ES2270417T3

ES2270417T3 - Vacuna contra clamidias que comprende anticuerpos antiidiotipicos.

Info

Publication number: ES2270417T3
Application number: ES94915339T
Authority: ES
Inventors: Judith A. Whittum-Hudson; Alex Bruce Macdonald; Elizabeth Sutton Stuart; Ling Ling An
Original assignee: University of Massachusetts UMass; Johns Hopkins University
Current assignee: University of Massachusetts UMass; Johns Hopkins University
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-15
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2014-03-15
Also published as: DE69434796D1; CN1106203C; CA2158575C; IL109026A0; EP0690724A4; WO1994021291A1; JPH08512195A; EP0690724B1; CN1121312A; JP2990211B2; EP0690724A1; NZ266053A; US5840297A; AU695949B2; ATE333286T1; IL109026A; BR9406014A; CA2158575A1; DE69434796T2; AU6663494A

Abstract

UNA VACUNA DE CLAMIDIA DE GENERO ESPECIFICA, QUE CONSTA DE UN ANTICUERPO ANTI-IDIOTIPICO CAPAZ DE PRODUCIR EN UN ANIMAL UN ANTICUERPO ANTI-ANTI-IDIOTIPICO QUE RECONOCE UN EXOANTIGENO GLICOLIPIDO (GLXA) DE CLAMIDIA. LA VACUNA SE PRODUCE PRODUCIENDO UN ANTICUERPO IDIOTIPICO AL GLXA QUE, A SU VEZ, ES UTILIZADO PARA PRODUCIR EL ANTICUERPO ANTI-IDIOTIPICO QUE INCLUYE LA VACUNA.

Description

Vacuna contra clamidias que comprende anticuerpos antiidiotípicos.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a una vacuna contra antígenos clamidiales, un procedimiento para hacer la vacuna, un procedimiento para inmunizar una persona o un animal y un procedimiento para ensayar la presencia de una infección de clamidias. La infección clamidial es un grupo diverso de infecciones conjuntivales, genitales, respiratorias y neonatales que se presentan principalmente en superficies mucosas. El agente etiológico de la infección es un parásito bacterial intracelular de células eucarióticas, las clamidias. Hay tres especies genéticamente diferentes de este género, con ciertas similitudes en cuanto a morfología, ciclo de desarrollo intracelular y respuestas antigénicas: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y Chlamidya pneumoniae.

La infección por C. trachomatis esta limitada a seres humanos. Se diferencian quince serovares sobre la base de variaciones antigénicas de la proteína principal de la membrana exterior (MOMP) (Grayston y Wang, J. Infect. Dis. 132:87, 1975). Los serotipos D-K son la causa más común de enfermedades venéreas transmitidas sexualmente. Con criterio conservador, en los EE.UU. se pueden presentar cada año más de 4 millones de infecciones sexuales de clamidias, lo que hace que prevalezcan a todas las otras enfermedades combinadas transmitidas sexualmente. Las enfermedades incluyen uretritis no gonococal, cervicitis mucopurulenta, epididimitis aguda, embarazo ectópico y enfermedad inflamatoria pélvica (PID, endometritis, salpingitis, parametritis y/o peritonitis). La infección en mujeres puede ser bastante lesiva: de los 250.000 casos de enfermedades de inflamación pélvica causadas por este organismo en los EE.UU. cada año, un 10% condujo a la infertilidad. En cuanto a los niños nacidos de madres infectadas con clamidias, tienen un riesgo grande de desarrollar conjuntivitis y neumonía. Los serovares A, B, Ba y C de C. trachomatis causan tracoma, una infección de las células epiteliales conjuntivales. Las infecciones crónicas y secundarias inducen la infiltración de linfocitos subepiteliales, que forman folículos, y la invasión de fibroblastos y vasos sanguíneos en la córnea, lo que conduce a la ceguera. Por otra parte, la formación de cicatriz y la malformación del párpado causan que la pestaña raspe constantemente la córnea, lo que puede conducir a opacificación de la córnea y ceguera. Hay aproximadamente 500 millones de casos de tracoma en el mundo y entre 7 y 9 millones son ciegos ahora a causa de las complicaciones, lo que hace que el tracoma sea la causa más importante de ceguera evitable. La prevalencia del tracoma activo es alta en la edad temprana. Hay 80 millones de niños que necesitan tratamiento. Ha sido un problema de salud enormemente importante en el Medio Este, África del Norte, Sur de Asia y Norte de India.

