CN1106203C - 衣原体疫苗及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种特异性衣原体疫苗，包括一种在动物体内可产生抗抗独特型抗体的抗独特型抗体，抗抗独特型抗体型抗体可识别衣原体的糖脂外源抗原(GLXA)。
Description
本发明涉及衣原体抗原的疫苗，制备疫苗的方法及使人或动物对衣原体产生免疫力的方法和鉴定衣原体感染的方法。衣原体可感染结膜、生殖器、呼吸道等，新生期主要感染粘膜表面。衣原体是真核细胞内一种专性细菌性寄生物，它们在形态学、细胞内发育周期及抗原性反应上具有一定的相似性，主要分为三种：沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体。
沙眼衣原体感染限于人类。根据其主要外膜蛋白(MOMP)的抗原性差异分为15种血清型(Grayten and Wang，J.Infect.Dis.，132：87，1975)。血清型D-K是性传播疾病的最常见原因。保守地估计，美国每年有400万以上衣原体性感染病例，因此它较其它所有性病更为流行。衣原体感染所引起的疾病包括非淋病性尿道炎、脓性宫颈炎、急性附睾炎、异位妊娠和盆腔炎(PID，即宫内膜炎、输卵管炎、附件炎和/或腹膜炎)。女性感染后危害极大：在美国每年由衣原体引起的25万例盆腔炎中约10％导致不育。感染了衣原体的母亲所生的孩子，极易罹患结膜炎和肺炎。沙眼衣原体血清型A、B、Ba和C可导致沙眼—一种结膜上皮细胞的感染。慢性和继发性感染产生皮下淋巴细胞渗出、形成滤泡，同时角膜发生成纤维细胞浸润，导致失明。另外，还可形成瘢痕和眼睑畸形，引起倒睫，睫毛不断磨擦角膜使其浑浊也导致失明。全世界约有5亿沙眼患者，其中由于其并发症而失明者有7-9百万人，在可预防性失明中占第一位。在年幼者中活动性沙眼高度流行，8千万孩子需要治疗。这已成为中东、北非、南亚和印度北部的极严重的健康问题。
鹦鹉热衣原体主要感染动物和鸟类。它曾经且至今仍然对乳制品、羊毛、肉类工业发挥着重大的经济影响。在哺乳动物中有9种血清型，鸟类中有7种血清型，考拉熊中则有2种生物变种。哺乳类血清型1、2、3和9感染牛和羊，引起胎牛羊、胎盘感染及其至生殖障碍，多关节炎—多窦炎，脑脊髓膜炎，结膜炎与肠道感染。尽管做了无数次制备疫苗的尝试，仅有极少数获得成功(Schnorr，J.Am.Vet.Med.Assoc.195：1548，1989)。血清型4、5和6引起猪类流产、肺炎、多关节炎。血清型7引起猫类结膜炎、鼻炎、肺炎。血甭型8引起豚鼠结膜炎。鸟类血清型常常使接触鸟类和家禽的工人发生感染。
肺炎衣原体是近来鉴定的新种。到目前为止，已鉴定一种血清型-TWAR(Grayston，Proceedings of the Seventh Inteinational Sympo-sium on Human Chlamydial Infection，Pg，89，1990)。现有的证据表明肺炎衣原体主要在人类之间传播，在成人的群体性获得性肺炎中占10-20％。它已成为人的呼吸道疾病如肺炎、支气管炎、咽炎、窦炎的主要原因和活动性关节炎的潜在原因。在医院、军队和家庭中均可发生流行。许多国家的血清学检查表明带有肺炎衣原体抗体的成人中50-55％的人体内抗体与TWAR抗原转异结合。它也是新生儿细菌感染的主要病原。感染发生于老年及慢性病患者中可加重甚至导致死亡。
衣原体感染的发病机制尚待研究。感染发生于不同的个体可显示不同的临床表现。此曾归因于宿主免疫应答的变异。现已证明在不同的小鼠杂交品系中对Th/B细胞表位的免疫应答是不同的，提示Th细胞表位由主要组织相容性复合体识别。
衣原体侵袭的典型目标是宿主的上皮细胞。尚不肯定衣原体的原体(EB，一种核样、直径约300nm的球状颗粒)是怎样进入细胞的：或者是受体介导的吞饮作用、或者是非特异的高亲和性吸附作用。据报道沙眼衣原体的两种蛋白18和32KD可结合Hela299细胞膜的提取物。近来发现另一热敏膜蛋白，38KD，可与Hela细胞结合，提示存在一种配体样机制。由于衣原体在体外可感染各种哺乳类细胞，推测存在某种发生感染的粘附机制。MOMP被认为是与此相关的粘附素。最近已证示衣原体表面出现一种肝素硫酸盐样葡萄糖胺对与宿主细胞发生粘附是必需的。对宿主细胞的受体也作了研究。已证示Hela细胞的18KD、31KD蛋白可能是对衣原体特异的受体(对胰蛋白酶敏感)。已证明沙眼和肺炎衣原体可特异结合Hela细胞的脂类。核磁共振和质谱分析表明这种脂类为磷脂酰乙醇胺。同时发现串联的神经节糖脂可特异结合EBs。上述所有结果提示宿主上皮细胞的内吞机制仍是一未知数。一旦EBs内吞入宿主细胞，将转化为具有代谢活性的非感染性的网状体。网状体的主要功能是利用宿主代谢产物以二元分裂的方式进行复制。复制发生于与膜结合的囊泡(包涵体)中。此包涵体可抵抗宿主细胞溶酶体的融合。最终每一网状体产生一个或多个原体(EB)，开始新的感染周期。宿主细胞可因释放包涵体而被溶解或完好。表面抗原被认为可引导吞噬和逃避吞噬溶酶体的融合。
衣原体感染的治疗主要依靠抗生素。在感染早期应用抗生素是有效的。由于感染可能无症状，大多数患者直到感染很久方被诊断。在猴感染模型中，在慢性期如果发生生殖器感染，则很难阻止其对生殖道的损害。
人们曾尝试用完整的菌体或其亚单位作为疫苗阻止各型沙眼衣原体的感染。但结果令人失望，部分是由于发生宿主对疫苗的超敏反应(Grayston，et al，Clini，Med，J.<Republic of China>8：312，1961；Wang et al，1967，Am.J.Opthalmol.63：1615；Schachter，Pathol.Immunopathol，Res.8：206，1988)。感染的致病机制是迟发型超敏反应。慢性炎症引起的反复再感染在人的结膜炎渗出、沙眼的后遗症失明和导致不育与异位妊娠的输卵管疤痕形成中起重要作用。原体的表面抗原是否可作为保护性抗原已成为研究焦点。
衣原体的表面组分活跃地与宿主细胞和宿主免疫系统相互作用。它们被用于解释粘附、内吞和免疫应答，但这些相互作用的精确性质与调控尚未完全阐明。对沙眼、鹦鹉热和肺炎衣原体的7个不同的抗原性成分进行了研究，包括它们在衣原体感染中的鉴定、特性和功能。明确感染的机制和保护性抗原是重要的。表面抗原是大量研究的主要目标，因为它们易于接近免疫或其它防御系统。这些抗原主要包括主要外膜蛋白(MOMP)、衣原体脂多糖、64KD热休克蛋白(HsP60)、粘附素和糖脂外源抗原(GLXA)。
在衣原体外膜有三种富含半胱氨酸的蛋白：57、40和12.5KD，它们装配成革兰氏阴性细菌的基质蛋白。在衣原体的网状体中未发现57和12.5KD蛋白。作为MOMP的40KD在原体和网状体中均大量存在。在网状体中此蛋白可形成孔，使网状体得以完成营养的交换。遗传学和分子特征表明此蛋白由4个可变区散布于5个稳定区中组成。可变区暴露于表面并具有血清型、亚种和种特异性的决定簇。
对此蛋白的免疫应答，主要通过用纯化的蛋白免疫动物进行研究。用对MOMP和原体特异的单克隆或多克隆抗体的混合物对体外培养的感染细胞进行的中和试验研究提示MPMP或其某一表位的特异性抗体可阻止包涵体的形成。中和作用的机制不包含对粘附或渗透的抑制，但包括内在化以后的阻滞过程。用血清型B的完整原体产生的单抗(此单抗在斑点印迹试验中识别MOMP的表位)可中和猴眼中衣原体的感染。这种保护是血清型特异的。用单抗的Fab段进一步证明单价的Fab段可通过阻止对叙利亚仓鼠肾细胞的粘附而中和感染。这种保护不是由于二价的IgG的聚集。对MOMP的T细胞的表位也进行了研究。用含有重迭的合成肽的MOMP(代表了血清型A的MOMP的主要序列)免疫A/J小鼠，发现此小鼠的脾脏中产生T细胞增殖应答。此合成肽与可变区I和IV中的血清型特异性表位一致。用类似方法发现在BALB/CByT小鼠中可变区III是T细胞依赖的、用嵌合的T/B细胞证明此肽源于MOMP的两个表位：一个为保守的T辅助细胞表位，另一个为血清型A特异的中和表位。用此肽免疫小鼠，一部分可产生高滴度的血清中和抗体，而另一部分则不产生。尽管对MOMP进行了深入研究且在实验动物中产生了中和抗体，但关于免疫应答仍存在许多问题未能解决。例如，由于感染的中和作用是血清型特异的，因此限制了其作为候选疫苗。中和作用仍限于体外研究，用任何MOMP或已知的嵌合表位免疫，在体内是否产生保护尚未明确。
人们很早就了解到衣原体的种特异性抗原为糖脂(Dhis et at，J.Inrnunnol，109：116-122，1972)，很久以后才发现衣原体的原体和网状体中都含有脂多糖(LPS)。其结构与肠道杆菌脂多糖类似(Nus-minel et at，Science，220：1279-1281，1983)。用血清型L2的原体免疫制备的单抗对衣原体LPS具有特异性，但对淋球菌，鼠伤害菌和大肠杆菌的LPS则无特异性，可是，用鼠伤害菌的ReLPS或类脂A产生的抗体可识别衣原体的LPS(CaldWell and Hitchcock，Infetc.Immun.44：306，1984)。提示衣原体LPS与其它革兰氏阻性细菌比较具有独特的抗原性区。进一步证明衣原体特异性区位于糖类部分，即由3-脱氧-D-甘露-2-辛基糖酮酸(KDO)组成的序列：-KDO(2-8)-KDO(2-4)-KDO(KDO3)。这种2-8连接是衣原体LPS的结构特征。对发育周期中外膜上LPS的分类和分布也进行了研究。用单抗免疫染色法证示在发育周期中LPS松散地结合于膜中，而不脱落于基质中。
衣原体LPS曾被认为是制备疫苗的理想抗原，因衣原体表面富含LPS，且具有抗原性。LPS曾被疑为感染早期的重要毒性决定簇，认为其特异性抗体在解除衣原体感染中发挥了一定的作用。然而对LPS的生物学功能或机体对LPS的免疫应答了解极少。目前LPS的特异性抗体仅用于衣原体感染的诊断和LPS的定位，在治疗感染上则无效。
其它的衣原体种特异性原是57-60KD，75KD蛋白，与HSP家族相关。这是通过比较编码这些蛋白的操纵子与大肠杆菌或B.megotezium的groE抑制应答操纵子序列而发现的。与抗HSP抗血清的反应证实了57KD蛋白的抗原性。60KD蛋白则诱导免疫的豚鼠发生眼的超敏反应，此反应以单核吞噬和淋巴细胞掺出为特征(Watkins，et at，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7580，1986；Morrisonct al.S.Exp.Med.169：663，1989)。提示此抗原在人的衣原体疾病中刺激免疫病理应答的精确机制已经明了。有证据表明患PID、异位妖娠、输卵管性不育的妇女中，有相当比例的血清与衣原体HSP-60发生很强的抗原抗体反应。但不是所有病人的血清发生高滴度反应，提示HSP-60不是暴露于表面的或者其抗原性是MHC限制性的。
