JPH08127599A - モノクローナル抗体、その製造法、その抗体産生細胞及びクラミジア・ニューモニエの検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 クラミジア・ニューモニエの外膜主要タンパ
ク質に対して反応性を有し、尚且つクラミジア・ニュー
モニエの基本小体に強い反応性を有するモノクローナル
抗体、その抗体産生細胞、その抗体の製造法及びクラミ
ジア・ニューモニエの検出法。 【効果】 量的に多く含まれるＭＯＭＰに反応し、尚且
つ蛍光抗体法によりクラミジア・ニューモニエのＥＢに
非常に強い反応性を示すことから、クラミジア・ニュー
モニエの検出用に使用できる。クラミジア・ニューモニ
エ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出するための各種診断
法、各種試薬に有用であり、また医薬品としても有用で
ある。 また、本発明の抗体産生細胞は上記抗体を産生
することの他に抗体遺伝子のソースとしても有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、従来特異的な検出が困
難であったクラミジア・ニューモニエを特異的に検出で
きるモノクローナル抗体、その製造法、その抗体産生細
胞及びクラミジア・ニューモニエの検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア属には、クラミジア・トラコ
マティス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・シ
ッタシ及びクラミジア・ペコラムの４種類のものが知ら
れている。クラミジア・ニューモニエは、臨床上、肺炎
などの起因菌と考えられており、Cho-chou Kuoらにより
1986年に初めて報告された(J. Clinical Microbiology,
24(6), 1034-1037(1986))。クラミジア・ニューモニエ
の抗原としては、リポ多糖（ＬＰＳ）及びタンパク質が
知られている。リポ多糖は、クラミジア属に共通な抗原
性を有している。また、タンパク質としては、分子量3
9.5Kダルトン、60Kダルトン、75Kダルトン、98Kダルト
ンのものなどが知られているが、特に分子量39.5Kダル
トンのタンパク質は、外膜主要タンパク質（Major Oute
r Memblane Protein、以下、ＭＯＭＰと略す）と呼ばれ
ている。

【０００３】モノクローナル抗体の作製は、1975年にKo
hlerとMilsteinにより報告されて以来、数多くの報告が
なされている。クラミジア属に特異的な抗原としてはGL
XA(a genus-specific glycolipid antigen)、リポ多
糖、ＭＯＭＰ等が知られている。GLXAに対するモノクロ
ーナル抗体をElizabeth S. Stuart等が(Current Microb
iology, 28, 85-90(1994))、リポ多糖に対するモノクロ
ーナル抗体をHarland D. Caldwell AND Penny J. Hitch
cockが(Infection and Immunity, 44(2), 306-314(198
4))、ＭＯＭＰに対するモノクローナル抗体をEllena M.
Peterson等が(Infection and Immunity, 59(11), 4147
-4153(1991))、Byron E. Batteiger等が(Infection and
Immunity, 53(3), 530-533(1986)）報告している。

【０００４】クラミジア・トラコマティスに対するモノ
クローナル抗体は、Richard S. Stephens等の報告(J. I
mmunology, 128(3), 1083-1089(1982))後、多くの報告
がなされている。クラミジア・シッタシに対するモノク
ローナル抗体は、H. Puy等が報告しており、この中にク
ラミジア・シッタシ及びクラミジア・ニューモニエに蛍
光抗体法でほぼ同等の強さの反応性を示すモノクローナ
ル抗体が報告されている(Immunology Letters, 23, 217
-222(1989/1990))。しかしながら、このモノクローナル
抗体が認識する抗原についての記載はない。クラミジア
・ペコラムに対するモノクローナル抗体は、Kuroda等が
(Am. J. Vet. Res, 54(5), 709-712(1993))報告してい
る。