C. psittaci afecta principalmente a los animales y pájaros. Ha tenido, y todavía tiene, un gran impacto económico en las industrias lácteas, de la lana y la alimentación. Hay 7 serovares de especies mamíferas, 7 serovares de especies de aves y 2 serovares de osos koala. Los serovares de mamíferos 1, 2, 3 y 9 infectan el ganado y los ovinos, ocasionando una gama amplia de trastornos por infección de la placenta y el feto y otros problemas reproductivos, incluidos poliartritis-polisisitis, encefalomielitis, conjuntivitis así como infecciones intestinales. Aunque se han hecho muchos intentos para producir vacunas, sólo se han logrado éxitos modestos (Schnorr, J. Am. Vet. Med. Assoc. 195:1548, 1989). Los serovares 4, 5 y 6 son causa de abortos, neumonía y poliartritis en especie de porcinos. El serovar 7 representa cepas clamidiales de conjuntivitis en felinos, rinitis y neumonitis y el serovar 8 incluye conjuntivitis de inclusión en la cobaya. Frecuentemente, las cepas de aves causan infección humana en comerciantes de pájaros y trabajadores de granjas de aves de corral.

C. pneumoniae es una especie recientemente identificada. Hasta ahora se ha identificado un serovar, TWAR (Grayston, Proceedings of the Seventh International Symposium on Human Chlamydial Infections, pág. 89, 1990). La evidencia actual sugiere que C. pneumoniae es un patógeno primario humano que se transmite de hombre a hombre y causa aproximadamente 10-20% de las neumonías adquiridas por la comunidad en adultos. Se ha convertido en el principal agente de enfermedades respiratorias humanas tales como neumonía, bronquitis, faringitis y sinusitis y en un posible agente en la artritis reactiva. Se han presentado epidemias en hospitales, el ejército y las familias. El hallazgo serológico de muchos países ha revelado que el 50-55% de adultos con anticuerpo contra el antígeno de TWAR es específico para C. pneumoniae. La infección en personas mayores y en quienes tienen enfermedades crónicas puede causar una enfermedad seria e incluso la muerte.

La capacidad patogénica de la infección clamidial no se conoce bien. Se sabe desde hace tiempo que diferentes individuos infectados por estos serovares presentan diferentes manifestaciones clínicas. Se ha propuesto que probablemente ello es debido a la variación de la respuesta inmune del huésped. Se ha demostrado que la respuesta inmunológica a los epitopos sintéticos de células Th/B en las varias cepas endógamas de ratones es diferente, lo que indica que el epitopo cooperador T se reconoce en el contexto del complejo de histocompatibilidad múltiple mayor.

Típicamente, la diana de la invasión clamidial son células epiteliales de un huésped. No se sabe con certeza todavía cómo entran en la célula huésped los cuerpos elementales clamidiales (EB) (una partícula esférica de tipo espora, de un diámetro de aproximadamente 300 nm): endocitosis mediada por receptor y/o absorción de alta afinidad no específica. Se ha dado cuenta de que dos proteínas, 18 y 32 kD de C. trachomatis, se unen a preparaciones de membrana de células Hela 299. Recientemente, se ha propuesto otra proteína de membrana lábil al calor, 38 kD, que se une a una línea de células Hela, lo que sugiere un mecanismo de tipo ligando. Se ha propuesto también que, puesto que las clamidias tienen la capacidad de infectar una amplia variedad de células mamíferas in vitro, debe haber algún mecanismo de adherencia para establecerse la infección. Como agente de tal adherencia se ha propuesto la proteína más importante de la membrana exterior. Recientemente se ha demostrado que, para la agregación a las células huésped, se requiere que esté presente un glicosaminoglicano sobre la superficie de organismos de clamidias. También se han estudiado los receptores en las células huésped. Se ha sugerido que las proteínas de 18.000 y 31.000 kD de células Hela son los receptores debido a la sensibilidad a la tripsina para la unión específica de EB. También se ha demostrado que C. trachomatis y C. pneumoniae se unen específicamente a un lípido de células Hela. El análisis por espectroscopía de resonancia magnética nuclear y espectroscopía de masas por bombardeo de átomos revelan que se trataba de fosfatidiletanolamina (PE). Al mismo tiempo, se encontró que glicolípidos de la serie ganglio se unieron específicamente a EBs. Todos estos hallazgos sugieren que el mecanismo de endocitosis por células huésped epiteliales es, todavía, una cuestión de incertidumbre. Una vez que los EBs entran en las células huésped por endocitosis, dependiendo de las condiciones, se transforman en un cuerpo reticulado (RB) metabólicamente activo, no infeccioso. El propósito principal de los RBs es la replicación intracelular por fusión binaria usando metabolitos del huésped. Esto se produce en una vesícula unida a membrana, denominada inclusión. Esta inclusión (endosoma) puede resistir la fusión con los lisosomas de las células huésped. Eventualmente, cada RB puede dar origen a uno o más EBs que pueden iniciar otro ciclo infeccioso. Las células huésped se pueden lisar de cuerpos de inclusión o sanar por exocitones de cuerpos de exclusión. Se cree que antígenos de superficie dirigen la fagocitosis y la evasión de fusión fagolisosomal.

