达到令人满意的治疗效果。
大量的研究已经证实,IL-6与类风湿性关节炎RA有着密切的关系。相对于正常人的血清中IL-6的含量而言,RA患者血清中该因子的含量会有显著升高,且其浓度与C反应蛋白的水平、晨僵持续的时间及影像学关节破坏的程度呈明显正相关。在经过有效治疗后,IL-6水平有明显的降低。RA患者关节液中的IL-6浓度较血清中更高,高浓度的IL-6可激活破骨细胞,而破骨细胞活性则与关节破坏程度有明显关联。
目前靶向IL-6治疗类风湿性关节炎的药物研发主要集中在单克隆抗体的制备,通过阻断IL-6与IL-6R结合介导的信号通路达到治疗疾病的目的。Regeneron公司研发的IL-6受体特异性人源化单克隆抗体(REGN-88)已进入I期临床研究;此外,CentorOrthoBiotech公司研发的IL-6抑制剂(CNTO-136),UCBSA公司研发的IL-6特异性单克隆抗体(CDP-6038)以及Alder联合BMS公司研发的IL-6特异性人源化单克隆抗体(ALD518)均已进入II期临床研究,2010年1月FDA批准人源化抗IL-6R单克隆抗体—托珠单抗(Tocilizumab商品名Actemra)被用于中、重度活动性RA的患者的治疗。由此我们看到阻断IL-6信号通路来治疗类风湿关节炎拥有非常广阔的前景。但是抗体药物使用周期长、价格昂贵且易产生免疫耐受,基于IL-6疫苗的主动免疫治疗策略正成为RA免疫治疗研究的新热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于IL-6的抗原表位。
本发明的另一目的是提供上述基于IL-6的抗原表位的用途。
本发明的第一方面,提供了一种抗原表位肽,所述抗原表位肽源自哺乳动物IL-6且包含一个或多个抗原表位,
并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为IL-6全长的2-100%(优选地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-70%;更优选地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-50%;最优选地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-30%,如5%、10%、15%、20%、25%),且所述抗原表位肽的长度为3-300个氨基酸;
并且所述抗原表位肽与载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述哺乳动物产生针对IL-6的免疫反应。
优选地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为3-57。更优选地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为5-17。如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个氨基酸。
在另一优选例中,所述抗原表位肽包括人IL-6全长序列、鼠IL-6全长序列或其同源序列。
在另一优选例中,所述人IL-6全长序列如SEQIDNO.:1所示。
在另一优选例中,所述鼠IL-6全长序列如SEQIDNO.:2所示。
在另一优选例中,所述抗原表位肽选自下组:
(1)SEQIDNO.:1、2或8所示的氨基酸序列;
(2)将(1)中所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的衍生的多肽。
在另一优选例中,所述抗原表位肽的氨基酸序列为AEKDGCFQSGFN。
在另一优选例中,所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位,并且在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换、和/或插入而引入所述的抗原表位肽。
在另一优选例中,所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白,并且所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。
在另一优选例中,所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍乱毒素B亚单位(CTB)、沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)、百日咳毒素(PTX)、破伤风毒素、或上述蛋白的免疫原性片段(如破伤风毒素的C片段)、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA),鸡卵白蛋白(Ovalbumin,OVA),纤维蛋白原。
在另一优选例中,所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。
本发明的第二方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白是如本发明第一方面所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。
在另一优选例中,所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位,并且在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换、和/或插入而引入所述的抗原表位肽。
在另一优选例中,所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白,并且所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。