【０００５】クラミジア・ニューモニエに対するモノク
ローナル抗体として、Iijima等は種々のものを報告して
いるが(J. Clinical Microbiology, 32(3), 583-588(19
94))、この中にＭＯＭＰに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体の報告はない。Cho-chou Kuo等は、クラミジア
・ニューモニエに特異的な反応性を有するモノクローナ
ル抗体(RR402)を報告しているが(J. Clinical Microbio
logy, 24(6), 1034-1037(1986)、特表昭64-500083号公
報)、このモノクローナル抗体(RR402)が認識する抗原
は、明らかにされていない(Y. Iijima, J. Clinical Mi
crobiology, 32(3), 583-588(1994))。現在までにクラ
ミジア・トラコマティスのＭＯＭＰに反応性を示さず、
クラミジア・シッタシのＭＯＭＰに反応性を示さないか
または微弱な反応のみを示し、クラミジア・ニューモニ
エのＭＯＭＰに反応性を有し、尚且つ蛍光抗体法で非常
に強い反応性（即ち、基本小体（Elementary Body、以
下、ＥＢと略す）に非常に強い反応性）を有するモノク
ローナル抗体の報告はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】クラミジア・ニューモ
ニエを特異的・簡便・迅速に検出する測定方法として短
時間で判定できる蛍光抗体法が望ましいものの一つであ
ると考えられる。また、クラミジア・ニューモニエに特
異的な抗原としてＭＯＭＰが考えられる。そのため、ク
ラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰに反応性を示し、し
かもクラミジア・ニューモニエのＥＢに非常に強い反応
性を有するモノクローナル抗体を使用した蛍光抗体法に
よるクラミジア・ニューモニエの検出が望まれている。
そこで、クラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰに反応
し、尚且つ蛍光抗体法でクラミジア・ニューモニエのＥ
Ｂを強く染色するモノクローナル抗体の作製を鋭意検討
した。その結果、我々は、クラミジア・ニューモニエの
ＭＯＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体を
作製し、しかもこのモノクローナル抗体が蛍光抗体法に
よりクラミジア・ニューモニエのＥＢと非常に強い反応
性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】即ち本発明は、クラミジ
ア・ニューモニエのＭＯＭＰに対して反応性を有し、尚
且つクラミジア・ニューモニエのＥＢに強い反応性を有
するモノクローナル抗体、その製造法、前記抗体の産生
能を有するモノクローナル抗体産生細胞及びその抗体を
用いることを特徴とするクラミジア・ニューモニエの検
出法に関する。

【０００８】本発明のモノクローナル抗体産生細胞は、
クラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰに対して反応性を
有し、尚且つクラミジア・ニューモニエのＥＢに強い反
応性を有するモノクローナル抗体を産生できるものであ
れば特に制限はないが、一般に、動物の免疫、細胞融
合、融合細胞の選択、特異抗体産生細胞の選択、クロー
ニング等の工程を経て調製される融合細胞（ハイブリド
ーマ）であって、クラミジア・ニューモニエ由来ＭＯＭ
Ｐに対して反応性を有し、尚且つ、クラミジア・ニュー
モニエのＥＢに非常に強い反応性を有するモノクローナ
ル抗体を産生するものである。

【０００９】免疫用抗原として使用するクラミジア・ニ
ューモニエは、適当なストレインを使用できる。例え
ば、ＹＫ−４１株、ＴＷＡＲ株等が挙げられる。免疫さ
れる哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ニワトリ等が挙げられるが、特にマウスが好まし
い。免疫方法は、適宜、周知の適当な方法を組み合わせ
て実施できる。本発明のモノクローナル抗体産生細胞を
効率的に作製するためには、例えば、まず、クラミジア
・ニューモニエのＥＢ又はその未変性のＭＯＭＰで免疫
を惹起し、最終免疫用抗原として還元剤及び界面活性剤
処理を施すことにより変性させたＭＯＭＰを用いる方法
が好ましい。還元剤としては、特に制限はないが、2-メ
ルカプトールエタノールが好ましい。界面活性剤として
は、特に制限はないが、ＳＤＳ（ドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム）が好ましい。また、免疫の際にアジ
ュバントを用いるのが好ましく、例えば、フロイントの
完全アジュバント（以下、ＦＣＡと略す）、フロイント
の不完全アジュバント（以下、ＦＩＡと略す）等が好ま
しいものとして挙げられる。上記方法による充分な免疫
後、免疫した哺乳動物から、脾細胞、リンパ球Ｂ細胞等
を抗体産生能を有する親株として摘出する。