El tratamiento de las infecciones clamidiales se ha basado en la administración de antibióticos. Esto ha demostrado ser efectivo en las etapas tempranas de la infección dependiendo de si el momento de la diagnosis y exploración es el apropiado. El problema es que la infección puede ser asintomática. La mayoría de los pacientes no creen en su presencia hasta un tiempo después de la infección. En el estado crónico, como en el caso de una infección genital, se ha demostrado que poco se puede hacer para prevenir la lesión de los tractos reproductores en un modelo de infección de mono.

Se han usado vacunas que emplean el organismo entero o subunidades del organismo en un intento para prevenir las infecciones de clamidias causadas por miembros de los biovares de tracoma. Estos intentos, sin embargo, han resultados ser decepcionantes en parte debido a la hipersensibilidad del huésped al reaccionar con las vacunas (Grayston y otros, Clini. Med. J. (Republic of China) 8:312, 1961; Wang y otros, 1967, Am. J. Ophtalmol. 63:1615; Schachter, Pathol. Immunopathol. Res. 8:206, 1989). Se cree que la patogénesis asociada con las infecciones es un proceso de hipersensibilidad demorada. Se cree que la inflamación crónica resultante de la reinfección repetida de seres humanos tiene un papel importante en la infiltración conjuntival, las secuelas cegadoras de tracoma y la cicatrización de los tubos de Falopio con el resultado de infertilidad y embarazo ectópico. Los antígenos de superficie de cuerpos elementales han sido el foco de investigación que pretende identificar un antígeno protector.

Los componentes de superficie de clamidias interactúan activamente con células huésped y con el sistema inmune del huésped. Se cree que son la causa de la unión, endocitosis y la respuesta inmune, pero todavía no se han identificado totalmente la naturaleza exacta y la regulación de estas interacciones. Se han investigado varios componentes antígénicos distintos de C. trachomatis, C. psittaci y C. pneumoniae, incluidas la caracterización y función en la infección clamidial. Además, es importante determinar el mecanismo de la infección y determinar los antígenos protectores. Los antígenos expuestos en la superficie son las dianas principales de mucha investigación, dado que son accesibles al sistema inmune u otros sistemas de defensa. Entre los antígenos más activamente investigados están incluidos proteínas mayores de la membrana exterior (MOMP), lipopolisacáridos clamidiales, adhesinas de proteínas de choque de calor de 60-kD (HSPO 60), y un exoantígeno glicolipídico denominado exoantígeno (GLXA).

En la membrana exterior de clamidias hay tres proteínas ricas en cistina, 57, 40 y 12,5 kD, que se asemejan a las proteínas de matriz de bacterias gram negativas. Las proteínas de 57 y 12,5 kD no se pueden encontrar en forma de replicación de los RBs de bacterias. Como proteína mayor de la membrana exterior (MOPM), 40 kD, es abundante en EBs infecciosos y RBs. En RBs, la proteína podría actuar como proteína formadora de poros que permiten el intercambio de nutrientes para los cuerpos reticulados. La caracterización genética y molecular ha revelado que esta proteína está compuesta por cuatro segmentos variables (VS) dispersados entre cinco segmentos constantes. Esos segmentos variables están expuestos en la superficie y tienen los determinantes de especifidad de serovares, subespecies y especies.