75KD蛋白在衣原体的热抑制期优先转录。发现来自于家兔的抗75KD蛋白的单特异性抗体在体外可结合衣原体及中和感染，此蛋白为外膜中的暴露抗原。
种特异性糖脂外源抗原(GLXA)最初分离自衣原体感染的培养细胞的上清(Stuait and Mac Donald，Cwzznt Miciobiology，11：123，1982)近年来已在化学、生物学和血清学上对其进行了研究(Stuantand Mac&onald，Pioceeding of the Sixth Lnteinational Sgmposium on Hu-man Chlamydia Imfection，P167，1986；Stait et al，Immunology，67：527，1987)。质谱分析提示GLXA含有多糖：即古洛糖(非葡萄糖)、甘露糖和可能的半乳糖，而脂类成分含链长C17和C18：1的脂肪酸；不含KDO或脂质A。在体外培养的生长期感染细胞中可产生和释放GLXA。在透射电镜下用胶体金作标记的单抗鼠第二抗体观察特异结合的单抗显示GLXA不同于衣原体LPS，在感染后48小时大部分位于胞外(Stuait et al，Immunology，74：747，2991)。性病淋巴肉芽肿(LGV)患者血清中含有识别GLXA的IgG抗体(Stuaitand Mac Donald，Immunology，68：469，1989)，提示在自然感染中GLXA的可免疫性。尚不了解GLXA在衣原体感染及免疫应答中的作用。对衣原体抗原的总的免疫学反应尚未完全阐明。尚不清楚衣原体是如何逃避宿主的免疫监视的。在感染病人中发现对衣原体抗原特异的抗体对以后的再次感染几乎无保护用作用。尽管衣原体主要感染粘膜表面，对衣原体的IgA免疫也未完全弄清。衣原体疫苗的可行性依赖于它是否能使宿主产生保护性防御，包括SIgA应答，细胞介导的应答和可能的体液抗体应答。此外，由于需要大量的抗原，可能应选择合成或嵌合抗原。
随着1974年Jene网络理论的提出，对独特型作了深入研究。此理论的主要观点之一是免疫系统通过独特型—抗独特型网络实现自我调节。提示抗体分子上的独特型可以在分子水平上模拟任何外源或自身的表位(即内影象)。
由于可变区和Fab段中独特型—抗独特型结合对抗体产生的抑制是同样的，表明抗体分子的全部表位均定位于可变区(Givol，1991)。一般将抗独特型抗体分为三类：Ab2α、Ab2β，Ab2ε。只有Ab2β只有Ab2与互补决定区结合，因而它可能为抗原的内影象。具有内影象性质的抗体应符合下述条件：(1)可与不同种属的Ab1结合；(2)抑制Ab1与特异性抗原结合；(3)在未预先接触抗原的动物中可诱导与抗原特异结合的Ab3的产生(Ertl and Bona，1988)。
抗独特型抗体在体内的重要作用已在大量实验中得到证实。抗独特型抗体的引入可诱导不同的效应：或抑制或增强对特异性独特型的应答(Hart，1972，Kennedy，1983)。它在自身免疫中发挥了重要作用。与自身免疫相关的病理学极可能(至少部分)是由于自身免疫抗体与抗独特型抗体的独特型—抗独特型作用的结果。与特异性半抗原的结合可抑制独特型的识别，证明了特异性抗体中独特型的特异性。内影象的有效性的最早的实验证据是由Sege和Peterson在1978年用抗独特型作探针鉴定细胞表面受体而提出的。
对模拟的分子基础的精确资料来源于独特型—抗独特型的X射线晶体学。例如在呼肠弧病毒系统中抗体分子模拟的基础可能为与原始蛋白同源的局部序列；而在大多数情况下例如血红蛋白—肌球蛋白家族，则为完全不同的氨基酸序列形成的同样构型。后来研究发现在141个氨基酸中多达137个氨基酸序列不同而功能性构型完全相同是可能的。对抗溶菌酶抗体和抗独特型抗体中独特型—抗独特型复合体的晶体结构的研究表明一个独特型包含13个氨基酸残基，这些残基大多数来自互补决定区，仅3个氨基残基来自VL区的第三框架区。其中7个氨基酸残基与抗溶酶抗体的结合部位共用，提示独特型与抗原结合部位存在重要的重迭。自从独特型被发现和认识以来，它已成为研究免疫应答的特征与调控的独特工具，如作为克隆标志研究B细胞发育、体细胞突变B细胞克隆的命运；也可作为胚系V区基因的表型标志。带有外来致病原如病毒、细菌或寄生虫的内影象的抗独特型抗体已用于作为替代疫苗，治疗B细胞淋巴瘤及自身免疫病如脑脊髓膜炎。
在本发明之前，已在细菌系统中生产出针对抗—抗独特型抗体模拟糖类抗原的中和抗体(Schriver，et al，J.Immunol；144：1023，1990)。
因此，人们迫切希望得到一种制备抵抗衣原体感染的种特异性疫苗的方法，同时希望得到大量生产此疫苗的方法和提高疫苗效果的方法。
附图的简要描述
图1为豚鼠抗血清与GLXA-Ab1单抗的结合曲线。
图2为免疫吸收前后豚鼠抗GLXA-Ab1IgG单抗的抗血清与正常小鼠IgG的结合曲线。
图3为吸收后的豚鼠抗独特型抗血清对GLXA-Ab1单抗与GLXA的结合的抑制曲线。
图4为豚鼠抗独特型IgG的分离曲线。
图5为豚鼠抗独特型同种型对GLXA-Ab1单抗与GLXA结合的抑制曲线。
图6为家兔抗—抗独特型抗体与豚鼠抗独特型IgG的结合曲线。
图7为家兔GLXA-Ab3抗体对GLXA-Ab1单抗与GLXA结合的抑制曲线。
图8为来自灵长类的衣原体的特异性核糖体RNA的检测曲线。
图9为GLXA-Ab3IgG对眼感染疗效的临床评分曲线。
图10为显示对单克隆GLXA结合的抑制的曲线。
图11为衣原体患者抗血清与GLXA-Ab2单抗的直接结合曲线。
图12为家兔抗衣原体抗血清识别GLXA-Ab2单抗的曲线。
图13为用GLXA-Ab2单抗免疫对小鼠衣原体感染的保护作用曲线。
图14为高剂量的眼感染后GLXA-Ab2单抗的保护作用。
图15为明矾对小鼠衣原体感染的保护作用。图16A、B为用GLXA-Ab2单抗免疫后眼感染的进程
本发明基于以下发现：抗独特型抗体(下文GLXA-Ab2)可在动物体内产生识别GLXA的抗抗独特型抗体(下文GLXA-Ab3)，它可使动物产生对衣原体的免疫力，且可中和衣原体感染。此外，根据本发明发现多克隆或单克隆抗体均可成为有效的抗独特型抗体。另还发现尽管GLXA-Ab2的前体(下文GLXA-Ab1)对衣原体感染均无免疫和中和活性，但GLXA-Ab2都具有这些活性。
本发明用GLXA-Ab2模拟糖脂抗原的糖类，为胸腺非依赖抗原性转化为胸腺依赖抗原(因独特型疫苗为蛋白质)提供了一替代方法。据本发明，模拟衣原体抗原GLXA的GLXA-Ab2对下述问题十分重要：(1)阐明与GLXA糖类表位相关的免疫学机制；(2)它在衣原体感染中的作用如粘附和宿主细胞的吞噬；(3)为鉴定宿主细胞的GLXA特异性受体提供了基本工具，还为生产衣原体疫苗提供了方法。
GLXA-Ab2单抗是一种免疫原，可与免疫应答产物特异性结合，这些产物包括抗体、B/T细胞的表面受体。对GLXA单抗的快速应答和记忆(此在下述例1和图16A、B中予以讨论)提示T细胞应答接受了刺激。这意味着T辅助细胞对不同于GLXA表位的抗原决定簇发生了应答，此抗原决定簇包含于B细胞的刺激中，使后者产生针对结合GLXA的GLXA-Ab3的抗体受体。此外，Th细胞可产生对衣原体感染起保护作用的细胞因子，其中两种为γ-干扰素和TNF(肿瘤坏死因子)。
本发明包括：(1)以GLXA抗原表位的内影象生产单克隆和多克隆抗独特型抗体；(2)抗独特型抗体的特性；(3)一种在体内外均能对衣原体感染提供免疫中和及保护作用的疫苗；(4)在生物标本中观察衣原体存在的方法。
根据本发明，生产抗衣原体感染的疫苗的第一步是用任何常规方法生产出抗GLXA的抗体。
GLXA可通过目前任何可行的方法提取和纯化。GLXA可在辛基琼脂糖凝胶柱上分离、以乙醇洗脱；或以DEAE琼脂糖凝胶分离、以低PH水溶液洗脱；或以聚丙烯酰胺珠柱分离以低PH的5MKSCN水溶液洗脱。
用一种优选方法，GLXA可从感染细胞培养上清中分离纯化，用Sephorose 6B-C1色谱柱，以0.075M磷酸、0.154M氯化钠(PH7.2)作为脱洗液。GLXA在洗脱液的前一部分出现，可用吖啶酯偶联的GLXA-Ab1单抗以化学发光法检测。包含GLXA的部分常被核酸而不是蛋白质污染。将GLXA部分混合、浓缩并用RNA酶和DNA酶在PH8.0、37℃下处理2小时，并再次如上述过程即被纯化。保存于4℃备用(可加防腐剂)。
抗体可为单抗或多抗。可用GLXA作为抗原免疫动物(一般用小鼠)制备抗独特型单抗GLXA-Ab1。按Kohler与Milstein(Natwre256：459，1975)方法用聚乙二醇使免疫脾细胞与淋巴瘤或骨髓瘤细胞融合。融合细胞在选择性培养基如HAT中培养，以阻止未融合肿瘤细胞的生长。杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆并检测分泌所需特异性单抗的上清。产生GLXA-Ab1的杂交瘤存入ATCC并被定名为ATCC H.B.11300。单抗可用体内生长腹水的方法制备。另一替代方法为用Epstein Barr病毒免疫淋巴细胞。用独特型抗体GLXA-Ab1可产生GLXA-Ab2，后者具有抵抗及中和衣原体感染的活性。此外，GLXA-Ab1不具有种特异性而具属特异性，其免疫与中和作用可用于多种动物。用GLXA-Ab1作为抗原产生的杂交瘤亦可生产GLXA-Ab2单抗。产生GLXA-Ab2的杂交瘤存入ATCC并命名为ATCC H.B.11301。GLXA-Ab2亦可制备为多抗，作为多抗则具有对衣原体感染的免疫和中和作用。多抗可用任何常规方法制备，即以GLXA免疫第一只动物，自该动物血清中分离多克隆GLXA-Ab1，然后以多克隆或单克隆GLXA-Ab1免疫种属不同的第二只动物，即可得到多克隆GLXA-Ab2。
单克隆GLXA-Ab2或多克隆GLXA-Ab2均为抗抗独特型抗体，可模拟含有类特异性衣原体糖脂外源抗原(GLXA)的抗原。两种GLXA-Ab2均可作为疫苗免疫动物以抵抗类特异性衣原体感染，或中和其感染。
此外，根据本发明，GLXA-Ab2的Fab段亦可作为疫苗免疫动物或中和衣原体感染。Fab段可用任何常规方法制备，如用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜胰蛋白酶消化后再还原与烷化。
