CN110382519B

CN110382519B - 恙虫病东方体的全新重组蛋白抗原以及使用上述重组蛋白抗原的疫苗组合物

Info

Publication number: CN110382519B
Application number: CN201780079268.0A
Authority: CN
Inventors: 赵南赫; 河奈咏
Original assignee: Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN110382519A; US20190330283A1; US10961284B2; KR102027809B1; WO2018117691A1; KR20180072586A

Abstract

本发明公开一种可有效地适用于恙虫感染与否的诊断并作为恙虫疫苗进行使用的从TSA56抗原的保守序列导出的全新重组蛋白抗原以及使用上述重组蛋白抗原的疫苗组合物。

Description

恙虫病东方体的全新重组蛋白抗原以及使用上述重组蛋白抗原的疫苗组合物

技术领域

本发明涉及一种恙虫病东方体的全新重组蛋白抗原以及使用上述重组蛋白抗原的疫苗组合物。

背景技术

恙虫病(scrub typhus)是一种当人体被受到恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi，以下简称为“恙虫病”)感染的恙螨幼虫叮咬人体时发生的以节肢动物作为媒介传播的传染疾病，主要发生在俄罗斯沿海地区、韩国、日本、中国、东南亚地区以及澳大利亚北部等亚太地区，每年感染的患者约有一百万人以上。被受到感染的恙虫叮咬的患者会在经过1-2周的潜伏期之后出现发烧、发冷、结痂、皮疹、肌肉疼痛、淋巴结肿大等症状。如果能够在感染初期做出正确的诊断就可以通过适当的抗生素处方进行治疗，但是因为初期的临床症状与其他热性传染疾病类似而难以做出鉴别诊断，而且并没有能够在临床现场简单快速地进行诊断的方法，因此经常会演变成重度的全身热性疾病并在每年导致不少的死亡病例。

目前已经得知有非常多样化的血清型(serotype)或基因型(genotype)的恙虫存在，分为包括传统的吉列姆(Gilliam)、卡普(Karp)以及卡托(Kato)等原型(prototype)在内的几十种亚型(strain)(Eisemann ans Osterman 1985,Am J Trop Med Hyg.Nov；34(6):1173-8；Akira Tamura and Akiyoshi Kawamura 1991,J.CLIN.MICROBIOL.Feb.1991,Vol.29,No.2；WOO-HYUN CHANG et al.1993,J.CLIN.MICROBIOL.Mar.1993,p.598-605)。恙虫的基因型是利用对上述细菌的主要膜蛋白即56kDa型特异性抗原(56kDa Type specificantigen，TSA56)进行加密的基因进行分类。在韩国经常发生与卡普型类似的保宁基因型感染病例，但是已经得知在各个恙虫病的发病国家发现的恙虫的基因型的种类以及频度非常多样化。

通过人体或小鼠感染模型可以得知，恙虫感染而引起的保护性免疫是对所感染恙虫的基因型特异性的，而且抗体反应的持续性仅为1～2年的较短时间。此外，在被其他基因型二次感染时并没有任何防御能力。例如，曾有报告指出被吉列姆血清型感染的患者在2个月之后再次被卡普血清型感染的恙虫病病例。因为如上所述的恙虫的基因多样性，目前为止还没有能够开发出有效的疫苗产品，而且这也导致了此类疾病在血清学诊断方面的障碍。此外，在东南亚以及印度等地还有与抗生素抗菌相关的报告，而且在韩国以及中国等东亚地区的发病报告也呈现出了增加的趋势，成为了重大的公共安全问题。因此，需要开发出一种能够快速有效地对恙虫基因型的感染进行诊断并提供有效的保护性免疫的技术。

为了开发出恙虫病疫苗产品，在过去的70多年来一直进行着大量的研究。在初期的研究过程中开发出的恙虫病疫苗为利用福尔马林处理或伽马射线照射的灭活疫苗(Killed-vaccine)，已确认其无法为人体提供有效的保护性免疫，此外还进行了有关利用TSA56蛋白(56-kDA型特异性抗原，56-kDa Type-Specific Antigen)以及47KDa的外模蛋白的重组蛋白疫苗(Subunit vaccine)、DNA疫苗等的研究活动，但是有报告指出这些疫苗只能对相同的基因型感染提供暂时的防御性免疫，已确认其无法诱导其他基因型的保护性免疫(Buckland and Dudgeon,1945；Lancet 2,734～737；Kawamura et al.,1940.Trop.Dis.Bull.37,269～270；Seong et al.,1997.Infect.Immun.65,1541～1545；Yu et al.,2005.Am.J.Trop.Med.Hyg.72,458～46)。

因此，急需开发出一种能够克服如上所述的基因差异并为多样化的基因型或血清型提供普遍的保护性免疫的疫苗抗原。此外，还急需开发出一种能够有效地在早期诊断出如上所述的多样化的基因型的诊断抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恙虫病东方体的全新重组蛋白抗原。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述重组蛋白抗原的恙虫病东方体疫苗组合物。

本发明的又一目的在于提供一种使用上述重组蛋白抗原的恙虫病东方体诊断用组合物。

本发明的其他目的或具体的目的将在后续的内容中进行公开。

如下述实施例所示，本发明人在从美国国立生物信息学中心(National Centerfor Biotechnology Information)的碱基序列数据库中收集了直至2015年12月31日之前发表的1,030个TSA56蛋白基因碱基序列并从中筛选出了包含全部TSA56蛋白序列的加密部位(ORF部位)中的85％以上的206个基因之后(收录到美国国立生物信息学中心的tsa56基因序列中，有包含全部ORF的序列以及只包含其中一部分的序列，从上述基因序列中筛选出包含对与相应菌株的全长TSA蛋白氨基酸序列相比的85％以上碱基序列进行加密的部位的基因)，对上述206个基因的氨基酸序列以及碱基序列进行分析并分类成呈现出明显的统计学差异的17个基因型，再以系统树的距离为基准进一步将其分为5个基因型组。对于这些基因型，接下来利用Gblocks程序(Systematic biology,2007,56,564-577.)等在基因型之间的变异较少的保守区(Conserved blocks)中规定了连续的氨基酸序列的非特异性变化少且一贯性高的7个区间(C1～C7)，然后通过对包含于17个基因型中的基因的氨基酸序列进行相互比较而规定了7个保守区所包含的氨基酸序列中出现频率最高的各个位置的氨基酸并以此为基础导出了代表整体的序列(“代表序列”)。