Los estudios sobre respuestas inmunes a esta proteína en su mayor parte se han realizado por inmunización de animales con proteína purificada. Los experimentos de neutralización in vitro se han realizado usando la mezcla de anticuerpos policlonales o monoclonales específicos a MOMP y EBs para infectar cultivos de células. Estos experimentos indican que los anticuerpos específicos para la proteína MOMP o un epitopo individual previenen la formación de cuerpos de inclusión en cultivos de células. El mecanismo de neutralización no implica la inhibición de la agregación o penetración, sino que interfiere con el proceso después de la internalización. Usando anticuerpos monoclonales generados por cuerpos totalmente elementales del serovar B, los anticuerpos monoclonales que reconocían el epitopo de MOMP inmunoaccesible en ensayos de transferencia de mancha neutralizaban la capacidad de infección de organismos de los ojos del mono. La protección era específica para el serovar. En un experimento posterior usando fragmentos de Fab del anticuerpo monoclonal, se ha demostrado además que el Fab monovalente neutralizaba la infección por prevenir la agregación a células de riñón de hamster sirio (HaK). Lo que confirma que la protección no es debida a la agregación de IgGs bivalentes. También se han investigado los epitopos de células T. Se encontraron respuestas de proliferación de células T en células T esplénicas obtenidas de ratones A/J inmunizados con MOMP en presencia de péptidos sintéticos que se solapan, que representan la secuencia primaria de MOMP de serovar A. Los péptidos sintéticos que producían la respuesta de células T corresponden a epitopos serovar-específicos accesibles en la superficie, localizados en los dominios variables (VD) VD I y VD IV. Usando un enfoque similar, se encontró en ratones BALB/cByJ que el fragmento VDIII es dependiente de células T. También se ha visto que, usando péptidos de células T/B quiméricas derivadas de dos epitopos de MOMP, uno es un epitopo de células cooperadoras T conservadas y el otro es un epitopo neutralizante específico para el serovar A. Algunos ratones inmunizados con este péptido produjeron anticuerpos neutralizantes de suero de alta titulación, mientras que otros no lo hicieron. Aunque MOMP ha sido un antígeno de superficie estudiado muy intensivamente y los antisueros neutralizantes se han producido en animales experimentales, hay todavía muchas cuestiones sin resolver en cuanto a la respuesta inmune. Por ejemplo, la neutralización de la infección es específica para el serovar, por lo que está limitada como candidato a la vacuna. La neutralización está limitada todavía a estudios in vitro y no ha habido una protección in vivo convincente del reto por inmunización con cualquier MOMP o epitopos quiméricos conocidos.

Se ha conocido desde hace tiempo que un antígeno específico del genero chlamydia era un glicolípido (Dhir y otros, J. Immunol. 109:116-122, 1972). Se encontró mucho más tarde que el lipopolisacárido (LPS) estaba en la membrana exterior de los EBs y RBs de clamidias. Tiene una estructura química similar a la de LPS enterobacterial del quimiotipo Re (Nurminan y otros, Science, 220:1279-1281, 1983). Los anticuerpos monoclonales preparados por inmunización con EBs del serovar L2 eran específicamente contra LPS de clamidias pero no LPS de N. Gonorrhoeae, S. typhimurium o E. Coli. Sin embargo, los anticuerpos producidos por Re LPS de S. typhimurium o lípido A reconocían LPS clamidial (Caldwell y Hitchcock, Infect. Immun., 44:306, 1984). Esto demostró que LPS clamidial tiene un singular dominio antigénico en comparación con otras bacterias gram negativas. Posterior caracterización ha revelado que un dominio específico para clamidias contenía, en su porción de sacárido, ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO) con una secuencia de -kDo (2-8)- kDo(2-4)- kDo(kDo_{3}). El resto unido 2,8 es la característica estructural del LPS clamidial. Se han realizado también estudios sobre la distribución y recubicación de LPS sobre la membrana durante el ciclo de desarrollo. Por tinción con un anticuerpo monoclonal, se demostró que el LPS está unido holgadamente en la membrana durante el ciclo de desarrollo y no se desparramó al medio.

Se creyó que el LPS clamidial es un antígeno ideal para candidato a vacuna a causa de su abundancia en la superficie y su carácter antigénico. Se sospechó que el LPS es un importante determinante virulento en las etapas tempranas de la infección y que los anticuerpos específicos para él tienen alguna función en la resolución de la infección clamidial. Sin embargo, se conoce poco concerniente a la función biológica de LPS o la respuesta inmunológica a él. Parece que los anticuerpos específicos para LPS sólo han sido útiles en la diagnosis de la infección clamidial y la localización de LPS, pero no son efectivos para resolver la infección.