在另一优选例中,所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍乱毒素B亚单位(CTB)、沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)、百日咳毒素(PTX)、破伤风毒素、或上述蛋白的免疫原性片段(如破伤风毒素的C片段)、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA),鸡卵白蛋白(Ovalbumin,OVA),纤维蛋白原。
在另一优选例中,所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。
在另一优选例中,所述的载体蛋白为白喉毒素的跨膜结构域DTT。
在另一优选例中,所述白喉毒素的跨膜结构域DTT的loop区包括:DTT的第305-310位氨基酸残基(1F0L.pdb)。
在另一优选例中,所述将权利要求1所示抗原表位替换白喉毒素跨膜结构域DTT的第305-310位氨基酸残基(1F0L.pdb)形成所述融合蛋白。
在另一优选例中,所述的载体蛋白为霍乱毒素B亚单位。
在另一优选例中,所述霍乱毒素B亚单位的loop区包括:霍乱毒素B亚单位(CTB)的31-LAGKRE-36位氨基酸残基(3CHB.pdb)。
在另一优选例中,所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端形成所述融合蛋白。
在另一优选例中,所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地,所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地,所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地,所述连接肽长度为7-17个氨基酸。
在另一优选例中,所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
在另一优选例中,所述融合蛋白选自:
(a)SEQIDNO.:29、31、33、35所示氨基酸序列的多肽;
(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有诱发针对IL-6的免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。
本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第四方面,提供了一种表达载体,所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体,或者在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞、DC细胞等。
本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述的组合物为疫苗。
本发明的第七方面,提供了一种疫苗组合物,所述的组合物含有本发明第一方面所述的所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞,以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中,所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12和CpG)。
本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞的用途,
(a)用于制备针对所述抗原表位的抗体;和/或(b)用于制备治疗与所述抗原表位相关的疾病的药物。
在另一优选例中,所述的疾病包括:自身免疫疾病(如类风湿关节炎)、肿瘤、心血管疾病等。
本发明的第九方面,提供了一种治疗方法,给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了抗血清抗体产生的测定情况。
图2显示了多抗体外中和mIL-6活性的鉴定结果。
图3显示了多抗体外中和hIL-6活性的鉴定结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一类基于IL-6的抗原表位肽,使用该抗原表位肽与载体蛋白融合表达制备的融合蛋白,可有效激发机体针对IL-6的免疫反应。
使用包含本发明抗原表位肽的融合蛋白免疫BalB/C小鼠,ELISA方法检测免疫后抗血清产生了很高的针对IL-6的滴度,WesternBlotting方法检测抗血清与抗原具有很好的特异性结合。用IL-6生长依赖细胞株7TD1测定多抗体外中和IL-6活性的实验表明多抗在体外具有明显的抑制IL-6活性的效果。使用该融合蛋白作为疫苗可治疗类风湿性关节炎。
IL-6
IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生。它可调节多种细胞的生长与分化,具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能,并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6在多种疾病发生时有明显改变。IL-6表达失调可引起许多疾病,其临床表现主要为发病时IL-6水平增高。IL-6上升的水平与疾病的活动期、肿瘤的发展变化、排斥反应程度以及治疗效果都密切相关,因此,对病人体液中IL-6水平的检测可反映患者的病情变化。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述人IL-6(hIL-6)的氨基酸序列如下所示:
PPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM(SEQIDNO.:1)
在本发明的一个优选的实施方式中,所述小鼠IL-6(mIL-6)的氨基酸序列如下所示:
FPTSQVRRGDFTEDTTPNRPVYTTSQVGGLITHVLWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLLKISSGLLEYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKLESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQT(SEQIDNO.:2)
