CN1452635A - 用于诊断恙虫病的重组融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断恙虫病的重组融合蛋白抗原，更具体地说，本发明涉及血清型诊断恙虫病的方法，该方法使用重组融合蛋白抗原，所述重组融合蛋白抗原是以串联嵌合物形式融合的两个或多个来自恙虫病东方体抗原决定部位的蛋白。
Description
发明领域
本发明涉及用于诊断恙虫病(tsutsugamush disease)的重组融合蛋白抗原，更具体而言，本发明涉及血清学诊断恙虫病的方法，其利用以串联嵌合物形式融合的两个或多个蛋白的重组融合蛋白抗原，所述蛋白由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)抗原决定部位(epitopes)产生。
背景技术
恙虫病(即恙虫热(Scrub typhus))由恙虫病东方体引发，恙虫病东方体归类为立克次氏体科(Rickettsiaceae)。当恙螨(Trombicula chiggers)—恙虫病东方体的载体—侵入到人体组织液中时，由于恙螨唾腺中的恙虫病东方体转移到人体内而引发该病。恙虫病的症状包括突然发烧，猛烈头痛，焦痂，流行皮疹(popular rashes)，点状出血等。
恙虫病是由恙虫携带，其为节肢动物，属于纤恙螨属(Leptotrombidium)，该属动物的生长模式不规则。恙螨的变态需要脊椎动物的组织液。所以，恙螨是暂时性地寄生在动物体上，而动物体就是在此时感染了螨虫。在韩国，约有20种恙虫(trobiculids)(Traub，R.，M.L.Morrow和L.J.“Lipovsky：NewSpecies of chiggers from Korea.Proc.Ent.Soc.Wash.60：145-66，1958)，这些物种所携带的恙虫病东方体包括leptotrombidium pallidum和leptotrombidiumscutellare等。
恙虫病东方体是典型的专性细胞内细菌(obligate intracellular bacteria)，0.3-0.7μm大小，具有短杆菌或球菌外形。立克次氏体科包括斑疹伤寒，斑疹热，恙虫病，五日热罗卡利马氏体(Rochalimea Quintana)包括战壕热，伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetti)包括Q热。该分类依赖于宿主细胞，细菌传代载体的类型，外-斐二氏试验(Weil-Felix assay)和补体结合反应试验，最近依赖于抗原分析和分子生物学方法。
所有被归类为立克次氏体科的生物可通过恙虫，虱子或跳蚤以及其他载体而使人类产生各种疾病。另外，根据立克次氏体属的划分，疾病的症状或流行病学表现显示出显著的差异。相同的种具有血清学关联，但是不同的种不具有交叉反应性。归类于恙虫病的恙虫病东方体是一个物种，但根据抗原的结构，可能被划分为许多血清型。各种恙虫病东方体血清型的例子包括Gilliam，Karp和Kato(Traub，R.和C.L.Wisserman，Jr.，1974)。除这些原始的血清型外，还在亚洲发现了新的血清型如TA678，TA686，TA716，TA763，TH1817等等(Shirai，A.，Robinson，D.M.，Brown，G.W.等，Characterization ofRickettsia tsutsugamushi strains in two species of naturally infectedlaboratory-reared chiggers.An.J.，Trop.Med.Hyg.，31(2)：395-402，1982)。在韩国，除Gilliam，Karp和Kato外，还发现了与原始品系不同血清学反应的Boryong血清型(Chang和Kang，1987)。根据该报道，从位于北部区的京畿道分离的恙虫病东方体与从南部的Choongchung道分离的恙虫病东方体血清学不相同，Choongchung道分离的血清型具有血清学特异性，这与原始菌株有显著差异。
这些血清型的变种是由来自细胞膜蛋白的抗原的区别而产生，该抗原被分为种特异性抗原，血清型特异性抗原等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记分析的研究中，恙虫病东方体蛋白如70，60，54-56，46-47kDa被鉴定为主要的抗原(Takahashi，K.，Urakami，H.和A.Tamura：Purification of cellenvelopes of Rickettsia tsutsugamushi.Microbiol.Immunol.，29：475，1985)。在这些主要抗原中，46-47，54-56和70kDa蛋白具有抗原性，特别地，70和46-47kDa蛋白是种特异性抗原(Tamura，A.，Urakami，H.和Tsurhara，T.：Purification of Rickettsia tsutsugamushi by percoll density gradientcentrifugation.Microbiol.Immunol.26：321，1982)。
同时，当用胰蛋白酶处理恙虫病东方体时，细菌会丧失其进入小鼠L细胞的侵袭力。这个发现说明恙虫病东方体的膜蛋白与其病原性有关(Weiss，E.：The biology ofRickettsiae.Ann.Rev.Microbial.36：345，1982)。所以，依赖于血清型的恙虫病东方体病原性被认为是由特定细胞膜蛋白结构上的差异而导致的。
另外，恙虫病东方体的病原性介导了系统微血管炎，该病由恙虫病东方体侵入内皮细胞而导致。换言之，通过诱导的内皮细胞吞噬作用机制，侵入血液的恙虫病东方体被吞噬。当从吞噬体中释放出来后，恙虫病东方体在细胞质内通过二分裂增殖(Tamura等，1982)。增殖导致内皮细胞的破裂，显微镜可见的血栓或在血管附近的炎症。