Otros antígenos específicos para el género son las proteínas 57 a 60 y 75 kD, que se han identificado como relacionadas con la familia de proteínas de choque de calor (HSP). Esto se hizo comparando la secuencia de los operones que codifican estas proteínas con el operón de respuesta a la tensión de groE de E. Coli o B. megaterium. Se confirmó la identidad antigénica de la proteína 57 kD por la reacción con antisuero anti-HSP 60. La proteína 60 kD edujo una respuesta de hipersensibilidad ocular en cobayas inmunizadas, que se caracterizaba por una infiltración celular de macrófagos predominantemente mononucleares y linfocitos (Watkins y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7580, 1986; Morrison y otros, S. Exp. Med. 169:663, 1989). Esta era la primera indicación de que un antígeno es responsable de la hipersensibilidad demorada en la infección ocular clamidial. No se ha determinado la implicación precisa de esta proteína en la estimulación de respuestas inmunopatogénicas en enfermedades clamidiales humanas. Hay evidencia que revela que un cierto porcentaje de suero tomado de mujeres con PID, embarazo ectópico e infertilidad tubal tiene anticuerpos anticlamidiales que reaccionan con la proteína de choque de calor HSPO-60. Sin embargo, no todos los sueros de pacientes que tienen un título alto para clamidias reaccionan con ella, lo que indica que la HSP-60 no está expuesta en la superficie o que la capacidad antigénica esta restringida por MHC.

La proteína 75-kD se encontró preferentemente transcrita durante la tensión por calor de organismos clamidiales. Se encontró que los anticuerpos específicos de conejos criados contra la proteína 75-kD se unen al organismo y neutralizan la infección in vitro. Es un antígeno expuesto en la membrana exterior.

El exoantígeno glicolipídico especifico para el género (GLXA) se aisló originalmente del material sobrenadante de cultivos de células infectadas con clamidia (Stuart y MacDonald, Current Micobiology, 11:123, 1982). Ha sido caracterizado química, biológica y serológicamente en años recientes (Stuart y MacDonald, Proceedings of the Sixth International Symposium on Human Chlamydia Infections, p167, 1986; Stuart y otros, Immunology, 67:527, 1987). El análisis espectrográfico de masas indicó que el GLXA contiene polisacáridos: gulosa (no glucosa), manosa y, posiblemente, galactosa, en tanto que el componente lipídico tiene ácidos grasos de cadena larga C17 y C18:1. No se ha encontrado en su estructura KDO o lípido A. Se produce y libera de células infectadas durante el ciclo de crecimiento in vitro. La microscopía electrónica de transmisión, utilizando anticuerpo segundo coloidal conjugado con oro, de cabra antirratón para detectar el anticuerpo monoclonal unido específicamente, reveló que el GLXA es en su mayor parte extracelular 48 horas después de la infección (Stuart y otros, Immunology, 74:747, 1991), lo que es diferente de lo encontrado para LPS clamidial. Los sueros humanos de pacientes con linfogranuloma venéreo (LGV) definido clínicamente contienen anticuerpos de IgG que reconocen GLXA (Stuart y MacDonals, Immunology, 68:469, 1989), lo que demuestra la inmunoaccesibilidad en la infección natural. Pero había poca información sobre su función en la infección clamidial y la respuesta inmune a ella. La reacción inmunológica global a los antígenos clamidiales no se conoce bien. Todavía no se conoce cómo evaden las clamidias la vigilancia del huésped inmune. Los anticuerpos encontrados como específicos para antígenos clamidiales en pacientes humanos infectados han presentado poca protección para una infección posterior. Aunque las clamidias afectan principalmente a las superficies mucosas, no se ha descrito totalmente la importancia clínica de la inmunidad de IgA a ellas. La factibilidad de la vacuna contra clamidias depende de la producción de una defensa protectora del huésped que puede incluir una respuesta de S-IgGA, una respuesta celular mediada y, posiblemente un anticuerpo humoral. Además, la capacidad para producir cantidades grandes de este antígeno indica que un antígeno sintético y/o quimérico puede ser el procedimiento de
elección.

Se han estudiado intensivamente idiotipos siguiendo la teoría reticular de Jeme en 1974. Una de sus principales propuestas es la autorregulación del sistema inmune a través de una red de interacciones idiotipo-antiidiotipo (Jeme, 1974). Se ha sugerido que los idiotipos en una molécula individual de anticuerpo pueden imitar (esto es, ser la "imagen interna") cualquier epitopo foráneo o propio a nivel molecular.