载体蛋白
如本文所用,术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常,所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白,例如病原体蛋白,代表性的例子包括(但并不限于):病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。
如本文所用,术语“抗原表位(肽)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽,该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常,抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段,较佳地来源于哺乳动物(如人)蛋白的一段肽,而不是来自所述载体蛋白。
如本文所用,术语.pdb专指蛋白质三级结构数据文件,来自ProteinDataBank(www.pdb.org);
如本文所用,术语DTT指白喉毒素的跨膜结构域;
如本文所用,术语T细胞表位又称为T细胞抗原表位,是抗原分子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽,能够由主要组织相容性复合体(MHC)分子结合,呈递在细胞表面被T细胞受体(TCR)结合,激活T细胞,包括T辅助细胞表位等。
如本文所用,术语“低免疫原性蛋白”是指单独免疫动物不能引起足够的免疫反应的蛋白。
如本文所用,术语“分子表面氨基酸残基区”或“表面氨基酸残基区”是指位于蛋白分子表面的氨基酸残基组成的区域,优选地,所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。
代表性的载体蛋白
1.白喉毒素及其跨膜结构域
白喉毒素(diphtheriatoxin,DT)是感染了beta噬菌体的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)产生的外毒素,存在于临床使用的百白破疫苗成份中。安全性得到多年临床使用的验证,罕见严重不良反应,目前尚无由白喉成份引起过敏反应的报道。
白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成,空间上相对独立的催化结构域(1-193AAs)、跨膜结构域(205-378AAs)和受体结合域(386-535AAs)组成;跨膜结构域和受体结合域本身无毒性,其功能是通过细胞表面受体结合,将催化结构域转导进入细胞内。
白喉毒素氨基酸序列(P00588,DTX_CORBE)如下所示:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKY
DAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS(SEQIDNo.:3)
白喉毒素分子中的存在5个T-辅助细胞表位可被高达80%以上的人MHCclassⅡ识别。白喉毒素跨膜结构域(DTT)主要由α螺旋元件构成核心骨架,螺旋元件之间由灵活性的环区连接。
本发明人对白喉毒素的蛋白结构进行模拟,保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位,能够被替换植入抗原表位的表面氨基酸残基区287-QVIDSETADNLEK-299位氨基酸残基(1F0L.pdb);
DTT氨基酸序列(1F0L.pdb:202–378)如下所示:
202INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELS
262ELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAV
322HHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRP(SEQIDNo.:4)
本发明人对DTT的蛋白结构进行模拟,保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位,能够被替换植入抗原表位为285-VAQVIDSETAD-298位氨基酸残基;
在本发明的优选例中,可选择药物拟干预的靶蛋白的肽段移植到DTT上,并替换DTT的表面氨基酸残基区,包括α螺旋元件之间环区氨基酸残基。
本发明的研究表明,白喉毒素跨膜结构与来自靶蛋白的肽段整合后,不会或基本上不会影响各自的折叠。在重组蛋白中,DTT作为蛋白骨架,靶蛋白肽段移植到DTT上后,可以诱导动物产生针对所述靶蛋白的免疫反应。因此DTT是一种非常合适的蛋白骨架。
2.霍乱毒素B亚单位(CTB)
霍乱毒素(choleratoxin)是霍乱弧菌分泌的外毒素(84kDa),由A、B亚基组成,为AB5型。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素无毒的部分,具有良好的免疫原性,经人体试验证明是疫苗的有效成分。CTB能与大多数哺乳动物细胞表面存在的神经节苷脂GM1特异性结合,刺激机体产生粘膜IgA,加强抗原性诱导粘膜免疫反应。CTB已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体。
CTB无毒,由2段α螺旋元件和6段beta-片构成核心骨架,结构元件之间由灵活性的环区连接。五个B亚以长α螺旋元件相对平行向内组装,形成五角星形状。每个亚基都可独立结合细胞膜上的神经结苷脂(GM1)受体。
CTB氨基酸序列(3CHB.pdb:1–103)如下所示:
1TPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDS
60QKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN(SEQIDNO.:5)
CTB含2个T细胞表位,CTB-Th表位81-100(81-KVEKLCVWNNKTPHAIAAIS-100)为优势表位,CTB-Th表位31-50(31-LAGKREMAIITFKNGAIFQV-50)为弱势表位,分布在亚单位结构核心的4段Beta-片上。
本发明人对CTB的蛋白结构进行模拟,保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件,T细胞表位,能够被替换植入抗原表位的位置31-LAGKRE-36位氨基酸残基;
3.沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)
沙门氏菌鞭毛蛋白FliC(Phase1-Cflagellin)是鞭毛的丝状体成份,与多种动物细胞受体TLR5结合,激发动物的先天性免疫系统应答,促使未成熟DC细胞表面表达CD80和CD86,分泌多种细胞因子和趋化因子,在先天性免疫反应和特异性特异性免疫反应中发挥较强的免疫佐剂作用,其作为免疫佐剂成份已在多个病原体疫苗制剂中获得应用。
FliC由494个氨基酸组成,晶体结构显示,此蛋白回折使其N端与C端靠拢形成状如大写的希腊字母gamma“Γ”。
FliC(1ucu.pdb:1–494)的氨基酸序列如下所示:
AQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGL
TQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLN
EIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQQKYKV
SDTAATVTGYADTTIALDNSTFKASATGLGGTDQKIDGDLKFDDTTGKYYAKVTVTGGTG
KDGYYEVSVDKTNGEVTLAGGATSPLTGGLPATATEDVKNVQVANADLTEAKAALTAAGV
TGTASVVKMSYTDNNGKTIDGGLAVKVGDDYYSATQNKDGSISINTTKYTADDGTSKTAL
NKLGGADGKTEVVSIGGKTYAASKAEGHNFKAQPDLAEAAATTTENPLQKIDAALAQVDT
LRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLA
QANQVPQNVLSLLR(SEQIDNO.:6)
本发明人对FliC的蛋白结构进行模拟,在保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件的情况下,能够被替换植入抗原表位257-TLAGGATSPLTGGLPATAT-275:
4.肺炎球菌溶血素(Ply)
肺炎球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)是肺炎链球菌的主要蛋白质抗原,存在于细胞质内,通过自溶作用而释出,因此疫苗可以通过口服或吸入途径进行粘膜免疫,是一种的理想疫苗载体候选蛋白。
Ply由471个氨基酸组成,分子量53kDa,含4个结构功能域,氨基酸序列(P0C2J9,TACY_STRPN)如下所示:
MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDI
SVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSN
SSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDF
NSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSV
AYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGA
RVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRN
GDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRN
LSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVEND(SEQIDNO.:7)
本发明人对Ply的蛋白结构进行模拟,保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件,能够被替换植入抗原表位的位置266-LIKGVKVAPQTEWK-279。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物,它含有:(i)本发明的重组蛋白或本发明的可编码重组蛋白的多核苷酸,以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组蛋白或多核苷酸),也可以是多价的(含有多种重组蛋白或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型,其中包括(但并不限于):注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量,或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此,预先指定准确的有效量是没用的。