可用GLXA-Ab2单抗与其Fab段的混合物作为疫苗(以磷酸缓冲液进行适当稀释或使其终浓度为每ml含1mg蛋白质)。对正常成人，可用50-100μl(μg)稀释至4500μl与500μl佐剂如白蛋白氢氧化物或白蛋白磷酸盐(500μg)、PH6.0±0.1混合后免疫。根据不同动物的不同情况如体重，剂量可不同。
本发明中多克隆或单克隆GLXA-Ab2亦可用于鉴定生物体是否感染了衣原体。Ab2可进行标记以确定标本中Ab1是否与衣原体的抗原决定簇结合。Ab2可用酶、荧光素、放射性同位纱、或发光素进行标记。如果任何结合区在与标记的Ab2结合以后均可以随后的酶反应、荧光、放射性或发光确定，则可用任何常规方法鉴定结合区的范围。生物标本可用乙醇或或甲醇固定于固体支持物上，然后加入标记的Ab2或Ab2的Fab段，通过检测标记物的出现确定结合的范围。此外，也可用来标记的Ab2.，通过观察免疫复合物的浓度达到目的。
另一方面，单克隆GLXA-Ab2可用于确定真核细胞如上皮细胞表面的衣原体受体。GLXA-Ab2单抗或其Fab段可与生物素形成免疫复合物，然后与细胞接触复合物与细胞的GLXA-Ab2受体结合，然后再与标记的亲和素结合，观察细胞表面的标记可鉴定受体。通过常规的细胞分类术可将标记与未标记细胞分离。一旦以此法鉴定受体的存在，即可确定细胞通过内吞感染衣源体的机制。其它标记包括放射性同位素、酶和发光。
下述为本发明的应用实例，实际应用范围不限于此。
例1
本例采用了沙眼衣原体的两种血清型。血清型B(Har 36品系)衣原体最初分离自儿童的结膜拭取物，在HMEM培养基培养的Mc-Coy细胞单层中生长并以10％二甲亚砜存冻于-70℃，血清型C(TW-3)在培养的McCoy细胞中大量生长，原体用肾造影剂离心并重悬于磷酸缓冲液中，冻存于-70℃。
无衣原体的Hartley品系杂交豚鼠源于Jackson实验室，在同一群体中繁殖和维持。应用时选择一岁龄的雌性。
无巴斯德菌属的雌性新西兰家兔来自Mill Brock农场(Hadly，MA)。家兔重约6-8磅，一周内使用。BALB/cByJ小鼠(H-2d)来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。成年Cynomolgus猴(Macaccafasicuiareis)来自Charles River Plimates公司(Port Washington，Ny)，均无C型沙眼衣原体感染，部分猴先用一衣原体蛋白免疫。本研究被免疫的动物不患病及未免疫，实验开始时随机取样，所有操作均在麻醉下实施。
制备多克隆抗独特型抗体，用6只豚鼠，每只皮下注射150μg单克隆GLXA-Ab1(89MS30)IgG(稀释于1ml水中)加1ml Maalox Plus悬液(Willier.H.Roger，INc，PA)，3周后用100μ4g单克隆GLXA-Ab1(溶于1ml Maclox和H2O中，Maalox为白蛋白氢氧化物与明矾混合物)，一月后再加强免疫一次。
制备抗抗独特型抗体，在3只家兔中，用300μg吸收的抗独特型豚鼠同种型IgG1(溶于1ml明矾和1ml水)真皮下多点注射，3周后同法加强免疫。间隔1月再加强一次。制备单克隆抗独特型抗体GLXA-Ab2(9IMS441)，用KLH偶联的GLXA-Ab1IgG50μg与等量完全福氏佐剂(Sigma)腹腔注射20只9周龄雌性BALB/CbyJ小鼠，2周后同法加强一次，然后每周以不完全佐剂加强一次持续5周。在取脾前3天再加强一次。在衣原体感染保护作用的实验中，取2组BALB/cByJ小鼠(每组6-20只)，每只以50μg单克隆GLXA-Ab2IgG或50μg正常小鼠IgG加或不加Maalox皮下注射，以后每周加强免疫一次持续3周。
单克隆GLXA-Ab1IgG用蛋白A亲和层析柱分离。含有单克隆GLXA-Ab1的腹水先用玻璃棉去除脂类，每分钟200转离心10分钟弃去沉淀。亲和层析柱(1.5×9cm)用2ml蛋白A Sephorose CL4B(ZyMED，CA)装填，以结合缓冲液(1.5M甘氨酸3M氯化钠，PH8.9)平衡(Jackson Labs，PA)，2ml腹水加等量结合缓冲液以每分钟0.6-0.8ml加入柱上。静置30分钟使结合充分。然后以约3倍于柱床体积的结合缓冲液冲洗。以0.1M PH3的柠檬酸洗脱结合的IgG，样品试管中预先加入50μlPH8.0、1MTBS以平衡PH值。以280nm吸收峰观察。光密度大于0.1的部分混合并对0.075MPBS(PH7.2)透析过夜。分离的IgG以SDS-PAGE(Phast System，Phama-cia，NJ)纯化。
直接酶联免疫吸附试验(ELISA)
单克隆Ab1IgG免疫的豚鼠的特异应答用直接ELISA检测。96孔板(Dynatech，KI)每孔用0.4μg单克隆Ab1IgG包被(包被缓冲液：0.015M碳酸氢钠，0.3M甘氨酸，0.02％叠氮钠，0.06M聚乙二醇，PH9.6)，4℃过夜。每板用0.075M PBS(含0.05％TWeen20)冲洗3次，用1％BSA/PBS室温下封闭2小时。再冲洗3次。豚鼠未免疫血清或抗血清用0.075M PBS系列稀释后每孔加入100μl并作一复孔。混合液室温孵育1小时后冲洗，加入辣根过氧化物酶(Jackson Labs，PA)偶联的羊抗豚鼠IgG(H$L)1∶1000，孵育1小时后冲洗。然后加入TMB底物(Kirhegard and Perry Labs，MD)。用Vmax miciouell reader(Moleculer Devices Cosp.CA)在450nm处检测。豚鼠IgG1免疫的家兔抗血清用类似方法检测。每板用豚鼠IgG1包被，二抗为酶标羊抗兔(Jackson Labs，PA)。
制备亲和层析柱
按产品说明书将正常小鼠IgG(Jackson Labs.PA)与Affi-GellO偶联。简言之，5ml Affi-GelIO移入与吸引器连接的玻璃瓷漏斗中，用3倍核床体积的异丙醇冲洗，再以3倍体积冷去离子水冲洗。正常小鼠IgG(5mg/ml)10ml与Affi-Gel IO在小瓶中混合。在温和的振荡下4℃过夜。填入0.9×5ml的柱中，以PH7.20.075M PBS冲洗。以280nm紫外吸收监测。最高光吸收部分用Bradford Assay(Bio-Rad Labs.CA)检测以估计偶联效果。用正常小鼠IgG吸收豚鼠抗血清
用免疫后3、4、5周的豚鼠抗血清混合物上偶联有正常小鼠抗血清的亲和层析柱。层析柱如上述方法制备。抗血清上柱后4℃下孵育30分钟，以PH7.20.075MPBS洗脱。然后用新制备的柱子同法再吸收一次。豚鼠IgG同种型的分离
正常小鼠IgG吸收后的豚鼠抗血清5ml加于蛋白A Sephosose柱上，以PH7.3、0.02M磷酸—构橡酸缓冲液冲洗。豚鼠IgG亚类IgG1和IgG2用PH4.9液洗脱，直至无蛋白为止。然后用PH4.3洗脱。对PH7.3、0.02M磷酸—构橡酸缓冲液透析后，各同种型进行第二轮亚类分离。
血清型B衣原体(Har36)的原体在McCoy细胞单层中繁殖，后者于2升摇动的瓶子中(Corncing，PA)培养。培养基为HMEM，加入终浓度0.5mML-谷氨酰胺，终浓度0.4mM碳酸氢钠及10％胎牛血清。简言之，在细胞单层交汇后弃去培养基。0.5-3.0ml原体悬液与40ml放线菌酮强化培养基(COM)(Whittacker MD)(含L-谷氨酰胺及胎牛血清)混合后接种入瓶中，以每分钟3转速度在35℃下摇动。2小时后加入200ml COM，继续摇动48-72小时。离心收获上清。糖脂外源抗原(GLXA)的纯化
GLXA自上清中以两步提纯。首先，上清过辛基-SephasoseCL4B柱并以95％乙醇洗脱(Stuast and Mac Donald，Cwzzent Mlciobi-ology，11：123，1984)，乙醇中的抗原(含量等同于50ml严重感染的组织培养上清)浓缩至50μl并重悬于PH7.5、0.1M PAS至1ml。第二，抗原进一步用亲和层析法提纯。亲和层析柱以Affi-Gel IO(Bio-Rad Labs.CA)偶联单克隆GLXA-Ab1IgG(按产品说明书)。样品离心后上柱，4℃孵育30分钟。柱子以0.1M磷酸缓冲液洗脱直至洗脱液变清。GLXA溶于15-20ml 5M的硫氰酸钾(KSCN，Mallincksodt Inc，KY)中，对0.075M磷酸盐缓冲液透析过夜。
GLXA、GLXA-Ab2、GLXA-Ab3免疫点印迹结合试验中的GLXA以分子筛法分离。Sephozose 6BLC柱(2×100cm)以0.075MPBS平衡。来自沙眼衣原体血清型F的细胞培养上清5000转/分离心以去除碎片。取20ml上柱，流速为0.5ml/分。洗脱液中GLXA以Magic Lite Analyzer(Ciba Cozning Diagnostic Corp.，MA)检测，方法见下文。化学发光免疫检测法(抑制法)
用豚鼠GXLA-Ab2或家兔GLXA-Ab3(抗血清，IgG，IgG同种型)对单克隆GLXA-Ab1与GLXA结合的抑制，采用化学发光法以Magic Lite Analyzer检测。方法如下：亲和纯化的GLXA与试剂A(Cibo Cozning)1∶5混合分装入塑料试管(200μl/管)(Saistedt，NJ)，每管中加入100μl中和试剂B(Cibo Cozning)。豚鼠GLXA-Ab2或家兔GLXA-Ab3 IgG系列稀释后每管中加入50μl，室温下孵育1小时。加入吖啶酯(AE)标记的单克隆GLXA-Ab1IgG(于1％BSA/PBS中)(220,00-240,000相对光单位，RLU)，混合孵育1小时。每管中加入500μl与顺磁珠基价结合的多克隆衣原体抗体再温育1小时。置于磁场中使顺磁颗粒-GLXA-AE标记的单克隆GLXA-Ab1Ig复合物与未结合组分分离。冲洗3次，结合的AE标记的抗体以Magic Lite Analyzer检测(以RLU为单位)。结合抑制百分率按下式计算：
“对照”代表PBS，“检测”代表未免疫血清或抗血清(或Ig)。免疫斑点印迹试验
用Bio-Rad斑点印迹仪器进行本实验。聚乙烯氟(PVDF)膜，0.45μm，Immobilen-NC(Millipore，MA)以亲和纯化的GLXA或衣原体rLPS4℃下包被18小时。以含0.05％Tween 20的0.075MPBS(PH7.2)洗涤，以3％BSA/PBS阻断2小时(室温)。冲洗后加入系列稀释的兔GLXA-Ab3IgG(90MS699)(以蛋白A亲和层析分离，见上)或单克隆Ab1IgG(89MS30)，室温2小时，洗涤去除未结合IgG。取下PVDF膜以3％BSA/PBS阻断2小时(在轻微振动下)，然后加入过氧化物酶偶联的羊抗兔Ig(H&L)或兔抗鼠1g(H&L)(JacksonLabs.PA)室温下1小时。在平皿中振荡洗涤4次，每次5分钟，以除去未结合抗体。以4CN(4-氯-1-萘酚)膜过氧化物酶底物系统观察结合情况。实验重复一次。IgG的生物素化
