CN1163754C - 检测患者中的衣原体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测胞外样品中的衣原体的方法，包括将样品与GLXA独特型抗体接触以形成免疫复合物，以及检测所述的免疫复合物。
Description
相关申请的参考
本发明是1993年3月19日申请的美国申请系列号08/034,572的部分继续申请。
发明背景
本发明涉及检测患者中是否存在衣原体的方法。
衣原体感染是主要发生在粘膜表面的结膜、生殖道、呼吸道和新生儿感染，该感染的病因是真核细胞的专性胞内细菌寄生虫，衣原体属。这一属中有四个遗传学不同的种，它们在形态学、胞内发育循环以及抗原应答方面有一定的相似性，这四个种是砂眼衣原体(Clamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)以及Chlamydia Percorum。砂眼衣原体的感染仅限于人类。根据主要外膜蛋白(MOMP)的抗原性变化分化为15个血清型(Grayston and Wang，传染病杂志，132：87，1975)，血清型D-K是性传播性病的最主要病因。保守地估计，每年在美国有超过4百万个衣原体性感染病例，使其比所有其它性传播疾病加在一起还要更流行。所述的疾病包括非淋球菌性尿道炎、粘液脓性子宫颈炎、急性附睾炎、异位妊娠和骨盆炎症(PID，子宫内膜炎、输卵管炎、子宫旁炎和/或腹膜炎)。女性中的感染可能导致损害很大：在美国每年由这一生物体引起的骨盆炎症的250,000个病例中，有10％导致不育。当衣原体母亲生下婴儿时，这些婴儿处于患包涵体结膜炎和肺炎的高度危象。砂眼衣原体血清型A、B、Ba和C导致砂眼，其是一种结膜上皮细胞感染，慢性和继发性感染诱导上皮下膜淋巴细胞的浸润，形成滤泡以及成纤维细胞和血管侵入角膜，导致失明。另一方面，眼睑形成疤痕以及畸形引起的睫毛倒睫经常摩擦角膜也能导致角膜混浊和失明。全世界有约5亿砂眼病例，现有7-9百万因并发症而失明，使得其成为世界上可预防性失明的主要病因。活性砂眼的流行在低年龄段非常高，有8千万儿童需要治疗，其在中东、北非、南亚以及印度北部是非常重要的健康问题。
鹦鹉热衣原体主要感染动物和鸟类，其对于牛奶业、羊毛工业以及肉食业曾经具有并仍具有很大的经济影响力。其有9个血清型来自哺乳动物，7个血清型来自禽类，2个生物变型来自考拉熊。哺乳动物血清型1、2、3和9感染牛和绵羊，导致各种疾病，包括胎盘和胚胎感染以及其它生殖问题如多关节炎-polysistitis，脑脊髓炎，结膜炎以及肠道感染。虽然已尝试各种方法生产疫苗，但是仅获得中等程度的成功(Schnorr，美国免疫医学协会杂志，195：1548，1989)。血清型4、5和6是在猪中导致流产、肺炎和多发性关节炎的病因。血清型7代表了猫科结膜炎、鼻炎和肺炎的衣原体株，而血清型8包括豚鼠包涵体结膜炎。禽类衣原体株经常引起养鸟人和家禽加工业工人的感染。
肺炎衣原体是新鉴别的物种，目前已鉴定了一个血清型TWAR(Grayston，第七届人类衣原体感染国际研讨会资料汇编，89页，1990)。目前的证据提示肺炎衣原体是在人和人之间传播的主要人类病原体，其导致成人中10-20％的群落获得性肺炎。其已成为人类呼吸道疾病如肺炎、支气管炎、咽炎、窦炎的主要病因并且是反应性关节炎的可能的病因，在医院、军队和家庭间流行。来自许多国家的血清学发现显示50-55％的带有抗TWAR抗原的抗体的成人对肺炎衣原体有特异性。其是新生儿疾病的主要细菌性病因，而对老年人和慢性病患者的感染可能会导致严重疾病或者甚至导致死亡。
Chlamydia pecorum是1992年鉴别的新物种，其在牛、绵羊和猪以及一些外来鸟类和无脊椎动物中流行。在牛中其导致脑脊髓炎、上呼吸道鉴别和肺炎，而在绵羊中，从患多关节炎的小羊中分离到这种衣原体。这种衣原体广泛传播并且在某些物种动物中的致病性仍未确定(Storz等，第八届人类衣原体感染国际研讨会资料汇编，563页，1994)。
衣原体感染的致病病理尚未完全清楚，很久以来就知道被这些血清型感染的不同个体具有不同的临床表现，已有推断这可能是由于宿主免疫应答的不同所致。已经显示在不同种系小鼠中对合成Th/B细胞表位的免疫学应答是不同的，提示在多重主要组织相容性复合体中T辅助表位被识别。
衣原体感染的靶典型的是宿主的上皮细胞，尚不清楚衣原体原体(EB)(一种孢子形圆形颗粒，直径约300nm)如何进入宿主细胞：受体介导的胞吞和/或非特异性高亲和性吸附。已报道砂眼衣原体的两个蛋白18和32kD与Hela 299细胞膜制剂结合。最近有报道另一种热变蛋白膜蛋白38kD与Hela细胞系结合，提示有类似配体的机制。还有见解指出因为衣原体能体外感染各种哺乳动物细胞，所以肯定存在某种粘附机制用来建立感染，推测主要外膜蛋白是这种粘附蛋白。最近已证实衣原体表面存在的硫酸肝素样糖氨基聚糖是附着于宿主细胞所需的。还研究了宿主细胞上的受体，由于EB特异性结合的胰蛋白酶敏感性提示来自Hela细胞的18,000和31,000kD是受体。还显示砂眼衣原体和肺炎衣原体特异结合Hela细胞上的一种脂类，核磁共振光谱分析和原子轰击质谱显示其是磷脂酰乙醇胺(PE)，同时发现神经系列糖脂特异与EB结合。所有这些发现提示上皮宿主细胞的胞吞机制尚存疑点。当EB通过胞吞作用进入宿主细胞后，根据条件不同它们被转化成代谢活性的非感染性网织体(RB)。RB的主要目的是通过使用宿主代谢物的二分分裂进行胞内复制，这发生在膜结合小泡中，称为包涵体，这种包涵体(内体)可以抵抗与宿主溶酶体融合。每一RB最终产生一或多个EB，这些EB可以起始另一感染循环。宿主细胞可能因包涵体释放而溶解，或者通过胞吐作用排出包涵体而不损害宿主。据信表面抗原介导吞噬溶胞作用(phagocytosis)和吞噬溶酶体融合(phagolysosomal fusion)的抵抗作用(evasion)。
衣原体的表面组分与宿主细胞和宿主免疫系统活性相互作用，据信它们负责附着、胞吞和免疫应答，但是这些相互作用的具体性质及调节尚未完全清楚。砂眼衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体的某些独立的抗原组分已在鉴别、定性和在衣原体感染的功能方面作了研究。另外，确定感染机制以及确定保护抗原是非常重要的。表面暴露的抗原是许多研究的重要目标，因为它们是免疫或其它防御系统可及的。研究最深入的抗原包括主要外膜蛋白(MOMP)衣原体脂多糖、60kD热休克蛋白(HSPO 60)粘附素以及称为外抗原的糖脂外抗原(GLXA)。
在衣原体外膜中有三个富含半胱氨酸的蛋白57、40和12.5kD，它们类似革兰氏阴性细菌的基质蛋白。在细菌RB的复制型中未发现57和12.5kD蛋白，作为主要外膜蛋白(MOMP)，40kD在感染性EB和RB中均很丰富，在RB中该蛋白能起成孔蛋白的作用，使得提供给网织体营养交换，遗传学和分子鉴定显示这一蛋白由散置于5个恒定区段中的4个可变区段(VS)组成，这些可变区段是暴露在表面的并具有血清型、亚种和种特异性的抗原决定簇。
对这一蛋白的免疫应答的研究最主要通过用纯蛋白免疫动物而进行，使用特异于MOMP和EB的多克隆抗体或单克隆抗体的混合物感染细胞培养物而进行体外中和实验。这些实验提示特异于MOMP蛋白或一个单表位的抗体可以阻止在细胞培养物中形成包涵体。中和机制不涉及对附着或穿透的抑制，但是却干扰内化后的过程。使用通过血清型B的完整原体产生的单克隆抗体(这些单克隆抗体在斑点印迹分析中识别免疫可及MOMP表位)可以中和对猴眼的感染性，这一保护是血清型特异性的。在使用单克隆抗体的Fab片段的后来实验中进一步证明单价Fab片段通过阻止对叙利亚仓鼠肾(HaK)细胞的附着而中和感染，证实保护作用不是由于双价IgG的聚集所致。还研究了MOMP的T细胞表位，发现在代表血清型AMOMP的主要序列的重叠合成肽的存在下，在得自用MOMP免疫的A/J小鼠的脾T细胞中有T细胞增殖应答，产生T细胞应答的合成肽相应于位于可变功能域(VD)VDI和VDIV中的表面可及的血清型特异性表位。使用类似的途径发现在BALB/cByJ小鼠中VDIII片段是T细胞依赖性的。使用衍生自MOMP两个表位的嵌合T/B细胞肽还显示其中一个是保守的T辅助细胞表位，另一个是血清型A特异性中和表位。用这一肽免疫的一些小鼠产生高效价的血清中和抗体，而另一些小鼠则不然。尽管MOMP是一种最深入研究的表面抗原并且已在实验动物中产生了中和抗血清，但是仍有许多未解决的针对免疫应答的问题，例如，感染的中和是血清型特异性的，因此其作为疫苗候选者是受限制的。中和还仅限于体外研究，对来自用任何MOMP或已知嵌合表位的免疫接种的攻击尚没有令人信服的体内保护作用。
很久以来就已知衣原体属特异性抗原是一种糖脂(Dhir等，免疫学杂志109：116-122，1972)，后来发现脂多糖(LPS)位于衣原体EB和RB的外膜中，其具有与Re化学型肠细菌LPS类似的化学结构(Nurminen等，科学220：1279-1281，1983)。用血清型L2的EB免疫而制备的单克隆抗体特异地抗衣原体的LPS，但是不抗来自N.Gonorrhoea、鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的LPS。但是由鼠伤寒沙门氏杆菌Re LPS或类脂A产生的抗体识别衣原体LPS(Caldwell和Hitchcock，感染免疫学44：306，1984)，这证明与其它革兰氏阴性细菌相比衣原体LPS具有一独特的抗原功能域。进一步的鉴定证实衣原体特异性功能域在其糖部分含有3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)，序列为αkDO(2-8)-αkDO(2-4)α-kDO(kDO3)。2.8连接的基序是衣原体LPS的特征。对于在发育循环中LPS在外膜上的分布和再定位也进行了研究，通过用单克隆抗体免疫染色显示LPS在发育循环中松散地结合膜，而不是排入到培养基中。
因为其在表面的丰富含量以及其是抗原性的，所以据认为衣原体LPS是疫苗候选者的理想抗原，怀疑LPS在感染早期是重要的病毒决定簇并且特异于其的抗体在消除衣原体感染方面起某些作用。然而，对于LPS的生物学功能以及对其的免疫学应答知之甚少，特异于LPS的抗体似乎仅在衣原体感染的诊断和定位LPS中有用，而对于消除感染则没有效果。
其它属特异性衣原体抗原是57-60kD和75kD蛋白质，经鉴别它们与热休克蛋白(HSP)家族相关，这是通过将编码这些蛋白的操纵子的序列与大肠杆菌或巨大芽孢杆菌的groE应激应答操纵子的序列进行对比而得出的结论。57kD蛋白的抗原性通过与抗HSP-60抗血清反应而证实。60kD蛋白在免疫豚鼠中引发眼部超敏应答，其是通过主要为单核的巨噬细胞和淋巴细胞浸润而鉴定(Watkins等，美国国家科学进展83：7580，1986，Morrison等，S.Exp.Med.169：663，1989)，这是第一次表明在衣原体眼部感染中一个抗原负责延迟超敏性。这一蛋白在人衣原体疾病中刺激免疫病原应答的具体步骤尚未清楚，有证据表明取自患PID、子宫外孕和输卵管不孕的妇女的血清中有相当一部分具有与衣原体HSPO-60热休克蛋白反应的高抗衣原体抗体。然而，不是每一位具有针对衣原体高滴度的患者的血清均与衣原体反应，表明HSP-60不是暴露于表面的或者抗原性是受MHC限制的。
发现在衣原体生物体的热应中75kD蛋白优势转录，从兔中产生的抗75kD蛋白的单特异性抗体结合衣原体并体外中和感染，其是在外膜中的暴露抗原。