然而,对于某给定的状况而言,可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克,较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常,可将组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白),并且通常与“药学上可接受的载体”组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外,抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于:(1)铝盐(alum),如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;(2)水包油型乳剂配方,例如,(a)MF59(参见WO90/14837),(b)SAF,和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT),(3)皂素佐剂;(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5)细胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如,可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂),通常含有稀释剂,如水,盐水,甘油,乙醇等。另外,辅助性物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地,包括免疫原性组合物在内的疫苗,包含免疫学有效量的免疫原性多肽,以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内,可通过常规实验来确定。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
此外,本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(iii)给药途径和剂量
一旦配成本发明的组合物,可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物,尤其是人。
当用作疫苗时,可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于):肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要,可以组合给药途径,或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予,且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组蛋白疫苗,即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答,能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于):自身免疫性疾病、肿瘤等。
在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量,是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常,在感染宿主细胞后,各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg,较佳地为1μg-100mg,更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后,可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外,本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予,或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的主要优点在于:
(1)包含本发明的基于IL-6的抗原表位的融合蛋白,用作疫苗可有效激发机体针对IL-6的免疫反应。
(2)携带本发明的抗原表位的重组蛋白的制备成本低,给药方便。
(3)相对于与载体蛋白化学偶联的制剂,本发明的抗原结构确切、质量可控,更安全。
实施例1
1.线性B表位的移植
本实施例中设计了6个融合表位,以DTT为载体,用于制备免疫抗原肽的基础,移植结果总结于表1。
表1IL-6表位移植到DTT的设计
2.抗原肽的制备
2.1引物设计
根据人源IL-6结构域,鼠源IL-6结构域,设计的5个候选表位以及DTT的碱基序列信息,利用Primer5.0软件设计引物。其中,两个结构域分别插入在DTT的羧基端(C端),设计引物命名为hP1、hP2、mP1、mP2。表位插入到DTT中需要设计四个引物,分别命名为P1、P2、P3、P4,其中,引物P1、P4是一致的,分别在P1、P4引物的5’端和3’端插入BamHI(该限制性内切酶的识别序列为5'G^GATCC3')和XhoI(该限制性内切酶的识别序列为5'C^TCGAG3')两个酶切位点。引物设计见下表:。
表2设计并合成的18条引物(5’-3’)
2.2重组载体构建
1)重叠延伸PCR扩增融合基因
采用重叠延伸PCR技术进行DTT与hIL-6表位基因进行重组。
模板为含DTT的PGEX-6P-1质粒,上半段PCR所用引物为P1和P2,下半段PCR使用的引物为P3和P4。
上下半段PCR扩增体系:模板(含DTT质粒)0.5μL,引物P1/41.5μL,引物P2/31.5μL,PlusNeo酶1μL,10×buffer5μL,dNTPs5μL,Mg2+(25mmol/L)2μL,ddH2O33.5μL。
PCR扩增程序:94℃预变性2min,94℃变性15s,55℃退火30s,68℃延伸2min,34个循环,68℃延伸10min。12℃Forever,保存。使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物,将回收后的上下半段PCR产物做20倍稀释分别作为模板1和2,进行第二轮PCR扩增。第二轮PCR扩增体系:模板10.5μL,模板20.5μL,引物DTT-11.5μL,引物DTT-41.5μL,PlusNeo酶1μL,10×buffer5μL,dNTPs5μL,Mg2+(25mmol/L)2μL,ddH2O33μL。