单克隆GLXA-Ab1或兔GLXA-Ab3IgGs以生物素标记。简言之，GLXA-IgG先对PH8.8、0.1M硼酸钠透析，4℃4小时。每mg IgG加入200μg生物素氨基已酸N羟基酯(Sigma，MO)室温作用4小时。每250μl酯加入20μl 1M NH4cl室温作用10分钟终止反应。标记的IgGs 4℃下对0.075M PBS透析3天。感染的McCoy细胞的免疫荧光染色
交汇的McCoy细胞单层在置于24孔板(Falcon，NJ)中的盖片上生长24小时，弃去培养基，每孔加入200μl沙眼衣原体血清型B原体(Har36)或200μl HMEM。每200μl含1000个包涵体形成单位(IFU)。然后立即加入200μl含L—谷氨酰胺和胎牛血清的COM培养基。混合物在37℃中培养2小时，培养液以每孔1ml COM代替，5％CO2、37℃湿代孵箱中培养48小时。
孵育后细胞盖片以0.075M PBS洗2次，每次5分钟。小心去除盖片上残留的缓冲液。滴加50μg/ml生物素标记的单克隆GLXA-Ab1抗体400μl或1.20mg/ml生物素标记的GLXA-Ab3400μl，室温作用1小时。以PBS冲洗盖片2次，每次5分钟。1∶50的荧光素—亲和素(溶于1％BSA/PBS)400μl，孵育1小时。如上洗涤未结合亲和素。
以Zeiss A.7082 Oberkichen显微镜观察，以Olympus25、35mm照相机、ASA 400 TMAX黑白柯达胶片摄影，以12v/100z汞灯照射。
体内GLXA-Ab3(90MS699)对衣原体的中和作用接种物与标本
未免疫家兔和GLXA-Ab3Ig，正常小鼠和单克隆GLXA-Ab3IgG无菌过滤。IgGs(0.2mg/ml)分别与沙眼衣原体血清型C(TW-3)原体(2000IFU/20μl)以1∶1比例混合。混合物及作为对照的未处理原体37℃45分钟，每15分钟轻轻摇动一次。
然后将2μgIgG与1000IFu(共约20μl)接种入8只猴子的双眼的下穹窿中，4只以GLXA-Ab3Ig加EBs，2只以未免疫IgG加EBs，2只仅以EBs接种。同时，用100μl各种混合物感染48孔板内10孔生长于盖片上已2天的McCoy细胞单层以鉴定接种物的感染性。培养方法见下文。
在接种后2、6、9、13、20天自下眼睑及下穹窿、侧穹窿、上眼睑及上穹窿、中穹窿提取结膜试取物，拭取物立即浸入2ml标本液中并用涡流破碎2分钟。细胞培养中衣原体感染性的确定
结膜拭取物先于涡流中破碎2分钟以收获EBs，取此标本液200μl接种于盖片上的McCoy细胞单层。在48孔板中培养2天，每一标本作5复孔。对体外中和试验，取此混合物100μl接种于盖片细胞单层，每种标本10孔。接种培养板室温下1000xg离心1小时。在5％CO2、37℃中培养48小时。然后以吸引器吸去培养液。盖片以0.075M PBS洗一次，于乙醇中固定5分钟后以水冲洗2次。荧光素标记免抗衣原体单抗与伊文氏兰交叉染色(Syvo，CO，CA)液，每孔加入25μl，37℃温育30分钟，以水冲洗2次后盖片以封固液封固于孔内，倒置培养板于荧光显微镜下计数包涵体。直接荧光抗体染色细胞学(DFA)。
将感染的灵长类结膜拭取物涂布于乙醇预处理后的玻片上，空气中干燥后以冷丙酮固定5分钟。干燥后滴加30μl荧光标记单抗与伊文氏兰交叉染色液(Micio Trak Chlamydia Pirect Reagent，syvo CO、CA)。于湿盒中温育15分钟后除去剩余的染色液并以去离子水冲洗10秒。空气中完全干燥后加盖片与封固剂封固(Syvo CO.CA)。在500X和1250X放大倍数下以荧光显微镜检查。感染滴度以半定量法计数：0-4+：0为阴性，0.5为首次传代阴性而任何再次传代阳性，1为首次传代中每孔含1-9个包涵体，如此类推。临床检查和评估
每只眼的临床反应按10种临床症状分级(Taylor etal，Invcst.Opthalmol，Vis，Sci.29：847，1988)：腰、四肢、上睑、上穹窿、下穹窿的滤泡反应，结膜充血、球部感染，上睑、下睑、上穹窿、下穹窿的流出物。对每只猴子临床反应根据结膜炎10种体征对总的炎症进行评估并分为0-3级。设为单盲检查(即检查者不知道猴子是否患病)，得分均数用来描述一组猴子的反应。RNA-直接杂交分析结膜拭取物
在以GLXA-Ab3或正常家兔IgG免疫前或免疫后2、G、9、12、20天的猴子中的结膜拭取物中提取总RNA。拭取物先在65％酸(包含PH8.0 50mm Tris，150mM NaCl，10mM EDTA，1％SDS)中混匀；将沉淀的RNA重溶于上述缓冲液中。RNA以3∶1的酚/氯仿提取数次。重悬并以DNA酶工处理。以甲酰胺琼脂糖电泳及溴化乙锭检测所制备的RNA的纯度。
所用探针为一含16S和23S核糖体RNA和自衣原体基因组质粒克隆PL2，434Sel-IA(Cheema et al，The Amur，J.Med.Sci.302：261-268 1991)切下的侧接序列DNA片段。DNA片段以32PdcTP(800ci/mmet)用缺口平移法标记(Amersham Corp，IL)，对全部限制性片段探针的特异性活性约106cpm/μgDNA。在每印迹的槽中含1μg猴或人的总RNA，10pg提纯的沙眼衣原体或血清型C RNA(阳性对照)，3μg酵母或大鼠RNA，单独的缓冲液或1μg感染前猴眼拭取物中提取的RNA(阴性对照)。RNA固定于0.22μn滤膜上(Schleichcrand Schuell cosp，NH)杂交结果用放射自显影法以X-OMAT AR胶片(Kadak，NY)显影。
抗独特型单克隆抗体(单克隆GLXA-Ab2)的制备和特性锁眼 血蓝蛋白与单克隆GLXA抗体的连接
单克隆Ab1(89MS30)以蛋白A亲和层析柱按前法分离。以戊二醛进行血蓝蛋白偶联。简言之，1.5mg IgG与0.05nmg KLH(Sigma，Mo)混合(KLH的每50氨基酸加1mol IgG)于等体积的0.2％戊二醛中，室温中振荡1小时。加入1M甘氨酸使终浓度为0.02M，再作用1小时，对PBS透析过夜。抗单克隆Ab1杂交瘤的制备
在最后一次加强免疫后4天，自2只小鼠中分离高滴度的脾细胞。根据Kohlor与Milstein法(Nature，1975)并作改良(Golsby，APsactical Guide to Mcking Hybidomas In Nuilei ACid & Monoclonol Anti-booly Probes，Swaminathn & Prokask，Eds，Deller，N.Y.pg，367，1989)，用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/D-Agl4与免疫脾细胞融合。饲养层细胞来自8周龄小鼠脾细胞。单克隆抗体9(MS44)的筛选(单克隆GLXA-Ab2)
来自于免疫小鼠的抗独特型抗血清和克隆细胞培养上清以夹心ELISA检测(Uytdchaag et al，J.Immunol，134：1225，1985，Hizoshimaet al，J.Immunol 144：224，1990)。简言之，聚苯乙烯Immulon II微孔板(Dynatech Labs Inc.，VA)以100μl 1μg单克隆Ab1IgG(于0.1M碳酸盐缓冲液，PH8.9)包被4℃过夜。去除未结合IgG，以3％BSA/PBS阻断1小时(37℃)。冲洗后加入系列稀释的抗血清或杂交瘤培养上清100μl。37℃温育1小时后冲洗，每孔加入1μg生物素偶联的单克隆Ab1IgG及亲和素—辣根过氧化物酶(Jackson Labs，PA)检测反应。1小时后加入TMB底物(Kirkeigaard & Perry Labs，Inc.MD)。以酶标仪于405nm处测定光吸收。取自融合前的免疫血清(1∶10)与培养基分别作为阳性和阴性对照。结合的抑制的检测
单克隆GLXA-Ab1与GLXA结合的抑制用小鼠抗血清和克隆上清按上述免疫组化法检测。腹水的生产
10只BALB/cByJ小鼠，月龄无严格要求，每只腹腔注射1ml降植烷(Sigma，Mo)10天后注射2×106产生GLXA-Ab2(91MS441)的单克隆杂交瘤细胞。约10天后以Vacutainer 20g采血针头(Becton Dickinson，NJ)收获腹水。以2000转/分离心10分钟后，上清保存于-20℃备用。
接同种型的抗独特型IgG同种型的抗独特型IgG
用ELISA检测同种型。用来自91MS 441上清(100μl)。包被微孔板4℃过夜，冲洗后用3％BSA/PBS封闭2小时，然后于每孔加入兔抗鼠亚群的特异抗血清：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、K链和H链，并设复孔，室温下放置1小时，兔8抗血清用辣根过氧化物酶连接的羊抗兔血清(H和L)和TMB底物(Kirkeraard & Perry Laboratories Inc MD)检测。
单克隆GLXA-Ab2 IgG的纯化
单克隆GLXA-Ab2 IgG用蛋白-G-琼脂糖柱通过亲和层析进行纯化。蛋白-G-琼脂糖-4B(Zymed，CA)5ml装入0.5×9cm的柱子中，为2ml的腹水用(PH＝7.3)磷酸缓冲液按1∶1进行稀释然后上柱，用同一缓冲液进行冲洗直至无蛋白为止。结合的IgG用(0.1MPH2.6)的枸椽酸—甘氨酸缓冲液进行洗脱。洗脱物按1ml一份进行收集，并且用50μl的Tris一盐酸缓冲液(PH8.0)平衡洗脱液。紫外吸收超过0.1部分混合并溶解在PBS中4℃过夜，这一纯化的IgG再用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进一步签定。
用从其它种属的抗衣原体血清的单克隆GLXA-Ab2做免疫沉淀