【００１０】ハイブリドーマ作製のもう一方の親株とし
ては、一般に骨髄腫（ミエローマ）細胞が用いられる。
例えば、マウス由来のＰ３Ｕ１、ＮＳ−１、６５３、Ｓ
Ｐ２、Ｘ６３、ＭＰＣ−１１等、ラット由来のＡＧ１、
ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、２１０等、ヒト由来のＳＫ
Ｏ−００７等が使用できるが、マウス由来のものが好ま
しく、特にＰ３Ｕ１、６５３等が好ましい。細胞融合は
ポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイル
スを用いる方法、電気融合法等が使用できるが、ポリエ
チレングリコールを用いる方法が好ましい。ハイブリド
ーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育できる選択培
地中で培養することにより行うことができる。例えば、
ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
培地、ＨＡｚ（ヒポキサンチン−アザセリン）培地等が
好ましいものとして挙げられる。

【００１１】特異抗体産生細胞の選択は、上記培養によ
りハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清を採
取し、クラミジアニューモニエのＥＢ、ＭＯＭＰ等を用
いた免疫ブロッティング法等により抗体産生の有無を調
べることにより行うことができる。クローニングとは、
上記特異抗体産生細胞を１つのクローンに由来する均一
な細胞集団とすることであり、例えば、限界希釈法、ソ
フトアガー上のコロニーを拾い上げる方法、シングルセ
ルマニュピュレーション法、ＦＡＣＳ法等が挙げられる
が、限界希釈法が簡便で好ましい。以上の方法により、
モノクローナル抗体産生細胞を得ることができる。本発
明のモノクローナル抗体産生細胞の一例であるハイブリ
ドーマＣＰ−１１を、工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託し、１９９４年１０月２０日に寄託番号 生命
研菌寄第１４５９２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５９２）と
して受託された。

【００１２】上記方法により得られたモノクローナル抗
体産生細胞を好適な培地で培養することにより、モノク
ローナル抗体を製造することができる。培地としては例
えば、牛胎児血清を添加したダルベッコの変性イーグル
培地（ＭＥＭ培地）が好ましいものとして挙げられる。
モノクローナル抗体の回収は、培養上清を集め、プロテ
ィンＡカラム、プロティンＧカラム等を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラ
フィー法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール
分画法、硫酸アンモニウム分画法などにより行うことが
できる。これらの中でアフィニティークロマトグラフィ
ー法が好ましく、特にプロティンＡカラムを用いる方法
が好ましい。

【００１３】得られたモノクローナル抗体は、クラミジ
ア・ニューモニエのＭＯＭＰに対して特異的な反応性を
有するか否か評価することができる。例えば、クラミジ
ア・ニューモニエのＥＢを適当な処理液で処理し、電気
泳動し、これを用いたウエスタンブロット法により、分
子量が約３９．５ＫダルトンのＭＯＭＰのバンドと特異
的に反応するものを選択することができる。こうして得
られるモノクローナル抗体は、クラミジア・ニューモニ
エのＭＯＭＰのアミノ酸配列を抗原決定基として認識す
るものと判断できる。本発明のモノクローナル抗体は、
さらに、クラミジア・ニューモニエのＥＢ自体に対して
強い反応性を有する。これは、蛍光抗体法でクラミジア
・ニューモニエのＥＢと強い反応性を示すことで確認で
きる。このモノクローナル抗体は、ＥＢの膜外に露出す
るアミノ酸配列を抗原決定基として認識するものと判断
できる。 よって、本発明のモノクローナル抗体は、ク
ラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰの、ＥＢの膜外に露
出するアミノ酸配列を抗原決定基として認識するものと
結論できる。