扩增程序同上,同样使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。两次PCR扩增产物经凝胶电泳验证,PCR的条带很亮,特异性很高,无非特异性条带出现。且条带位置、大小正确,与预期相符,使用凝胶回收试剂盒对其进行割胶回收。
除了构建DTT与hIL-6表位基因的重组,我们还将DTT分别与hIL-6以及mIL-6的结构域基因进行了重组,使用一步PCR即可实现。模板分别是DTT和hIL6(或mIL6),使用的引物为hP1和hP2(或mP1和mP2)。PCR扩增的体系、PCR扩增的程序、琼脂糖凝胶电泳条件、琼脂糖凝胶回收步骤均同前述一致。
2)双酶切质粒和重组基因
为把重组后的基因片段连接到载体pGEX-6P-1质粒中,需要对重组基因(DTT-IL-6表位或者DTT-IL-6结构域)和质粒pGEX-6P-1使用两种一致的限制性内切酶进行酶切,形成一致的核苷酸序列末端,使用的两种限制性内切酶为BamHI和ghoI。
目的基因酶切体系为:目的基因片段16μL,BamHI酶和XhoI酶各1μL,10×FastDigestBuffer6μL,ddH2O补足至50μL。质粒酶切体系为:pGEX-6p-1载体30μL,BamHI酶和XhoI酶各1μL,10×FastDigestBuffer6μL,ddH2O补足至50μL。
酶切温度为37℃恒温水浴,酶切时间为6小时。酶切后使用AXYGEN公司的DNA清洁回收试剂盒,进行PCR清洁回收。
3)连接重组基因与质粒
使用T4DNA连接酶把经过限制性内切酶酶切处理的重组基因和质粒进行连接,构成重组质粒。连接反应体系为:pGEX-6p-1载体1μL,目的基因片段5.5μL,T4DNA连接酶0.5μL,10×LigationBuffer1μL,ddH2O补足至10μL。
把50μLEP管放入PCR仪,启动incubate程序,设置恒温16℃连接过夜。
4)转化及重组质粒的提取验证
为验证连接后质粒与目的基因的重组情况,对连接产物使用热激法将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞,并分别挑取2个单克隆菌落(共16个)于3mLLB培养基中培养,利用AXYGEN公司的质粒抽提试剂盒来提取DH5α菌中扩增的重组质粒,方法步骤参考产品说明书。对菌落抽质粒并以此为模板进行质粒PCR,对于DTT-表位,引物为DTT-P1和DTT-P4;对于DTT-人白介素6结构域,引物为hP1和hP2;对于DTT-人白介素6结构域,引物为mP1和mP2。PCR扩增的体系及PCR扩增的程序参照前述的实验条件。PCR扩增结束后对产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果表明,以12个质粒(表位融合组)为模板均可得到重组基因,大小在500bp左右,且条带特异性高。将其连同DTT-mIL-6以及DTT-hIL-6的4个质粒送金斯瑞南京生物科技公司测序,得到的序列用NCBI上BLAST工具来进行比对,比对正确率为100%的质粒为阳性质粒。阳性的质粒将会转化入BL21(DE3)表达菌株用于后续实验。
构建的疫苗的蛋白和核苷酸序列:
hIL6-2表位组(将hIL6-2表位“hIL669-80位”替换DTT305-310位氨基酸,在说明书中也称为DTT-U69-80,DTT-hIL6-2):
融合蛋白的氨基酸序列:
INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALAEKDGCFQSGFNGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRP(SEQIDNO.:29)
其核苷酸序列如SEQIDNO.:30所示。
注:下划线为表位(69-80)对应的氨基酸序列和核苷酸序列。
mIL6-2表位组(将mIL6-2表位“mIL669-80位”替换DTT305-310位氨基酸):
蛋白的氨基酸序列:
INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALQRNDGCYQTGYNGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRP(SEQIDNO.:31)
其核苷酸序列如SEQIDNO.:32所示。
DTT-hIL6组(将hIL6插入DTT羧基端):
蛋白的氨基酸序列:
INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPPPGEDSKDVAAPHRQPLTSS ERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIIT GLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQ WLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM(SEQIDNO.:33)
其核苷酸序列如SEQIDNO.:34所示。
DTT-mIL6组(将mIL6插入DTT羧基端):
蛋白的氨基酸序列:
INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPFPTSQVRRGDFTEDTTPNRP VYTTSQVGGLITHVLWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLL KISSGLLEYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKL ESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQT(SEQIDNO.:35)
其核苷酸序列如SEQIDNO.:36所示。
2.3融合蛋白表达及纯化
1)融合蛋白表达验证