通过ELISA用诊断为衣原体感染的病人或衣原体EBs注射的兔子获得的多克隆抗体来识别单克隆GLXA-Ab2。其程序基本上与上述描述相同但有如下例外。简而言之，ELISA板每孔用1μg的单克隆GLXA-Ab2溶于0.075M PBS进行包被(不用包被液)4℃过夜。各孔用溶于0.075M PBS的0.05％吐温-20进行洗涤并用3％牛血清白蛋白/PBS在室温下封闭两小时。病人的血清(92MS273)、对照人的血清(88MS 356)、兔抗血清(88MS 188)或对照兔子血清(92MS450)进行系列稀释，于各孔加入100μl。室温下孵育1小时，各孔洗三次然后加入100μl的连有过氧化物酶的羊抗人或羊抗兔IgG(杰克逊免疫研究室MD)、TMB底物在孵育1小时后加入，然后把板放于Vman微孔极测量仪上读出(分子设备公司生产，CA)。
单克隆GLXA-Ab2在感染模型中对衣原体感染的免疫保护作用
用免疫斑点印迹法进行检测，此法与上述方法一样，不同的是每条PVDF纸条用纯化的GLXA(100μl)在0.075M的PBS中包被。把单克隆GLXA-Ab2IgG式正常鼠IgG免疫的小鼠抗血清用3％牛血清白蛋白/PBS进行系列稀释，二抗是连有辣根过氧化酶的兔抗鼠IgG，照片采用柯达TMAX100。斑点着色的强度用密度扫描仪进行扫描。
样本与培养
沙眼衣单体(TW-3)单体5000/20μl在小鼠的每只眼睛上进行培养，C1小鼠用单克隆-Ab2或正常鼠IgG进行免疫。在培养的前一天或培养后的7、10、14、21、28和35天，用拭子拭抹每只眼，包括眼部的前睑板、穹窿、侧穹窿、上睑板和上穹窿及中穹窿、结膜的擦拭物迅速浸在收集液中，涡漩破坏2分钟，保存在冰溶直至培养。
用单克隆GLXA-Ab2 IgG对宿主细胞受体的鉴定。
流式细胞仅分析单克隆GLXA-Ab2对HECEC细胞的特异结合位点
(HECEC)人子宫内膜腺上皮细胞培养在75mm2烧瓶中37℃5％CO2温箱中，细胞长满后，用细胞括匙(贝克斯特，IL)从瓶中刮下，离心200xg 5分钟，细胞用含20％牛血清的Hank′s液洗一次而后让细胞通过IgG的注射器头4次以获得单细胞。把生物素标记的单克隆GLXA-Ab2或生物素标记的正常鼠IgG用Hank′s液系列稀释，在每含有大约1.5×106HECEC细胞的小瓶中加入上述稀释液100μl，冰浴30分钟；每小瓶用含有0.02％叠氮化合物的Hank′s液洗两次，然后加入100μl的连接有异硫氰酸荧光素的链亲和素、冰浴30分钟。洗涤两次后，细胞冰溶保存在400μl的鞘缓冲液中(Sleathbuffer)，设置细胞和细胞加异硫氰酸荧光素作为背景控制。
多克隆抗独特型抗体的检测及鉴定
用豚鼠制备抗单克隆GLXA-Ab1的抗独特型抗体
用来在豚鼠制备抗独特型抗体的免疫原是鉴定为89MS30(单克隆GLXA-Ab1)的单克隆抗体。它的来源是用在鸡胚中繁殖的衣原体原体免疫BalB/C ByJ小鼠所得。小鼠脾细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合后筛选出这一克隆，这一克隆(89MS30)对沙眼衣原体，肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体的所有的15种血清型以及鼠脑膜炎有反应，通过酶免疫法(EIA)证明它可识别种属特异性抗原。这种IgG用兔抗鼠的抗血清采用ELISA证明与IgG26同型。从腹水中将单克隆GLXA-Ab IgG用eec-蛋白-A琼脂糖48交连的柱子(ZYMED.CA)进行分离。近交的豚鼠(Honfley13)用GLXA-Ab1IgG免疫和加强，每只150μg且加Maalox作为佐剂。免疫前血清和免疫后血清通过心脏穿刺后离心制备。免疫的5只豚鼠用ELISA证明具有强烈的抗单克隆Ab1IgG的免疫反应，且抗单克隆GLXA-Ab1IgG的滴度在第一次加强免疫后一周大于1/20,000。这些豚鼠的抗血清在加强免疫后两周内持续增高如图1所示。在图1中，免疫前血清(□)；免疫后抗血清3星期(□)；强化后一星期(■)和二星期(□)。
用正常鼠IgG对豚抗血清的完全吸收
为了去除直接抗表位而不是抗特发位的豚鼠抗鼠抗体(特发位存在于单克隆-Ab1IgG分子高变区)，免疫的豚鼠血清用正常鼠IgG吸收。这一吸收采用亲和层析的方法，柱子的制备是将正常鼠IgG连接于亲和胶-10上。连接与否是通过检测非结合蛋白在280nm波长的吸收值，取一部分最高的光密度值是0.23，含0.18mg蛋白(用Bradford Assay)，用在连接的总的鼠IgG量是50mg，结果表明连接是成功的。豚鼠抗血清上柱后用PH7.2、0.075M PBS冲洗。这一程序用新制备的柱子重复，并将吸收前后抗血清与免疫前的血清用ELISA检测并与正常鼠IgG做比较。做此试验时血清浓度一致。每孔用1μg正常鼠IgG覆盖，加入预吸收(·)；未免疫(□)和吸收的豚鼠血清(□)的稀释液。PBS作为背景对照(o)。辣根过氧化酶结合的山羊抗豚鼠IgG(H和L)作为第二抗体。每个值是两次测定的平衡值。结果表明吸收后的血清象免疫前的血清一样对正常鼠血清有反应(图12)，没有被吸收的抗血清比吸收的血清高出5倍的反应性，表明所有对表位特异的抗体而不是对特发位的抗体已完全被去除了。
用豚鼠抗血清抑制单克隆GLXA-Ab1对GLXA的结合
如果豚鼠抗血清含有抗单克隆GLXA-Ab1 IgG分子的特异抗独特型分子，直接的作用是它将抑制抗原(即GLXA)与单克隆抗体(即GLXA-Ab1)的结合。换句话说，抗血清结合到单克隆GLXA-Ab1 IgG的补体结合位点，这样就阻止了GLXA结合到活性位点上。为证实这一点，用免疫化学发光法作竞争性结合。将系列稀释的豚鼠免疫前血清，没有吸收的抗血清式吸收的抗血清与经免疫素和层析分离的GLXA共育，室温孵育1小时后，再将连有吖啶(Acridium)酯的单克隆GLXA-Ab1 IgG加入共育1小时，然后加入固相的顺磁微粒，测RLU值。抑制百分率按前面材料方法中提到的进行计算。由鼠IgG吸收的豚鼠抗独特型抗血清(■)可在与未吸收豚鼠抗血清(□)的大约相同稀释度下通过化学发光免疫分析表明其可抑制mAb1与GLXA的结合，未免疫(o)；mAb1(·)和2×PBS作为对照。抑制结合的百分比按说明书中所述计算。如图3所示，当豚鼠抗血清按1∶40稀释时，没有吸收的抗血清及吸收过的抗血清抑制单克隆Ab1与GLXA的结合率可达95％，而免疫前的血清只有15％。另外，在相同蛋白浓度时吸收过的抗血清与没有吸收过的抗血清抑制效果几乎相等，说明非抗独特型抗体通过吸附被去除。因此，用豚鼠就制备出了竞争性抗独特型抗体。
豚鼠抗单克隆GLXA-Ab1 IgG亚型
前面的试验已经显示豚鼠抗独特型的不同型别在独特型产生中发挥不同的作用，IgG2型可抑制独特型克隆。为证明豚鼠抗独特型IgG不同型别的抑制效率，从吸收过的豚鼠抗独特型抗血清分离出IgG亚型。这里用到梯度PH酸构酸缓冲液。IgG1和IgG2用蛋白-A层析柱分离。同型的IgG1和IgG2冲洗的过程如图4所示。磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的PH梯度步骤分离豚鼠的IgG2和IgG1。每个峰与羊抗豚鼠IgG做免疫电泳后(IEP)在免疫沉淀带谱(Bethyl.TX)上鉴定。含有IgG1的第一个峰用羊抗豚鼠IgG1和IgG2沉淀，但用羊抗豚鼠抗血清只形成一条带。然后将第一个峰值用同一方法纯化。
豚鼠IgG结合的抑制作用
用IgG1或IgG2型豚鼠抗独特型抗体，通过免疫化学发光测量法对不同的IgG亚型的竞争进行了检测。图5表明0.4μg IgG对单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合可抑制50％。如图5所示，mAb1与GLXA的结合被豚鼠抗独特型同种型所抑制。在化学发光免疫分析法中，豚鼠抗独特型IgG1(·)可抑制mAb1与GLXA的结合，而IgG2可部分抑制(■)。同源未结合的mAb1(o)或PBS(□)用作对照。抑制结合的百分比如上所述计算。当剂量达到100μg时可达到完全抑制。重要的一点是为应用没有标记的单克隆GLXA-Ab1 IgG时浓度需一致。IgG2的抑制效力则较弱，1μg只抑制25％。这些资料表明抗独特型IgG的IgG1亚型比IgG2亚型的抑制效率高出5倍。
用豚鼠IgG1免疫兔子制备抗-抗独特型抗体(GLXA-Ab3)
已获得的证据表明豚鼠抗独特型IgG1是抗单克隆GLXA-Ab1 IgG高复区的，但亦可抑制单克隆GLXA-Ab1 IgG与GLXA结合。抗独特型抗体的内影像的最终标准是在结构上证实Ab2是Ab2β，而不是Ab2α或Ab2∈。因为Ab2结合于免疫球蛋白的框架部分，亦可抑制Ab1与同源抗原相结合。为证实豚鼠抗独特型IgG1是Ab2，用同型IgG1制备抗-抗独特型抗体(GLXA-Ab3)，Ab3能识别动物从没有接触过的GLXA的表位(Ertl eral Proc.Natl.Acad.Sci，USA81：2850.1988)。在佐剂存在下，用豚鼠抗独特型IgG1免疫三只新西兰白兔。用ELISA检测兔的(S2)抗IgG1的抗血清(图6)。兔抗血清对豚鼠IgG1的专一活性通过ELISA测定。豚鼠IgG1用作抗原，山羊抗鼠IgG结合物用作第二抗体。滴度表示免疫3星期后兔抗-抗独特型抗血清(□)；1星期(■)和3星期(增强后)。未免疫血清作为对照(□)。抗体滴度在免疫后随时间延长而增加，加强免疫后3周滴度与免疫前血清相比高出20.000。
兔的抗-抗独特型抗体识别GLXA
用斑点印迹设备(Bio-Rad Iaboratories.CA)检测兔抗血清对GLXA的反应性。将两只兔子的抗血清通过免疫斑点印迹法证实。由于单克隆GLXA-Ab1对衣原体有交叉反应，把聚乙烯氟化物膜用GLXA和衣原体cLPS包被，发现兔抗血清具有很高的反应性识别GLXA和LPS。当应用免(S2)(90MS 699)IgG时，在浓度为0.006μg时即可出现斑点阳性，而免疫前的IgG无反应性。检测了从抗血清分离出的IgG抑制单克隆GLXA-Ab1对GLXA结合能力，由于GLXA-Ab3是由内影像产生的，那么GLXA-Ab2应该表现相同的结合能力。如图7所示既证实了这一现象。未免疫(□)兔Ab3抗体(■)mb1(o)IgG的稀释液用于在化发光免疫分析法中评价结合。所得抑制百分比是两份测定的平均值。由GLXA-Ab3所致的抑制随抗原的浓度增加而增加，但是与非标记的单克隆Ab1相比它的抑制率约小于5倍，这就证实豚鼠抗独特型抗体IgG1是抗原GLXA的内影像。GLXA-Ab3IgG做了进一步的体外识别沙眼衣原体的试验。
单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3通过戊二醛与生物素相连。标记的单克隆GLXA-Ab1或GLXA-Ab3与已感染沙眼衣原体48小时(Har36)的单层McCoy细胞在培养皿中共同培养。没有感染的单层细做对照。用单克隆GLXA-Ab1和多克隆GLXA-Ab3 IgG3对原体的荧光染色表明GLXA-Ab3不仅识别纯化的亦可识别没纯化的GLXA。