【００１４】こうして得られる本発明のモノクローナル
抗体は、クラミジア属のその他の種であるクラミジア・
トラコマティスのＭＯＭＰと実質的に反応性を示さない
ものが好ましく、特にクラミジア・ニューモニエ種以外
の全てのクラミジアのＭＯＭＰと実質的に反応性を有し
ないものが、クラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰの種
特異的な診断等に有用であるので好ましい。しかも、ク
ラミジア・ニューモニエ以外の全てのクラミジアのＥＢ
自体とも実質的に反応性を有しないものが好ましい。し
かしながらクラミジア・ニューモニエ以外の他の種と厳
密な意味では反応性を有しても、蛍光抗体法などで微弱
な反応性しか示さない場合は、強い反応性を有する場合
と区別がつくので、実質的に診断上の使用は可能であ
り、その有用性が損なわれるものではない。また、臨床
上分離頻度の高いクラミジア・トラコマティスとの交差
反応性がないことは重要であるが、比較的分離頻度の低
いと考えられるクラミジア・ペコラム及びクラミジア・
シッタシとの交差反応性はさほど重要ではない。逆に、
蛍光抗体法でクラミジア・ニューモニエと強く反応し、
別の一種（例えば、クラミジア・シッタシ）と微弱な反
応性を示し、残る種（例えば、クラミジア・トラコマテ
ィス及びクラミジア・ペコラム）とは全く反応しない場
合は、反応の程度により、いずれの種のクラミジアかの
診断が可能となるので、好ましいといえる。本発明のモ
ノクローナル抗体の種類には現在知られているどのよう
なタイプ（グロブリンクラス）のものも含まれる。ま
た、モノクローナル抗体からの部分分解物（Ｆａｂ、Ｆ
ａｂ′、Ｆａｂ′₂等）又はモノクローナル抗体の部分
構造を有するものも含まれる。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体は、各種色素
類、コロイド類、酵素などを結合させた抗体としてクラ
ミジア・ニューモニエの検出に用いることができる。色
素としては、ＦＩＴＣ、ローダミンなどの蛍光色素類が
推奨されるがこれに限定されるものではない。また、コ
ロイド類としては金コロイドなどが使用できる。酵素と
してはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼな
どが使用できる。さらに、本発明のモノクローナル抗体
とともに、上記色素類、コロイド類、酵素などを標識し
た二次抗体を使用してクラミジア・ニューモニエの検出
に用いることもできる。また、本発明のモノクローナル
抗体は、必要に応じて他のクラミジア・ニューモニエに
対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と組
み合わせてクラミジア・ニューモニエの検出に用いるこ
とができる。

【００１６】検出手段として具体的にはラジオイムノア
ッセイ、エンザイムイムノアッセイなどの免疫反応を利
用した検出法に使用できる。また、その為の診断薬又は
研究用試薬の一成分として使用できる。さらに、直接又
はキメラ抗体やドラフト化抗体として医薬品にも使用で
きる。また、本発明のモノクローナル抗体はポリメラー
ゼチェーンリアクションなどと組み合わせた診断キット
に使用することもできる。本発明の抗体産生細胞は、抗
体遺伝子のソースとしても使用できる。さらにこの抗体
遺伝子は、各種の細胞で発現させることもできる。

【００１７】

【実施例】

１．クラミジア・ニューモニエＥＢの調製 クラミジア・ニューモニエＥＢの調製にはＹＫ−４１株
を用いた。ＹＫ−４１株のヒト肺由来細胞（ＨＬ細胞と
略す）への感染は、岸本らの方法（検査と技術,18(7),9
59-964(1990)）に従った。２４ウエル又は６ウエルシャ
ーレで培養した感染細胞を細胞剥離し、培地ごと回収し
た後、６，０００rpmで３０分間遠心した。上清を除去
し沈澱物をシュークロース-リン酸-グルタミン溶液
（７．５％(ｗ／ｖ)シュークロース、３．８ｍＭ ＫＨ₂
ＰＯ₄、７ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、５ｍＭグルタミン酸（pH
７．４）、ＳＰＧと略す）に懸濁した。懸濁液をホモジ
ナイザーで破砕した後、２，５００rpmで１０分間遠心
した。上清を除去し沈澱物をＳＰＧに懸濁した。この操
作を５回繰り返した後、上清を回収した。回収液を２３
％（ｖ／ｖ）ウログラフィン（日本シェーリング社
製）、５０％（ｗ／ｖ）シュークロースと２容：２容：
１容の比で混合し遠心分離（８，０００rpmで１時間）
した。上清除去後、下層（５０％（ｗ／ｖ) シュークロ
ース層）を回収しＳＰＧに懸濁、洗浄し、遠心分離（１
０，０００rpmで３０分間）後、上清を吸引除去し、沈
澱物をＳＰＧに懸濁後、２６．６〜３８％（ｖ／ｖ）ウ
ログラフィンDensity Gradientと１容：４容の比で混合
し遠心分離（８，０００rpmで１時間）し、中間層を回
収、ＳＰＧに懸濁した。遠心分離（１０，０００rpmで
３０分間）後、上清を吸引除去し、沈澱物を適当量のＳ
ＰＧに懸濁しＥＢ溶液とした。保存は分注後、４℃又は
−７０℃で行った。