为了验证所构建的重组质粒的蛋白表达情况以及确定表达位置,我们对9个重组质粒进行了小规模(100mL)蛋白的表达,先尝试使用常规的诱导条件:诱导温度37℃,IPTG终浓度1mM,诱导时间4h,电泳验证融合蛋白表达情况,结果发现6个融合蛋白DTT-hIL6-1,DTT-hIL6-2,DTT-hIL6-3,DTT-hIL6-4,DTT-hIL6-5.DTT-hIL6-6以及DTT均为可溶性表达,目的蛋白存在于上清中,而融合结构域的两组在此诱导条件下为包涵体,目的蛋白存在于沉淀中,于是我们对这两个蛋白进行了诱导条件的优化,设置不同的诱导温度(30℃、20℃、16℃),IPTG浓度(1mM、0.5mM、0.3mM)以及诱导时间(12h、24h、48h),采用正交实验设计最终优化出在诱导条件(诱导温度16℃,IPTG终浓度0.5mM,诱导时间24h)下融合结构域的两组出现可溶性表达且菌落状态良好。
2)融合蛋白大规模表达,纯化及定量
通过小规模诱导原核表达确定各蛋白的表达情况后,使用适合的诱导条件(其中DTT-hIL-6和DTT-mIL-6容易形成包涵体的两组的诱导温度为16℃、诱导剂IPTG的终浓度为0.5mM、诱导时间为24h;其他几组的诱导温度为37℃、IPTG终浓度为1mM、诱导时间为4h),进行大规模原核表达(2L),由于融合蛋白带有GST标签,故可以通过GST亲和层析柱将其与其他杂蛋白进行纯化与分离。
纯化后进行电泳验证,各融合蛋白条带位置正确,通过ImageLab4.0软件分析蛋白纯度,均达到90%以上,将其分别放入透析带中加入200μLPSP酶(浓度为1mg/mL),置于PSP酶切缓冲液中透析过夜。收集透析过夜的蛋白溶液,此时溶液中含有三种成分,目的蛋白,GST蛋白,以及少量酶切不充分的融合蛋白,利用GST亲和层析柱将目的蛋白与其他蛋白进行分析,收集流穿液即得目的蛋白。使用12%SDS-PAGE电泳检测纯化效果,检测结果表明,酶切后GST标签被除去,条带大小正确,通过ImageLab4.0软件分析蛋白纯度,均达到90%以上,达到免疫小鼠的要求。使用3KD超滤管对所得融合蛋白进行浓缩。采用BCA法对目的蛋白进行定量,以牛血清白蛋白为标准蛋白,设置酶标仪吸光度值为570nm,所得标准曲线一元一次方程:Y=0.3485X+0.0339,R2=0.9934.根据此方程以及各蛋白对应的读数计算其浓度。总结如下:
表3.目的蛋白的浓度
实施例2动物免疫及活性检测
1动物免疫及抗原抗体结合强度的测定
1.1动物的免疫及采血
6~8周龄BalB/c小鼠60只,随机分为11组,铝佐剂对照组,空载体DTT对照组,实验组8组,每组6只。抗原与氢氧化铝(终浓度1.6mg/mL)佐剂1:1混合,注射剂量为50μg抗原/只/次,背部皮下多点注射。初次免疫后每隔两周免疫一次,第3次免疫后一周收集抗血清。
1.2ELISA法检测抗体的产生
为了测定实验组血清中是否产生针对hIL6或者mIL6的抗体,需要进行ELISA实验。ELISA实验测定抗体的过程如下:
1)底物的包被:用包被液(碳酸氢铵溶液,pH9.6)稀释hIL6或mIL6至1μg/mL,在96孔板中每孔加入100μL的底物,37℃孵育2h,用洗涤液PBST(PBS溶液+0.05%的Tween20)溶液清洗孔板后拍干;
2)封闭:每孔用300μL封闭液(PBST溶液+5%的脱脂奶粉)封闭1h,封闭时把96孔板置于37℃之中,洗板(程序同上)后拍干;
3)抗血清的稀释及孵育:对得到的抗血清用样品稀释液(即封闭液)作100倍稀释,每孔加入100μL稀释后的抗血清,37℃孵育1h后洗板(程序同上),拍干;
4)二抗的孵育:用样品稀释液(即封闭液)对二抗(HRP标记的羊抗鼠抗体)稀释5000倍,96孔板中每孔加入100μL的二抗,37℃孵育1h后洗板(程序同上),拍干;
5)添加底物溶液TMB:每孔加入100μL底物溶液TMB,37℃之中放置10~30min,视颜色适时终止;
6)终止反应:每个小孔之中加入50μL的浓度为2mol/L的H2SO4溶液,终止酶促反应;
7)读数的测量:利用酶标仪对OD450nm的吸光度数值进行测量,并记录。根据读数与对照组的读数的大小的差别来判断是否有抗体的存在,有则为阳性结果,判断的依据为P/N≥2.1。
实验结果:
分别对每组6个抗血清(共60个)稀释100倍作为一抗孵育,其中DTT-mIL-6组包被的底物为mIL-6细胞因子,其他实验组包被底物为hIL-6细胞因子,检测抗血清稀释100倍时OD450nm吸光度值,结果表明,空白对照组OD450nm值很低,表示实验过程稳定,没有引起背景偏高的状况出现。阴性血清组的OD450nm值很低,表示免疫前小鼠血清中并未产生有针对IL-6的抗体。Al(OH)3和DTT对照组的OD450nm值均小于0.15,表示侣佐剂和载体蛋白并未引起小鼠机体产生针对IL-6的抗体。8个实验组中有3组(分别是hIL6-2组、DTT-hIL6组、DTT-mIL6组)的OD450nm值显著高其他5组,可见这三组的小鼠产生了针对IL-6的抗体,进一步对这三组的抗血清稀释不同的倍数来测定其效价。
图1为分别包被hIL-6和mIL-6细胞因子,一抗分别使用Alum组、DTT组、hIL6-2组、DTT-hIL6组、DTT-mIL6组的测定结果。可见相比对照组,hIL6-2组、DTT-hIL6组、DTT-mIL6组针对hIL-6和mIL-6细胞因子均产生有很高的抗体,说明这三组的抗血清与细胞因子均产生有交叉反应。
1.3ELISA测定阳性血清的效价
将抗血清(DTT组,hIL6-2组,DTT-hIL6组,DTT-mIL6组)分别稀释12个倍数,100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍、102400倍、204800倍,且每组做4个血清样品的平行,其中,DTT组、hIL6-2组、DTT-hIL6组包被底物为商品化的rMuIL-6细胞因子;DTT组、DTT-mIL6组包被的底物为商品化的mIL-6细胞因子。检测结果表明,DTT-hIL-6组的效价约为2×105,hIL6-2组的效价略低,约1.5×105。说明本发明的抗原表位(仅12个氨基酸)在载体蛋白的作用下可产生相当于整个结构域(212个氨基酸)的效果,证明了基于本发明的抗原表位肽的表位疫苗的可行性。DTT-mIL6组的效价约为1.5×105。
1.4WesternBlotting测定抗原抗体的特异性结合