GLXA-Ab3(90MS 699)IgG对灵长类衣原体感染的中和作用
下面的问题涉及到单克隆GLXA-Ab1或GLXA-Ab3中和衣原体原体及保护宿主细胞免受感染的能力。用的实验方法包括培养细胞感染的中和及灵长类结膜感染的中和。
活体试验GLXA-Ab3可中和衣原体感染而单克隆GLXA-Ab1则不能
在灵长类结膜上的中和作用是通过预先与IgG抗体做组织培养和以及检测眼部感染效力。单克隆GLXA-Ab1或Ab3组份与沙眼衣原体进行共育，并设正常鼠和兔免疫前血清及非免疫球蛋白作对照。把这些混合物接种到灵长类的眼上。接种前后用拭子擦拭结膜的不同部位(见前)，在灵长类眼部的衣原体感染是通过细胞培养来决定的，且这一细胞培养包括感染后的第二阶段。如表(1)所示，三只灵长类动物用单克隆GLXA-Ab1处理过的EBs感染左眼，GLXA-Ab3处理过的EBs感染右眼。另设二只灵长类动物用正常鼠IgG处理过的EBs(如N1所示)或单独用EBs交替感染左右眼，对免疫前兔IgG(如N3所示)用相同的方法。接种用单克隆GLXA-Ab1，处理过的EBs，所有眼睛至少一次阳性(灵长类动物编号515，84和26)。然而用GLXA-Ab3处理过的眼睛只有一只眼睛出现一次阳性，在感染后10天两只眼睛均没有出现阳性(灵长类动物编号515，84，26)。接种正常鼠或免疫前兔IgG处理的EBs所有眼睛至少一次阳性(动物编号563，20，17和329)。没有处理过的EBs(如C所示)在四只眼睛中两只产生感染(动物编号563，20，17和329)。虽然资料有限，但这些资料的确显示出单克隆GLXA-Ab1对灵长类结膜衣原体感染没有中和作用，而另一方面提示GLXA-Ab3有中和作用。为了证实这一点即GLXA-Ab3有中和作用又做了许多试验，包括(A)，细胞培养的中和(B)在灵长类动物眼结膜的中和(C)临床培养方法的检测8(D)直接荧光抗体细胞学检测(E)衣原体特异的RNA探针杂交和(F)通过临床观察测定的眼睛感染的严重程度。
表1
用Ab3而不是mAb1对灵长类结膜衣原体感染的中和
灵长类 眼 抗体a 感染后天数
0 3 7 10 14
515 左 mAb1 - - + + -
右 Ab3 - - - - -
563 左 C - - - - -
右 N1 - - - + -
84 左 mAb1 - - - + +
右 Ab3 - - - + -
20 左 N3 - - - + -
右 C - - - - -
26 左 mAb1 - - + - -
右 Ab3 - - - - -
17 左 N1 - - - + +
右 C - - - + +
329 左 C - - + - -
右 N3 - - - + +
N1＝用正常鼠IgG处理的EBs，N3＝免疫前兔子IgG；
c＝EBs这三组都作为对照
GLXA-Ab3在体外中和衣原体的感染
在体外，用GLXA-Ab3和免疫前兔抗体做细胞培养，免疫前免和GLXA-Ab3(90MS 699)1gG3用蛋白A亲和层析分离。将10μg上述两血清和100μl血清型CEBs(1000FU/ml)或单独EBs接种到含McCoy单层细胞的培养孔中，每个样本设10个复孔。包涵体在培养48小时后用连有FITC的单克隆抗衣单体抗体检测。依据1FU/ml每孔15个空斑，如表2所示，与免疫前IgG相比可减低3倍的感染率，与单独EB相比可减低5倍的感染率。指出了GLXA-Ab3可中和衣原体的感染。
表2
Ab3 IgG在体外中和衣原体的感染用Ab3处理EBs 平均1FU/15区+S.E.M.
34.1+7.2正常IgG 93.8+22.4无 155.3+5.5
GLXA-Ab3在灵长类动物中和衣原体感染
8只灵长类动物在这个实验中随机分为三组。在眼部，4只动物接受预先与GLXA-Ab3IgG(8只眼睛)共育的纯化过的单体，2只接受预先与免疫前IgG共育(4只眼睛)，另外两只接受没有处理过的单体(EB)(4只眼睛)。在检测日取擦拭物作细胞培养。由于免疫前IgG组与单独单体组(EB)没有差异，所以结果是以8只实验眼和8只对照眼睛表示。细胞培养结果表示为1FU/ml，按在15个区域数的包涵体数，每个样本两孔。如表3所示，在接种20天以后，实验组8只眼睛中有一只阳性，而对照组8只眼睛全部阳性。检测的累计结果是与GLXA-Ab3共育的9/40(22.5％)阳性，相反，没有与GLXA-Ab3共育的36/40(90％)是阳性。
表3细胞培养法分析在灵长动物结膜，Ab3 IgG对衣原体感染的中和实验天数
眼睛培养阳性数
Ab3 免疫前 总计IgG对照0 0/8 0/4 0/4 0/82 3/8 2/4 3/4 5/86 3/8 4/4 4/4 8/89 1/8 3/4 4/4 7/812 1/8 4/4 4/4 8/820
1/8 4/4 4/4 8/8
9/40 17/20 19/20 36/40
a只有一个第一阶段阴性的样本为第二阶段阳性
b EB3预先同抗体共育
在实验的同时，也做了直接荧光抗体细胞学分析(DFA)，评估从结膜擦拭物中EBs的数量。结膜擦拭物样本固定在玻片上，用标记有异硫氰酸荧光素的抗沙眼衣原体的单克隆抗体进行染色。每玻片有5个或更多的典型的原体可见就是为阳性(Miem trnk、，Syra Co.CA)。如表4所示，用GLXA-Ab3处理组只有2例出现原体，在感染后6天和12天；而其他组20天中全部阳性。只有一只在没有处理组第2天阴性，考虑是人为因素，这一组的其他动物的眼睛全为阳性。在实验的最后测检日(第20天)，用GLXA-Ab3处理过的全为阴性，而在对照组分全阳性。另外，DFA结果与培养结果完全一致。
表4
用DFA例Ab3对衣原体感染的中和
眼睛培养阳性数实验天数 Ab3 免疫前 无b 合计
IgG 对照0 0/8 0/4 0/4 0/82 0/8 2/4 3/4 5/86 1/8 2/4 4/4 6/89 0/8 4/4 4/4 8/812 1/8 4/4 4/4 8/820
0/8 4/4 4/4 8/8
2/40 16/20 19/20 35/40
a如果4个原体发现于破片就认为是阳性，DFA(直接荧光抗体血细胞计数分析)
b原体预先没有与抗体进行共育
GLXA-Ab3防止结膜感染是通过减缓衣原体复制
为了深入了解中和作用的机理，用DNA探针(Cheema et al，The Ameri，J.Med，Sci 302：261-268，1991)检测从实验的动物结膜擦拭物的衣原体特异核粒体RNA。从实验动物结膜取出擦拭物，然后抽提总的RNA。把来源于血清型C EBs、人和酵母的RNA作为对照。用编码核糖体RNA 16S亚基和23S亚基的磷32p标记的DNA通过Northern点杂交的方法检测衣原体特异的RNA。如图8所示。对照动物眼睛(接种与免疫前兔IgG共育的EBs或单独原体(EB))，在所有的检测日都一致地显示有较高水平的衣原体RNA，相反用GXLA-Ab3处理过的实验组则所显著地降低衣原体RNA水平。白RNA是由来自用Ab3IgG(·)处理的EBs的四个灵长类，四个用未免疫兔IgG(o)处理的灵长类和两个单独用EBs处理的灵长类(■)的结合拭子得到的。Northern印迹放射自显影图的相对信号强度用任意强度表示。在所有检测时间点上每只灵长类的一只眼上所测定的值是平均值。这就表明，中和作用是发生在感染的早期阶段。
通过临床反应，对三组接种后结膜感染的程度进行了评价。临床反应参照感染的10个临床特点的完全临床疾病评分(TCDS)进行分级。(Tay lor et al.Invest.Opthalmol，Vis，Sci，29：1847.1988)。通过检测存在于结膜10个标志为每一组动物取得累计疾病积分。临床疾病计分按每10个结膜炎症标志分0-3级。总的炎症得分是由用Ab3(·)处理或未免疫兔IgG(o)处理的原体而感染的每个灵长类得到的。如图9所示，用GLXA-Ab3处理过的组只有很轻的临床疾患，且8天后下降；而对照组在整个感染后的21天过程中发展成为严重的疾患。这一病理改变与细胞培养，荧光染色和RNA杂交资料一致。
产生抗独特型抗体杂交瘤细胞系的制备及其特性
抗独特型杂交瘤细胞的产生
腹腔注射有完全福代佐剂连有KLH的单克隆GXLA-Ab1IgG免疫5只同源鼠(Ba1B/C By J)。来自这些鼠的抗单克隆GLXA-Ab1IgG的抗独特型抗血清用ELISA进行检测。免疫后3周抗体的滴度可达1∶1000(资料没显示)。将2只最高滴度的抗单克隆GLXA-Ab1的小鼠脾细胞与SP2/0-Ag14细胞进行组融。脾脏的大小是正常鼠的2倍。用相同的鼠抗血清试验筛选克隆。1∶10稀释的鼠抗血清或免疫前血清在所有筛选试验作为对照。在对283孔的筛选中，有8孔滴度2倍于或高于阴性对照认为是抗单克隆Ab1阳性。这些杂交瘤株被克隆，其中一个克隆(91MS441)用ELISA检测时滴度最高，把它扩增，产生腹水分离IgG；其IgG的型别鉴定为IgG1，具有K轻链(Bio-Rad lab.cA)。融合的结果总结于表5。
表5
抗独特型抗体融合概要
| 免疫的BALB/cByJ | 上清液中抗-id滴度 | 成长的杂交瘤的总孔数 | 抗-id的阳性孔数(％) | 稳定的克隆的抗-id细胞株(总量％) |
| 2 | 1∶1000 | 283 | 8(2.8) | 1(0.35) |
| 轻链：K | 重链：IgG1 |
杂交瘤(91MS441)分泌的IgG抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA结合
通过免疫化学发光法，对来自阳性克隆的上清做进一步的试验即抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合。发现4个没有稀释克隆的上清具有完全的抑制作用。两周后仅一个克隆(91MS441)是稳定的，如图10所示。在1∶10的稀释度下，来自这一克隆的上清抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA结合率可达80％，而对照(即来自同一融合非阳性克隆)抑制率是0。培养皿上清液中自克隆91MS411(·)和阴性克隆91MS442(o)的稀释度是通过化发光免疫分析法检测的。所得百分比是两份的平均值。说明这一克隆即可产生抗独特型抗体。这一抗体鉴定为GLXA-Ab2且能被病人及兔抗衣原体抗血清所识别。