接下来，本发明人通过在大肠杆菌中的表达/纯化而制备出了在上述17个基因型的序列、5个基因型组的序列以及1个代表序列中代表性地对保宁(Boryong)基因型的7个保守区序列进行连接的重组蛋白抗原(C1保守区中的“LSLTTGLPFGGTLAAGMTIA”的氨基酸序列被排除，这是因为根据预测上述氨基酸序列会构成跨膜基序(transmembrane motif)且已经确认其会对重组蛋白的产量造成阻碍)，并且为了对上述重组蛋白作为诊断目的使用的可能性进行确认，在使上述重组蛋白与恙虫感染抗血清发生反应之后利用蛋白印迹(western blot)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)对其反应性进行了确认，其结果呈现出了与保宁抗原类似的反应性，此外为了对上述重组蛋白作为疫苗使用的可能性进行确认，通过利用上述重组蛋白抗原对小鼠进行免疫，确认其能够有效地诱导如对TSA56的抗体生成等体液性免疫且利用上述重组蛋白抗原进行免疫的小鼠与利用TSA56抗原进行免疫的试验组相比对其他基因型的抵抗性更加优秀。

本发明涉及一种在图3至图8所示的17个基因型、图9以及图10所示的5个基因型组以及图11所示的1个代表序列中分别对7个C1至C7的保守区序列按顺序进行连接的序列标号1至23中的一种序列构成的重组抗原蛋白。此外，在制备出利用代表序列的重组蛋白抗原并利用相应的蛋白抗原对小鼠进行免疫时也能够确认恙虫感染小鼠的生存率高于比较组(TSA56抗原免疫小鼠)。

较佳地，是在从各个C1中排除预测为跨膜螺旋(transmembrane helix)的区间(对于保宁(Boryong)基因型为从第47个氨基酸到第66个氨基酸即LSLTTGLPFGGTLAAGMTIA)的氨基酸序列之后进行连接的重组抗原蛋白为宜。关于上述跨膜螺旋(transmembranehelix)区间，能够在图3至图8所示的17个基因型、图9以及图10所示的5个基因型组以及图11所示的1个代表序列的C1序列中查找与上述保宁(Boryong)基因型的序列对应的序列，或利用可以对如上所述的区间进行预测的TMHMM Server v.2.0程序(http://www.enzim.hu/hmmtop/)等进行查找。

如上所述，在由上述23个氨基酸序列构成的重组蛋白抗原中，代表性地针对保宁菌株的重组蛋白抗原能够在恙虫感染抗血清中呈现出与TSA56抗原类似的反应性，因此具有作为诊断目的使用的效果，而且与TSA56抗原相比还能够诱导对其他基因型的免疫反应，因此还具有作为疫苗目的使用的效果。但是，TSA56或现有的利用TSA56的重组蛋白疫苗却无法诱导对其他基因型的免疫反应(Seong et al.,1997.Infect.Immun.65,1541-1545；Yuet al.,2005.Am.J.Trop.Med.Hyg.72,458-46)。

此外，因为各个序列与代表序列的序列同源性至少达到68.8％，因此包含与上述代表序列共通的序列且序列同源性达到68.8％以上的重组抗原也应理解为包含在本发明的范围之内。其中，“与代表序列共通的序列”是指在对代表序列以及剩余的22个序列进行排序时各个位置上的23个序列全部由共通的氨基酸构成的序列。

在另一侧面，本发明涉及一种用于对上述重组蛋白抗原进行加密的基因，在又一侧面，本发明涉及一种利用上述基因制造重组蛋白抗原的方法。

在适用本发明的制造方法中，能够利用用于对上述重组蛋白抗原进行加密的基因，通过本行业公知的脱氧核糖核酸(DNA)重组技术等进行制造。上述方法，包括：(i)制造出包含用于对上述重组蛋白抗原进行加密的基因的表达载体的步骤；(ii)利用上述表达载体对宿主细胞进行性状转化的步骤；(iii)对性状转化后的宿主细胞进行培养的步骤；以及，(iv)在上述培养物中对上述重组蛋白抗原进行分离、纯化的步骤。

用于对上述重组蛋白抗原即目标蛋白(需要生产的蛋白)进行加密的目标基因，能够以上述基因进行加密的目标蛋白序列为基础进行化学合成。如上所述的化学合成方法为本行业众所周知的信息，例如能够使用固相合成技术、液相合成技术等，也能够使用通过应用上述技术而实现自动化的市售的基因合成机(DNA synthesizers)。具体信息能够参考文献[Nucl.Acid Res.14:5399-5467,1986]、文献[Tet.Lett.27:5575-5578,1986]、文献[Nucl.Acid Res.4:2557,1977]、文献[Lett.,28:2449,1978]等。

在本发明中，表达载体能够是如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体等形态的核酸，且能够根据宿主微生物从商用化的载体中购买使用适当的载体或在购买、改造后使用。例如，当作为宿主微生物使用大肠杆菌时，能够使用如pUC19、pSTV28、pBBR1MCS、pBluscriptII、pBAD、pTrc99A、pET、pACYC184、pBR322、pJE101、pJE102、pJE103等。

关于包含重组脱氧核糖核酸(DNA)技术的表达载体的构成，在本行业中已经积累了大量的文献资料，例如能够参考文献[Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)]、文献[F MAusubel et al,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley amp；Sons,Inc.(1994)]、文献[Marston,F(1987)DNA Cloning Techniques]等。即使没有明确的提及，在本说明书中引用的所有文献均应视为本说明书的一部分。

表达载体中除了用于对上述重组蛋白抗原进行加密的目标基因之外，还包括通过以可操作的方式连接到上述目标基因而对上述目标基因的转录以及翻译造成影响的调节序列。

在上述调节序列中，通常包括启动子序列、转录终止信号序列(polyadenylationsignal)等。其中，“以可操作的方式连接”是指以可对某个基因的转录和/或翻译造成影响的方式连接。例如，当某个启动子可对与其连接的某个基因的转录造成影响时，上述启动子与上述基因就是以可操作性的方式连接。

在本说明书中，“启动子”表示本行业公知的一般含义，具体来讲，是指位于以某个基因的转录起始位点为基准的上游(5’一侧)且包含脱氧核糖核酸(DNA)-依赖核糖核酸(RNA)聚合酶的结合部位、转录起始位点、转录因子结合部位等并配备对一个以上基因的转录进行控制的功能的核酸序列。当上述启动子是来源于原核生物时包括位于转录起始位点的上游的Prib-now box(通常位于转录起始位点(+1)-10附近位置)、Hogness box(通常位于转录起始位点(+1)-35附近位置)，而当上述启动子是来源于真核生物时包括位于转录起始位点的上游的TATA框(通常位于转录起始位点(+1)-20至-30位置)、CAAT框(通常位于与转录起始部位相比的大约-75位置)、增强子、转录抑制因子等。