【００１８】２．クラミジア・ニューモニエＭＯＭＰの
調製 上記により得られたＥＢ溶液をディスクプレパラティブ
電気泳動により分離精製し、ＭＯＭＰを調製した。即
ち、得られたＥＢ溶液（タンパク（ＥＢ）濃度７２７μ
g/ml）０．５mlと０．５mlの２倍濃度のサンプルバッフ
ァー（０．３１Ｍトリス−塩酸（pH６．８）、１．６％
（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳと略す）、
１ｍＭジチオスレイトール、１６％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン、０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）
を混合し、煮沸（１００℃で３分間）によりタンパクを
可溶化後、全量をディスクゲル（濃縮ゲル４％、分離ゲ
ル１０％）に付加、電気泳動（装置：ディスクプレパラ
ティブ電気泳動装置ＮＡ−１８００型、日本エイドー社
製、泳動条件１００Ｖ(定電圧)）し、一定量ずつ（０．
２６ml／フラクション）回収した。フラクションごとの
ＳＤＳスラブ電気泳動を行い（装置：ＤＮＡ−ＰＡＧＥ
用電気泳動装置ＮＢ−５０００型、日本エイドー社、泳
動条件１００Ｖ(定電圧)）分子量３９．５ＫのＭＯＭＰ
をフラクション３３〜４５番に回収したことを確認した
（タンパク濃度０．２１mg/ml）。

【００１９】３．ハイブリドーマ及びモノクローナル抗
体の製造 上記方法により得られたＥＢの生理食塩液溶解液０．５
mlをＦＣＡ（ディフコ社製）０．６mlと混和、超音波破
砕機（ブランソン社製）を用いて油中水型のエマルジョ
ンを作製し免疫用抗原とし、生後８週令のＢＡＬＢ／ｃ
雌性マウス５匹に、２０0μｌずつ腹腔内注射した（１
回あたりＥＢ免疫量１０μｇ／マウス）。６日後及び１
２日後にＦＩＡ（ディフコ社製）を用いて免疫を行っ
た。その６日後、部分採血し各々の血清について抗体価
をDot Immuno Binding Assay法(以下ＤＩＢＡ法と略
す）で測定し、抗体価の一番高いものについて、測定日
から３日間最終免疫として上記方法により得られた精製
ＭＯＭＰ２００μｌ（１回あたりＭＯＭＰ免疫量１μｇ
／マウス）を尾静脈より投与した。最終免疫３日目の翌
日にマウスの頚椎脱臼後脾臓を摘出し単細胞分散を行い
細胞融合用の脾細胞とした。細胞融合用のパートナー細
胞には１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清加ダルベッコＭＥＭ
培地（１０Ｆ培地と略す）であらかじめ培養した（ナプ
コ社製ＣＯ₂インキュベーター、３７℃、５％炭酸ガ
ス、飽和湿度下）、Ｐ３Ｕ１マウスミエローマ細胞を用
いた。