作为抗原决定簇的内影像，不管种属如何，抗这一表位的特异血清能识别此抗独特型抗体。为证实由克隆(91MS441)产生的IgG的这一特性，应用了临床上诊断为衣原体阳性的病人血清。由于单克隆GLXA-Ab2是IgG型，通过蛋白G亲和层析对这种IgG进行纯化。分离的单克隆GLXA-Ab2IgG包被微孔板，用病人血清(91MS253)通过ELISA测其反应性。用临床上没有诊断为衣原体感染的人的血清(88MS 356)作为阴性对照。结果显示病人血清在抗单克隆GLXA-Ab2时滴度可达1∶2000(Fig，11)。从诊断为衣原体感染(■)的患者和未诊断的个体得到的抗血清稀释液与覆在聚苯乙烯壁上的mAb2 IgG共育。第二抗体是山羊抗-人过氧化酶结合物。数据是两份的平均值。这证明感染病人的抗血清具有特异抗单克隆GLXA-Ab2的抗体，从而说明单克隆GLXA-Ab2是GLXA的内影像。
用相同的方法检测了兔抗衣原体抗血清对单克隆GLXA-Ab2的特异识别。兔抗血清是通过接种原体而制备。如图12所示，兔抗血清比免疫前血清对单克隆GLXA-Ab2有较高的结合，但比预期的低。结合的差异性在稀释到1∶1000时才能见到。聚苯乙烯盘用mAb2 IgG包被，1μg/孔。对衣原体EBs(■)或未免疫兔血清(□)专一的兔抗血清稀释液以双份加到每个孔中。抗血清的专一结合是通过鼠抗兔IgG(H和L)HRP结合物和TMB底物测定的。这就表明兔抗衣原体抗血清有特异抗体识别单克隆GLXA-Ab2，这就从另一方面说明单克隆GLXA-Ab2是内影像。
来源于同源鼠的抗血清单克隆GLXA-Ab3只别GLXA
作为内影像的抗独特型抗体能提高从没有接触过此抗原的动物的抗原特异性抗血清。这种情况下，如果单克隆GLXA-Ab2(91MS441)是GLXA的内影像(具有相同的抗原结构)，那么既使动物没有接触过GLXA，用GLXA-Ab2免疫同源的BaLB/CByJ小鼠能产生抗-GLXA的抗体。开始试验时，8只小鼠用单克隆Ab2IgG免疫，四只小鼠用正常鼠IgG免疫。不加佐剂皮下注射，加强免疫后14天和免疫后7天，杀死实验组的一半以获得这些鼠的抗血清。用纯化的GLXA作免疫斑点印迹。结果表明用单克隆GLXA-Ab2IgG免疫的小鼠滴度可达1∶800，而用正常鼠血IgG免疫的小鼠滴度最高才达1∶100。此斑点一步通过密度扫描证实。当第一次加强免疫后稀释度为1∶00时，4只小鼠的抗血清可结合GLXA，而在对照组即使稀释度1∶50时亦没有发现能与GLSA结合。这就证明这种抗血清反被抗独特型的对位所触发，因为免疫的动物是同源的。
同源鼠GLXA-Ab3抑制单克隆Ab1与GLXA结合
通过免疫化学发光法检测与GLDA特异结合的GLXA-Ab3，抗血清对单克隆Ab1与GLXA结合的抑制作用。在稀释度为1∶25时GLXA-Ab3可抑制结合的90％，而免疫后8天的对照组抗血清只抑制18％。这相当于10μg的未标记单克隆GLXA-Ab1的抑制效率。在第一次加强后一周用相同量(50μg/mouse)的IgG，第14天此血清有相同的抑制率。当稀释度为1∶100时，它的抑制百分率从第7天的70％到第14天下降至50％。
用单克隆GLXA-Ab2免疫可保护小鼠免于衣原体感染
在此研究中，BalB/C ByJ小鼠用作眼衣原体感染动物模型。第一次实验用39只小鼠，20只小鼠用正常IgG免疫，19只用50μg单克隆GLXA-Ab2度下免疫注射，都不加佐剂。总共三次注射，一周一次，最后一次免疫一周，给小鼠接种沙眼衣原体血清型C原体(每只眼睛5000IFU)。接种后第0、7、14和21天从每只眼睛中取结膜擦拭物。收集的擦拭物样本与单层McCoy细胞培养48小时。计数包涵体，15个区域内5个包涵体认为是阳性。如图13所示，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠与用正常鼠IgG免疫的不鼠相比只有一半的感染率。在第二次试验中(每组20只小鼠)，用相同的方法进行免疫，然而每只眼睛接种106IFU，是第一次实验原体的100倍。20只小鼠用mAb2(·)免疫，19只小鼠用正常鼠IgG(o)(50μg IgG/鼠)免疫。1星期免疫3次后用沙眼血清型C EBs对它们眼睛进行感染。每只眼接种5000IFU。感染前和后一天，从每只眼取结膜样本并进行细胞培养。阳性眼的百分比为组中所有检测眼中的阳性眼数目。发现在这些小鼠几乎是相同的保护曲线(图14)，从而提示单克隆GLXA-Ab2触发强烈的宿主防御反应。一星期免疫3次后，用mAb2 IgG(·)免疫的20只小鼠和用20正常鼠IgG(o)免疫的20只小鼠接种约5×104-5×106衣原体沙眼血清型C EBs/眼。结膜衣原体是由结膜拭子的细胞培养物检测的。所得值是不包括第28天的第一和第二阶段培养结果的平均值。
第三次试验，免疫时加入明矾(alum)。10只小鼠用单克隆GLXA-Ab2在Maalox作为佐剂下进行免疫，8只小鼠在不含佐剂下免疫，16只小鼠在Maalox存在的情况下用正常鼠IgG进行免疫，免疫程序同前。当应用Maalox时，在免疫印迹试验中，小鼠抗-抗特型抗血清在抗GLXA时其滴度增高一倍。加佐剂免疫的小鼠有较高滴度的抗血清，与没有佐剂的相比，在保护小鼠免于眼部感染时有较高的保护效率(图15)。10只小鼠用mAb2 IgG(不加明矾)(o)免疫，16只小鼠用正常鼠IgG+明砜(■)免疫。最后强化后一星期，小鼠被眼部感染，并通过感染那天的细胞培养物检测结膜感染。然而用单克隆GLXA-Ab2免疫小鼠与用正常鼠IgG加明矾相比有较低的感染率，另外在第28天感染消失。第四次试验中，8只小鼠用单克隆GLXA-Ab2进行免疫，8只用正常鼠IgG加明砜进行免疫，免疫与接种程序与前面相同。然而如图16(A)所示，在第七天，两组具有相同程度的感染，50％的眼睛受感染；但第10天两组的感染就有明显差异。用单克隆GLXA-Ab2IgG免疫的一组，在第14天，8只眼睛中2只是阳性；22天时，一只眼睛阳性；28天时都为阴性，显示了感染的明显消退。相反，用正常鼠IgG免疫的小鼠，在第14天，8只眼睛中6只是阳性且一直持续到42天仍为阳性。在这一组感染眼睛有数目开始下降被认为是自然恢复过程。最后的试验中，把上次试验中完全清除感染的小鼠再次用EBs进行接种来评价此免疫有无记忆。发现已感染过的小鼠从眼中清除有机物的能力比没有感染的小鼠要早。如图16(B)，从而说明单克隆GLXA-Ab2不仅能引起免疫保护反应，亦能引起免疫记忆反应。
这一试验证明了模仿GLXA的抗独特型抗体，可保护作为动物模型小鼠免于眼部衣原体的感染。用来产生抗独特型抗体的单克隆抗体mAb1(89MS30)通过完整的原体免疫而产生，又通过它对同源特异抗原的反应而筛选。它已被用作鉴定GLXA，并证明它可对GLXA多糖部分具有特异结合。这一抗体与cLps有交叉反应。
首先，GLXA和cLps具有明显不同的种属特异性抗原。GLXA存在于始体、原体、包膜、宿主细胞膜，并可从感染细胞的胞浆脱落到周围环境。它可从感染细胞培养上清中获得。而cLps仅发现于原体和始体(主要是始体)。它们不被分泌或从感染细胞中释放，但仅与RBs(始体)有松散的结合。在结构上，他们有不同的多糖成份。GLXA有特异的糖基：古洛糖或古洛糖衍生物—甘露糖和半乳糖，可能以重复的古洛糖和甘露糖醛酸单位进行排列。仅发现两种此抗原相关的脂肪酸，，相当于12个cLps。而cLps有典型的线性2-酮基—3—脱氧庚酸(KDO)三糖(共核)和象葡糖胺与庚糖一样的多糖。血清学上，单克隆GLXA-Ab1特异地结合与甘露糖与古洛糖的重复区域。而cLps种属特异表位是在KDO上，特异的决定簇在2-8键之间。明显，GLXA与cLps不可能分享相同的表位。由完整的原体产生的单克隆才多克隆抗体对纯化的cLps都不具有中和或保护功能。从成份分析上来看，葡葡糖与甘露糖及半乳糖一起形成GLXA的特异表位。而cLps除了KDO三糖作为表位，还在KDO区域有其他表位并且亦有其他的单糖部分。后面的这些结构显示了从其他的阴性细菌株获得的Lps具有较广泛的交叉反应。由于GLXA保护性表位有一束糖基残基所组成，所以认为cLps某些糖基与GLXA共享是合理的。
这一交叉反应的其他可能性亦存在。如(1)GLXA和cLps不具有任何主要的相似性。但结构上形成相同的结合位点；(2)虽然单克隆GLXA-Ab1与cLps相结合，GLXA和cLps在抗体结合位点没有相似性。单克隆抗体可能是多特异性，也就是说，它识别相当不同表位且与其结合。
从以上讨论可短单克隆GLXA-Ab1，对GLXA表位有特异性。正是由于GLXA和CLPS具有相同的糖基或者仅结构相似性可解释交叉反应性。
抗独特型抗体GLXA-Ab3和单克隆GLXA-Ab2
抗独特型抗体是具有潜力的长久的免疫原
把单克隆GLXA-Ab1，在没有连接物或福氏佐剂存在下皮下注射豚鼠。发现四只免疫过的豚鼠，早在第一次免疫后了周，就具有高滴度的与特异单克隆Ab1相结合的抗独特型抗体。用ELISA检测滴度可达大约1∶5000。产生的抗独特型抗血清中含有相当高浓度的GLXA-Ab2，且这一GLXA-Ab2对单克隆GLXA-Ab1的高变区具有特异性。这一点通过正常鼠：IgG吸收两次后可以证明。将豚鼠抗独特型抗体IgG1型作为免疫原免疫三只兔子，免疫后两个月抗抗独特型抗体滴度可达1∶20000。这就证明免疫球蛋白的本身就是一个很强的免疫原，不仅对种属间免疫而且对同种系的动物免疫而言都是如此。用单克隆抗独特型抗体(单克隆GLXA-Ab2)，在不含佐剂和没有KLH交联的情况下，免疫同种系的小鼠。在免疫后(9天)的较短时间内，这些小鼠就具有高滴度的GLXA-Ab3。在这些研究中的程序不同于用交联剂或福氏佐剂做为免疫增强剂时所采用的程序。这就指出免疫球蛋白作为一种抗原与分析或人工合成的肽类抗原相比具有较高的免疫原性。
成功的疫苗不仅需要它有较好的免疫原性而且它能持续较长时间。由独特型产生的免疫性是长期的。对3只免疫的豚鼠来源的GLXA-Ab2抑制单克隆GLXA Ab与GLXA结合的能力进行了长达77周的监测。只有三次加强，免疫后一年的抑制能力儿乎相当于免疫后早期阶段收集的抗血清的抑制能力。这说明由单克隆GLXA-Ab1这种独特型抗体所致的免疫有长期记忆能力。由于抗体分子的半衰期或大多数产生抗体的细胞只有几周，免疫加强间隙(6个月)远远超出了B细胞和免疫球蛋白的生存时限，所以保持抗独特型抗体在某一水平是对独特型网络中的持续性刺激。
衣原体GLXA内影像的同型差异