只要是能够对与其连接的目标基因进行表达的启动子，组成型启动子(在特定有机体中始终对表达进行诱导的启动子)以及诱导型启动子(对特定的外部刺激做出反应并对目标基因的表达进行诱导的启动子)都能够作为启动子进行使用，较佳地使用适合于特定宿主微生物的启动子为宜。例如，当将大肠杆菌作为宿主微生物使用时，使用T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA、rrnB、1PL等启动子为宜，而当将酵母作为宿主微生物使用时，使用GAL1、GAL10、ADH1、TDH3、PGK等启动子为宜。

在上述表达载体中，除了启动子之外还包括转录终止序列即终止序列，终止序列是起到poly(A)添加信号(polyadenylation signal)作用的序列，用于提升转录的完结性以及效率性。适合于不同宿主微生物的终止序列属于本行业中的公知信息，例如，当宿主微生物为大肠杆菌时，能够使用如tac终止序列、rrnB终止序列等，而当宿主微生物为酵母时，能够使用如ADH1终止序列等。

上述表达载体能够追加包括筛选标志基因。筛选标志基因是一种用于对可筛选出包含上述标志物质的宿主微生物的性状进行加密的基因，通常是抗生物质抗性基因。可使用的抗生物质抗性基因的实例，包括嘌呤霉素抗性基因(例如来源于白色链球菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因)、新霉素抗性基因(例如来源于弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸转移酶基因)、潮霉素抗性基因(来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的吸水链霉菌磷酸转移酶基因)、博莱霉素抗性基因(来源于轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的博来霉素结合蛋白)、杀稻瘟素抗性基因(例如来源于轮状链霉菌(Streptomyces verticillum)的杀稻瘟素S-乙酰基转移酶基因)、潮霉素抗性基因(例如来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的氨基环醇磷酸转移酶基因)、氨苄西林抗性基因(β-内酰胺酶基因)等。

在适用本发明的方法中，表达载体还能够包括限制性内切酶识别位点(restriction enzyme recognition site)，以便能够轻易地对目标基因进行克隆。

在适用本发明的方法中，在通过上述步骤(a)制备出表达载体之后，将执行利用上述表达载体对宿主微生物进行性状转化的步骤(b)。

性状转化是指因为目标基因的导入而造成的宿主微生物的基因型的变异，所导入的外来基因能够相对于宿主微生物的基因组独立存在或以整合到宿主有机体的基因组中的方式存在。

利用上述表达载体对宿主微生物进行性状转化的方法也属于本行业中的公知信息，能够选择使用公知方法中的任意方法，例如，当宿主微生物为大肠杆菌等原核细胞时，能够使用如CaCl₂法、Hanahan法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法等性状转化方法，而当素质微生物为酵母等真核细胞时，能够使用显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、DEAE-葡聚糖处理法、基因枪转化法等性状转化方法。与性状转化相关的具体信息，能够参考文献(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973))、文献(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))、文献(Dower,W.J.et al.,Nucleic.Acids Res.,16:6127-6145(1988))、文献(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980))、文献(Graham,F.L.et al.,Virology,52:456(1973))、文献(Neumann,E.et al.,EMBO J.,1:841(1982))、文献(Wong,T.K.et al.,Gene,10:87(1980))、文献(Gopal,Mol.CellBiol.,5:1188-1190(1985))、文献(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))、文献(Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Har bor Laboratory(1982))、文献(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255,12073-12080(1980))、文献(Luchansky et al Mol.Microbiol.2,637-646(1988))等。

在适用本发明的方法中，可适用于性状转化的宿主微生物能够是原核细胞或真核细胞。作为原核细胞，能够使用革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌都。具体来讲，能够使用包含埃希氏菌(Escherichia)属细菌在内的如沙门氏菌(Salmonella)属细菌、志贺氏菌(Shigella)属细菌、肠杆菌(Enterobacter)属细菌、沙雷氏菌(Serratia)属细菌、欧文氏菌(Erwinia)属细菌、沙雷氏菌(Serratia)属细菌、假单胞菌(Pseudomonas)属细菌、柄杆菌(Caulobacter)属细菌、集胞藻(Synechocystis)属细菌(例如集胞藻属PCC 6803或聚球藻属PCC 6301)、聚球藻(Synechococcus)属细菌、芽孢杆菌属细菌(例如短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringienesis)等)、乳球菌(Lactococcus)属细菌(例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))、链霉菌(Streptomyces)属细菌(例如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus))、红球菌(Rhodococcus)属细菌(例如红平红球菌(Rhodococcus erythropolis))、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌(例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))、分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌(例如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis))等。

作为真核细胞，能够使用如毕赤属酵母(例如毕赤酵母(Pichia pastoris))、酒酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、汉逊属酵母(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、克鲁维属酵母(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis))、裂殖属酵母(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))等。

较佳地，使用大肠杆菌(Escherichia coli)为宜。与其他表达宿主微生物相比，在大肠杆菌中的表达能够提供收率方面的多种优势。作为适合于目标基因的高收率表达的大肠杆菌，包括如大肠杆菌W3110、大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DHIOB/p3、DH1IS、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、ER1647、NovaBlue、DH5α、K12RV308、K12C600、K-12、MG1655、HB101菌株等。相关详细信息能够参考文献(Brown,Molecular Biology Labfax,AcademicPress(1991))，上述文献也应视为本说明书的一部分。

为了能够在大肠杆菌中发挥、维持目标蛋白的功能，将蛋白分解酶活性受损的大肠杆菌作为宿主微生物使用为宜。相关详细信息能够参考文献(Gottesman,S.,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California,119-128(1990))。

此外，为了在大肠杆菌中实现目标基因的高收率表达，也能够在将目标基因的序列优化成在大肠杆菌中优选的密码子之后使用。与其相关的信息能够参考文献(Wada etal.,Nucleic Acids Res.20:2111-2118(1992))。

在适用本发明的方法中，在得到如上所述的经过性状转化的宿主微生物之后，能够通过对上述宿主微生物进行培养而生产出上述重组蛋白抗原。

对经过性状转化的宿主微生物进行培养时，能够使用本行业公知的任意方法。

作为在对细胞进行培养时所使用的培养基，能够使用包含经过性状转化的宿主微生物可有效利用的碳源、氮源、微量元素等的天然培养基以及合成培养基。当作为宿主细胞使用动物细胞时，使用如Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium,Eagle,H.Science 130:432(1959))、α-MEM(Stanner,C.P.et al.,Nat.New Biol.230:52(1971))、Iscove's MEM(Iscove,N.et al.,J.Exp.Med.147:923(1978))、DMEM(Dulbecco'smodification of Eagle's medium,Dulbecco,R.et al.,Virology8:396(1959))等为宜。与培养基相关的具体信息能够参考文献[R.Ian Freshney,Culture of Animal Cells,AManual of Basic Technique,Alan R.Liss,Inc.,New York]。