属特异性糖脂外抗原(GLXA)最初从衣原体感染的细胞培养物的上清中分离(Stuart and MacDonald，当今微生物学，11：123，1982)，其在近年来已被化学、生物学和血清学鉴定(Stuart andMacDonald，第六届人衣原体感染国际研讨会资料汇编，167页，1986，Stuart等，免疫学，67：527，1987)。质谱分析表明GLXA含有多糖：古洛糖(而非葡萄糖)、甘露糖以及可能还有半乳糖，而脂类成分有链长为C17和C18:1的脂肪酸，在其结构中没有发现KDO或类脂A。这一蛋白在体外生长循环中从感染细胞中生产并释放。使用胶态金缀合的山羊抗鼠第二抗体检测特异结合的单克隆抗体的透射电镜显示GLXA在感染48小时后最主要是在胞外(Stuart等，免疫学，74：747，1991)，其不同于观察衣原体LPS时的发现。来自临床鉴定为腹股沟淋巴肉芽肿(LGV)的患者的人血清含有识别GLXA的IgG抗体(Stuart and MacDonald，免疫学，68：469，1989)，证明在天然感染中的免疫可及性。但是，对此蛋白在衣原体中所起的作用以及对其的免疫应答还知之甚少，对衣原体抗原的整体免疫学反应尚未完全清楚，并且尚不知道衣原体如何躲避宿主免疫监视。在感染的人患者中发现的特异于衣原体抗原的抗体在后来的感染中所起的保护作用很小。尽管衣原体主要感染粘膜表面，但是尚未完全了解IgA免疫对其的临床相关性。衣原体疫苗的可用性取决于保护性宿主防御的产生，所述的防御包括S-IgA应答、细胞介导的应答以及可能的体液抗体。另外，产生大量这种抗原的能力显示合成和/或嵌合抗原可以是应选择的方法。
随着Jerne1974年的网络理论，独特型已被深入的研究，Jerne的主要预测是免疫系统通过一个独特型-抗独特型相互作用的网络实现自我调节(Jerne，1974)。推测位于单一抗体上的独特位可以在分子水平模拟(即“内像”)任何外来或自身表位。
已发现一个单一免疫球蛋白分子的所有独特型均位于Fv(可变区片段)区，这是通过对抗独特型抗体与独特型的结合的抑制作用在Fv和Fab之间均是相同的这些研究发现得出的结论(Givol，1991)。通常抗独特型抗体分为三种类型，Ab2α、Ab2β和Ab2ε。仅Ab2β能与互补决定区结合，因此可以作为抗原的内像(intemal image)。Ab2显示内像性质的发生必须符合下述标准：(1)结合到Ab1以及来自另一物种的任何其它抗标准抗原的抗体并且丧失与其它抗体Ab2的反应性；(2)抑制Ab1与特异抗原、标准抗原的结合；以及(3)能在动物中不需预先与抗原接触就激发合成带有抗抗原特异性的Ab3(Ertl and Bona，1988)。
抗独特型抗体的体内重要作用已经经过大量实验证明，已发现给予抗独特型抗体能激发不同效果：或者抑制或者增强对特异性独特型的应答(Hart，1972，Kennedy，1983)。在自身免疫中它当然起重要作用。与许多自身免疫疾病相关的病理非常可能(或者至少部分)由于自身免疫抗体与抗独特型抗体的直接独特型-抗独特型相互作用。通过证明特异半抗原结合能抑制独特型识别首先在一特异抗体中鉴别了独特型特异性。内像的有效性的第一个实验证据是由Sege和Peterson在1978年通过用抗独特型作为探针鉴别细胞表面受体而作出的。
目前模拟的精确分子基础的最佳信息是从独特型-抗独特型复合物的X-射线结晶学得到的。抗体的分子模拟基础可以是如在reovirus系统中相对于原始蛋白的局部序列同源性，或者在大多数情况下，如在血红蛋白-肌红蛋白家族中从完全不同的氨基酸序列得到相同的构象。后来的X-射线结晶学和序列数据显示141个氨基酸中多达137个不同的蛋白质也可以有相同的功能构象。对抗溶菌酶抗体和抗独特位中的独特位-抗独特位复合物的结晶结构的研究证明一独特位由13个氨基酸残基组成，其中大部分氨基酸残基来自互补决定区，但也包括来自其VL功能域的第三框架区的3个残基，这些残基中的七个与抗溶菌酶抗体的互补位相同，提示在独特位和抗原结合位点之间有一显著重叠。独特型在免疫应答的鉴别和操作中已成为一独特的工具，因为已发现并认识到其可作为追踪B细胞发育、体细胞突变和B细胞克隆成功与否的克隆标记物。它们已被用作细菌V基因的表型标记。携带外来病原体如病毒、细菌或寄生虫的内像的抗独特型抗体已被用作疫苗的代用抗原并且正被用于治疗B细胞淋巴瘤和自身免疫疾病如脑脊髓炎。另外，还显示抗独特型抗体可以诱导T细胞应答，所述应答由识别原始抗原的毒性T细胞或T辅助细胞产生。
由于衣原体是细胞内部寄生虫，所有目前的试验强调从待测试样品中收集细胞材料的重要性。当使用这些试验时，在进行免疫学试验时需要提取方法以从细胞材料中分离衣原体抗原，因此目前使用的衣原体诊断试验是基于检测主要外膜蛋白(MOMP)或脂多糖(LPS)的存在。目前可用的用于MOMP的诊断程序是不理想的，因为其缺乏灵敏性和特异性。而基于LPS的诊断试验也是不理想的，因为LPS仅以很少的量存在，而需要浓缩LPS的程序是复杂的。另外，基于细胞材料的诊断试验因为其需要费时的细胞培养步骤以及需要费时且复杂的处理细胞材料步骤所以是不希望的。
在Current Microbiology，卷28，85-90页，1994中还建议了一种针对被衣原体感染的细胞的诊断试验，其基于从被衣原体感染的培养细胞中产生的GLXA，尽管这一GLXA诊断分析方法被证明对于分析得自细胞培养物的GLXA是有用的，但是没有确定这一分析方法对于分析体液如尿或血清中的GLXA是否有用。
虽然诊断体液中GLXA抗体的存在的方法能用于确定是否动物或人曾被衣原体感染过，但是它不能确定在诊断时动物或人是否被衣原体感染。
因此，需要提供一种特异而灵敏的衣原体诊断试验，另外，还需要这种诊断试验适合于衣原体的所有血清型，再者，需要这种试验对于不需裂解细胞而能在动物和人的细胞外生物学液体中发现的一种衣原体抗原是灵敏而特异的。这种试验能避免培养或处理细胞。
附图的简要描述
图1是豚鼠抗血清与单克隆GLXA-Ab1的结合曲线。
图2是豚鼠抗单克隆GLXA-Ab1IgG抗血清与正常小鼠IgG在免疫吸附之前和之后的结合曲线。
图3是示出单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合被吸收的豚鼠抗独特型抗血清抑制的曲线。
图4是示出豚鼠抗独特型IgG的组分的曲线。
图5是示出单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合被豚鼠抗独特型同种型抑制的曲线。
图6是示出兔抗抗独特型抗体与豚鼠抗独特型IgG的结合的曲线。
图7是示出兔GLXA-Ab3对单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的抑制的曲线。
图8是示出对来自灵长目动物的衣原体特异性核糖体RNA的检测的曲线。
图9是示出由临床疾病评分评价的GLXA-Ab3IgG对眼部感染的作用的曲线。
图10是示出一杂交瘤克隆对单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的抑制的曲线。
图11是示出衣原体患者抗血清与单克隆GLXA-M Ab2的直接结合的曲线。
图12是示出兔抗衣原体抗血清识别单克隆GLXA-M Ab2的曲线。
图13是示出通过用单克隆GLXA-M Ab2免疫接种而保护小鼠不被衣原体感染的曲线。
图14是在高剂量眼部感染后单克隆GLXA-Ab3IgG的保护作用曲线。
图15是示出明矾对小鼠衣原体感染的保护作用的效果的曲线。
图16A和B示出在用单克隆GLXA-Ab2免疫接种后眼部感染率随时间的变化的曲线。
发明概述
本发明基于下述发现：即用于检测人或动物中衣原体存在与否的诊断试验可以通过使用人或动物的胞外生物学液体如尿、眼泪、唾液、鼻咽流体、宫颈刮液或阴道刮液来进行。用针对GLXA的独特型抗体(以下称为GLXA-Ab1)或者抗抗独特型抗体(以下称为GLXA-Ab3)测试所述的胞外生物学液体中是否存在GLXA，所述的抗抗独特型抗体是针对GLXA-Ab1的抗独特型抗体(以下称为GLXA-Ab2)的抗体。根据本发明，已发现直接得自人或动物的胞外生物学液体可以用于分析是否存在GLXA，GLXA是所有已知形式的衣原体的灵敏而特异的标记物。本发明的诊断用途可以以任一种模式使用，包括直接分析、间接分析、竞争分析或夹心分析。因此，本发明的诊断试验提供了优于现有技术测试的实质优势，现有技术测试中需要来自待测人或动物的细胞材料。
具体实施方案的描述
可以用任何现有的方法得到并纯化GLXA，因此，GLXA可以在一辛基琼脂糖凝胶柱上用醇洗脱而分离，或者在DEAE琼脂糖凝胶中用低pH的水溶液洗脱而分离，或者在聚丙烯酰胺珠柱上用低pH的KSCN水溶液(5M)洗脱而分离。在一优选的方法中，GLXA从感染的细胞培养物上清中用现有的方法获得及提纯，所述的方法例如在一Sepharose 6B-Cl柱上在0.075M磷酸盐、0.154M NaCl，pH7.2中排阻层析，GLXA出现在柱的前部组分中并通过应用丫啶翁酯缀合的单克隆抗体GLXA-Ab1的化学发光分析法检测。含有GLXA的组分通常被核酸而不是蛋白质污染，合并GLXA组分，浓缩并用RNase和DNAase在pH8.0于37℃处理2小时。在相同柱上再次层析混合物，从而变为纯的GLXA，其可在4℃贮存(加或不加防腐剂)。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，在生产单克隆抗体时，通过用GLXA或衣原体细菌作为抗原免疫动物(通常为小鼠)而提供独特型抗体GLXA-Ab1，随后鉴别、分离动物的免疫脾细胞，并与淋巴瘤或骨髓瘤细胞融合，融合采用融合试剂如聚乙二醇通过例如Kohler&Milstein，Nature 256：459，1975所述的程序进行。然后在选择培养基如HAT培养基中培养融合的细胞，所述的培养基能阻止未融合的恶性细胞的生长。通过有限稀释克隆杂交瘤细胞，并分析上清中分泌的单克隆抗体的希望的特异性。一种生产GLXA-Ab1的合适的杂交瘤已保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC
H.B.11300。单克隆抗体还可以通过体内腹水培养杂交瘤而获得。或者，可以将淋巴细胞与Epstein-Barr病毒接触而使之无限增殖化。独特型抗体GLXA-Ab1能用于生产GLXA-Ab2，GLXA-Ab2在抗衣原体感染的免疫中或中和衣原体感染中有令人吃惊的活性。另外，GLXA-Ab2不是种特异性的，而是属特异性的，因此其免疫和中和活性在许多动物物种中均是有用的。单克隆GLXA-Ab2还可以通过上述用于生产GLXA-Ab1的使用杂交瘤的方法生产，只是使用GLXA-Ab1作为抗原。一种生产GLXA-Ab2的合适的杂交瘤已保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC
H.B.11301。GLXA-Ab2还可作为多克隆抗体生产，并且作为多克隆抗体其在抗衣原体感染的免疫中或中和衣原体感染中有活性。多克隆抗体可以任何常规方式制备，其中第一种动物用GLXA作为抗原进行免疫并从动物血清中分离多克隆GLXA-Ab1。然后将多克隆GLXA-Ab1或单克隆GLXA-Ab1注射进与第一种动物不同种的第二种动物中，然后从第二种动物的血清中分离多克隆GLXA-Ab2。
本发明中可使用任何常规的测试程序，包括放射免疫分析、酶联免疫吸附分析、荧光分析、化学发光分析、竞争免疫分析、膜基免疫分析、沉淀、凝集、抗原捕获等等。