在这一研究中，分离了豚鼠GLXA-Ab2IgG1和IgG2。这两种型别对独特型的调节功能还没有研究。但发现IgG1和IgG2亚群对单克隆GLXA-Ab1与GLXA结合力的抑制方面有差异。采用了新的免疫化学发光法，培养及最终的检测物在液相而不是在固相，这样大大减少了阻碍所引起的抑制。结果表明，在相同的浓度下GLXA-Ab2 IgG1抑制率可达100％而IgG2只能达50％。说明GLXA-Ab2IgG1与独特型结合有较高的亲和性或者它更象GLXA抗原，从而表明它们与独特型结合能力存在同型差异。这差异反应了它们各自的活性位点的不同。IgG1具有和IgG2在结合能力存在不同的独特型。有许多决定簇独特型的例子、如A5A抗链A碳水化合物抗体独特型或磷脂酰胆碱抗体T15独特型。目前还不知道在不同系统中是否存在任何抗独特型抗体型别的优先。这一发现提示某型的GLXA-Ab2是内影像而其他型别的不同。
单克隆GLXA-Ab2作为衣原体GLXA免疫原
制备单克隆抗独特型抗体的目的是(1)可提供源源不断抗独特型抗体用于疫苗研究；(2)鉴定宿主细胞上的GLXA的可能受体；(3)进一步研究GLXA上表位的特点。这使得能按表位的密度了解GLXA的生物学功能，以及在活体衣原体感染的机理及抗衣原体感染的保护功能中所起的作用。用同源的BaLB/cByJ小鼠制备单克隆抗独特型抗体。在第一次融合中，从283个克隆中筛选出一个稳定高抑制活性克隆(91MS441)。第二次融合中，筛选出另一克隆(91MS442)免疫化学发光分析表明它的抑制活性不如91MS411克隆。由91MS411克隆产生的单克隆GLXA-Ab2证明是衣原体GLX-A的内影像。
鼠GLXA-Ab3抑制能力随时间有轻微或明显的减低。抗独特型的剂量在增强独特型或抑制独特型方面是一个因素。由GLXA-Ab3产生的抑制结果显示应用单克隆GLXA-Ab2IgG 2次之后的抑制活性此应用单克隆GLXA-Ab2 IgG 3次之后获得的血清抑制活性高。这指出50μg在作为一次剂量或反复多次应用中是太大了。另一方面，说明低剂量对保护性免疫是足够的。
在免疫中选择小鼠正常IgG作为阴性对照而不选择非相关克隆作为阴性对照的原因是为了避免任何可能的对特异克隆的偏见。
单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3具有同一抗原的结合结构
虽然以前没有接触过GLXA或感染过，GLXA-Ab3识别亲和纯化的GLXA，可用免疫印迹法显示。当GLXA-Ab3浓度增加时单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合可被抑制。这表明抗抗独特型具有作为独特型相等的抗原反应性，也就是能识别同一表位。通过对感染的McCOy细胞包涵体的免疫荧光染色，进一步证明从兔来源的单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3具有相同的抗原反应性。从而提示抗体结构的相似性。用模仿GLXA的单克隆GLXA-Ab2确定它的识别部位，在理解抗独特型保护机制中有价值。试验用人的表皮样瘤细胞(A431)以及人子宫内膜腺上皮细胞(HEGEC)。应用这些细胞系是因为它们是人源的。初步的结合试验是直接抗体染色层用流式细胞仪进行检测。如果不用酶或粗糙的分离法很难把这些上皮细胞分着成单细胞，特别是HEGEC细胞；细胞群中含有单体、双体和多体。所以采用在细胞碎片上方收集单细胞群。由于对照组细胞是用正常鼠IgG用同一种方法进行染色，所以这两组是具有可比性的。另外，结合是直接的，单克隆GLXA-Ab2或正常鼠IgG直接用生物素标记。单克隆GLXA-Ab2结合强度随浓度增加而增加，特别是对宿主细胞(HEGEC)。而正常鼠：IgG既使在最高浓度也没有这样的结合。如果说这一发现能被重复和证明是有效的，那么GLXA将是结合HEGEC细胞的粘附分子或连接子。另一些原因认为GLXA是一种粘附分子或连接子。首先，如上所提到的，GLXA-Ab3的中和作用发生在很早的阶段；把用GLXA-Ab3处理的原体接种灵长类动物的结膜，取结膜样本表明没有发现显著的有意义的衣原体特异的核粒体RNA可进一步证实这一点。这表明GLXA-Ab3可阻止原体进入宿主。第二，当用GLXA预先与McCOy细胞进行培养，GLXA大约能增加感染率3倍。所以只有GLXA作为粘附分子或连接子才使得原体容易接触宿主细胞，导致上述结果发生。实际上，因为GLX-A从感染细胞分泌，EBs很可能利用这一机制感染宿主细胞。
GLXA作用的机制可能如下：原体通过存在于自身的GLXA或通过自由的GLXA(即由感染细胞分泌到周围环境)来接触宿主细胞，这使得GLXA吸附到环境中的细胞更为容易和有效。这一机制似乎比直接接触更为有效。
GLXA-Ab3对衣原体感染的中和作用
前面体外中和试验已经表明用GLXA-Ab1处理沙眼衣原体包涵体血清型B原体要比用兔Ab3处理过的原体所发现的包涵体多。这表明GLXA-Ab3可中和感染，而单克隆GLXA-Ab1则不能。GLXA-Ab3中和细胞培养的感染而单克隆GLXA-Ab1则不能。这一体外试验的结果在后两次试验中用灵长类动物模型体进行了重复。结果表明无论体内外GLXA-Ab3能有效地中和衣原体的感染。
对这一中和作用机制的了解是来自衣原体特异的RNA杂交试验。灵长类动物眼部接种预先用GLXA-Ab3或正常鼠IgG处理的原体，在接种前后不同的时间从灵长类动物结膜擦拭物中检测衣原体RNA。RNA杂交法在这一研究中是极为敏感的检测样本衣原体感染的方法，即是DFA细胞培养检测阴性的样本也可查出。用Ab3处理过的灵长类动物发现只有相当低的RNA提供了中和发生在早期阶段的证据。这提示GLXA可能是在接触的阶段起到粘附分子或连接子的作用。
体液免疫在抗衣原体感染中所起的作用长期被忽视。然而现在无论在体内和体外体液免疫可能在防止衣原体感染中起作用。
用单克隆GLXA-Ab2免疫小鼠防止衣原体感染
在BeLB/cByJ小鼠衣原体眼部感染模型用于单克隆抗独特型抗体单克隆GLXA-IgG的疫苗研究。它是只感染人的沙眼衣原体的模型。在免疫试验中用单克隆(GLXA-Ab2)IgG(50μg/鼠)在有佐剂或无佐剂的情况下，皮下注射各组，每组6-20只小鼠。在一次免疫之后一周，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠可检出相当的GLX-A-Ab3的滴度。用在这一研究的系统是同源的：单克隆GLXA-Ab1，单克隆GLXA-Ab2或单克隆GLXA-Ab3均为小鼠同一种系所产生，就基因型而言免疫球蛋白是相同的。仅有的外部结构是每一型抗体的特异的结合点(单克隆GLXA-Ab1或单克隆GLXA-Ab2)。用同一种系的正常鼠IgG作阴性对照，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠可产生比对照组明显高的滴度抗纯化的ILXA的Ab3。对照组滴度1∶200，而实验组平均滴度可达1∶3200。这就明确指出高变区激发同源鼠GLXA-AB3抗体的产生而这一高变区是模仿GLXA的。另外，来自这些鼠的GLXA-Ab3与未标记的单克隆GLXA-Ab1一样有效地抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合。这些试验表明单克隆GLXA-Ab2模仿GLXA的一个单表位。
保护小鼠免于沙眼衣原体对眼部的感染用活体的四个试验进一步证实。用单克隆GLXA-Ab2或正常鼠IgG进行免疫(每周基础上三次)，眼部接种EBs(5000IFU/眼)于小鼠。在感染前后不同的时间(天)取结膜擦拭物，用细胞培养的方法检测包涵体。用单克隆GLXA-Ab2IgG免疫的小鼠眼睛的恢复期较短(眼部接种后9天即恢复而用正常鼠IgG免疫的对照组需28天)。单克隆GLXA-Ab3的滴度与细胞培养结果有好的相关性。这表明单克隆GLXA-Ab2是模仿单一的GLXA表位且是有效的免疫原，可激发强的抗衣原体感染的保护性免疫反应。这表明单一的保护性表位存在于衣原体GLXA上。
中和和保护机理的前景
这一例子是第一次证明非中和性单克隆GLXA-Ab1在活体通过抗独特型抗体(GLXA-Ab2)能产生中和性GLXA-Ab3。核心既单克隆GLXA-Ab1可通过用原体免疫产生，但不具有中和和保护灵长类动物的再感染；而由豚鼠GLXA-Ab2产生的GLXA-Ab3可以中和感染，用单克隆GLXA-Ab2免疫可保护小鼠再感染。
Claims (17)
1.在动物体内能诱导抗-抗独特型抗体的单克隆抗独特型抗体，其能识别包括种属特异性的衣原体糖脂外膜抗原的抗原。
2.能产生单克隆抗独特型抗体的持续的杂交瘤细胞系，其能在动物体内诱导产生抗-抗独特型抗体，该抗体能识别包括种属特异性衣原体糖脂外膜抗原的抗原。
3.权利要求2的持续杂交瘤细胞系ATCC、Acc、No.H.B.11301。
4.权利要求2中的细胞系，其中的细胞系是免疫脾细胞的杂交体，它能产生抗独特型抗体，其可在动物体内诱导抗-抗独特型抗体，该抗体能识别包括种属特异性的衣原体糖脂外膜抗原。
5.包括足够量有效免疫所述动物抵抗动物体内衣原体感染的给予动物的疫苗，此疫苗包括选自单克隆抗独特型抗体、所述抗独特型抗体的Fab片段及其混合物的生物活性组份以及药学上可接受的辅剂，上述的单克隆抗独特型抗体可以在动物体内诱导抗-抗独特型抗体，该抗体可以识别包括种属特异性衣原体糖脂外膜抗原的抗原。
6.包括足够量有效免疫所述动物抵抗动物体内衣原体感染的给予动物的疫苗，此疫苗包括选自单克隆抗独特型抗体、所述抗独特型抗体的Fab片段及其混合物的生物活性组份以及药学上可接受的辅剂，所述的单克隆抗独特型抗体可以在动物体内诱导抗-抗独特型抗体，该抗体可以识别包括由连续细胞系ACTT Acc.No.B.H.11301产生的种属特异性衣原体糖脂外膜抗原的抗原。
7.权利要求5中的疫苗，其中的辅剂是氢氧化铝。
8.权利要求6中的疫苗，其中的辅剂是氢氧化铝。
9.权利要求5中的疫苗，其中的动物是人。
10.权利要求6中的疫苗，其中的动物是人。
11.权利要求7中的疫苗，其中的动物是人。
12.权利要求8中的疫苗，其中所述的动物是人。
13.能诱导抗-抗独特型抗体的单克隆抗独特型抗体在制备用于免疫动物抵抗衣原体感染的疫苗中的用途。
14.用权利要求13中的用途，其中的抗独特型抗体由连续细胞系ACTT Acc.No.H.B.11301产生。
15.权利要求13所说的用途，其中所述的动物是人类。
16.权利要求14所说的用途，其中所述的动物是人类。
17.由权利要求3中所述细胞系产生的单克隆抗体。
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