针对恙虫病东方体的免疫学防御机制目前还所知甚少。但是，一些研究显示对于恙虫病东方体的防御机制包括体液免疫和细胞免疫应答。感染了恙虫病东方体的裸鼠会产生针对该抗原的抗体，但是小鼠不能诱导记忆性恙虫病东方体再感染的免疫应答。另外，有报道称转移分离自免疫小鼠的T淋巴细胞可产生恙虫病东方体再感染的抗性。与该报道一起，有研究支持细胞免疫应答也有所参与，该研究显示在临床期和T淋巴细胞的数目之间存在相关性。同时，有报道称：抗体诱导感染了恙虫病东方体的吞噬细胞的细胞数目减少50％，该报道也证明体液免疫应答和保护性免疫之间的关联。
同时，人类对于恙虫病的保护性免疫特异于其接受的血清型。换言之，对于相同血清型的记忆免疫应答可持续几年，但是对于不同血清型的记忆免疫应答只能持续几个月。例如，该结果是从对初次感染Gilliam和Karp再感染2个月后的患者的4个月的观察和血清学测试中被报道的。
恙虫病的临床症状包括，例如，全身淋巴结肿大，焦痂，皮肤溃疡等。通常，恙虫病导致轻微的临床症状，该病通过观察临床症状而做出诊断。但是，恙虫病可能会频繁地显示出意外的症状，而恙虫病通常的症状如全身淋巴结肿大和焦痂有时却不出现。在这种情况下，恙虫病也许不会与钩端螺旋性病，伤寒热或带有肾综合症的出血热区别开来。
最近，诊断恙虫病的方法包括一种方法：从患者血液分离并鉴定恙虫病东方体，从患者血清中检测针对恙虫病东方体的抗体，PCR扩增来自患者血液的恙虫病东方体DNA。但是，这种疾病诊断伴随细菌培养，该培养需要2到4周培养时间，这样，该方法并不优选用于诊断临床患者。另外，该方法使用PCR，重现性不佳。所以，近来发展的恙虫病诊断方法包括血清学方法，例如外-斐二氏方法，补体结合方法，间接免疫荧光测试，酶联免疫吸收方法和被动血凝方法。
但是，血清学方法中的外-斐二氏方法目前未被应用，因为通常其灵敏度很低，在恙虫病和钩端螺旋体病，其变种的尿道感染和其他热病的诊断中产生假阳性结果。
同样，补体结合方法需要复杂的技术方法，导致重现性低。另外，使用补体结合方法的诊断需要纯化的恙虫病东方体抗原，这样，当抗体的滴度较低时，就存在呈现假阴性诊断的可能性。所以，目前不应用该方法。
所以，大体上，目前恙虫病的诊断是通过间接免疫荧光方法和酶联免疫吸收方法(ELISA)进行的。这些方法灵敏度高，具有特异性，能够通过IgG和IgM间的区别来测定免疫球蛋白的滴度，这样，通过这些方法初次感染能够与再感染区别开来。由于这些优点，WHO推荐这些方法用于诊断恙虫病。
同时，间接荧光方法需要培养对人类具有高病原性的细菌，为获得抗原需要细胞培养或卵孵化的设备；以及荧光显微镜。在使用1∶10到1∶20稀释血清的情况下，间接荧光方法会产生假阳性诊断。
所以，我们尝试使用重组抗原诊断恙虫病，该抗原由含有编码恙虫病东方体主要抗原基因的大肠杆菌(E.coli)产生。
发明内容
为解决传统诊断恙虫病方法的问题而提出本发明。
换言之，本发明提供用于诊断恙虫病的融合蛋白以及制备融合蛋白的方法。
使用本发明的融合蛋白来诊断恙虫病的方法不需要培养微生物，而且得到的诊断结果比使用单一基因重组蛋白的传统方法灵敏度高。这样，使用本发明融合蛋白的诊断恙虫病的方法可以降低使用多种单一基因重组蛋白混合物的诊断成本。发明详述
为达到上述目的，本发明使用融合蛋白作为抗原用于诊断恙虫病，该融合蛋白是两个或多个由恙虫病东方体抗原决定部位所产生的蛋白的串联嵌合物形式。
在此，所述用于诊断恙虫病的抗原优选来自恙虫病东方体56kDa蛋白的蛋白片段的融合蛋白。更优选地，所述用于诊断恙虫病的抗原是来源于两个或多个物种的蛋白的融合蛋白，所述物种选自各种恙虫病东方体异种血清型，如Gilliam，Karp，Kato等。
另外，为达到上述目的，本发明提供制备所述用于诊断恙虫病的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
1)构建所述用于诊断恙虫病的融合蛋白的表达载体，其中所述表达载体包括DNA片段，该片段包括编码两个或多个蛋白的基因，所述蛋白来源于恙虫病东方体的抗原决定部位；
2)将所述表达载体转化到宿主细胞；
3)培养所述转化的细胞；以及
4)从所述培养基和/或所述转化细胞中获得所述融合蛋白。
由于恙虫病东方体的56kDa蛋白可以具有抗原性，本发明通过使用恙虫病东方体的56kDa蛋白进行恙虫病的诊断。
为诊断恙虫病，应通过以下步骤制备和纯化融合蛋白，所述融合蛋白含有来自恙虫病东方体56kDa蛋白的蛋白：
a)通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增编码来自恙虫病东方体标准血清型(Gilliam，Karp和Kato)56kDa蛋白的蛋白的基因片段；
b)将PCR产物与表达载体线性连接；
c)将重组的表达载体转化到大肠杆菌中；
d)培养该转化的大肠杆菌；以及
e)纯化该重组融合蛋白作为抗原用于诊断恙虫病。
换言之，所述方法可总结为：在克隆编码来自所述56kDa蛋白的蛋白的基因片段后，大规模生产来自恙虫病东方体56kDa蛋白的蛋白。由于通过本方法得到的重组蛋白对恙虫病血清具有很强的反应性，诊断试剂盒如被动血凝反应(PHA)试剂盒，其不需要特定仪器和设备，可通过使用所述重组融合蛋白进行开发，所述重组融合蛋白还可用于酶联免疫吸收试验(ELISA)方法用于测定滴度，这是大规模样品处理所需要的。
生产用于诊断恙虫病的重组融合蛋白抗原的方法以及诊断恙虫病的方法在下文详述。
首先，在小鼠L929细胞中培养每种血清型恙虫病东方体后，分离出恙虫病东方体菌株如Gilliam，Karp和Kato。其次，通过酶解纯化每种分离的血清型的DNA，苯酚抽提以及乙醇沉淀。
在编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白基因的序列基础上，选择出在Boryong，Gilliam，Karp和Kato血清型中氨基酸序列具有高于30％同源性的区域，分别制备用于扩增Boryong，Gilliam，Karp和Kato的寡核苷酸引物对。然后，使用上述引物，通过PCR扩增来自Boryong，Gilliam，Karp和Kato菌株的基因片段，纯化的DNA作为模板。