目标蛋白的分离、纯化方法属于本行业公知的信息，能够使用公知的任意方法。例如能够使用超滤法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法(当结合有标志肽时)、高效液相色谱法(HPLC)、疏水层析法、等电点层析法等方法或上述方法之组合。

关于利用脱氧核糖核酸(DNA)重组技术生产适用本发明的目标蛋白的方法，除本说明书中记载的内容之外还能够参考文献[Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,US(1989)]、文献[Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Jon Willey&Sons,US(1993)]、文献[Sambrook,J.&Russel,D.Zeo,Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001年01月15日发行，第1卷7.42至7.45，第2卷8.9至8.17]等。

在另一侧面，本发明涉及一种作为活性成分包含上述重组蛋白抗原的疫苗组合物。

在本说明书中，“疫苗”的含义包括通过在作为宿主的人体内诱导对相应病原体的免疫反应，从而预防相应病原体的感染或再次感染、减少相应病原体的症状严重程度或消除症状、实质或彻底去除相应病原体或与相应病原体相关的疾病。因此，适用本发明的疫苗组合物能够在人体被相应病原体感染之前以预防为目的进行给药或在人体被相应病原体感染之后以治疗为目的进行给药。其中，上述“免疫反应”的含义包括体液性免疫反应、细胞性免疫反应或上述两者。

此外在本说明书中，“活性成分”是指能够单独诱导免疫反应的成分或虽然其自身无法诱导免疫反应但能够与载体一起诱导免疫反应的成分。因此，并不一定要求活性成分本身具有免疫原性(能够诱导免疫反应的能力)。在本发明中虽非必须，但对上述活性成分进行纯化为宜。其中，“纯化”是指包含该对象物质的原有有机体(即本发明中经过性状转化的微生物)的细胞成分或其补偿液成分(污染物)被实质性减少或去除的状态。污染物被实质性减少或去除的状态，是指纯度达到50％以上，较佳地达到90％以上，更较佳地达到99％以上的状态。纯度能够通过层析、凝胶电泳、免疫学分析等本行业公知的方法进行评估，作为纯化方法也能够使用后续说明的本行业公知的方法。

此外在本说明书中，上述“恙虫”的含义包括被分类、识别为恙虫病东方体的所有微生物。具体来讲，其含义包括吉列姆(Gilliam)血清型、卡普(Karp)血清型、卡托(Kato)血清型以及保宁(Boryoung)血清型。

适用本发明的疫苗组合物，能够以任意适当的且在药学上容许的制剂形态制造。例如，能够以可直接给药的溶液或悬浮液形态、需要在给药之前进行适当稀释的浓缩原液形态、或如冻结干燥、冷冻干燥或冷冻制剂等可重组的形态进行制造。

适用本发明的疫苗组合物，在制剂化时能够包括药学上容许的载体。关于能够在对疫苗组合物进行制剂化时使用的药学上容许的载体，已在大韩民国药典或其他国家的药典尤其是美国、日本、欧洲的额姚奠中进行了列举、规定，具体信息可以参考相关药典。

如上所述的载体通常能够包括稀释剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂等。作为适当的稀释剂，能够使用如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油、花生油等植物油等非水性溶剂或如盐水(较佳地为0.8％的盐水)、包括缓冲介质的水(较佳地为0.05M的磷酸盐缓冲液)等水性溶剂，作为适当的赋形剂能够使用如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙烯、水、乙醇等，作为适当的稳定剂能够使用如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸、葡萄糖等碳水化合物或如奶粉、血清白蛋白、酪蛋白等动物性、植物性或微生物性蛋白等蛋白。作为适当的防腐剂，能够使用如硫汞撒、硫柳汞、庆大霉素、新霉素、制霉菌素、两性霉素B、四环素、青霉素、链霉素、多粘菌素B等。

适用本发明的疫苗组合物还能够追加包括抗原佐剂(adjuvant)。抗原佐剂能够由可增强对抗原的免疫反应的一个以上的物质构成。佐剂能够起到用于对抗原进行缓释的组织储存库和/或用于非特异性地强化免疫反应的淋巴系统激活因子的作用(Hood et al.,Immunology,Second Ed.,1984,benjamin/Cummings:Menlo Park,California,p.384)。抗原佐剂能够是如弗氏(Freund)完全佐剂、弗式非完全佐剂、皂苷、凝胶性状的铝佐剂、表面活性物质(如溶血卵磷脂、荧光酮乙二醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液等)、植物油(棉籽油、花生油、玉米油等)、维生素E醋酸酯等。

目前可适用于人体的抗原佐剂中最广泛使用的是铝佐剂，上述铝佐剂是以磷酸铝(Aluminum phosphate)、硫酸铝钾(Potassium aluminum sulfate)、氢氧化铝(Aluminumhydroxide)等铝盐(Aluminium salts)的凝胶性状使用。上述铝佐剂通常能够诱发Th2-type免疫反应并借此强化疫苗效果(Sokolovska A et al.,Vaccine.2007Jun6；25(23):4575-85；O'Hagan DT AND Rappuoli R.,Pharm Res.2004Sep；21(9):1519-30.)。在适用本发明的实施例中使用的Invivogen公司的是氢氧化铝(Aluminium hydroxide)的凝胶形态(colloidal)悬浮液。上述铝佐剂的制造方法属于本行业的公知信息(R.Bomford.Immunological Adjuvants and Vaccines.NATO ASI Series 1989；179:35-41；Vogel FR AND Powell MF.Pharm Biotechnol.1995；6:141-228.；Derek T.O'Hagan,Methods in Molecular Medicine.2000；April15；42:65-90)，能够直接制备使用或购买使用市场上流通的产品。作为市场上流通的产品，包括在下述实施例中使用的Invivogen公司的2％产品在内的如Sigma公司的Aluminum hydroxide Gel产品、BRENNTAG公司的Alhydrogel^TM产品等。

适用本发明的疫苗组合物能够以任意的单位容量制备。单位容量是指以向人体进行1次以上给药为目的包装的独立产品中所包含的活性成分以及药学上容许的载体的量，上述活性成分以及载体的适当的量是对适用本发明的疫苗组合物进行1次以上的接种时可发挥作为疫苗的功能的量，上述量能够在相关从业人员的一般能力范围内以非临床或临床方式确定。