【００２０】上記の脾細胞４．８×１０⁷個とＰ３Ｕ１
マウスミエローマ細胞１．２×１０⁷個とを混合し、遠
心分離（１，０００rpmで１０分）後、上清を吸引除去
し、軽く振動を与えて細胞ペレットをほぐした後、細胞
融合剤（５０％(ｖ／ｖ)ポリエチレングリコール；ＭＷ
＝４０００、メルク社製）を０．２ml加えた。１分４５
秒後、培養液１０mlを１分間かけて加え、さらに培養液
２０mlを加え懸濁後、段階的に遠心し分離した（３００
rpmで３分、５００rpmで３分、７００rpmで３分）。上
清を吸引除去し、細胞ペレットに５％ブライクローン
（大日本製薬製）を含有する１０Ｆ培地（１０Ｆ＋Ｂｒ
ｉ培地と略す）を加え、細胞浮遊液を調製した。細胞浮
遊液を９６ウエルのプラスチック平底マルチプレート
（コーニング社製）にミエローマ細胞換算で４×１０⁴
個／ウエル／０．１mlになるよう分注し、３７℃、５％
炭酸ガス、飽和湿度下で培養した。翌日ＨＡＴを含有す
る１０Ｆ培地（１×１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０
^-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０^-5Ｍチミジン及び１
０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を添加したダルベッコＭＥＭ
培地、ＨＡＴ培地と略す）を０．１ml／ウエル加え、更
に３、４日間隔で培養上清の半量をＨＡＴ培地におきか
え、いわゆるＨＡＴセレクションを約２週間にわたって
行い、ハイブリドーマの増殖が認められたウエルの上清
を採取して Dot Immuno Binding Assay法（以下、ＤＩ
ＢＡ法と略す）によりＥＢに対する抗体産生の有無をス
クリーニングした。

【００２１】ＤＩＢＡ法は９６ウエルのＵ底マルチプレ
ート（コーニング社製）を用い、あらかじめ、１ドット
当り０．０２μｇのＥＢを抗原として固定した３mm角の
メンブランフィルター（アドバンテック社製、４７mm径
格子入フィルターＡ０４５ｂ０４７Ａ）に１０％（ｖ／
ｖ）ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）を加え室温に１５分、
ついで上清除去後、ハイブリドーマの培養上清１００μ
ｌを加え室温に１時間、ついで上清除去後パーオキシダ
ーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペ
ル社製）の５００倍希釈液１００μｌを加えて同様に１
時間それぞれ反応させて最後に基質として４−クロル１
ナフトールを加えて発色させた。抗原を固定したメンブ
ランフィルター上に肉眼的に発色を認めたものを抗体産
生陽性と判定した。このスクリーニングの結果、抗体産
生陽性のウエルのハイブリドーマをさらに限界希釈法に
よりクローニングを行なった。すなわち、該抗体産生陽
性のハイブリドーマのＨＡＴ含有培地による浮遊液を調
製し細胞濃度を測定して新しいマイクロプレートにハイ
ブリドーマが２個／１００μｌ／ウエルになるよう希釈
液を分注して培養した。この時希釈液にはＨＴ＋５％ブ
ライクローン培地を用いた。

【００２２】ウエルでハイブリドーマの増殖が認められ
た場合は抗体産生能の測定と顕微鏡観察を行いモノクロ
ーンであることを確認した上さらに再度同じ操作を繰り
返し、抗体持続産生能の高い抗ＥＢモノクローナル抗体
産生クローンを得た。得られた各クローンは培養スケー
ルを徐々に上げ最終的に５０mlの１０Ｆ培地で培養その
培養上清につき抗体の性質を調べた。以上の実験操作を
前後２回にわたって行い、最終的にモノクローナル抗体
産生クローンを１株（ＣＰ−１１）得た。ハイブリドー
マクローンＣＰ−１１の産生するモノクローナル抗体の
グロブリンクラスはISOTYPE Ab-STAT-Iキット（Sang St
at Medical社）により測定した結果ＩｇＧ１であった。