纯化PCR扩增产物之后，将扩增产物连接到pTYB12载体的多克隆位点。首先，来自Gilliam菌株的DNA片段被插入到pTYB12载体中，来构建pTG3载体，然后，来自Karp菌株的DNA片段被插入到pTG3载体中，来构建pTGP1载体，然后来自Kato菌株的DNA片段被插入到pTGP1载体中，来构建pTGPT2载体。另外，获得DNA片段后，在该DNA片段中来自Gilliam，Karp和Kato的基因片段是线性连接的，该DNA片段被插入到pET22b(+)载体来构建pETb7载体。
用以上制备的表达载体转化大肠杆菌后，为获得融合蛋白的表达而培养转化的大肠杆菌。通过电泳和western印记分析融合蛋白的表达，然后从相应的克隆中纯化出融合蛋白抗原。纯化的抗原被用于免疫学定量和定性分析。
在此，“免疫学定量和定性分析”是指定量或定性分析抗恙虫病东方体的抗体的技术，以达到利用所述纯化抗原来测定恙虫病东方体既往病史的目的，所述恙虫病东方体来自人体或动物血清。免疫学定量和定性分析的例子包括使用抗原-抗体相互反应如ELISA和被动血凝，进行定量方法和定性的方法。
使用本发明重组融合蛋白诊断恙虫病和正常人的结果显示，获得了93.6％的诊断灵敏度以及94.2％的诊断特异性。
附图说明
图1是显示编码56kDa蛋白的基因片段线性连接的实例示意图，所述蛋白来源于Gilliam，Karp和Kato，作为恙虫病东方体的3种血清型，其中图1a是pTGPT2载体，图1b是pETb7。
图2是说明通过分别将编码来源于恙虫病东方体Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的片段依次插入到pTYB12载体中，从而由pTYB12载体制备pTG3，pTGP1和pTGPT2载体的过程示意图。
图3是说明从pTGPT2中引出线性连接的56kDa蛋白基因片段而导入pET22b(+)来获得pETb7载体的过程示意图。
图4是克隆载体的电泳结果，其中M是λHindIII大小标记，V是pTYB12载体，G是pTG3载体，P是pTGP1载体，T是pTGPT2载体。
图5是克隆载体pETb7的电泳结果，其中M是λHindIII大小标记，1道是pET22b(+)载体(5493bps)，2道是pETb7载体(8004bps)。
图6是显示编码来源于恙虫病东方体三种血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pTYB12载体的形式表达的电泳凝胶图谱，
其中，V代表来源于用pTYB12转化的大肠杆菌ER2566的蛋白片段；
G代表由用pTG3转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam的56kDa蛋白片段；
P代表由用pTGP1转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam和Karp的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
T代表由用pTGPT2转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
图7是显示编码来源于恙虫病东方体三种血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pET22b(+)载体的形式表达的电泳凝胶图谱，
其中，第1道代表由用pTGPT2转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
第2道代表pET22b(+)转化的大肠杆菌ER2566；
第3道代表由用pETb7转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
图8是显示从pETb7载体转化的大肠杆菌中纯化融合蛋白的过程示意图，该过程包括线性连接来自恙虫病东方体Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白，其中数字轮流代表片段数字，在进行点印记分析后，洗脱组分用小鼠抗血清进行免疫酶学染色。
图9是利用ELISA显示融合蛋白抗原与来自恙虫病患者或正常人的每种血清的反应性，所述融合蛋白抗原由编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白的线性连接基因所表达，其中，恙虫病患者通过间接免疫荧光抗体测试(IFA)进行诊断。在图9中，横轴代表IFA分析的血清抗体的滴度；纵轴代表ELISA测定的吸收值。
图10显示使用重组融合蛋白抗原进行ELISA的灵敏度和特异性，所述融合蛋白抗原由编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白的线性连接基因所表达，其中诊断恙虫病的灵敏度为93.6％，特异性为94.2％。
本发明由优选实施方式和实验实施例更具体地说明。但是，本发明不应限于这些实施例。
本发明仅由涉及重组融合蛋白抗原的实施例说明，所述融合蛋白抗原是利用编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白的基因片段所产生。但是，本发明的范围包括两个或多个蛋白以串联嵌合形式融合而成的抗原，所述蛋白选自来源于天然存在于自然界的恙虫病东方体30个或更多血清型的22，47，56，8，60，110，115和130kDa蛋白，以及由恙虫病东方体不同血清型抗原决定部位所产生的蛋白。
另外，本发明仅由用大肠杆菌作为宿主细胞用于表达上述本发明重组融合蛋白抗原的实施例解释。但是，本发明的范围包括应用酵母，其它真核细胞，动物或植物组织细胞和来源于DNA重组哺乳动物的细胞。
实施例1：细菌菌株，质粒和培养基
从恙虫病患者中分离出Boryong菌株并保藏在汉城大学医学院微生物与免疫系(Department of Microbiology and Immunology，College of Medicine，Seoul National University)，而获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(Manassas，VA 20110-2209)的Gilliam，Karp和Kato菌株则用作恙虫病东方体的实验血清型。