适用本发明的疫苗组合物较佳地能够通过非口服的如直肠、经皮、静脉注射、动脉注射、肌内注射、皮内注射、皮下注射、腹膜内注射、心室内注射等方式进行给药。

适用本发明的疫苗组合物能够通过控释系统进行给药。作为上述控释系统，能够包括脂质体、移植渗透泵、经皮贴剂等方式。较佳地，通过脂质体方式传递活性成分为宜。与通过脂质体方式传递活性成分的详细信息能够参考文献[Langer,Science 249:1527-1533(1990)]、文献[Treat at al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(des.),Liss,New York,pp.353-365(1989)]等。与其他活性成分的传递方式相关的详细信息能够参考文献[Langer,supra；Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)]、文献[Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)]、文献[Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)]、文献[Medical Applications ofControlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)]、文献[Controlled Drug Bioavailability.Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)]、文献[Ranger and Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)]、文献[During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989)]、文献[Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989)]等。这些文献应视为本说明书的一部分。

适用本发明的疫苗组合物的给药量，能够由医疗服务人员在考虑年龄、体重、性别、症状、并发症、其他疾病的患病与否等患者特性的前提下确定。

此外，给药的时间间隔以及次数，能够在考虑所使用的剂型或活性成分在血液中的半衰期等的前提下确定。

如上所述，虽然给药量和给药的时间间隔或次数等需要根据医疗服务人员的判断以及个人的情况确定，但是适当的给药量通常应在每1天每1kg体重约0.1至10mg的范围内确定，给药间隔应在3至10天、给药次数应在1至5次的范围内确定。

在另一侧面，本发明涉及一种包含上述重组蛋白抗原的恙虫的特异性抗体检测用组合物。

适用本发明的检测用组合物用于对生体样本中的特异性抗体尤其用于对TSA56抗原的特异性抗体进行检测，通过使适用本发明的组合物与生体样本接触并对其反应程度进行测定，能够作为对恙虫感染者和未感染者进行区分的用途使用。尤其是在恙虫病的发病危险期内，能够有效地作为对呈现出与恙虫病相同、类似症状的患者是恙虫感染者或是未感染者进行区分的用途使用。

在本说明书中，“特异性结合”是指与恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体进行特异性结合的上述重组蛋白抗原仅与上述抗体结合而不与其他蛋白进行实质性结合的情况。其中，“实质性”是指虽然程度较低但能够形成非特异性结合体的情况，而这些特异性结合能够在后续说明的特异性结合检测之前通过洗涤溶液进行洗涤、去除。

在本说明书中，“生体样本”是指可能有恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体存在的样本，包括血液、血清、血浆、唾液、泪液、粘液、鼻涕、阴道分泌物等，较佳地是血清为宜。这是因为在本行业众所周知的是抗体在血清中以较高的浓度存在。

适用本发明的组合物能够是上述重组蛋白抗原被溶解到如碳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液等可溶性溶液中的形态或冻结干燥的形态。

此外，适用本发明的组合物能够以固定到支撑体中的形态使用，可使用的固体支撑体包括如粒子(树脂珠、磁珠、金属细颗粒、金胶体等)、基板(微量滴定板、玻璃基板、硅基板、树脂制基板、电极基板、膜等)等，但并不限定于此。作为支撑体的材料，能够使用如(i)玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石(forsterite)、氧化硅等无机材料，或(ii)聚乙烯、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、硅树脂、聚苯醚、聚砜、聚乙二醇、琼脂糖、丙烯酰胺、硝化纤维、尼龙、乳胶等有机材料。

作为将适用本发明的组合物固定到支撑体中的方法，能够通过吸附(例如覆盖)方式直接进行固定，或利用与蛋白以及支撑体同时结合的连接子等间接进行固定。

在将适用本发明的组合物吸附到支撑体中进行使用时，上述吸附能够通过利用如pH为9.5的0.006M碳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液对适用本发明的组合物进行稀释之后使上述稀释液与支撑体在一定温度下接触一定时间的方式实现。其中，只要能够充分实现吸附，则吸附所需时间以及温度并不受到特殊的限定，例如在4℃下进行吸附时能够执行72小时，而在37℃下进行吸附时能够执行2小时。在吸附之后能够利用蒸馏水或乙醇等进行洗涤，也能够利用如包含于PBS等溶液中的牛血清白蛋白(BSA)等阻断剂进行覆盖。在利用阻断剂进行覆盖之后，也能够利用蒸馏水或不包含阻断剂的缓冲溶液等进行洗涤。

被吸附到支撑体中的适用本发明的组合物(具体来讲是指包含于上述组合五种的上述重组蛋白抗原)在利用生体样本对支撑体进行处理时将与上述生体样本中的恙虫的特异性抗体尤其是TSA56的特异性抗体形成结合体。在对结合体的生成进行诱导之后，为了去除非特异性结合的抗体等或去除污染物质等，利用如Tween 20等洗涤缓冲液或蒸馏水等洗涤剂进行洗涤为宜。

通过利用多种方法对上述结合体进行检测，能够定性、定量地确认生体样本中恙虫的特异性抗体尤其是TSA56的特异性抗体的存在与否和/或存在程度。结果，能够提供被检测人是否被恙虫感染的有价值的信息。

上述结合体能够利用检测剂进行检测，检测剂能够是与恙虫的特异性抗体尤其是TSA56的特异性抗体进行结合的二级抗体。作为二级抗体的实例，能够对抗体(一级抗体)的Fc部分进行识别，上述二级抗体能够通过利用Fc部分对鸟类(例如鸡等)、哺乳动物(例如兔子、山羊、马、羊、老鼠等)等动物进行免疫化之后从上述动物的血液进行分离、纯化的方式获得。

二级抗体能够通过与提供检测信号的标志(label)或酶进行接合而方便地进行检测。

标志接合是指将可提供检测信号的任意标志与抗体结合。作为上述标志，能够使用如氚、碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、磷(³²P)、硫(³⁵S)、金属类(例如⁶⁸Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ge、⁵⁴Mn、⁹⁹Mo、⁹⁹Tc、¹³³Xe等)等的放射性同位素、异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、取代的异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸二氯三嗪、Alexa或AlexaFluoro等荧光性物质或荧光体。

酶接合是指将抗体与如过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或生物素-抗生物素蛋白复合物等酶等结合，这些酶能够在与特定基质发生反应时提供特定的检测信号。例如，过氧化物酶在与氨基水杨酸和过氧化氢或对苯二胺和过氧化氢发生反应时呈现出紫色，碱性磷酸酶在与磷酸硝基苯发生反应时呈现出黄色，而β-半乳糖苷酶在与邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖发生反应时呈现出紫色。