Se ha encontrado que todos los epitopos de una molécula individual de inmunoglobulina están situados en la región de Fv (fragmento variable) mediante estudios que revelan que la inhibición de la unión de anticuerpos antiidiotípicos al idiotipo es la misma entre Fv y Fab (Givol, 1991). En general, los anticuerpos antiidióticos se dividen en tres tipos: Ab_{2}\alpha, Ab_{2}\beta y Ab_{2}\varepsilon. Sólo Ab_{2}\beta se une a la región que determina la complementariedad, por lo que puede ser la imagen interna del antígeno. La presencia de Ab_{2} que expone la imagen o las propiedades internas debe adherirse a los criterios siguientes: (1) unirse a Ab_{1} o a cualesquier otros anticuerpos antigénicos antinominales de otra especie y falta de reactividad con Ab_{2} a otros anticuerpos; (2) inhibición de la unión de Ab_{1} al antígeno específico, el antígeno nominal, y (3) la capacidad de educir la síntesis de Ab_{3} con especifidad anti-antigénica en animales sin una previa exposición al antígeno (Ertl y Bona, 1988).

Numerosos experimentos han revelado el importante papel de anticuerpos antiidiotípicos in vivo. Se encontró que la administración de anticuerpos antiidiotípicos inducía diferentes efectos: la supresión o la intensificación de las respuestas al idiotipo específico (Hart, 1972; Kennedy, 1983). En la autoinmunidad juega con certeza un papel importante. La patología asociada con muchas enfermedades autoinmunes muy probablamente es debida (al menos en parte) a una interacción directa idiotipo-antiidiotipo de los anticuerpos antiinmunes con anticuerpos antidiotípicos. Primeramente se caracterizó la especifidad antiidiotípica en un anticuerpo espacífico demostrando una unión específica al azar podía inhibir el reconocimiento del idiotipo. El primer soporte experimental de la validez de la imagen interna lo presentaron Sege y Peterson en 1978 usando un idiotipo como sonda para identificar receptores de células de superficie.

La mejor información de la base molecular exacta para la imitación se obtiene actualmente por cristalografía de rayos X del complejo idiotipo-antiidiotipo. La base molecular para la imitación de los anticuerpos puede ser la homología de secuencia local con la proteína original como en el sistema reovirus o, en la mayoría de los casos, conformaciones idénticas de las totalmente diferentes secuencias de aminoácidos, como en la familia homoglobina-mioglobina de proteínas. La cristalografía de rayos X y los datos de secuencias de los úiltimos estudios revelaron que proteínas que difieren en más de 137 o 141 aminoácidos pueden asumir idénticas conformaciones funcionales. Los estudios de la estructura cristalina del complejo idiotipo-antiidiotipo en el anticuerpo de antilisozima y el antiidiotipo han demostrado que un idiotipo privado está constituido por 13 restos de aminoácidos, la mayoría de regiones determinantes de complementariedad, pero que incluye tres restos de la tercera región de armazón de su dominio VL. Siete de estos restos son comunes con el paratopo de anticuerpo antilisozima, lo que indica un solapamiento significativo entre idiotipo y sitio que combina antígeno. El idiotipo ha sido una herramienta singular en la caracterización y manipulación de la respuesta inmune puesto que se encontró y realizó: como un marcador clonal para seguir el desarrollo de células B, la mutación somática y la destrucción de clones de células B. Se han usado como marcador fenotípico para genes V de la línea de gérmenes. Los anticuerpos antiidióticos que presentan la imagen interna de patógenos externos tales como virus, bacterias o parásitos, se han usado como antígenos subrogados para vacunas y se están usando en el tratamiento de linfomas de células B y enfermedades autoinmunes tales como encefalomielitis.

Antes de la presente invención, la producción de anticuerpos neutralizantes usando un anticuerpo de idiotipo anti-antiidiotípico para imitar un antígeno de carbohidrato se ha logrado usando un sistema de bacterias, Schriver y otros, J. of Immunol. 144: 1023, 1990.

Consecuentemente, sería deseable proporcionar un medio para preparar una vacuna de un género específico capaz de proporcionar inmunización de la infección clamidial. Sería también deseable proporcionar un medio para producir tal vacuna en cantidad y para proporcionar un procedimiento para aumentar la eficacia de la vacuna.