质粒pCYB1，pCYB2，pCYB3，pCYB4，pCYB12(NEB#6902)，pET(Novagen)和pBluescript(Stratagene)被应用于以下实验，而大肠杆菌BL21(DE3)和ER2566菌株用作宿主细胞来扩增质粒以及表达蛋白。
当用插入了来源于恙虫病东方体的基因片段的载体转化大肠杆菌后，于37℃，在含有100μg/ml氨卞青霉素(Sigma A9518)的LB(Luria-Bertani)肉汤或LB琼脂板上培养转化的大肠杆菌。
实施例2：恙虫病东方体的培养和纯化
在37℃，5％CO2的培养箱中，用EMEM-10培养基(含有10％胎牛血清(FBS；Gibco Lab.Grand island N.Y.)的Earles’最小基础培养基，(Gibco，410-1500EG))培养在150cm3细胞培养皿(Falcon 32025)中的5×107小鼠L-929细胞(American Type Culture Collection，Manasass，VA 20110-2209)。当增殖的细胞覆盖了培养皿的底部时，将其用于以下感染实验。
去掉95％的培养基后，将测试量的每种恙虫病东方体Gilliam，Karp，Kato和Boryong菌株倒入上述培养板，然后在37℃，在CO2培养箱中培养1.5小时。将含有0.4μg/ml道诺霉素和5％FBS的EMEM-5D加入5％CO2培养箱中后，在34℃继续培养细胞。当80％的细胞被感染时，收集细胞。
用于纯化基因组DNA的恙虫病东方体制备如下：从20个150cm3细胞培养皿中收集恙虫病东方体感染的小鼠L-929细胞，然后，在4℃，8,000×g离心(Sorval)15分钟沉淀细胞，去上清。然后，用6.5ml TS缓冲液(33mMTris-HCl pH7.4，0.25M蔗糖)重悬沉淀。用Potter-Elvehjem匀浆器匀浆悬浮液中的细胞3分钟，然后400×g离心10分钟。向上清中加入Percoll使其终浓度为40％，然后进行等密度离心1小时来分离恙虫病东方体。
实施例3：从恙虫病东方体中分离DNA
向纯化的恙虫病东方体中加入含有1％SDS(十二烷基硫酸钠)和100μg/ml蛋白酶K的缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA pH8.0，150mM NaCl)，然后在50℃培养混合物2小时，致使细菌溶解。接下来，加入等体积苯酚后，缓慢摇动，12,000×g离心溶菌液5分钟，获得上清(下文中称为‘苯酚抽提’)。用同样的方法，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(isoamylalcohol)(25∶24∶1)抽提蛋白质2次。向DNA溶解相加入3M乙酸钠(pH5.4)使其终浓度为0.3mM，再加入2倍体积的100％乙醇，在-20℃贮藏18小时。然后在4℃，12,000×g离心15分钟沉淀DNA。向沉淀中加入与100％乙醇等体积的70％乙醇，在4℃，12,000×g离心5分钟洗涤DNA。快速真空干燥器(Savant SVC100-H)中干燥10分钟，再用50μl TE缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0，1mM EDTApH8.0)悬浮DNA(下文中称为‘乙醇沉淀’)。
实施例4：制备小鼠抗恙虫病东方体血清
为选择克隆以及进行western印记分析，抗恙虫病东方体Boryong菌株的C3H/HeDub小鼠抗血清按如下制备：
首先，从所述小鼠L-929细胞中分离并在小鼠C3H/HeDub中测定的1000×MLD50恙虫病东方体Boryong菌株被皮下注射到实验小鼠中作为初级免疫。然后，从最初注射的日期开始，以2周的间隔进行细菌注射给药，进行免疫，共进行3次注射。最后一次注射2周后，将免疫小鼠断头，得到小鼠血清。然后，IFA测定抗体对Boryong菌株的滴度后，制备滴度高于1∶1280的血清。
利用下述方法从上面获得的血清中去除抗大肠杆菌的抗体：在1升含有100μg/ml氨卞青霉素的LB肉汤中培养pTYB12载体转化的大肠杆菌18小时。然后，用含有0.05％Tween-20的TBST(Tris-缓冲盐；50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.4)清洗培养基3遍，溶液用20ml TBST悬浮。在100℃水浴中加热悬浮液后，用最大功率的超声波仪(Quigley-Rochester Inc.)匀浆溶液中的细菌3分钟。然后，向溶液中加入等体积的抗血清，在室温下缓慢摇动，吸附4小时。然后，2,000×g离心吸附的溶液20分钟，这样，去除了细胞碎片，获得上清液。
接下来，使用该抗血清进行的westem印记分析或者免疫分析显示：非特异性反应性显著降低。
实施例5：大肠杆菌中表达、分离和纯化来自恙虫病东方体的56kDa蛋
白
(1)PCR扩增编码56kDa蛋白的基因
在56kDa蛋白基因序列(Genebank编号：：04956)的基础上，选择出恙虫病东方体各种血清型Boryong，Gilliam，Karp和Kato中带有高度保守同源性的区域，并分别制备Gilliam，Karp和Kato的每对寡核苷酸引物。换言之，制备互补于含有127-140个核苷酸的DNA序列的正向引物，以及互补于含有1069-1092个核苷酸的DNA序列的反向引物，用于扩增Gilliam中具有127-1092个核苷酸的序列的DNA片段。用同样的方法，制备以下正向和反向引物用于扩增Karp中具有118-1013的序列的DNA片段以及Kato中具有121-957的序列的DNA片段。通过Oligo.Etc.Co.Wilsonville，OR.指数制备法(order preparation)获得以下引物：
Gilliam正向引物：5’GGA
CA’T ATG ATT ACT GGT GCA GAA-3’(Seq.ID No.：1)
Gilliam反向引物：5’-ATC
G’TC GAC ATT TAA AAG CCT AAC-3’(Seq.ID No.：2)