较佳地，上述标志或酶与抗体共价键合为宜。

在利用上述二级抗体等的检测剂进行检测时，能够利用如酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、发光免疫测定法等本行业公知、惯用的多种免疫学测定法对这些二级抗体与上述结合体的反应程度进行测定。较佳地使用酶免疫测定法，最佳地使用ELISA(酶联免疫吸附测定法，enzyme-linked immunosorbent assay)为宜。

在另一侧面，本发明涉及一种恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体的检测用试剂盒。

适用本发明的检测用试剂盒的特征在于包含上述重组蛋白抗原。

适用本发明的试剂盒中包含的上述重组蛋白抗原能够是与支撑体结合或游离的形态，也能够是溶解于可溶性溶液的形态或冻结干燥的形态。

适用本发明的试剂盒，还能够追加包括用于对生体样本中的恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体和与上述特异性抗体进行特异性结合的上述重组蛋白抗原的结合体进行检测的检测剂。上述检测剂能够是如上所述的与标志或酶结合的二级抗体。

此外适用本发明的试剂盒，还能够追加包括载体、清洗缓冲液、样本稀释液、酶基质、反应停止液等，还能够追加包括用于指导如结果的解释方法等使用方法的说明书。

在另一侧面，本发明涉及一种生体样本中的恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体的检测方法。

适用本发明的方法，包括：(a)通过使生体样本与包含上述重组蛋白抗原的恙虫的特异性抗体检测用组合物结合，形成生体样本中的恙虫的特异性抗体尤其是TSA56抗原的特异性抗体和与上述特异性抗体进行特异性结合的上述重组蛋白抗原的结合体的步骤；以及，(b)对上述结合体进行检测的步骤。

在适用本发明的方法中，因为如上所述的原因，上述步骤(a)中的生体样本较佳地是血清为宜。

此外在适用本发明的方法中，对结合体进行检测的上述步骤(b)，包括：使得与可提供检测信号的标志或酶接合的二级抗体与上述结合体发生反应的步骤；以及，对与上述结合体的反应程度进行测定的步骤。其中，二级抗体与结合体的反应程度能够使用如上所述的酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、发光免疫测定法等进行测定，较佳地使用ELISA(酶联免疫吸附测定法，enzyme-linked immunosorbent assay)为宜。

在又一侧面，本发明涉及一种用于为恙虫的感染与否诊断提供有价值的信息的方法。

适用本发明的方法包括与如上所述的生体样本中的恙虫特异性抗体的检测方法相同的步骤，因此对检测方法的说明内容同样适用于适用本发明的方法。

如上所述，本发明能够提供可有效地适用于恙虫感染与否的诊断并作为恙虫疫苗进行使用的从TSA56抗原的保守序列导出的全新重组蛋白抗原。

适用本发明的全新重组蛋白抗原有望提供一种能够克服基因型差异导致的防御免疫诱导能力差异以及诊断能力差异的疫苗组合物以及诊断组合物。

附图说明

图1是所收集到的206个tsa56基因的系统树(phylogenetic tree)分析及其基因型分析结果；

图2是通过206个TSA56蛋白的氨基酸序列分析确认的7个保守区(conservedblocks：C1～C7)；

图3至图8是在17个基因型中导出的7个保守区的各个氨基酸序列；

图9至图10是在5个基因型组中导出的7个保守区的各个氨基酸序列；

图11是代表序列的7个保守区的各个氨基酸序列；

图12是作为疫苗抗原使用的cTSA56_Boryong的氨基酸序列；

图13是经过纯化的cTSA56_Boryong重组蛋白和TSA56_Boryong重组蛋白的考马斯亮蓝染色结果以及利用健康人群和恙虫感染患者的抗血清的蛋白印迹(western blot)结果；

图14是对利用重组蛋白对小鼠进行3次免疫之后诱导的TSA56_Boryong蛋白的特异性IgG1以及IgG2c抗体力价进行图示的结果；

图15以及图16是被恙虫感染之后进行免疫的小鼠的生存率分析结果。

具体实施方式

接下来，将结合实施例对本发明进行说明。但是，本发明的范围并不限定于如下所述的实施例。

<实施例1>TSA56的保守区(conserved blocks)的识别以及cTSA56重组蛋白抗原的制备

从美国国立生物信息学中心(National Center for BiotechnologyInformation)的碱基序列数据库中收集了直至2015年12月31日之前发表的1,030个tsa56基因碱基序列并从中筛选出了包含全部对TSA56蛋白序列进行加密的部位中的85％以上的324个基因中的206个基因(收录到美国国立生物信息学中心的tsa56基因序列中，有包含全部ORF的序列以及只包含其中一部分的序列，从上述基因序列中筛选出包含对与相应菌株的全长TSA蛋白氨基酸序列相比的85％以上碱基序列进行加密的部位的基因)。上述所筛选出的206个基因序列如下述【表1】所示(在下述【表1】中以序列编号(Sequence ID)特定的206个基因序列，因为在共计324个基因序列中有序列相同的基因序列，因此最终筛选出了206个)。

【表1】筛选出的206个基因序列

将上述所筛选出的206个tsa56基因转化成氨基酸序列之后，利用MAFFT算法(Multiple Alignment using Fast Fourier Transform；Molecular biology andevolution,2013,30,772-780)程序执行了多重序列排序(Align)。将206个基因中共通保有的蛋白加密区间重新转化成碱基序列并将其适用于系统树的创建。

为了创建系统树，使用JModelTest 2.0程序(Darriba D,Taboada GL,Doallo R,Posada D.2012.jModelTest 2:more models,new heuristics and parallelcomputing.Nature Methods 9(8),772；Guindon S and Gascuel O(2003).A simple,fastand accurate method to estimate large phylogenies by maximum-likelihood,Systematic Biology 52:696-704)补正为碱基序列的优化取代矩阵。基因系统树(phylogenetic tree)是以极大似然(Maximum Likelihood)的一种即RaxML(RandomizedAxelerated Maximum Likelihood,BIOINFORMATICS APPLICATIONS NOTE Vol.22 no.212006,pages 2688-690)为基础利用SeaView4.5.1程序创建，并通过Shimodaira-Hasegawa-like(SH-like)test(Molecular biology and evolution,2010,27,221-224)分为呈现出明显的统计学差异(support value:＝0.9)的17个基因型，再以系统树的距离为基准进一步将其分为5个基因型组【图1】。为了对206个基因之间的氨基酸序列的保守区间进行定义，在氨基酸序列的各个位置上以连续的10个氨基酸单位(第1个氨基酸与接下来的9个氨基酸形成一个区间，第2个氨基酸与接下来的9个氨基酸形成一个区间)计算出在相应的各个区间序列中出现的基因之间的氨基酸变异的算数平均值，得到整体平均值即3.3氨基酸变异/位置的结果值，然后指定了在氨基酸序列的各个位置上连续的10个氨基酸区间的氨基酸变异数小于上述平均值的区间。接下来，利用Gblock程序(Systematic biology,2007,56,564-577)指定了基因之间的连续的氨基酸序列差异少且一贯性高的部位。通过如上所述的两种方法，规定了基因之间的差异相对较少的7个保守区(Conserved blocks)【图2】。在【图3】至【图11】中，整理出了从206个基因的主要氨基酸保留序列(major consensussequences)中推导出的17个基因型、5个基因型组以及代表整体序列的代表序列(Universal conserved sequence)的保守区的氨基酸序列。