尽管本发明可以用于直接测试胞外生物学液体，但是应理解的是本发明还可用于测试从人或动物得到的细胞中的衣原体，可以确定其中是否存在GLXA。然而，优选的是测试胞外生物学液体，因为与使用含需裂解的细胞的样品相比其可以相对简单的操作步骤实现分析。
标记抗体Ab1或Ab3或其Fab片段可以用来与胞外生物学样品直接相互作用以与样品中存在的任何GLXA形成结合复合物，在样品中存在的GLXA浓度通过测量形成的抗原(GLXA)-抗体复合物(如果有的话)中的可检测标记的浓度来确定。或者，GLXA的浓度可以通过使用常规的竞争分析来确定，在竞争分析中，Ab1或Ab3基抗体可以与未知浓度的GLXA和已知浓度的Ab2或Ab2的Fab片段相互作用。样品中的GLXA浓度还可以间接用标记的Ab2或Ab2的Fab片段确定，在这一程序中，任何存在的GLXA首先与Ab1或Ab3或其Fab片段形成复合物，然后标记的Ab2或Ab2的Fab片段与复合物相互作用以形成含有可检测标记的第二复合物。
一个优选的诊断程序是：
直接夹心分析
其中固定化的Ab1或Ab3或其Fab片段捕获胞外生物学液体样品中存在的任何GLXA，然后通过标记的Ab1或Ab3或其Fab片段的相互作用以及测定形成的抗原(GLXA)-抗体复合物(如果有的话)中的可检测标记来确定结合的GLXA的浓度。
下述实施例描述了本发明但非限制本发明。
实施例1
本项研究中使用了砂眼衣原体的两种血清型，血清型B(株Har36)生物体最初分离自一儿童的结膜擦拭术，其在McCoy细胞单层上用补加Hank’s平衡盐溶液的Eagle’s最低基本培养基(HMEM，Whittaker，MD)于37℃培养，并在补加10％二甲亚砜(SigmaChemical Co.，MO)的相同培养基中于-70℃贮存。血清型C(TW-3)在McCoyx细胞中在团块组织培养物中生长。通过肾造影剂(renograffin)离心纯化原体并重悬于磷酸缓冲盐水中，在-70℃贮存。
不携带衣原体的Hartley系近交豚鼠最初得自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)，在动物房中繁殖生长。在本项研究中使用1岁雌性豚鼠。
不携带巴斯德氏菌的雌性新西兰兔得自Mill Broock农场(Hadly，MA)，在收到时兔重约6-8磅并在一周内使用。BALB/cByJ(H-2d)小鼠得自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。年轻成年猕猴(
Macacca
fasicularis)得自Charles River Primates，Inc.(PortWashington，NY)，其未患临床眼疾。所有的灵长目动物均用砂眼衣原体血清型C原体进行眼部感染，其中一些灵长目动物已预先用一衣原体蛋白免疫。在本项研究中攻击的灵长目动物是无病的并且不是免疫的，将它们在开始实验前进行随机化。所有步骤均在麻醉下进行。
多克隆抗独特型抗体的生产
为生产多克隆抗独特型抗体，用在1ml水加1ml Maalox Plus悬浮液(William HRoger，Inc.，PA)中的150微克单克隆GLXA-Ab1(89MS30)IgG皮下免疫六只豚鼠中的每一只。三周后用在1mlMaalox(氢氧化铝，明矾)和水中的100微克单克隆GLXA-Ab1对豚鼠强化免疫，并且以月为单位强化免疫。
为生产抗抗独特型抗体，用在1ml明矾和1ml水中的300微克吸收的抗独特型豚鼠同种型IgG-1在多个位点真皮内免疫3只兔子并在3周后用相同程序强化免疫，随后以月为间隔强化免疫。为生产单克隆抗独特型抗体GLXA-Ab2(91 MS441)，将50微克KLH缀合的单克隆GLXA-Ab1IgG与等量弗氏完全佐剂(Sigma，MO)一起腹膜内注射进5只9周龄雌性BALB/cByJ小鼠中，在第14天用同样量强化免疫，随后以周为单位在弗氏不完全佐剂的存在下强化免疫5周。最后一次强化免疫注射后3天取出脾。
通过蛋白A亲和层析分离单克隆GLXA-Ab1 IgG，含单克隆GLXA-Ab1 IgG的腹水首先在4℃，2000rpm离心10分钟，然后使之流过玻璃棉以除去脂类和沉淀物。用2ml蛋白A SepharoseCL4B(ZYMED，CA)填充的亲和柱(1.5×9cm)首先在结合缓冲液(1.5M甘油，3M NaCl，pH8.9)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，PA)中平衡。将用等量结合缓冲液稀释的2ml腹水以0.6-0.8ml/分钟上样到柱中，静置柱约30分钟以进行结合，然后用约3个柱床体积的结合缓冲液洗柱。用0.1M柠檬酸，pH3将结合的IgG洗脱到含有50微升0.1M TBS，pH8.0的玻璃管中以平衡pH。用在280nm的吸收检测IgG。将吸收值大于0.1的组分合并并对0.075M PBS，pH7.2透析过夜。分离的IgG的纯度在一PhastSystem(Pharmacia，NJ)中经SDS PAGE证实。
用单克隆Ab1IgG免疫的豚鼠的特异应答通过直接酶联免疫吸附分析检测。带有Immulon 2可拆卸横隔的96孔板(Dynatech，RI)每孔用在pH9.6的包被缓冲液(0.015M NaHCO3，0.3M甘油，0.02％NaN3，0.06M聚乙二醇)中的0.4微克单克隆Ab1 IgG包被，将板在4℃贮存过夜。每个板用在0.075M PBS中的0.05％Tween 20洗3次并用1％ BSA/PBS在室温封闭2小时。再次洗板3次。将来自豚鼠的预免疫血清或抗血清用0.075M PBS系列稀释，将100微升每个稀释度样品以双份加入到每个孔中，将混合物在室温保温1小时并洗板。加入山羊抗豚鼠IgG(H&L)辣根过氧化物酶缀合物(JacksonImmunoResearch Labs，Inc.PA)1∶1000，保温1小时并洗板。洗板后加入TMB底物(Kirkegaard and Perry Laboratories，MD)。用Vmax微孔阅读器(Molecular Devices Corp.，CA)测定405nm处的吸收值。以相似方式分析来自用豚鼠IgG-1免疫的兔的抗血清，每个板用豚鼠IgG-1包被，第二抗体是山羊抗兔(H和L)辣根过氧化物酶缀合物(Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.PA)。
如厂商建议将正常小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.PA)与Affi-Gel 10(Bio-Rad Laboratories，CA)缀合。简单地说，将5ml Affi-Gel 10浆液转移到与抽吸器相连的玻璃填充漏斗中，用3个床体积的异丙醇洗涤，然后用3个床体积的冰冷去离子水洗涤。在一烧瓶中将10ml正常小鼠IgG(5mg/ml)与Affi-Gel 10混合，在4℃经轻度过夜振荡而进行偶联。用偶联的凝胶填充柱(0.9×5ml)并用0.075M PBS，pH7.2洗柱。监测流出液在280nm处的UV吸收值。通过Bradford分析(Bio-Rad Laboratories，CA)测定最高吸收值部分的蛋白含量以评价缀合。
通过亲和层析将免疫后3、4和5周的合并的一只豚鼠的抗血清吸收至一正常小鼠IgG-琼脂糖柱，该柱的制备如上所述。将约1个外水体积的抗血清上样到柱中并在4℃保温30分钟并用0.075MPBS，pH7.2洗脱。用新制备的柱再次吸收抗血清。
将已被正常小鼠IgG吸收的5ml豚鼠抗血清上样至蛋白A缀合的琼脂糖柱中，用0.02M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH7.3洗柱。用4.9的分步pH梯度分别洗脱豚鼠免疫球蛋白亚类IgG-1和IgG-2直至在流出液中检不出蛋白质。然后用低pH梯度，4.3，洗脱柱。在对0.02M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH7.3透析后，将每种同种型进行第二轮亚类分离。
单克隆抗独特型抗体(单克隆GLXA-Ab2)的生产和鉴定
如上所述从蛋白A层析柱中分离单克隆Ab1(89MS30)IgG。通过使用戊二醛进行匙孔嘁血蓝蛋白缀合。简单地说，将1.5mg IgG与0.05mg KLH(Sigma Chemical Co.，MO)在等体积的在PBS中的0.2％戊二醛中混合(KLH的每50个氨基酸约1M IgG)，在室温下轻度搅拌保温。1小时后加入1M甘油使其终浓度为0.02M并在室温下再保温1小时。然后将缀合物对PBS透析过夜。
最后一次加强免疫(见免疫接种)4天后，从具有最高效价的两只小鼠中分离脾细胞，根据最初由Kohler and Milstein(Nature，1975)开发的并经修饰的(Goldsby，制备核酸及单克隆抗体探针中的杂交瘤实用指南，Swaminathn & Prokask，Deller，N.Y.编辑，367页，1989)技术，与小鼠骨髓瘤细胞系Sp 2/0-Ag14制备融合体。饲养细胞层来自8周龄小鼠的脾。
用夹心ELISA(Uytdehaag et al.，免疫学杂志134：1225，1985，Hiroshima et al.，免疫学杂志144：224，1990)检测来自免疫小鼠的抗独特型抗血清和来自克隆细胞的上清。简单地说，用100微升在0.1M碳酸盐缓冲液pH8.9中的1微克单克隆Ab1IgG在4℃包被聚苯乙烯Immulon II微滴定板(Dynatech Laboratories，Inc.，VA)过夜，除去未结合的IgG并用3％BSA/PBS在37℃封闭孔1小时，洗涤后加入系列稀释的抗血清或100微升来自带有杂交瘤细胞的孔的培养物上清，在37℃保温1小时并洗涤后，向每孔中加入1微克生物素缀合的单克隆Ab1IgG，通过加入链亲和素-辣根过氧化物酶(Jackson Immune Research Labs.，PA)检测反应性，1小时后加入TMB过氧化物酶底物(Kirferggaard & Perry laboratories，Inc.，MD)。在一微板阅读器中读取405nm处的吸收值。使用融合前提取的免疫血清(1∶10稀释)及培养基分别作为阳性和阴性对照。
通过如上所述的免疫化学发光分析测定小鼠抗血清和克隆上清对单克隆GLXA-Ab1结合GLXA的抑制作用。
10只BALB/cByJ小鼠用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷，Sigma Chemical Co.，MO)注射，每只小鼠腹膜内注射1ml。10天后用约2×106个产生单克隆GLXA-Ab2(91 MS441)的杂交瘤细胞注射小鼠。约10天后用一Vacutainer 20 G血液收集针头(BectonDickinson，NJ)收集腹水，2000rpm离心10分钟澄清腹水并在-20℃贮存备用。
通过ELISA进行同种分型(isotyping)。用来自克隆91 MS441的上清(100微升)包被每个孔并在4℃保温过夜，洗涤后用3％BSA/PBS封闭2小时。向每孔中加入100微升特异于小鼠亚类：IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM，IgA，K链或λ链的兔抗血清(Bio-RadLaboratories，CAA)，以双份平行进行添加。将板在室温保温1小时，通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔(H和L)及TMB底物(Kirferggaard & Perry laboratories，Inc.，MD)检测兔抗血清。