【００２３】さらに、ハイブリドーマクローンＣＰ−１
１を１０Ｆ培地で培養して増殖した細胞をプリスタン
（和光純薬製）０．５ml／マウスを投与し前処理したＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１×１０⁷個づつ接種して
２〜３週間後に得られた腹水から本発明のモノクローナ
ル抗体を精製した。ハイブリドーマクローンＣＰ−１１
の腹水は下記の如くプロテインＡを固定化したアフィニ
ティカラムによる方法で精製した。すなわち、マウス腹
水と同量の１．５Ｍグリシン＋３ＭNaCl（pH８．９）を
加え０．４５μｍのナイロンフィルター（コーニング社
製）を通過させたのちプロテインＡ−ポロス（日本ガイ
シ製）のアフィニティカラムに付し１．５Ｍグリシン＋
３Ｍ ＮａＣｌ（pH８．９）で洗浄した。ついで１５０
ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸−クエン酸緩衝液（pH６．
０）で溶出させた。溶出液は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（pH９．０）で中和後冷却し、ＰＢＳで一晩透析
後、回収液の２８０nmの吸光度を測定（Ｕ−２０００、
日立製作所製）し、０．２μｍのセルロースアセテート
フィルター（コーニング社製）を通過させ−８０℃で保
存し精製抗体の保存液とした。

【００２４】４．モノクローナル抗体の特異性解析 モノクローナル抗体の特異性解析をウエスタンブロット
法で行った。クラミジア・ニューモニエとの反応性は上
記１．に記載した方法により得られたＥＢ溶液（ＥＢ濃
度７２７μg/ml）を使用した。具体的には、ＥＢ５０μ
ｇを含む前記ＥＢ溶液とサンプル処理液（０．０６３Ｍ
Ｔｒｉｓ、５％(ｖ／ｖ)２−メルカプトエタノール、
１０％(ｖ／ｖ)グリセリン、２．３％(ｗ／ｖ) ＳＤ
Ｓ、０．００１％(ｗ／ｖ)ＢＰＢ(Bromphenol Blue)(pH
６．８)）を１容：１容で混合し、１０分間煮沸した後
１００μｌ付加し、電気泳動した（電気泳動装置：ＡＥ
−６５６０(アトー社製)、ゲル：アトーパジェル１０２
０ＤＬ、泳動用バッファー：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、
０．１９２Ｍ グリシン、０．１％(ｗ／ｖ) ＳＤＳ(pH
８．３)、泳動条件：２０ｍＡ定電流、８０分間泳
動）。転写装置は、ＮＡ−１５１０（日本エイドー社
製）を使用した。

【００２５】あらかじめ氷中に浸しておいた転写用バッ
ファー（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｍ グリシ
ン、２０％(ｖ／ｖ) メタノール(pH８．３)）に泳動後
のゲル、３mm厚ろ紙（ワットマン社製）２枚及びニトロ
セルロース膜（バイオラッド社製）を転写用バッファー
に１５分間浸した。パット上にろ紙、ゲル、ニトロセル
ロース膜、ろ紙の順に乗せ、更にパットではさみ装置に
セットした。装置を氷中に置き、５０Ｖ定電圧、２時間
通電し、ニトロセルロース膜にタンパク質を移動させ
た。ニトロセルロース膜をＰＢＳ（日水製薬製）で洗浄
（２分間、２回、振とう）後、１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで
ブロッキング（３０分間、室温、振とう）した。ニトロ
セルロース膜をＰＢＳ（日水製薬製）で洗浄（２分間、
３回、振とう）後、表１に示す全てのハイブリドーマの
培養上清とそれぞれ反応（１時間、室温、振とう）させ
た。ＰＢＳで洗浄（２分間、３回、振とう）後、５００
倍希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体（カッペル社製）と反応（１時間、室
温、振とう）させた。ＰＢＳで洗浄（２分間、３回、振
とう）後、発色液（３mg/ml ４−クロロ−１−ナフトー
ル １ml、ＰＢＳ ５ml過酸化水素水 ２μｌ）を添加し
タンパク質のバンドが出現するまで反応させた後、蒸留
水で膜を数回洗浄し反応を停止した。

【００２６】クラミジア・トラコマティスとの反応性の
解析には精製クラミジア・トラコマティスＥＢ（Ｌ２株
由来）を使用し、上記条件と同様にウエスタンブロット
した。クラミジア・シッタシとの反応性の解析には精製
クラミジア・シッタシＥＢを使用し、上記条件と同様に
ウエスタンブロットした。その結果、このモノクローナ
ル抗体は、クラミジア・トラコマティスのＭＯＭＰとの
反応性を示さず、クラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰ
と非常に強い反応性を示し、クラミジア・シッタシのＭ
ＯＭＰとは微弱な反応性を示しただけであった。