为进一步验证hIL-6-2组、DTT-hIL-6组和DTT-mIL-6组是否产生针对IL-6的抗体以及产生抗体与相应抗原特异结合的强弱,采用WesternBlotting的方法对其进行验证。首先进行条件优化,摸索最佳的上样量和各抗血清稀释度后重新进行跑胶。实验的步骤流程如下:
1)电泳分离样品:分别取24μLhIL6抗原(浓度为20μg/mL)和8μLIL6(浓度为20μg/mL)加入5×电泳上样缓冲液,混匀后煮沸5min,离心后吸取10μL上样(间隔孔)。取8μL预染色marker点样用以指示转膜效率和标志泳道,取3μLMarker(easyWesternProteinLader)点样用于显影后显色。电泳整个过程为120V恒压电泳。
2)转膜:依据蛋白胶的大小剪取PVDF膜(即聚偏二氟乙烯膜)和6片滤纸,将滤纸、PVDF膜及海绵均置于转膜电泳缓冲液中平衡10min,预先用纯甲醇对PVDF膜进行浸泡3~5秒钟。装配转膜三明治,装配之时为负极面(黑色面),放置海绵,接着放置3层滤纸,再把蛋白胶小心的贴合在滤纸上,把PVDF膜贴合在蛋白胶上,再放置3层滤纸,垫上海绵,最后是夹套的正极面(红色面)。转膜电泳结束后,取出PVDF膜,观察预染marker的条带,判断转膜效果;
3)洗膜:使用25mLTBS溶液清洗膜5min,洗膜的过程置于室温并需伴有轻微的晃动;
4)封闭:把PVDF膜置于封闭液之中,室温条件之下封闭1h或者4℃封闭过夜,封闭结束后用TBST溶液清洗膜,清洗三次;
5)孵育一抗:根据铅笔标记的泳道用剪刀小心剪取合适的大小区域的PVDF膜,把PVDF膜小心的贴合在10mL的离心管壁上,加入合适稀释度的一抗(一抗为需要检测抗体的抗血清15μL稀释100倍,每张膜加1.5mL,10mL离心管中旋转反应),室温孵育1h,缓慢摇动。孵育结束之后,每次15mLTBST溶液清洗膜3次,以除去未结合的抗血清,每次清洗5min;
6)孵育二抗:加入稀释5000倍的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(羊抗鼠二抗),室温孵育1h,缓慢摇动。孵育结束后用TBST溶液对条带进行清洗,清洗3次,每次清洗5min,以充分地除去未结合的二抗。用TBS洗1次,洗涤5min;
7)发光:配置HRP-ECL发光显色溶液,取A、B发光液按1:1的比例混合,用去离子水对膜稍加漂洗后并排放置硬板上,用滤纸从角落把去离子水吸干,把发光混合液滴在膜上,覆盖均匀,用保鲜膜内包裹,固定于片盒中,关闭胶盒。根据所见荧光强度曝光。选取2min曝光并保存图像。实验结果表明在条件优化后DTT-mIL-6和DTT-hIL-6组的抗血清与mIL-6和hIL-6因子均产生有特异性结合。说明mIL-6与hIL-6产生一定的交叉反应。而表位组hIL6-2只与hIL-6有特异性结合,而与mIL-6无结合,说明表位组没有产生针对mIL-6的特异性抗体。对照组DTT抗血清与mIL-6和hIL-6因子均无结合,说明DTT并未刺激机体产生针对mIL-6和hIL-6的特异性抗体。
ELISA和WesternBlotting两种方法显示了一致的结果,共同说明了自身抗原(mIL-6结构域)融合载体蛋白DTT可以打破自身耐受实现机体针对自身的抗原产生特异性的抗体,进而有望研发一种可以打破自身耐受产生中和抗体的融合疫苗,达到减缓或治疗类风湿性关节炎的目的。比较融合表位组(hIL-6-2)和融合结构域(DTT-hIL-6)的结果可看出,本发明设计的B表位融合DTT后产生了和融合结构域相当的抗体效价。
实施例3多抗体外中和白介素6的活性测定
1.多抗的纯化及定量
采用本领域常规的方法对多抗进行纯化,经电泳分析所得多抗纯度达90%以上,使用BCA法对多抗进行定量。
2.多抗体外中和IL-6活性用量的探究
1)将冻存在液氮里的7TD1细胞(购自中科院上海细胞库)取出1管(约107个/mL)于冰盒中,放在37℃迅速冻融,加入7mLRPMI1640培养基中混匀后离心去上清(立即洗去DMSO);
2)分别取500μL细胞冻存液重悬浮于7mLRPMI1640培养基(含10%FBS、128pg/mLmIL6)和7mLRPMI1640培养基(含10%FBS、50ng/mLhIL6),吸打均匀后转移到小培养瓶中,显微镜下观察细胞状态,培养在37℃10%CO2培养箱中静置培养;
3)期间密切观察细胞的生长状况并每两天换液一次,收集处于对数生长期的7TD1细胞,离心后再悬浮于10mLRPMI1640(含10%FBS)中。吸打后(大概吸打40次),分别取5mL加入到两个大培养瓶中静置培养,培养2天后用血球细胞板计数,调细胞悬液密度至5.0×104/mL;
4)在96孔平底培养板分别加入200μL7TD1悬浮液(含10%FBS)以及30μL孵育液(对于四个多抗,分别取10μL、20μL、30μL参与反应,空白对照组只加230μL的RPMI(含10%FBS),阴性对照组不加多抗,共9组),每组做4个复孔。其中孵育液需提前在37℃,5%CO2培养箱中孵育2个小时;
5)于5%CO2、37℃条件下培养3天后倒置显微镜下观察细胞生长状况,并使用血球计数板做细胞计数。
实验结果:
分别取10μL(组1)、20μL(组2)、30μL(组3)7TD1细胞探究四个多抗体外中和IL-6活性的能力,实验结果如图2、3所示。
图2中Y轴单位为104个细胞/mL,空白组为7TD1细胞悬液,可以看出在加入mIL-6(终浓度128pg/mL)后细胞数目有了明显的增长,不同量的抗DTT多抗与mIL-6孵育后细胞数目较阴性对照组(即mL-6组)均没有明显的变化,而抗DTT-mIL-6多抗与mIL-6孵育后细胞数目较阴性对照组有明显的降低,由此可以看出抗DTT-mIL-6的多抗在体外有明显抑制mIL-6活性的效果。
图3中Y轴单位为104个细胞/mL,空白组为7TD1细胞悬液,可以看出在加入hIL-6(终浓度80ng/mL)后细胞数目有了明显的增长,抗DTT多抗与hIL-6孵育后同样没有中和hIL-6的活性,而抗DTT-hIL-6的多抗与hIL-6孵育后细胞数目有明显的降低,抗DTT-hIL-6-2多抗(抗hIL-6-2表位多抗)也能使细胞数目降低,说明这两个多抗在体外均有抑制hIL-6活性的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。