在一蛋白G-琼脂糖柱上通过亲和层析纯化单克隆GLXA-Ab2IgG，用蛋白G-琼脂糖4B(Zymed，CA)(5ml)填充一0.5×9cm柱。用0.02M磷酸盐缓冲液pH7.3 1∶1稀释腹水(2ml)并上样到柱中，用相同缓冲液洗柱直至检测不到蛋白质。用0.1M柠檬酸-甘油缓冲液pH2.6洗脱结合的IgG，将洗脱液收集成1ml组分，其中含50微升1M tris盐水缓冲液pH8.0。合并UV吸收值超过0.1的组分并在PBS中于4℃透析过夜。纯化的IgG用SDS-PAGE鉴定证实。
通过ELISA检测来自诊断患有衣原体感染的人患者的多克隆抗体以及来自用衣原体EB注射的兔的多克隆抗体对单克隆GLXA-Ab2的识别。所用程序基本上与上述程序相同，有几点例外。简单地说，ELISA板的每个孔不加包被缓冲液而用在0.075M PBS中的1微克单克隆GLXA-Ab2于4℃包被过夜，用在0.075M PBS中的0.05％Tween 20洗孔并用3％BSA/PBS在室温封闭2小时。以双份向每孔中加入100微升系列稀释的患者血清(92MS273)、对照人血清(88MS356)、兔抗血清(88MS188)或对照兔血清(92MS450)，在室温保温1小时后，洗孔3次并加入100微升过氧化物酶缀合的山羊抗人或山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Labs，MD)，保温1小时后加入TMB底物。在一Vmax微板阅读器(MolecularDevices Corp.，CA)中读板。
通过如上所述相同方法进行免疫斑点印迹分析，一点不同是用在0.075M PBS中的纯化的GLXA(100微升)包被PVDF膜的每一道。用3％BSA/PBS系列稀释取自用单克隆GLXA-Ab2IgG或正常小鼠IgG免疫的小鼠的抗血清。第二抗体是辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG(H和L)。用Kodak TMAX 100照相。斑点印迹的染色强度用光密度计扫描。
抗原的产生
在2升摇瓶(Corning，PA)中在McCoy细胞单层上用添加L-谷氨酰胺(终浓度0.5mM)、NaHCO3(终浓度0.4mM)和10％胎牛血清(FBS)的HMEM培养砂眼衣原体血清型B(Har.36)原体。简单地说，在单层细胞汇合后从瓶中除去培养基，然后接种在添加L-谷氨酰胺和FBS的40ml环己酰亚胺覆盖培养基(COM)(Whittacker，MD)中的0.5-3.0mlEB悬浮液(根据生物体的密度而定)，并在35℃以3rpm摇瓶。2小时后，加入200ml COM并继续摇瓶48-72小时。离心除去生物体和任何细胞碎片后获得上清。
通过两个步骤从上清中纯化GLXA，首先，将上清流过辛基-琼脂糖CL4B柱并用95％乙醇洗脱(Stuart and MacDonald，CurrentMicrobiology，11：123，1984)。将在乙醇中的抗原(抗原含量相当于50ml重度感染的组织培养物上清)浓缩至约50微升并重悬于0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5中至1ml。然后，将如此制备的抗原进一步经亲和层析纯化，亲和柱的制备根据厂商指导通过将单克隆GLXA-Ab1IgG与Affi-Gel 10(Bio-Rad Laboratories，CA)缀合而进行。离心样品并上样至亲和柱，在4℃保温30分钟，用0.1M磷酸盐缓冲液洗柱直至洗脱液变清。GLXA用约15-20ml5M硫氰酸钾(KSCN，Mallinckrodt Inc.，KY)洗脱下来，并对0.075M PBS透析过夜。
在下述通过GLXA-Ab3进行的对GLXA和单克隆GLXA-Ab3的结合的免疫印迹分析中所用的GLXA通过大小排阻方法分离用0.075M PBS平衡琼脂糖CL-CB柱(2×100cm)。来自砂眼衣原体血清型F细胞培养物的上清首先以5000rpm离心除去细胞碎片，并将约20ml上样至柱，流速为0.5ml/分钟。在洗脱液中的GLXA用Magic Lite分析仪(Ciba Corning Diagnostic Corp.，MA)检测。程序如下所述。
豚鼠GLXA-Ab2或兔GLXA-Ab3(抗血清，IgG，IgG同种型)对单克隆GLXA-Ab1IgG与GLXA的结合的抑制通过化学发光免疫分析经Magic Lite分析仪(Ciba Corning Diagnostic Corp.，MA)检测。用于抑制的程序如下：用试剂A(Ciba Coming)以1∶5稀释亲和纯化的GLXA，混合并等分至塑料管中(200微升/管，Sarstadt，NJ)。向每管中加入100微升中和溶液试剂B(CibaCorning)并混合均匀。向每个上述管中加入系列稀释的豚鼠GLXA-Ab2或兔GLXA-Ab3IgG(50微升)并在室温保温。1小时后向混合物中加入在1％BSA/PBS中的100微升丫啶翁酯(acridiumester)标记(AE标记的)单克隆GLXA-Ab1 IgG(介于220,000-240,000相对光单位，RLU)，并保温1小时。然后向每管中加入与顺磁颗粒共价结合的多克隆抗衣原体抗体(500微升)并再保温1小时，通过将混合物置于磁场中将结合的免疫复合物(顺磁颗粒-GLXA-GLXA-Ab1-AE标记的单克隆GLXA-Ab1IgG)与未结合的分开。洗颗粒3次，结合的AE标记的抗体通过Magic Lite分析仪测量并记录RLU。对结合的抑制作用的百分数如下计算：
其中对照代表PBS，测试代表免疫前或加入的抗血清(或IgG)。
使用Bio-Rad斑点印迹装置进行直接分析。用亲和纯化的GLXA或衣原体rLPS在4℃包被0.45μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜Immobilon-NC(Millipore，MA)18小时，然后用在0.075M PBS缓冲液pH7.2中的0.05％Tween 20洗膜，用3％BSA/PBS在室温封闭2小时。洗膜后，加入系列稀释的兔GLXA-Ab3IgG(90MS699)(通过蛋白A亲和层析分离，方法见上述)或单克隆Ab1 IgG(89MS30)(每孔加100微升)，在室温保温2小时，然后洗去未结合的IgG。从装置中取出PVDF膜并用3％BSA/PBS轻轻振荡封闭2小时，然后用1∶1000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(H和L)或兔抗小鼠IgG(H和L)(Jackson ImmunoResearch Labs.，PA)在室温探查1小时。通过在培养皿中振荡洗4次，每次5分钟除去未结合的缀合抗体。通过4 CN(4-氯-1-萘酚)膜过氧化物酶底物系统(Kirferggaard & Perrylaboratories，Inc.，MD)检测结合作用。分析以双份重复进行。
单克隆GLXA-Ab1或兔GLXA-Ab3 IgG用生物素标记，简单地说，首先在4℃将GLXA-IgG对0.1M硼酸钠pH8.8透析4小时，然后按每毫克IgG加入200微克生物素酰胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma Chemical Co.，MO)，在室温保温4小时，最后按每250微升酯使用20微升1M NH4Cl在室温保温10分钟以终止反应。将标记的IgG在4℃对0.075M PBS透析3天。
将汇合的McCoy细胞单层在24孔板(Falcon，NJ)中于盖玻片上培养24小时，除去每孔中的培养基，然后加入200微升砂眼衣原体血清型B原体(Har 36)或200微升HMEM，包涵体形成单位(IFU)约为1000/200μl，加入完毕后立即向每孔中加入200微升添加L-谷氨酰胺和FBS的环己酰亚胺覆盖培养基(COM)，将混合物在37℃保温2小时后每孔培养基用1ml COM替换。然后在5％CO2湿培养箱中于37℃培养板48小时。
培养后，用0.075M PBS洗细胞盖玻片2次，每次5分钟，然后用吸水纸小心擦盖玻片以除去盖玻片上的缓冲液。随后向盖玻片上加入400微升50μg/ml生物素标记的单克隆GLXA-Ab1或400微升1.20mg/ml生物素标记的GLXA-Ab3并于37℃保温1小时，用PBS洗盖玻片2次(每次5分钟)。加入400微升在1％BSA/PBS中的荧光素-链亲和素1∶50并保温1小时，如上所述除去未结合的荧光素-链亲和素。用设在Zeiss A7082 Oberkichen显微镜上的Olympus 25，35mm相机(ASA 400 TMAX黑白柯达胶卷)在12v/100z卤素灯照明下照相检测荧光。
用GLXA-Ab3(90MS699)在体内中和衣原体
将兔免疫前和GLXA-Ab3IgG，正常小鼠和单克隆GLXA-Ab3IgG过滤除菌。将这些IgG(0.2mg/ml)分别与砂眼衣原体血清型C(TW-3)原体(200包涵体形成单位/20μl)混合(1∶1)，将混合物和未处理的原体(用作对照)在37℃保温45分钟，每15分钟轻振一次。
保温后，将20μl的2μg IgGr+1000IFU接种到8只猴子的每只眼的下穹隆上，其中四只猴子接种GLXA-Ab3IgG+EB，两只猴子接种免疫前IgG+EB，两只猴子只接种EB。与此同时，用100μl每种类型的混合物感染在48孔组织培养板中的10个孔中的2天McCoy细胞单层盖玻片以确定接种物的感染性。培养方法如下所述。
在接种前一天、接种后2、6、9、13和20天通过擦拭下睑板和下穹隆、侧穹隆、上睑板和上穹隆以及中穹隆取结膜擦拭标本，擦拭标本立即浸入2ml收集培养基中并通过在收集培养基中倒置振荡2分钟破碎。
首先通过在收集培养基中倒置振荡2分钟破碎结膜擦拭标本以从擦拭标本中收集EB，然后将200微升这种培养基接种到McCoy细胞单层盖玻片上。将细胞在48孔组织培养板中培养2天，每种样品使用5个孔。为进行体外中和实验，对于每一样品，将100微升混合物接种到10个孔中的单层盖玻片上，然后将接种的板在室温于1000g离心1小时。将板在37℃保温2小时并用1ml在COM中的10％FBS(Whittaker，MD)替换培养基。在5％CO2湿培养箱中将板在37℃培养48小时，培养后从每孔中吸取培养基。用0.075M PBS洗单层盖玻片1次，用乙醇固定5分钟，然后用水洗2次。每孔中加入25微升带有Evans蓝负染料的荧光素标记的兔抗衣原体单克隆抗体(Syva，Co.，CA)，并在37℃保温30分钟，保温后用水洗孔2次，用固定液将盖玻片固定到每孔中。通过将板倒置在荧光显微镜上计数包涵体。
将来自感染的灵长目动物的每只眼的结膜擦拭标本压到用醇预清洁的玻片上，空气干燥玻片并用冷丙酮固定5分钟，然后干燥玻片并覆盖30微升带有Evans蓝负染料的荧光素标记的单克隆抗体试剂(MicroTrak Chlamydia Direct Reagent，Syva Co.，CA)。保温在有盖的湿箱中进行，15分钟后倾斜玻片除去过量的染料并用去离子水洗10秒钟，空气干燥玻片。在每一玻片上用固定介质(Syva，Co.，CA)覆盖一盖玻片并用指甲油密封。在荧光显微镜下以500倍和1250倍检测玻片，以半定量尺度0-4+记录感染滴度：0代表阴性，0.5代表在第一代为阴性而在第二代任何程度均为阳性，1代表在第一代每孔中有1-9个包涵体，依此类推。