此外，在下述【表2】中给出了代表序列(将C1至C7按顺序连接的序列)与剩余的22个序列的序列相同性的比较结果。

【表2】代表序列与剩余序列的序列相同性比较结果

为了对由上述共计23个保留区的氨基酸序列构成的重组蛋白抗原(由各个保守区序列按顺序连接而构成的蛋白抗原)作为诊断和疫苗用途使用的可能性进行确认，在实验中作为代表使用了由【图4】中的保宁(Boryong)基因型的7个保守区序列连接而构成的序列的蛋白(以下简称为“cTSA56_Boryong”)以及代表序列的蛋白质(universal conservedTSA 56；以下简称为“usTSA56”)。cTSA56_Boryong的C1至C7的各个序列，是从206个基因中已经被确认为保宁基因型的17个基因中对应于7个保守区的氨基酸序列上提取出的出现频率最高的氨基酸序列。上述cTSA56_Boryong序列如【图12】(以及序列编号24)所示，【图12】所示的cTSA56_Boryong的氨基酸序列是从【图4】所示的保宁基因型保守区1(C1)的氨基酸序列中去除“LSLTTGLPFGGTLAAGMTIA”氨基酸序列的结果，这是因为根据预测上述氨基酸序列会构成跨膜基序(transmembrane motif)且已经确认其会对重组蛋白的产量造成阻碍，因此制备了排除上述序列之外的重组抗原蛋白。ucTSA56是由包含于17个基因型的基因的7个保守区中所包含的氨基酸序列中出现频率最高的各个位置的氨基酸构成的序列，相应的序列如【图11】以及序列编号23所示。

在通过化学方式合成用于对cTSA56_Boryong或ucTSA56进行加密的核酸序列并通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增之后，在大肠杆菌表达载体在通过化学方式合成用于对cTSA56_Boryong或ucTSA56进行加密的核酸序列并通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增之后，在大肠杆菌表达载体即pET-28a(+)质粒中进行克隆并导入到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。在包含卡那霉素(Kanamicin，50μg/ml)的LB培养基(LB broth)中对上述重组大肠杆菌进行培养，直至OD600nm(Optical Density(光密度)600nm)的值达到0.6～0.8。接下来，在添加0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)之后在16℃下进行18小时的培养，从而对蛋白质的表达进行诱导。

将已完成表达诱导的菌以1,000xg的速度进行10分钟的离心分离之后悬浮到包含1mg/ml的溶解酵素(Lysozyme)的Ni-次氮基三乙酸(Ni-nitrilotriacetic acid，NTA)His-结合缓冲液(300mM NaCl,50mM sodium phosphate buffer,10mM imidazole)中并在4℃下进行30分钟的反应。接下来，在冰上进行5分钟的超声波处理并将由此得到的溶解物以1,600xg的速度在4℃下进行20分钟的李欣处理。

回收上清液并在4℃下与事先利用结合缓冲液进行平衡化的Ni-次氮基三乙酸(Ni-nitrilotriacetic acid，NTA)His-结合树脂(Resin)进行60分钟的反应。

在利用包含50nM咪唑(imidazole)的结合缓冲液对树脂进行西地之后，再利用包含250mM咪唑(imidazole)的结合缓冲液对蛋白进行纯化。接下来为了去除游离的咪唑(Free imidazole)而在4℃下利用磷酸缓冲液(pH 7.4)进行18小时的渗析(Dialysis)，接下来为了去除经过纯化的蛋白中的内毒素(Endotoxin)而使用了内毒素清除树脂(Endotoxin removal resin)。通过LAL(Limulus amebocyte lysate，鲎变形细胞溶解物)实验确认了经过纯化的蛋白溶液中的内毒素浓度下降到EU<0.05/dose水平。

对所提取出的蛋白进行电泳而执行考马斯亮蓝染色(Coomasie blue stain)的结果以及利用恙虫病患者血清和抗-His抗体的蛋白印迹(western blot)法反应与否确认结果如【图13】所示。通过【图13】的结果可以得知能够获得相当于预期分子量的30kDa的cTSA56_Boryong重组蛋白，同时可以得知cTSA56_Boryong重组蛋白不会与健康人体的血清发生反应但会与恙虫感染患者(OT patient)的血清发生反应，借此可以确认其可以有效地用于恙虫感染患者的诊断。

<实施例2>利用cTSA56_Boryong重组蛋白抗原的免疫原性以及疫苗功效验证

1.重组蛋白抗原免疫及血液采集

利用经过纯化的cTSA56_Boryong重组蛋白20μg和TSA56_Boryong(作为对照组的保宁基因型TSA56蛋白的细胞外部位，即排除了信号肽(signal peptide)以及跨膜区(transmembrane domain))20μg,以及作为阴性对照组的磷酸缓冲液进行了免疫。在将各个疫苗制剂与磷酸缓冲液混合直至达到80μl的总量之后添加免疫强化剂即2％铝胶(Alhydrogel)20μl使其总混合比例(final volume ratio)达到4:1(抗原:免疫强化剂)，接下来在室温下进行15分钟的反应。

将通过上述方式制备的各个疫苗制剂经皮下(subcutaneous)注射到C57BL/6(6-8周龄，雌性)小鼠中，并以2周为间隔进行共计3次免疫。

在每次免疫的7天之后通过眼窝采血采集血液，接下来通过以2,500xg进行5分钟的离心分离而分离出血清。

2.通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行特异性抗体定量

利用0.05M碳酸氢盐缓冲液(bicarbonate buffer，pH 9.5)将经过纯化的TSA56_Boryong蛋白稀释到1μg/ml的浓度之后，在免疫测定板(Immunoassay plate)以100μl/well的量在4℃下进行18小时的覆盖。