Karp正向引物：5’-GTT
G’TC GAC GGA ATG ATT ACT GGC-3’(Seq.IDNo.：3)
Karp反向引物：5’-GGC ATG ACA AAA TT
G’AAT TCT ATC-3’(Seq.IDNo.：4)
Kato正向引物：5’-GTC GTT GGA
G’AA TTC ATT ACT GGC-3’(Seq.IDNo.：5)
Kato反向引物：5’-TTG CTG CCC
GGG’CCC CTG CTG-3’(Seq.ID No.：6)
在此，
CA’TATG是NdeI的识别位点，
G’TCGAC是SalI的识别位点，G’AATTC是EcoRI的识别位点，
GGG’CCC是SmaI的识别位点。
当引物对用于分离自未感染恙虫病东方体的L929细胞的DNA的PCR时，未检测到PCR扩增的DNA带。该结果说明本发明的引物是恙虫病东方体特异性的。同时，通过恙虫病东方体纯化中所用的方法进行来自L929细胞的DNA纯化。
为扩增来自Gilliam，Karp和Kato的所述DNA片段，利用下述方法，使用恙虫病东方体DNA作为模板和上述引物，进行PCR：简言之，向PCR混合物(每种引物400nM，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH9.0，0.1％Triton X-100，dNTP每种0.2mM，MgCl2 1mM)中加入100ng恙虫病东方体DNA，终体积为50μl，再加入2.5U Taq聚合酶(Promega Cat#M1861，Madison，WI)。使用Thermal循环系统9600(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)进行PCR，PCR条件如下：94℃3分钟1个循环使其预变性，94℃15秒35个循环，其中包括了变性，60℃1分钟进行退火/延长，72℃2分钟1个循环进行最后的延长。
用含有溴乙啶的琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行电泳，紫外灯下目测。
(2)纯化PCR产物并克隆表达载体
使用QIAEX凝胶抽提试剂盒(Qiagen Inc.，Catsworth CA.)从琼脂糖凝胶中提取出每种PCR产物，然后将每种提取的产物重悬于20μl TE缓冲液。将400ng纯化的PCR产物加入Klenow缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0)中，再加入2.5U Klenow片段(Promega，M220，Madison，WI)。37℃孵育溶液3分钟，加入dNTP混合物(每种0.125mM)，再在37℃孵育1小时。进行所述苯酚抽提和乙醇沉淀后，获得10μl TE悬浮液。
纯化pTYB12载体后，用合适的限制性酶处理载体，然后将上述所获的PCR产物插入到载体中。简言之，用NdeI和SalI消化pTYB12载体以及从Gilliam中所获的PCR产物，再用CIAP(小牛肠碱性磷酸酶)将获得的物质进行脱磷酸作用。然后，进行所述苯酚抽提和乙醇沉淀后，获得10μl TE悬浮液。将100ng消化的载体和消化的PCR产物混合，终体积3.5μl，然后在45℃孵育混合物15分钟，再置于冰上。加入0.5μl 10×Ligase缓冲液(250mMTris-HCl pH7.8，100mM MgCl2，20mM DTT和4mM ATP)和2U连接酶后，在4℃孵育反应溶液18小时。用连接的载体DNA转化大肠杆菌ER2566，用于扩增载体。构建的载体命名为pTG3。
来自Karp的PCR产物被插入到载体pTG3中，然后用SalI和EcoRI消化，再利用与上面相同的方法，在大肠杆菌ER2566中进行连接和扩增。构建的载体命名为pTGP1。
另外，来自Kato的PCR产物被插入到载体pTGP1中，然后用EcoRI和SmaI消化，再利用与上面相同的方法，在大肠杆菌ER2566中进行连接和扩增。构建的载体命名为pTGPT2。
在构建的载体pTGPT2中，来自Gilliam的DNA片段大小为952bps；Karp DNA片段为873bps；Kato是915bps；插入的总DNA片段为2640bps，估测蛋白的大小为97kDa。
接下来，构建的pTGPT2载体用NdeI和SmaI消化，获得了线性连接的Gilliam，Karp和Kato片段的DNA片段。用XhoI消化pET22b(+)载体，再用苯酚抽提和乙醇沉淀。然后，加入Klenow片段，dTTP和dCTP后，在37℃孵育反应溶液30分钟。再用S1核酸酶处理通过苯酚抽提和乙醇沉淀所获得的TE悬浮液，然后在23℃孵育15分钟，再一次进行苯酚抽提和乙醇沉淀。然后将pET22b(+)载体平头处理，用NdeI消化该载体，再进行苯酚抽提和乙醇沉淀。接下来，用连接方法将含有来自Gilliam，Karp和Kato的基因片段的DNA片段插入到XhoI-NdeI处理过的载体中。然后，使用ER2566扩增上面所获的载体。该扩增的pET22b(+)载体含有来自Gilliam，Karp和Kato的基因片段的DNA片段，命名为pETb7。
用构建的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用免疫学方法选择出阳性克隆。
2000年8月5日，根据布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecogition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of PatentProcedure)将构建的载体pETb7保藏在位于Taejon的韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection of Type Cultures)，保藏编号为KCTC 18042P。该保藏已在2001年9月5日转为布达佩斯条约下的保藏，编号为KCTC 10065BP。