每只眼睛的临床反应按十种临床症状分级(Taylor et al.，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.29：847，1988)：结膜充血的腰、四肢、上睑板、上穹隆和下穹隆部分的滤泡反应，或者延髓、上睑板、上穹隆和下穹隆的注射以及眼排泄物。结膜炎症的10种症状中每一种的临床反应按0-3分级以得出每只猴子的总炎症级别分。检查者不知猴子的分布。用级别分的平均值描述一组猴子的反应。
从取自在攻击前一天及在攻击后2、6、9、12和20天的GLXA-Ab3或正常兔IgG处理的猴子的结膜擦拭标本样品制备总RNA。擦拭标本样品首先在含50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)h1％SDS的缓冲液中的65％苯酚中均质，沉淀RNA并重新溶于相同缓冲液中。这一RNA制备物用苯酚∶氯仿(3∶1)中抽提几次，重悬并用DnaseI充分处理。在甲醛-琼脂糖凝胶上分离后RNA制备物的质量用溴乙锭-UV显影来监测。
所用探针是含有16S和23S核糖体RNA及侧翼序列的DNA片段，该DNA片段从衣原体基因组质粒克隆pL2，434Scl-1A(Cheemaet al，The Amer.J.Med.Sci.302：261-268，1991)切下。使用32PdCTP，800Ci/mM(Amersham Corp.，IL)通过缺口翻译标记该DNA片段，所有限制片段的比活性约为106cpm/ug DNA。每一印迹上的狭线包括1微克猴或人来源的总RNA，10pg纯砂眼衣原体或C血清型RNA(阳性对照)，3微克酵母或大鼠RNA，缓冲液以及1微克来自在感染前从每一只猴子提取的擦拭标本的RNA(阴性对照)。将RNA固定于0.22μm滤膜(Schleicher and Schuell Corp.，NH)。杂交结果用X-OMAT AR胶卷(Kodak，New York)在-70℃放射自显影而观察。
接种和采标本
将5000/20μl砂眼衣原体血清型C(TW-3)原体接种到小鼠的每只眼上，小鼠已用单克隆Ab2或正常小鼠IgG免疫。在接种前1天以及在接种后7、10、14、21、28和35天，从每只眼的结膜取擦拭标本。区域包括下睑板和下穹隆、侧穹隆、上睑板和上穹隆以及中穹隆，将结膜擦拭标本立即浸入收集培养基中并倒置振荡破碎2分钟，置于冰上直至培养。
多克隆抗独特型抗体的检测和鉴定
用于在豚鼠中产生抗独特型抗体的免疫原是鉴别为89MS30(单克隆GLXA-Ab1)的单克隆抗体，其最初通过用在鸡胚中培养的衣原体原体免疫BALB/cByJ小鼠而产生，将小鼠脾细胞与Spa/0-Agl4骨髓瘤细胞融合并筛选克隆。通过EIA得知克隆(89MS30)与砂眼衣原体的所有15个血清型，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体6BC以及小鼠脑膜肺炎反应，证明其是一属特异性抗原。使用兔抗小鼠抗血清(Bio-Rad Laboratories，CA)通过ELISA将该IgG定为IgG2b。用rec蛋白A琼脂糖4B缀合柱(ZYMED，CA)从腹水中分离单克隆GLXA-Ab IgG。在Maalox用作佐剂的条件下每次用150微克单克隆GLXA-Ab1 IgG免疫和强化免疫近交豚鼠(Hartley 13)。通过心脏穿刺获得免疫前血清和抗血清并离心。通过ELISA表明5只免疫豚鼠具有针对单克隆Ab1 IgG的强免疫应答，在第一次强化免疫1周后发现抗单克隆GLXA-Ab1 IgG的效价超过1-20,000，如图1所示这些豚鼠抗血清在强化免疫后两周均保持增加。
为除去针对单克隆Ab1 IgG分子的超变区上存在的非独特位的其它表位的豚鼠抗小鼠抗体，用正常小鼠IgG吸收豚鼠抗血清，吸收通过亲和层析进行。通过将正常小鼠IgG与Affi-Gel 10缀合制备柱，通过检测在280nm处吸收值的未结合蛋白的量评价缀合，组分的最高光密度是0.23，Bradford分析(Bio-Rad Laboratories，CA)测量含有0.18mg蛋白质，在缀合中使用的总小鼠IgG是50mg，表明缀合是成功的。将豚鼠抗血清上样至柱上并用0.075M PBS pH7.2洗脱，用一新制备的柱重复这一程序。测试吸收前和吸收后的抗血清并与免疫前血清比较与正常小鼠IgG的ELISA反应性，对用于分析的每种抗血清的浓度进行标准化。结果显示吸收后的血清与免疫前血清具有相同的与正常小鼠IgG的反应性(图2)。未吸收的抗血清有高5倍的反应性，表明特异于非独特位的表位的所有抗体均已完全除去。
如果豚鼠抗血清含有针对单克隆GLXA-Ab1 IgG分子的特异抗独特型抗体，那么其直接的作用就是抑制抗原GLXA与单克隆抗体GLXA-Ab1的结合，换句话说，抗血清与单克隆GLXA-Ab1 IgG的互补决定区结合，从而防止GLXA与该活性位点的结合。为测试这一点，通过化学发光免疫分析进行竞争结合。将系列稀释的豚鼠免疫前血清、未吸收的抗血清或吸收的抗血清与通过免疫亲和层析分离的GLXA保温，室温1小时后，将混合物与用丫啶酯缀合的单克隆GLXA-Ab1 IgG再保温1小时，加入固相顺磁颗粒并测定RLU。如图3所示，当豚鼠抗血清以1∶40稀释时，单克隆Ab1与GLXA的结合的95％被未吸收的抗血清和吸收的抗血清抑制，而免疫前血清仅抑制15％。另外，在等价蛋白浓度未吸收的抗血清具有与吸收的抗血清几乎相同的抑制作用，表明吸收作用没有除去任何抗独特型抗体。因此，在豚鼠中产生了竞争性抗独特型抗体。
以前的实验表明豚鼠抗独特型的不同同种型引发对独特型产量的不同作用。IgG-1同种型增强独特型的产量，而IgG-2同种型抑制独特型克隆。为测试豚鼠抗独特型IgG的不同同种型的抑制作用，从吸收的豚鼠抗独特型抗血清中分离IgG亚类。使用逐步pH梯度的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。在一蛋白A亲和柱上分离IgG-1和IgG-2。同种型IgG-1和IgG-2的洗脱曲线如图4所示，通过免疫电泳(IEP)鉴别每一个峰，使用山羊抗豚鼠IgG(Bethyl，TX)沉淀条带。由IgG-1组成的第一个峰通过山羊抗豚鼠抗血清形成单一的条带。然后用相同方法再纯化第一个峰。
再次使用豚鼠抗独特型抗体的IgG-1或IgG-2同种型通过化学发光免疫分析进行不同IgG亚类的竞争，图5显示0.4μg IgG-1能抑制50％的单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合。当使用100μg时发生全部抑制，这基本是当使用未标记的单克隆GLXA-Ab1 IgG时所需的同样浓度。IgG-2显示很小(如果有的话)的抑制作用，用1.0μg约抑制25％的单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合。这些数据证明抗独特型IgG的IgG-1亚类比IgG-2亚类的抑制性至少高5倍。
获得的证据显示豚鼠抗独特型IgG-1是针对单克隆GLXA-Ab1IgG的超变区并抑制其与GLXA的结合。抗独特型抗体的内像的最终标准是在结构上证实Ab2是Ab2β而不是Ab2α。因为Ab2α与免疫球蛋白的框架部分结合，所以其还可以抑制Ab1与关联抗原的结合。为证实豚鼠抗独特型IgG-1是Ab2，用同种型IgG-1生产抗抗独特型抗体(GLXA-Ab3)，其能在从未接触GLXA抗原的动物中识别GLXA表位(Ertl等，美国国家科学进展81：2850，1988)。在佐剂Maalox(明矾)的存在下用豚鼠抗独特型IgG-1免疫接种3只新西兰白兔，通过ELISA用IgG-1测试来自1只兔(S2)的抗血清(图6)，免疫后效价随时间增加。在第二次免疫后三周其效价与免疫前血清相比高很多，效价超过20,000。
使用斑点印迹装置(Bio-Rad Laboratories，CA)检测兔抗血清与GLXA的反应性，测试了来自2只兔的抗血清。由于单克隆GLXA-Ab1与衣原体LPS交叉反应，所以用GLXA和衣原体rLPS包被聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。兔抗血清以高反应性识别GLXA和LPS。当使用来自兔(S2)的IgG(90MS699)时，斑点在每条道0.006微克的浓度下呈阳性，免疫前IgG不反应。从这一抗血清分离IgG并测试其抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的能力，因为由内像GLXA-Ab2产生的GLXA-Ab3应显示类似的结合。这一点如图7所示证实，GLXA-Ab3导致的抑制随浓度而增加，但是与未标记的单克隆Ab1相比，其抑制能力低约5倍。这证明豚鼠抗独特型抗体IgG-1是抗原GLXA的内像。进一步测试GLXA-Ab3IgG体外识别砂眼衣原体的原体的能力。
通过戊二醛将单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3IgG与生物素缀合，将标记的单克隆GLXA-Ab1或GLXA-Ab3与在盖玻片上的McCoy细胞单层保温，所述细胞已用砂眼衣原体血清型B(Har36)原体感染48小时，用未感染的单层作为对照。用单克隆GLXA-Ab1和多克隆GLXA-Ab3IgG对原体的荧光染色图案显示GLXA-Ab3不仅识别GLXA的纯化形式，也识别GLXA的天然形式。GLXA-Ab3IgG(9OMS699)在灵长目动物中中和衣原体感染
下一问题涉及单克隆GLXA-Ab1或GLXA-Ab3中和衣原体原体从而保护宿主细胞不受感染的能力。用于解答这一问题的实验途径是在培养细胞中中和感染以及在灵长目动物结膜中中和感染。
在灵长目动物结膜中的中和作用通过将生物体与抗体IgG预保温并检测对于眼部感染的作用而确定。将单克隆GLXA-Ab1或Ab3的IgG组分与砂眼衣原体血清型C的原体保温，正常小鼠或兔免疫前IgG以及不加免疫球蛋白作为对照。将混合物接种至灵长目动物的每只眼睛中，在接种前1天和接种后1天，通过擦拭结膜的不同区域而提取结膜擦拭标本(如上所述)。通过细胞培养分析确定灵长目动物中的眼部衣原体感染，该分析包括在感染后进行的第二传代。如表1所示，用单克隆GLXA-Ab1处理的EB感染3只灵长目动物的左眼，用GLXA-Ab3处理的EB感染右眼。与此同时，用正常小鼠IgG处理的EB(示作N1)或单独用EB感染2只灵长目动物的左眼或右眼，同样的方法适用于免疫前兔IgG(示作N3)。用单克隆GLXA-Ab1处理的EB接种的所有眼睛至少1次呈阳性(515、84和26号灵长目动物)，然而用GLXA-Ab3处理的眼中仅有1只眼在感染后第10天呈1次阳性，其中两只眼睛从未呈阳性(515、84和26号灵长目动物)。用正常小鼠或免疫前兔IgG处理的EB接种的眼睛至少一次全部呈阳性(563、20、17和329号灵长目动物)。未处理的EB(示作C)在所涉及的4只眼睛中的两只引起感染(563、20、17和329号灵长目动物)。虽然数据点缩减，但是它们确实示出单克隆GLXA-Ab1在灵长目动物结膜中不中和衣原体，另一方面，其暗示GLXA-Ab3是中和性的。为证实GLXA-Ab3确实是中和性的，进行若干试验，包括(A)在细胞培养中中和，(B)在灵长目动物中中和，(C)通过临床培养分析检测，(D)通过直接荧光抗体细胞学检测，(E)衣原体特异性RNA探针杂交，以及(F)通过临床评分确定眼部感染的严重性。