利用洗涤液(0.05％Phosphatate Buffered Sakine Tween-20,PBST)对覆盖后的孔(well)进行洗涤，然后利用3％BSA(Bovine serum albumin，牛血清白蛋白)溶液在室温下进行2小时的阻断(Blocking)。

将小鼠的血清100倍稀释液进行2倍连续稀释(serial dilution)并以100μl/well的量进行添加，接下来在室温下进行1小时的反应。

利用洗涤液(0.05％Phosphatate Buffered Sakine Tween-20,PBST)进行洗涤，然后将10000倍稀释的anti-mouse-IgG1、IgG2c HRP conjugate以100μl/well的量进行添加并在室温下进行1小时的反应。

利用洗涤液(0.05％Phosphatate Buffered Sakine Tween-20,PBST)进行洗涤，然后将显色剂即3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)溶液以100μl/well的量进行添加并在室温下进行7分钟的反应。

将反应停止溶液(1N H₂SO₄)以100μl/well的量进行添加之后，利用酶标仪(Microplate reader)在450nm下对吸光度进行了测定。

除了阴性对照组即磷酸缓冲液组之外，在cTSA56_Boryong重组蛋白以及TSA56_Boryong蛋白免疫实验组中可以观察到对TSA56_Boryong特异性的IgG1以及IgG2c抗体力价呈现出几乎类似的增加趋势【图14】。

3.小鼠感染实验

将按照如上所述的方式制备的各个疫苗制剂经皮下(subcutaneous)注射到C57BL/6(6-8周龄，雌性)小鼠中(n＝5/group)，并在以2周为间隔进行共计3次免疫的7天之后，利用相当于半数致死量的100倍(100×LD50)的保宁或卡普基因型恙虫通过腹膜内(Intraperitoneal)途径进行感染。对感染后30天的小鼠生存率进行了观察。

利用TSA56_Boryong或cTSA56_Boryong重组蛋白进行免疫的小鼠在感染保宁基因型之后全部存活。而对于利用卡普基因型进行感染的小鼠，TSA56_Boryong免疫组只有40％存活，而TSA6_Boryong免疫组全部存活。没有利用抗原进行免疫的阴性对照组的所有小鼠全部死亡。借此，可以确认通过利用cTSA56_Boryong重组蛋白进行免疫，不仅能够对相同基因型的保护性免疫进行诱导，还能够为其他基因型提供更加有效的保护性免疫。相应的结果如【图15】所示。

<cTSA56_Boryong重组蛋白抗原>

将上述实施例中的从cTSA56_Boryong或TSA56_Boryong疫苗制剂经皮下(subcutaneous)注射到C57BL/6(6-8周龄，雌性)小鼠中(n＝5/group)，并在以2周为间隔进行共计3次免疫的7天之后，利用相当于半数致死量的100倍(100×LD50)的保宁或卡普基因型恙虫通过腹膜内(Intraperitoneal)途径进行感染。对感染后30天的小鼠生存率进行了观察。

<ucTSA56重组蛋白抗原>

将ucTSA56重组蛋白抗原注射到C57BL/6(6-8周龄，雌性)小鼠(n＝5/group)，按照与上述实施例相同的方法对小鼠生存率的影响进行了观察。作为对照租，使用了TSA56_Boryong。

其结果，利用TSA56_Boryong或ucTSA56重组蛋白进行免疫的小鼠在感染保宁基因型之后全部存活。而对于利用卡普基因型进行感染的小鼠，TSA56_Boryong免疫组只有20％存活，而ucTSA56免疫组全部存活。而对于利用卡普基因型进行感染的小鼠，ucTSA56免疫组只有40％存活，而TSA56_Boryong免疫组全部存活。没有利用抗原进行免疫的阴性对照组的所有小鼠全部死亡。借此，可以确认通过利用ucTSA56重组蛋白进行免疫，能够为多种基因型提供更加有效的保护性免疫。相应的结果如【图16】所示。

Claims

1.一种恙虫病东方体的重组蛋白抗原，

所述重组蛋白抗原的序列如标号5、23或24所示。

2.一种基因，

用于对权利要求1所述的重组蛋白抗原进行编码。

3.一种根据权利要求1所述的重组蛋白抗原的制造方法，包括：

(i)制造出包含权利要求2所述的基因的表达载体的步骤；(ii)利用上述表达载体对宿主细胞进行转化的步骤；(iii)对转化后的宿主细胞进行培养的步骤；以及，(iv)在培养物中对权利要求1所述的重组蛋白抗原进行分离、纯化的步骤。

4.一种恙虫病东方体的疫苗组合物，

作为活性成分包含权利要求1所述的重组蛋白抗原。

5.根据权利要求4所述的恙虫病东方体的疫苗组合物，其特征在于：上述组合物包含药学上容许的载体。

6.根据权利要求5所述的恙虫病东方体的疫苗组合物，其特征在于：

上述药学上容许的载体，包含从由稀释剂、赋形剂、稳定剂以及防腐剂构成的组中选择的一种以上。

7.根据权利要求4所述的恙虫病东方体的疫苗组合物，其特征在于：上述组合物追加包含抗原佐剂。

8.根据权利要求7所述的恙虫病东方体的疫苗组合物，其特征在于：上述抗原佐剂是凝胶状的铝盐。

9.一种恙虫病东方体的特异性抗体检测用组合物，包含权利要求1所述的重组蛋白抗原。

10.根据权利要求9所述的恙虫病东方体的特异性抗体检测用组合物，其特征在于：上述恙虫的特异性抗体是TSA56抗原的特异性抗体。

11.根据权利要求9所述的恙虫病东方体的特异性抗体检测用组合物，其特征在于：上述组合物以与作为生体样本的血清接触的方式使用。

12.一种恙虫病东方体的特异性抗体检测用试剂盒，包含权利要求1所述的重组蛋白抗原。

13.根据权利要求12所述的恙虫病东方体的特异性抗体检测用试剂盒，其特征在于：上述试剂盒追加包含用于对生体样本中的恙虫的特异性抗体和与上述特异性抗体进行特异性结合的上述权利要求1所述的重组蛋白抗原的结合体进行检测的检测剂。

14.根据权利要求13所述的恙虫病东方体的特异性抗体检测用试剂盒，其特征在于：上述检测剂是与标志或酶结合的二级抗体。

15.根据权利要求12所述的恙虫病东方体的特异性抗体检测用试剂盒，其特征在于：上述试剂盒追加包含载体、清洗缓冲液、样本稀释液、酶基质、反应停止液以及用于指导使用方法的说明书中的一种以上。