【００２７】５．蛍光抗体法による抗体の解析（ニュー
モニエ、トラコマティス、シッタシ及びペコラムとの反
応性） クラミジア・ニューモニエ、トラコマティス、シッタシ
及びペコラムの各々の分離株を１μｌ点置したスライド
グラスに、ハイブリドーマＣＰ−１１の培養上清８μｌ
を載せ、湿箱に入れ３７℃に３時間反応させ、ＰＢＳと
蒸留水で洗浄し、風乾した。風乾後、１０倍希釈ＦＩＴ
Ｃ標識抗マウス免疫グロブリン・ヤギ血清（ＫＰＬ社）
８μｌを点置部位が全て覆われるように載せ、湿箱に入
れ３７℃で３０分間反応後、洗浄、風乾し封入液（５０
％(ｖ／ｖ)グリセリン−ＰＢＳ）１００μｌで封入し、
蛍光顕微鏡で観察した。その結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】 この結果から明らかなように、このモノクローナル抗体
を用いた蛍光抗体法では、強く反応するものはクラミジ
ア・ニューモニエ、微弱な反応を示すものはクラミジア
・シッタシ、全く反応のないものはクラミジア・トラコ
マティス又はクラミジア・ペコラムと診断することがで
きる。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マをＣＰ−１１として生命工学工業技術研究所へ寄託し
た（寄託番号：生命研菌寄第１４５９２号(ＦＥＲＭＰ
−１４５９２)）。以上の結果から、このモノクローナ
ル抗体は、クラミジア・ニューモニエのＭＯＭＰの、Ｅ
Ｂの膜外に露出する部分のアミノ酸配列を認識するもの
と判断できる。

【００２９】

【発明の効果】本発明のクラミジア・ニューモニエに対
するモノクローナル抗体は、量的に多く含まれるＭＯＭ
Ｐに反応し、尚且つ蛍光抗体法によりクラミジア・ニュ
ーモニエのＥＢに非常に強い反応性を示すことから、ク
ラミジア・ニューモニエの検出用に使用できる。クラミ
ジア・ニューモニエ又はそのＭＯＭＰを特異的に検出す
るための各種診断法、各種試薬に有用であり、また医薬
品としても有用である。また、本発明の抗体産生細胞は
上記抗体を産生することの他に抗体遺伝子のソースとし
ても有用である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成７年７ 月２０日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４５９２

【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５１５６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/571 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｑ Ｃ０７Ｋ 14/295 Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 川越 清隆 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 中野 博子 茨城県日立市東町四丁目13番１号 山崎産 業株式会社内 (72)発明者 永山 朱美 茨城県日立市東町四丁目13番１号 山崎産 業株式会社内 (72)発明者 斎藤 茂 茨城県日立市東町四丁目13番１号 山崎産 業株式会社内 (72)発明者 中尾 義喜 茨城県日立市東町四丁目13番１号 山崎産 業株式会社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クラミジア・ニューモニエの外膜主要タ
   ンパク質に対して反応性を有し、尚且つクラミジア・ニ
   ューモニエの基本小体に強い反応性を有するモノクロー
   ナル抗体。
2. 【請求項２】 クラミジア・トラコマティスの外膜主要
   タンパク質に対して実質的に反応性を有さない請求項１
   記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
   体の産生能を有するモノクローナル抗体産生細胞。
4. 【請求項４】 マウス由来の抗体産生細胞とマウスミエ
   ローマ細胞とのハイブリドーマである請求項３記載のモ
   ノクローナル抗体産生細胞。
5. 【請求項５】 ハイブリドーマＣＰ−１１（生命研菌寄
   第１４５９２号）である請求項４記載のモノクローナル
   抗体産生細胞。
6. 【請求項６】 請求項３、４又は５記載のモノクローナ
   ル抗体産生細胞を培養することを特徴とするモノクロー
   ナル抗体の製造法。
7. 【請求項７】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
   体を用いることを特徴とするクラミジア・ニューモニエ
   の検出法。
8. 【請求項８】 検出法が蛍光抗体法である請求項７記載
   のクラミジア・ニューモニエの検出法。