表1
Ab3而非mAb1在灵长目动物结膜中中和衣原体感染
灵长目动物 眼睛 Aba 感染后天数
0 3 7 10 14
515 L mAb1 - - + + -
R Ab3 - - - - -
563 L C - - - - -
R N1 - - - + -
84 L mAb1 - - - + +
R Ab3 - - - + -
20 L N3 - - - + -
R C - - - - -
26 L mAb1 - - + - -
R Ab3 - - - - -
17 L N1 - - - + +
R C - - - + +
329 L C - - + - -
R N3 - - - + +
a用正常小鼠IgG(N1)、免疫前兔IgG(N3)处理的EB或单独的EB作为对照GLXA-Ab3在体外中和衣原体感染
在体外，用GLXA-Ab3和免疫前兔抗体进行细胞培养分析，免疫前兔IgG和GLXA-Ab3(90MS699)IgG由蛋白A亲和层析分离。将10微克每种IgG和100微升血清型CEB(1000IFU/ml)的混合物或EB单独接种到含McCoy细胞单层的孔中，每一样品用10个孔。培养48小时后通过FITC缀合的单克隆抗衣原体抗体检测包涵体。IFU/ml是基于每孔上的15个区域计算。如表2所示，与免疫前IgG相比，Ab3IgG降低感染性的能力高3倍，而与单独使用EB相比降低感染性的能力高5倍，提示GLXA-Ab3有中和作用。
表2
Ab3IgG对衣原体感染的体外中和
用如下物质处理的EB 平均IFU/15个区域+SEM
Ab3 34.1+7.2
正常IgG 93.8+22.4
未处理 155.3+5.5
GLXA-Ab3在灵长目动物中中和衣原体感染
在这一实验中将8只灵长目动物随机分成3组，4只灵长目动物的眼睛给予预先与GLXA-Ab3IgG保温的纯EB(8只眼睛)，2只灵长目动物的眼睛给予预先与免疫前IgG保温的EB(4只眼睛)，2只灵长目动物的眼睛给予未处理的EB(4只眼睛)。在检查当天取结膜擦拭标本并进行细胞培养。因为在接受免疫前IgG和只接受EB的受体之间没有明显的差别，所以实验结果以8只实验组眼睛和8只对照组眼睛的形式提供。细胞培养结果以IFU/ml表示，其基于计数孔中15个区域的包涵体而确定，每个样品测试计数两个孔。如表3所示，在攻击后第3、20天，8只实验组眼睛中的1只呈阳性，而对照组中8只眼睛全部呈阳性。当检查累积结果时，使用GLXA-Ab3，40只眼睛中的9只(22.5％)呈阳性，相反，未使用GLXA-Ab3，40只眼睛中的36只(90％)呈阳性。
表3
通过细胞培养分析a检测Ab3IgG在灵长目动物结膜中中和衣原体感染
实验天数 眼睛培养物阳性数
Ab3 免疫前IgG 无b 合并的IgG对照
0 0/8 0/4 0/4 0/8
2 3/8 2/4 3/4 5/8
6 3/8 4/4 4/4 8/8
9 1/8 3/4 4/4 7/8
12 1/8 4/4 4/4 8/8
20 1/8 4/4 4/4 8/8
9/40 17/20 19/20 36/40
a.仅有一个第1代阴性样品在第2代为阳性
b.EB预先不加抗体保温
在一平行分析中，还进行了直接荧光抗体细胞学分析(DFA)以估算来自结膜擦拭标本中的EB数。将结膜擦拭标本样品固定在玻片上，用FITC标记的针对砂眼衣原体的单克隆抗体染色，当在每个玻片上看到5个或更多个特征性原体时则认为是阳性(Micro Trak，Syva Co.CA)。如表4所示，在GLXA-Ab3处理组中仅在感染后第6天和第12天检出两例阳性，而其余组在第20天之后均呈阳性。在未处理组仅在第2天有一只眼呈EB阴性，这可能是假阴性，在这一组其余实验中在所有眼中均检出EB。在最后1日检查(第20天)中，用GLXA-Ab3处理的眼睛中没有一只呈阳性，而在合并对照组中8只眼睛全部呈阳性。另外，DFA和培养分析结果完全对应。
表4
通过直接荧光抗体细胞计数分析(DFA)a检测Ab3中和衣原体感染
实验天数 眼睛培养物阳性数
Ab3 免疫前IgG 无b 合并的IgG对照
0 0/8 0/4 0/4 0/8
2 0/8 2/4 0/4 5/8
6 1/8 2/4 4/4 6/8
9 0/8 4/4 4/4 8/8
12 1/8 4/4 4/4 8/8
20 0/8 4/4 4/4 8/8
2/40 16/20 19/20 35/40
a.如果玻片上发现4个EB则认为DFA为阳性
b.EB预先不加抗体保温
GLXA-Ab3大大减弱在结膜感染中的衣原体的复制
通过DNA探针已检测了来自那些灵长目动物结膜擦拭标本中的衣原体特异性核糖体RNA(Cheema et al，美国医学科学杂志302：261-268，1991)。从取自灵长目动物眼睛的结膜擦拭标本中提取总RNA，使用来自血清型CEB、人或酵母的RNA作为对照。用编码核糖体RNA 16S和23S基因的32P-衣原体DNA在一Northern狭线斑点杂交分析中检测衣原体特异性RNA。如图8所示，对照眼(用免疫前兔IgG+EB感染或仅用EB感染)在所有检测的时间点上均显示显著水平的衣原体RNA，从GLXA-Ab3处理的生物体的眼中制备的类似的RNA样品显示明显减弱水平的衣原体RNA，提示中和作用发生在感染的非常早的阶段。
通过临床反应评价用下述EB接种后结膜发炎程度，所述的EB为与GLXA-Ab3或免疫前IgG预保温的EB或未经预先保温的EB。临床反应基于从炎症的10个临床特征得出的总临床疾病评分(TCDS)而分级(Taylor等，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.29：1847，1988)。每组灵长目动物中的累积疾病评分通过检查存在于结膜中的10个特征而得到。如图9所示，GLXA-Ab3的接受者几乎不发生临床疾病，在第8天后有所疾病反应，对照动物在感染后21天内持续发生严重疾病。这一病理发现于细胞培养、DFA和RNA杂交数据一致。
产生和鉴定生产抗独特型抗体的杂交瘤细胞系
在弗氏完全佐剂的存在下用KLH缀合的单克隆GLXA-Ab1IgG腹膜内免疫5只同种小鼠(BALB/cByJ)，来自这些小鼠的针对单克隆GLXA-Ab1IgG的抗独特型抗血清用夹心ELISA检测，免疫接种后3周效价约为1∶1000(数据未示出)。用Sp2/0-Agl4细胞和来自具有针对单克隆GLXA-Ab1最高效价的2只小鼠的脾细胞制备融合体，该脾的大小几乎是正常脾的两倍。用相同方法筛选克隆进行小鼠抗血清测试，在所有筛选试验中以1∶10稀释的小鼠抗血清或免疫前血清的集合作为对照，在所筛选的283个孔中有8个被认为对于GLXA-mAb1呈阳性，其效价是阴性对照的两倍或更高倍，克隆这些杂交瘤。其中一个克隆(91MS441)在ELISA中具有最高效价，对其进行繁殖，产生腹水并分离IgG，这一克隆的IgG的同种型被鉴别为IgG1，具有一K轻链(Bio-Rad Laboratories，CA)。融合结果如表5所示。
表5
用于抗独特型抗体的融合体
免疫的 上清中的 具有生长的 抗独特型阳性 稳定的抗独特型
BALB/cByJ 抗独特型 杂交瘤的 的孔数 克隆株
小鼠 效价 总孔数 (％) (总数的％)
2 1∶1000 283 8 1
(2.8) (0.35)
轻链：K 重链：IgG1
通过化学发光免疫分析进一步测试来自阳性克隆的上清抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的作用。对结合的完全抑制在不经稀释的4个克隆的上清中发现，2周后仅发现1个克隆(91MS441)是稳定的。如图10所示，在1∶10的稀释度，来自这一克隆的上清抑制80％的单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合，二来自同一融合体的非阳性克隆(91MS442)的抑制作用为0％。这证明产生了一抗独特型克隆，其被鉴别为单克隆GLXA-Ab2。
作为抗原决定簇的内像，抗独特型抗体应被针对这一表位的任何特异抗血清识别，而不管抗血清来自何种物种。为测试由克隆(91MS441)产生的IgG的这一性质，使用临床诊断为衣原体阳性的人患者的血清。因为单克隆GLXA-Ab2的同种型为IgG1，所以通过蛋白A亲和层析纯化该IgG。用分离的单克隆GLXA-Ab2包被微滴定板并通过ELISA测试其与患者血清(91MS253)的反应性，使用临床未诊断有衣原体感染的人血清(88MS356)用作阴性对照。结果显示患者血清针对单克隆GLXA-Ab2的效价超过1∶2000(图11)，这证明感染的人抗血清具有针对单克隆GLXA-Ab2的特异抗体，暗示单克隆GLXA-Ab2是GLXA的内像。
也以类似的方式测试了兔抗衣原体抗血清(88MS188)对单克隆GLXA-Ab2的特异识别，该兔抗血清是通过接种EB而产生。如图12所示，兔抗血清对单克隆GLXA-Ab2的结合高于免疫前血清对单克隆GLXA-Ab2的结合，但是没有预期的高。结合之间的差异在1∶1000倍稀释后仍可观察到。这说明针对衣原体的兔抗血清具有识别单克隆GLXA-Ab2的特异抗体，再次证明单克隆GLXA-Ab2是GLXA的内像。
作为内像的抗独特型抗体可以在从未接触过该抗原的动物中产生抗原特异性抗血清。在这种情况下，如果单克隆GLXA-Ab2(91MS441)是GLXA的内像，(即携带相同的抗原结构)，它应在相同的BALB/cByJ系小鼠中产生抗GLXA抗体，而不管该小鼠从未接触过GLXA。在一初级实验中，用单克隆Ab2IgG免疫8只小鼠，用正常小鼠IgG免疫4只小鼠。在皮下注射时不使用佐剂。在免疫及一次强化免疫后的第7天和第14天通过处死每组中的一半小鼠从这些小鼠中取抗血清。用纯GLXA进行免疫斑点印迹分析。斑点印迹显示用单克隆GLXA-Ab2IgG免疫的小鼠具有高达1∶800的效价，而用正常小鼠IgG免疫的小鼠的效价为1∶100或更低。通过光密度计进一步定量印迹。当在第一次强化免疫后稀释1∶100时，来自所有4只小鼠的抗血清均结合GLXA，而在对照组中仅稀释1∶50即观察不到结合。这证明这一抗血清仅被抗独特型的互补位激发，因为受体是同系的。
还通过化学发光免疫分析测试了特异结合GLXA的GLXA-Ab3抗血清对单克隆GLXA-Ab1的结合的抑制。在1∶25的稀释倍数时，GLXA-Ab3抑制90％的结合，而对照抗血清在免疫后8天抑制18％，这一结果与用10微克未标记的单克隆GLXA-Ab1证明的抑制相等。在第14天，即用相同量(50μg/小鼠)的IgG第1次强化免疫后1周的抗血清中发现相同的抑制。应注意当稀释为1∶100时，抑制百分数降至第7天为约70％，第14天约为50％。
用单克隆GLXA-Ab2免疫保护小鼠不受衣原体感染
在这一研究中使用BALB/cByJ小鼠作为眼部衣原体感染动物模型，第一个实验用39只小鼠，其中20只小鼠用50μg单克隆GLXA-Ab2皮下接种免疫，19只小鼠用正常小鼠IgG接种，均不加佐剂，共进行3次注射，间隔为1周。在最后1次注射后1周，用砂眼衣原体血清型C原体接种小鼠(每只眼5000IFU)。在感染后第0、7、14和21天从小鼠的每只眼取结膜擦拭标本。收集来自结膜擦拭标本的样品并在McCoy细胞单层中培养48小时。计数包涵体，在15个区域中有5个包涵体被认为呈阳性。如图13所示，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠的感染性是用正常小鼠IgG免疫的小鼠的感染性的一半。在第2个实验中(在每组中有20只小鼠)，以类似方式重复免疫，然而，每只眼接受106IFU，是第1个实验中使用的EB数的100倍。令人惊奇的是，在小鼠中发现几乎相同的保护曲线(图14)，提示单克隆GLXA-Ab2激发一强烈的宿主防御应答。