图1是显示编码56kDa蛋白的基因片段线性连接的实例示意图，所述蛋白来源于Gilliam，Karp和Kato，作为恙虫病东方体的3种血清型，其中图1a是pTGPT2载体，图1b是pETb7。
图2是说明通过分别将编码来源于恙虫病东方体Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的片段依次插入到pTYB12载体中，从而由pTYB12载体制备pTG3，pTGP1和pTGPT2载体的过程示意图。
图3是说明从pTGPT2中引出线性连接的56kDa蛋白基因片段而导入pET22b(+)来获得pETb7载体的过程示意图。
图4是克隆载体的电泳结果，其中M是λHindIII大小标记，V是pTYB12载体，G是pTG3载体，P是pTGP1载体，T是pTGPT2载体。
图5是克隆载体pETb7的电泳结果，其中M是λHindIII大小标记，1道是pET22b(+)载体(5493bps)，2道是pETb7载体(8004bps)。
(3)制备感受态细胞
LB培养基中过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)在同样的培养基中稀释100倍，并继续培养直到600nm的OD值达到0.3。然后，在冰上孵育细菌培养物之后，4℃，400×g离心20分钟，用冰冷却的0.1M CaCl2清洗培养液，离心后弃上清。然后，用1/2培养基体积的0.1M CaCl2重悬大肠杆菌细胞。在冰上孵育细胞1小时后，4℃，4000×g离心20分钟，弃上清。然后用1/10培养基体积的0.1M CaCl2重悬大肠杆菌细胞，获得转化用的感受态细胞。
(4)转化
将1μl上述获得的连接载体与100μl上述获得的感受态细胞混合，再置于冰上1小时。然后在42℃热休克180秒使感受态大肠杆菌细胞吸收表达载体的DNA。向热休克的溶液中加入500μl LB培养基，再在37℃培养1小时。再8000×g离心培养基1分钟，沉淀重悬于200μl LB培养基。然后将含有转化细胞的悬浮液涂布到LB琼脂板上，再在37℃培养18小时。
(5)转化的大肠杆菌菌落的免疫学选择
在位于LB琼脂板中的硝化纤维素(NC)纸上接种转化的大肠杆菌，再在37℃培养18小时。然后，将3张3MM Whamann纸置于带有菌落的NC纸上，并在3MM Whamann纸上放置新的NC纸。然后，再将3张3MM Whamann纸置于新的NC纸之上，这样，在压力下制备出NC纸的复制品。将原始的和复制的NC纸分别置于含有氨卞青霉素的LB琼脂板上，并在37℃培养1小时。然后，为使蛋白表达，将复制的NC纸置于含有0.1mM IPTG和100μg/ml氨卞青霉素的LB琼脂板上，再进一步培养3小时。
培养后，将NC纸暴露在充有氯仿的焊接玻璃瓶中10分钟，然后通过将细胞浸泡在溶菌酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，5mMMgCl2，3％牛血清白蛋白(w/v，BSA)，溶菌酶400μg/ml以及Dnase 1U/ml)中约1小时使细胞破裂。然后，清洗NC纸表面后，再在溶菌酶缓冲液中培养1小时。然后用TBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，0.05％Tween20)清洗NC纸两遍，使用抗血清测试NC纸。
用TBST缓冲液清洗NC纸3次，再用3％牛血清白蛋白处理30分钟，来阻断不期望的反应。然后用TBST缓冲液稀释抗恙虫病东方体Boryong的血清到1/1000浓度，再在室温下与上述NC纸反应30分钟，再用TBST缓冲液进行三次10分钟的清洗。TBST稀释10000倍的二次抗体(碱性磷酸酶连接的抗小鼠IgG，Promega S3721)与NC纸在室温下反应10分钟，再用TBST缓冲液进行三次10分钟的清洗。该溶液与用3MM Whatmann纸过滤过的发色底物溶液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.3mg/ml氮蓝四唑以及0.15mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate))混合，然后将该混合物在暗处培养5分钟，产生阳性信号的检测结果。
(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳和western印记分析
通过Laemmli改进的方法(Laemmli，1970)，如下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和western印记分析：
向含有0.1％SDS的0.37M Tris-HCl(pH8.0)溶液中加入丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物，用负压去除空气。分别以0.03％(w/v)和0.066％(w/v)的浓度向混合物中加入过硫酸铵和N，N，N，N-四亚甲基二胺，进行多聚反应获得溶解凝胶。
然后，将丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物(30∶0.8)以5％的终浓度加入到含有0.1％SDS的0.125M Tris-HCl(pH6.8)中，这样就获得堆积的凝胶。然后，将该堆积的凝胶置于上述所获的溶解凝胶上。
电泳所用的大肠杆菌蛋白按如下制备：
培养转化的大肠杆菌18小时。该过夜培养的大肠杆菌在新培养基中稀释100倍，并继续培养直到600nm的OD值达到0.5。然后加入0.1mM IPTG，再进一步培养3小时。4℃，4000×g离心培养基20分钟，弃上清。用50mMTris-HCl(pH7.4)清洗沉淀，离心后弃上清。然后，用样品缓冲液(2％SDS，5％巯基乙醇，20％甘油，0.001％溴酚蓝(w/v)，0.1M Tris-HCl pH6.8)悬浮含有大肠杆菌细胞的沉淀，再在100℃水浴加热5分钟。室温下离心10分钟后，在每个孔中用10μl收集的上清进行电泳。
电泳后，通过凝胶染色或免疫印记来鉴定蛋白质。