在第3个实验中，在免疫中使用氢氧化铝(明矾)，在佐剂的存在下免疫10只小鼠，不加佐剂用单克隆GLXA-Ab2免疫8只小鼠，在Maalox存在下用正常小鼠IgG免疫16只小鼠，免疫程序如前所述。当在免疫中使用Maalox时，在免疫斑点印迹分析中用GLXA测得小鼠中的抗抗独特型抗血清的效价会翻番。在佐剂处理的小鼠中有较高效价的抗血清表明与不加明矾免疫的小鼠相比其能更有效保护小鼠不受眼部感染(图15)。然而，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠的感染明显低于那些接受正常小鼠IgG+明矾的小鼠。另外，感染通过在攻击后28天而清除。在第4个实验中，在明矾存在下用单克隆GLXA-Ab2免疫8只小鼠并用正常小鼠IgG免疫8只小鼠，免疫及接种程序如上所述。然而，如图16(A)所示，在第7天，两组具有相同的感染程度，即50％的眼睛被感染，而从第10天开始在两组中显示出显著的感染差异。对于用单克隆GLXA-Ab2免疫的组，在第14天8只眼睛中的2只呈阳性，在第22天8只眼睛中的1只呈阳性，在第28天没有眼睛呈阳性，表明感染完全消退。与之相反，用正常小鼠IgG免疫的小鼠中，在在第14天6只眼睛均呈阳性并持续呈阳性直至第42天，在这一组中观察到在第28天感染的眼睛数开始减少，据信这是一天然恢复过程。在最后一个实验中，用EB再攻击已从上述实验中完全清除感染的小鼠，以评价免疫性是否与记忆相连。保护作用的一个重要因子是免疫的小鼠从其眼睛中清除微生物的能力比未免疫的小鼠要早得多，这一点在用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠中清楚可见(图16(B))。这表明单克隆GLXA-Ab2不仅能激发保护免疫应答，而且还是一记忆免疫应答。
这一实施例证明模拟GLXA的抗独特型抗体保护作为动物模型的小鼠不受衣原体眼部感染。用于产生抗独特型抗体的单克隆mAb1(89MS30)是通过用完整EB免疫产生并筛选其与属特异性抗原的反应而得到的。其已被用于鉴别GLXA并证明与GLXA多糖部分特异结合。还发现这一抗体与cLPS交叉反应。
首先GLXA和cLPS是完全不同的属特异性抗原，GLXA发现存在于RB、EB包涵体膜、宿主细胞膜上并分离到包涵体空间、感染细胞的细胞质中以及周围环境中，其从感染细胞培养物的上清中得到。而cLPS在EB和RB中发现(主要在RB中)，它们不从感染细胞分泌或与之分离，而是松散地与RB结合。结构上，GLXA和cLPS具有不同的多糖基元，GLXA具有一独特的糖残基：古洛糖或古洛糖衍生物、甘露糖和半乳糖，可能以古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的重复单位排列。发现GLXA中仅有2个脂肪酸与抗原结合，而cLPS中至少有12个脂肪酸与抗原结合。cLPS具有典型的线性2-酮-3-脱氧辛酮糖酸(KDO)三糖(通用核心)和多糖如氨基葡糖和庚糖。血清学上，单克隆GLXA-Ab1特异与古洛糖和甘露糖重复块结合。而cLPS属特异性表位在KDO上，特异决定簇是2-8连键。显然，几乎没有可能GLXA和cLPS共享同一表位。已知特异于cLPS的抗体，不管其是多克隆或单克隆的，或者是通过完整EB或纯化的cLPS产生的，均不具有中和或保护功能。组成分析提示古洛糖与甘露糖和半乳糖一起形成了GLXA的特异表位。而cLPS除了KDO三糖作为表位外在KDO区和其他糖部分还具有其他表位。这些后来的结构显示与来自其他革兰氏阴性细菌的广泛的交叉反应性。由于GLXA的保护表位由糖残基排列组成，所以更可相信cLPS与GLXA共享其中的一些。
关于这一交叉反应还有其他可能性，例如(1)GLXA和cLPS不共享任何初级相似性，但是结构上形成类似的结合基序；(2)虽然单克隆GLXA-Ab1与cLPS结合，但是GLXA和cLPS在抗体结合位点不具有相似性。单克隆抗体可以是多特异性的，即其识别非常不同的表位。
从上述讨论据信单克隆GLXA-Ab1特异于GLXA表位，GLXA和cLPS共享相同糖残基或仅仅是结构相似性的可能性可以解释交叉反应性。
通过单克隆GLXA-Ab2IgG鉴别宿主细胞上的受体
单克隆GLXA-Ab2与HECEC细胞的特异结合的FACS分析
在37℃、5％CO2下在75mm2培养瓶中培养人子宫内膜腺体上皮细胞(HECEC)，当汇合后，用一细胞刮棒(Baxter，IL)从培养瓶中刮下细胞并200×g离心5分钟，将细胞用含20％FBS的Hanks缓冲液(Whittker，MD)洗1次，并通过19G针头4次以获得单细胞。将含系列稀释的生物素标记的单克隆GLXA-Ab2或生物素标记的正常小鼠IgG的Hanks缓冲液(100微升)加入到含有约1.5×106HECEC细胞的每个小瓶中，置于冰上30分钟，每一小瓶用含0.02％叠氮化物的Hanks缓冲液洗2次。然后加入100微升FITC缀合的链亲和素并置于冰上30分钟。洗2次后，将细胞在400微升保护(sheath)缓冲液中于冰上保存。使用加FITC缀合的链亲和素的细胞和单独的细胞作为背景对照。立即通过FACS扫描(BectonDickinson)进行单色流式细胞计数。
抗独特型抗体，GLXA-Ab3和单克隆GLXA-Ab2
在不加弗氏佐剂缀合物的条件下，对豚鼠皮下注射单克隆GLXA-Ab1，所有4只免疫的豚鼠均产生特异于单克隆Ab1的高效价抗独特型抗体，其在第1次免疫后三周就已发现，ELISA测定效价约为1∶5000。抗独特型抗血清中含有相当高浓度的GLXA-Ab2，其特异于单克隆GLXA-Ab1的超变区。这一点在用正常小鼠IgG吸收2次后可以看出。当来自豚鼠抗独特型抗体的IgG-1同种型作为3只兔的免疫原时，免疫后2个月抗抗独特型抗体的效价超过1∶20,000，这证明免疫球蛋白本身是一非常强的免疫原。这不仅在种间免疫中发现，而且在同系免疫中也是如此。用单克隆抗独特型抗体单克隆GLXA-Ab2，在同系小鼠中不加KLH缀合或弗氏佐剂进行免疫，这些小鼠在免疫后短时间(9天)即产生高效价的GLXA-Ab3。在这一研究中使用的程序不同于多数使用缀合物或弗氏佐剂以提高免疫原性的方法。
一种成功的疫苗不仅需要其是一种好的免疫原，而且需要持续时间长(优选在宿主的生命期内均有用)。由独特型产生的免疫性是持续时间长的。来自3只免疫豚鼠的豚鼠GLXA-Ab2对单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的抑制能力已被监控长达77周。仅用3次强化免疫，免疫后1年的抑制作用几乎与免疫后早期收集的抗血清的抑制作用相同，这表明由独特型抗体单克隆GLXA-Ab1激发的免疫性具有长期记忆。由于抗体分子或大多数抗体产生细胞的半寿期约为几个星期，所以强化免疫间隔(6个月)远远超过了B细胞和免疫球蛋白的寿命。是独特型网络中的经常刺激作用使这一抗独特型抗体保持在恒定水平。在这一期间独特型特异性的变化在本例中未观察到。
衣原体GLXA的内像，同种型差异
在这一研究中，分离了豚鼠GLXA-Ab2IgG-1和IgG-2。这两种同种型对于独特型的调节功能未进行评价，但是发现了IgG-1和IgG-2亚类之间对于单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的抑制作用的差异。采用一个新的系统，化学发光免疫分析，保温和最终检测均在溶液中进行，而不是象ELISA在固相中进行，从而大大降低了由阻碍物导致的抑制的可能性。结果显示GLXA-Ab2IgG-1 100％抑制结合，而IgG2在相同浓度仅抑制50％，这提示GLXA-Ab2IgG-1对于结合独特型具有高亲和性或者其更类似抗原GLXA，从而证明在其结合独特型的能力之间存在同种型差异，这种差异反映了其各自活性位点的差异。IgG-1与IgG1具有不同的独特型结合能力。有几种主要独特型的例子，如抗-strep-A碳水化合物抗体的A5A独特位，或磷酰胆碱抗体的515独特位。尚不清楚抗独特型抗体在不同系统中是否有同种型优选性。这一发现提示某些GLXA-Ab2的同种型是内像，而另一些不是。
单克隆GLXA-Ab2作为衣原体GLXA的免疫原
制备单克隆抗独特型抗体的目的是：(1)提供用于疫苗研究的抗独特型抗体的恒定来源；(2)在宿主细胞中鉴别可能的GLXA受体；(3)进一步鉴定GLXA上的表位。这使得能了解GLXA的各种生物学功能，如表位密度、其在感染机制中的作用以及在体内抗衣原体感染的保护功能。单克隆抗独特型抗体的生产是在同系BALB/cByJ小鼠中进行，在第一次融合中，从所筛选的283个克隆中选定了1个稳定的、高抑制活性的克隆(91MS441)。在第二次融合中选定了另一个克隆(91MS442)，尽管在化学发光免疫分析中其抑制活性不如91MS441克隆。由这一克隆(91MS441)产生的单克隆GLXA-Ab2已显示是衣原体抗原GLXA的内像。
令人感兴趣地注意到小鼠GLXA-Ab3的抑制能力随时间稍稍但明显地下降。抗独特型的剂量是增强独特型或抑制独特型的一个因素。GLXA-Ab3的这一抑制结果显示在给予单克隆GLXA-Ab2IgG两次后，其抑制作用高于从给予3次后得到的血清。这表明50微克对于一剂来说太多了或者对于重复给予来说是太多了。另一方面，其说明低用量对于保护性免疫就足够了。在免疫中选择正常小鼠IgG而非不相关克隆作为阴性对照的原因是其能防止来自特异克隆的任何可能偏差。
单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3携带相同抗原结合结构
通过免疫斑点印迹分析证实来自免疫兔和小鼠的GLXA-Ab3识别亲和纯化的GLXA，尽管其未预先与GLXA接触或感染。单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合随着GLXA-Ab3浓度增加而被抑制，这表明抗抗独特型具有与独特型相等的抗原反应性，即它们识别相同表位。来自兔的单克隆GLXA-Ab1和GLXA-Ab3与GLXA的相同抗原反应性进一步在感染的McCoy细胞培养物中的包涵体的免疫荧光染色中证实。该实验提示抗体的结构相似性。使用模拟GLXA的单克隆GLXA-Ab2鉴别其作用在了解抗独特型保护作用的机制中很有价值。实验用人表皮样癌细胞(A431)和人子宫内膜腺体上皮细胞(HEGEC)进行，使用这些细胞系是因为它们是人源的。通过直接抗体染色进行初步结合实验，其用FACScan(BectonDickinson，N.J.)流式细胞计数器进行检测。由于如不使用酶或剧烈分离法而将这些上皮细胞特别是HEGEC细胞分离成单细胞悬浮液将非常困难，所以细胞群由单体、双体和多体构成。单细胞群恰在细胞碎片之上选出(gate)，由于对照即用正常小鼠IgG染色的细胞也在相同位置选出，所以认为这两组是可比的。另外，结合是直接的，单克隆GLXA-Ab2或正常小鼠IgG直接用生物素标记。结合的单克隆GLXA-Ab2的密度与特异于宿主细胞(HEGEC)的浓度而增加，而正常小鼠IgG甚至在最高浓度也没有这种结合。如果这一发现能重复并证明是可靠的，则GLXA是结合HEGEC细胞的粘附物或配体。首先，如上所述，GLXA-Ab3中和发生在非常早期，这也由如下发现证实，即在取自用GLXA-Ab3处理的EB接种的灵长目动物的结膜样品中没有明显的衣原体特异性核糖体RNA，这提示GLXA-Ab3阻断了EB进入宿主。第二，当将McCoy细胞与GLXA预保温时，发现GLXA能增强感染约3倍，这种结果只有在GLXA是一种促进EB与宿主细胞附着的粘附物或配体时才可能发生。实际上，EB能很好地运用这一机制感染细胞，因为GLXA从感染细胞中分泌。
GLXA可能的作用机制可能如下：EB通过在EB上的GLXA或被感染细胞分泌到周围环境中的游离GLXA附着于宿主细胞，这使得GLXA更容易而有效地吸附到周围细胞，然后EB可以通过EB上的GLXA附着于宿主细胞，从而结合宿主细胞。这一机制看起来比一对一附着更有效。
GLXA-Ab3对衣原体感染的中和
体外初级中和试验表明使用GLXA-Ab1处理的砂眼衣原体血清型B EB比兔Ab3处理的砂眼衣原体血清型B EB发现了更多的衣原体包涵体，这表明GLXA-Ab3中和感染，而单克隆GLXA-Ab1不中和。在细胞培养物中GLXA-Ab3中和感染，而单克隆GLXA-Ab1不中和。这一体外结果在两个后来的使用灵长目动物感染模型的实验中得以体内重复，证实GLXA-Ab3在体外及体内均有效中和衣原体感染。
对这一中和机制的了解来自衣原体特异性RNA杂交实验。用GLXA-Ab3或正常兔IgG处理的EB接种灵长目动物的眼部，在接种前及接种后不同天数从灵长目动物提取的结膜擦拭标本中检测衣原体RNA。在这一研究中使用的RNA杂交分析是检测经细胞培养或DFA或两种方法共同检测呈模糊阴性的样品中衣原体感染的非常灵敏的方法。在Ab3处理的灵长目动物中分析很低的RNA这一事实提供了中和作用在感染的非常早期即微生物的内化之前发生的证据，提示GLXA可能是在附着期起作用的粘附物或配体。
体液免疫在对抗衣原体感染的保护作用中的功能长期以来有争议，然而，体外和体内均已示出体液免疫可能在防止衣原体感染方面起某些作用。
通过用单克隆GLXA-Ab2免疫保护小鼠不受衣原体感染
在一使用单克隆抗独特型抗体单克隆GLXA-IgG的疫苗研究中采用BALB/cByJ小鼠中的衣原体眼部感染模型，其是针对仅感染人类的砂眼衣原体血清型的模型。在免疫实验中，用单克隆(GLXA-Ab2)IgG(50μg/小鼠)皮下免疫每组中的6-20只小鼠，免疫在佐剂存在下进行或不在佐剂存在下进行。用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠在单次免疫后1周产生可检的GLXA-Ab3效价。在本项研究中使用的系统是同系的：在同一株系小鼠中产生了单克隆GLXA-Ab1、单克隆GLXA-Ab2或单克隆GLXA-Ab3，它们遗传学上携带相同的免疫球蛋白。唯一的“外来结构”是每种抗体(单克隆GLXA-Ab1或单克隆GLXA-Ab2)的特异结合位点。使用来自同一株系的正常小鼠IgG作为阴性对照。恒定的是，用单克隆GLXA-Ab2免疫的小鼠总产生比对照组明显高很多的抗纯GLXA的GLXA-Ab3效价，平均效价高达1∶3200，而在用正常小鼠IgG免疫的小鼠中的效价为1∶200。这清楚地证明在同系小鼠中GLXA-Ab3抗体的产生由模拟GLXA的结构即超变区激发。另外，来自这些小鼠的GLXA-Ab3抑制单克隆GLXA-Ab1与GLXA的结合的有效性与未标记的单克隆GLXA-Ab1一样。这些实验显示单克隆GLXA-Ab2模拟GLXA的一个单表位。
在4个单独的体内实验中一致证实了使小鼠免受砂眼衣原体的眼部感染的保护作用。通过在眼睛中接种EB(5000IFU/眼)感染用单克隆GLXA-Ab2或正常小鼠IgG免疫(以周为单位进行3次)的小鼠，在感染前或后的不同天数提取结膜擦拭标本。通过细胞培养检测包涵体。用单克隆GLXA-Ab2IgG免疫的小鼠的眼睛具有明显短的恢复期(眼部感染后9天，而用正常小鼠IgG免疫的对照需28天)。GLXA-Ab3效价与细胞培养结果相关性很好，这证明模拟单一GLXA表位的单克隆GLXA-Ab2是一个有效的免疫原，并激发针对衣原体感染的强保护性免疫应答，表明单一保护性表位位于衣原体GLXA上。
中和及保护作用的机制的预期
本例是第一次证实非中和性单克隆GLXA-Ab1能通过抗独特型抗体(GLXA-Ab2)在体内产生中和性GLXA-Ab3。中心问题是用衣原体EB免疫产生的单克隆GLXA-Ab1不中和或保护灵长目动物免受再次感染，而由豚鼠GLXA-Ab2产生的GLXA Ab3中和感染并且用单克隆GLXA-Ab2免疫能保护小鼠免受再次感染。
实施例2-5中分析在体外和体内(包括细胞和非细胞材料)样品中是否存在GLXA的结果如下：
当在实施例2、3、4和5中分析时发现从体外细胞培养物中制备的衣原体EB悬液中存在GLXA。
当在实施例2和4中分析时发现在衣原体感染的体外细胞培养物上清中存在GLXA。
当在实施例3、4和5中分析时发现在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的子宫颈擦拭标本中存在GLXA。
当在实施例5中分析时发现在在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的阴道擦拭标本中存在GLXA。
当在实施例4和5中分析时发现在在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的尿样中存在GLXA。
实施例2
夹心ELISA分析
用含抗GLXA抗体(GLXA-Ab1)的兔多克隆抗血清包被聚苯乙烯微滴定板的孔。
将单克隆抗GLXA抗体(GLXA-Ab1)与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。
分析步骤：
1)每孔吸加100μl样品
2)每孔吸加100μl分析缓冲液
3)在37℃保温1小时
4)用PBS/吐温洗孔3次，干燥印迹
5)每孔吸加200μl单克隆抗GLXA：HRP缀合物
6)在37℃保温1小时
7)用PBS/吐温洗孔2次，然后用PBS洗孔2次，干燥印迹
8)每孔吸加200μl底物/显色溶液
9)在室温保温30分钟
10)通过每孔吸加100μl 1N H2SO4终止反应
11)在一分光光度计中读每孔的吸收值
实施例3
扩增夹心ELISA分析
用单克隆抗GLXA抗体(GLXA-Ab1)包被聚苯乙烯微滴定板的孔。单克隆抗GLXA抗体是生物素化的，将单克隆抗生物素抗体与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。
分析步骤：
1)每孔吸加140μl分析缓冲液
2)每孔吸加10μl样品
3)在室温保温30分钟
4)用PBS/吐温洗孔3次，干燥印迹
5)每孔吸加150μl生物素化抗GLXA抗体
6)在室温保温30分钟
7)用PBS/吐温洗孔3次，干燥印迹
8)每孔吸加150μl抗生物素：HRP缀合物
9)在室温保温30分钟
10)用PBS/吐温洗孔5次，干燥印迹
11)每孔吸加150μl底物/显色溶液
10)通过每孔吸加100μl 1N H2SO4终止反应
11)在一分光光度计中读每孔的吸收值
对于夹心ELISA分析，每孔中的最终吸收值与样品中的GLXA的量成正比。任何大于阴性对照吸收值2倍的吸收值表示样品中存在GLXA。
实施例4竞争ELISA分析
用单克隆抗GLXA抗体(GLXA-Ab1)包被聚苯乙烯微滴定板的孔。将单克隆抗独特型抗体(GLXA-Ab2)与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。
分析步骤：
1)每孔吸加200μl样品
2)在37℃保温1小时
3)每孔吸加100μl GLXA-Ab2：HRP
4)在室温保温30分钟
5)用PBS/吐温洗孔4次，干燥印迹
6)每孔吸加200μl底物/显色溶液
7)在室温保温20分钟
8)通过每孔吸加100μl 1N H2SO4终止反应
9)在一分光光度计中读每孔的吸收值
实施例5
扩增竞争ELISA分析
用单克隆抗独特型抗体(GLXA-Ab2)包被聚苯乙烯微滴定板的孔。单克隆抗GLXA(GLXA-Ab1)抗体是生物素化的，将单克隆抗生物素与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。
分析步骤：
1)每孔吸加100μl分析缓冲液
2)每孔吸加30μl样品
3)每孔吸加20μl生物素化GLXA-Ab1
4)在室温保温45分钟
5)用PBS/吐温洗孔3次，干燥印迹
6)每孔吸加150μl抗生物素：HRP缀合物
7)在室温保温45分钟
8)用PBS/吐温洗孔5次，干燥印迹
9)每孔吸加150μl底物/显色溶液
10)在室温保温5分钟
11)通过每孔吸加100μl 1N H2SO4终止反应
12)在一分光光度计中读每孔的吸收值
对于竞争ELISA分析，每孔中的最终吸收值与样品中的GLXA的量成反比。抑制百分率用下式计算：
任何大于20％的抑制表示样品中存在GLXA。
分析在体外和体内(包括细胞和非细胞材料)样品中是否存在GLXA的结果如下：
当在上述实施例2、3、4和5中分析时发现从体外细胞培养物制备的衣原体EB悬液中存在GLXA。
当在上述实施例2和4中分析时发现在衣原体感染的体外细胞培养物上清中存在GLXA。
当在上述实施例3、4和5中分析时发现在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的子宫颈擦拭标本中存在GLXA。
当在上述实施例5中分析时发现在在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的阴道擦拭标本中存在GLXA。
当在上述实施例4和5中分析时发现在在经细胞培养证实的衣原体感染女性中得到的尿样中存在GLXA。
Claims (11)
1、一种在哺乳动物中免疫化学诊断正在发生的衣原体感染的方法，所述方法包括将来自所述哺乳动物的胞外生物学液体与特异于衣原体糖脂外抗原(GLXA)的一个抗原决定簇的抗体接触，所述的糖脂外抗原基本上存在于任何衣原体种或血清型中，以及确定所述抗体与所述抗原决定簇的结合程度。
2、权利要求1的方法，其包括测定由所述抗体免疫学结合的GLXA的量，并且通过比较所结合的GLXA的量是否大于来自未感染哺乳动物的标本中发现的所结合GLXA的量来确定是否为阳性。
3、权利要求1的方法，包括使用抗独特型抗体通过竞争免疫分析确定样品中的糖脂外抗原的量，所述的抗独特型抗体含有衣原体糖脂外抗原的特异表位的内像。
4、权利要求1的方法，其中所述的免疫化学诊断方法选自：放射免疫分析、酶联免疫吸附分析、荧光分析、化学发光分析、生物发光分析、竞争免疫分析、膜基免疫分析、沉淀、凝集和抗原捕获。
5、权利要求1的方法，其中特异于衣原体糖脂外抗原的抗体是单克隆抗体。
6、权利要求1的方法，其中特异于衣原体糖脂外抗原的抗体是多克隆抗体。
7、权利要求3的方法，其中含有衣原体糖脂外抗原的特异表位的内像的抗独特型抗体是单克隆抗体。
8、权利要求3的方法，其中含有衣原体糖脂外抗原的特异表位的内像的抗独特型抗体是多克隆抗体。
9、权利要求1的方法，其中特异于衣原体糖脂外抗原的抗体是抗含有GLXA的一特异表位的内像的抗独特型抗体的抗抗独特型抗体。
10、权利要求9的方法，其中抗抗独特型抗体是多克隆抗体。
11、权利要求9的方法，其中抗抗独特型抗体是单克隆抗体。
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