为进行凝胶染色，将凝胶浸泡在染料溶液中(水∶甲醇∶乙酸(5∶5∶2)和0.1％(w/v)Coomassie Brilliant Blue R250)1小时，加入脱色液(25％甲醇和10％乙酸)脱色2小时。
为进行免疫印记，将凝胶置于NC纸上，再在90V下迁移1小时。迁移后，通过免疫学方法可以检测到NC纸上的蛋白质。
图6是显示编码来源于恙虫病东方体三种血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pTYB12载体的形式表达的电泳凝胶图谱，
其中，V代表来源于用pTYB12转化的大肠杆菌ER2566的蛋白片段；
G代表由用pTG3转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam的56kDa蛋白片段；
P代表由用pTGP1转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam和Karp的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
T代表由用pTGPT2转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
图7是显示编码来源于恙虫病东方体三种血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pET22b(+)载体的形式表达的电泳凝胶图谱，
其中，第1道代表由用pTGPT2转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
第2道代表pET22b(+)转化的大肠杆菌ER2566；
第3道代表用pETb7转化的大肠杆菌ER2566所表达的、来自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
(7)分离和纯化重组抗原
(a)37℃过夜培养pTGPT2转化的大肠杆菌，用相同的培养基稀释培养物100倍，进一步培养。当600nm下培养物的OD值达到0.5时，加入0.3mMIPTG，再在4-37℃培养18-72小时。4℃，4000×g离心培养物15分钟后，用溶解缓冲液(50mM Tris-HCl，30mM NaCl，0.2％Tween-20，10mM巯基乙醇，10mM EDTA，10mM EGTA pH7.0)悬浮沉淀。加入1mg/ml的溶菌酶后，在冰上溶解大肠杆菌30分钟。然后将获得的物质用超声波仪以最小功率的50％超声波处理1分钟。4℃，9000×g离心30分钟后，获得上清。用与上述相同的方法，再将蛋白从沉淀中洗脱3次，混合收集的上清。然后，向上清混合物中加入等体积的含有0.05％Tween-20的柱缓冲液，分别将NaCl浓度和pH调整到0.5M和7.0。
2g亲和层析树脂(几丁质等)与60ml柱缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，1mM EDTA和1mM叠氮化钠)混合，接下来在室温下再水化30分钟。用再水化的树脂填充2.5×50cm的柱子后，用该柱体积3倍的柱缓冲液清洗柱子。然后，以1ml/分钟的速度将大肠杆菌溶解液过柱，再用2倍体积的含有0.05％Tween-20的柱缓冲液清洗，然后只用2倍体积的柱缓冲液清洗。
收集每个洗脱组分的2ml洗脱液，混合，测定280nm下洗脱液的吸光值。收集OD值最高的10个洗脱组分，测定280nm和260nm的OD值来定量蛋白浓度。用下面的等式计算蛋白的浓度。
蛋白浓度(mg/ml)＝1.55×OD280nm-0.77×OD260nm
图8是显示从pETb7载体转化的大肠杆菌中纯化融合蛋白的过程示意图，该过程包括线性连接来自恙虫病东方体Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白，其中数字轮流代表片段数字，在进行点印记分析后，洗脱组分用小鼠抗血清进行免疫酶学染色。
(b)当用pETb7载体转化大肠杆菌时，用下述方法纯化重组融合蛋白。
在含有氨卞青霉素的LB培养基中37℃过夜培养pETb7转化的大肠杆菌BL21(DE3)，用相同的LB培养基稀释培养物100倍，进一步培养。当600nm的OD值达到0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.3mM，再在37℃进一步培养3小时。5000×g离心培养物30分钟后，弃上清。然后，用结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)重悬沉淀。超声波处理重悬液以抽提蛋白，12000×g离心30分钟以得到包含体形式的蛋白。在冰上孵育1小时使这些包含体在含有4M尿素的结合缓冲液中变性。16000×g离心30分钟后，将上清应用于His-树脂。
用于纯化的His-树脂数量约为2.5ml/100上清。将适量的树脂填充在柱子里，平衡柱子。然后，用树脂体积3倍的无菌水通过该柱，再进一步通过5倍体积的电荷缓冲液(50mM NiSO4)，来制备带电荷的树脂。然后，加入足够量的含有4M尿素的结合缓冲液平衡柱子。
接下来，将上述制备的蛋白悬浮液通过该柱，再通过10倍树脂体积的含4M尿素的结合缓冲液，以去除非特异性结合蛋白。然后再通过6倍体积的含有4M尿素的清洗缓冲液(60mM咪唑，0.5M NaCl和Tris-HCl，pH7.9)以去除残留的非特异性结合蛋白。然后再用含有4M尿素的洗脱缓冲液(1M咪唑，0.5M NaCl和20mM Tris-HCl，pH7.9)通过柱，接着收集洗脱组分。混合洗脱的蛋白组分并在碳酸盐缓冲液中持续透析，以减少尿素浓度。最后去除了尿素的蛋白用于进行ELISA。
在用三倍于树脂体积的剥离缓冲液(100mM EDTA，0.5M NaCl和20mMTris-HCl，pH7.9)通过树脂以去除由Ni+引起的电荷后，树脂可以重复使用。
6.ELISA方法
上述制备的重组融合蛋白抗原用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释到浓度为1.25μg/ml。然后，将200μl稀释的抗原覆盖到聚氯乙烯板96孔中的每个孔以进行EIA(TiterTek，平底，软板)，再4℃培养18小时，使抗原粘附。然后，用含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲液(下问中称为“PBST”)将每个孔冲洗3次，加入5％脱脂牛奶室温下阻断不期望的反应1小时。
上述制备的血清以1∶100稀释，在室温下培养30分钟，再用PBST清洗6次。当用PBST稀释二次抗体(辣根过氧化物酶连接的抗小鼠IgG，辣根过氧化物酶连接的抗小鼠IgM；Jackson 109-035-003)10000倍后，室温下培养孵育抗体30分钟，然后用PBST清洗6次。
加入发色底物溶液(磷酸柠檬酸缓冲液，H2O2 0.4μl/ml，邻苯二胺0.4mg/ml)，每个孔都被染色15分钟，加入2M H2SO4停止颜色反应。然后使用ELISA阅读仪(Dynatech MR 700)测定492nm的吸收值。
图9是利用ELISA显示融合蛋白抗原与来自恙虫病患者或正常人的每种血清的反应性，所述融合蛋白抗原由编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白的线性连接基因所表达，其中，恙虫病患者通过间接免疫荧光抗体测试(IFA)进行诊断。在图9中，横轴代表IFA分析的血清抗体的滴度；纵轴代表ELISA测定的吸收值。
图10显示使用重组融合蛋白抗原进行ELISA的灵敏度和特异性，所述融合蛋白抗原由编码来自恙虫病东方体56kDa蛋白的线性连接基因所表达，其中诊断恙虫病的灵敏度为93.6％，特异性为94.2％。
如上所述，使用本发明重组基因蛋白抗原诊断恙虫病，具有很高的诊断灵敏度，并且具有与使用培养的恙虫病东方体病原体作为诊断抗原的间接免疫荧光抗体方法同样的特异性。所以，相对于使用单独基因重组蛋白的传统方法而言，本发明并不需要培养微生物，能获得更灵敏的诊断效果，降低诊断费用，这样，相对于使用许多单一基因重组蛋白的诊断而言，使用本发明融合蛋白进行的恙虫病诊断可以降低诊断费用。
尽管上文已经详细地说明了本发明优选的实施方式，但是应该清楚地知道：改变和/或修饰本文所教导的基础创造性概念对于本领域技术人员而言是显而易见的，这些改变和修饰仍然属于本发明如权利要求所定义的精神和范围。
序列表<110> 株式会社太平洋制药
金翼祥
成承镛<120> 用于诊断恙虫病的重组融合蛋白<130> pct-010908<150> KR2000-53269
2000-09-08<160> 6<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 1ggacatatga ttactggtgc agaa 24<210> 2<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 2atcgtcgaca tttaaaagcc taac 24<210> 3<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 3gttgtcgacg gaatgattac tggc 24<210> 4<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 4ggcatgacaa aattgaattc tatc 24<210> 5<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 5gtcgttggag aattcattac tggc 24<210> 6<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于制备恙虫病东方体抗原决定子蛋白的引物<400> 6ttgctgcccg ggcccctgct g 21
Claims (16)
1、一种用于诊断恙虫病的融合蛋白，其特征在于融合两个或多个来自恙虫病东方体抗原决定部位的蛋白。
2、根据权利要求1的融合蛋白，其中所述两个或多个蛋白来自恙虫病东方体的56kDa蛋白。
3、根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述两个或多个蛋白来自恙虫病东方体异源血清型。
4、根据权利要求3的融合蛋白，其中所述两个或多个蛋白来自恙虫病东方体的Gilliam，Karp或Kato。
5、一种载体DNA，其特征在于包含DNA片段，该片段包含编码两个或多个来自恙虫病东方体抗原决定部位的蛋白的基因。
6、根据权利要求5的载体DNA，其中所述载体包含DNA片段，该片段包含编码两个或多个来自恙虫病东方体56kDa蛋白的基因。
7、根据权利要求5至6的载体DNA，其中所述载体包括DNA片段，该片段包含编码两个或多个来自恙虫病东方体异源血清型蛋白的基因。
8、根据权利要求7的载体DNA，其中所述载体包括DNA片段，该片段包含编码两个或多个来自恙虫病东方体Gilliam，Karp或Kato的蛋白的基因。
9、根据权利要求8的载体，其中所述载体为pTGP1。
10、根据权利要求8的载体，其中所述载体为pTGPT2。
11、根据权利要求8的载体，其中所述载体为pETb7，其由韩国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为KCTC 10065BP。
12、用权利要求5-8中任一所描述的载体转化的宿主细胞。
13、用于制备权利要求1-4中任一所描述的用于诊断恙虫病的融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括培养用权利要求5-8中任一所描述的载体转化的细胞的步骤。
14、根据权利要求12的方法，其中所述转化的细胞是选自下述组中的至少一个：大肠杆菌，酵母，真核细胞，动物组织细胞和植物组织细胞。
15、一种诊断恙虫病的方法，其特征在于使用权利要求1-4中任一所描述的融合蛋白。
16、一种用于诊断恙虫病的组合物，其特征在于含有权利要求1-4中任一所述的融合蛋白。
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