De acuerdo con ello, en un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal antiidiotípico según se reivindica en la reivindicación 1. La presente invención también proporciona una línea continua de células híbridas según se reivindica en la reivindicación 2, una vacuna según se reivindica en la reivindicación 6, y un procedimiento para detectar la presencia de un anticuerpo según se reivindica en la reivindicación 9. La presente invención también proporciona un procedimiento para detectar células según se reivindica en la reivindicación 12 y una composición según se reivindica en la reivindicación 16.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una curva de unión de antisuero de cobaya a GLXA-Ab_{1} monoclonal.

La Figura 2 es una curva de unión de antisuero de GLXA-Ab_{1} IgG antimonoclonal de cobaya a IgG de ratón normal antes y después de inmunosorción.

La Figura 3 es una curva que presenta la inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} a GLXA por antisueros antiidiotípicos absorbidos de cobaya.

La Figura 4 es una curva que presenta el fraccionamiento de IgG antiidiotípico de cobaya.

La Figura 5 es una curva que presenta la inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA por isotipos antiidiotípicos de cobaya.

La Figura 6 es una curva que presenta la unión de anticuerpo anti-antiidiotípico de cobaya a IgG antiidiotípico de cobaya.

La Figura 7 es una curva que presenta la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA por GLXA-Ab_{3} de conejo.

La Figura 8 es una curva que presenta la detección de RNA ribosomal específico para clamidias de primates.

La Figura 9 es una curva que presenta el efecto de GLXA-Ab_{3} IgG sobre la infección ocular por puntuación clínica de la enfermedad.

La Figura 10 es una curva que presenta la inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} a GLXA por un clon de hibridoma.

La Figura 11 es una curva que presenta la unión directa de antisuero de paciente de clamidias a GLXA-M Ab_{2} monoclonal.

La Figura 12 es una curva que revela que el antisuero anticlamidias de conejo reconoce GLXA-M Ab_{2} monoclonal.

La Figura 13 es una curva que muestra la protección de ratones frente a la infección clamidial por inmunización con GLXA-M Ab_{2} monoclonal.

La Figura 14 es una curva de protección por GLXA-M Ab_{2} IgG después de una dosis alta de infecciones oculares.

La Figura 15 es una curva que presenta el efecto de alum sobre la protección frente a la infección clamidial de ratón.

Las Figuras 16A y B corresponden a curvas de la capacidad de infección en función del tiempo después de inmunización con GLXA-Ab_{2}.

Descripción de realizaciones específicas

La presente invención está basada en el descubrimiento de que un anticuerpo antiidiotípico (denominado aquí GLXA-Ab_{2}) es capaz de producir en un animal un anticuerpo antiidiotípico (denominado aquí GLXA-Ab_{3}) que reconoce GLXA, que es capaz de inmunizar un animal frente a clamidias y es capaz de neutralizar la infección de clamidias en un animal. Además, se ha encontrado de acuerdo con esta invención que el anticuerpo antiidiotípico útil puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Además se ha descubierto que estas actividades del GLXA-Ab_{2} sorprendentemente se obtienen a pesar del hecho de que su predecesor, el anticuerpo idiotípico (denominado aquí GLXA-Ab_{1}) del que se obtiene Ab_{2}, no tiene actividad significativa alguna en la inmunización o la neutralización contra la infección de clamidias.

Usando GLXA-Ab_{2} para imitar el carbohidrato del antígeno glicolipídico, la presente invención ofrece una estrategia alternativa para la conversión de un antígeno timodependiente porque las vacunas del idiotipo son proteínas. La disponibilidad de GLXA-Ab_{2} que imita el antígeno clamidial, GLXA, de acuerdo con esta invención, es importante: (1) en la elucidación de los mecanismos inmunológicos asociados con el epitopo de carbohidrato presente en el GLXA, (2) su función en una infección clamidial tal como la unión y fagocitosis de las células huésped y (3) proporciona una herramienta esencial para identificar un receptor específico de GLXA de las células huésped. También proporciona un medio para prodcir una vacuna clamidial.

El GLXA-Ab_{2} es un inmunógeno (esto es, capaz de inducir una respuesta inmune) y que se une específicamente con los productos de esa respuesta, sean anticuerpos y/o receptores de células de superficie de células B o células T. La rápida respuesta a GLXA-Ab_{2} monoclonal y la memoria demostrada en el experimento de reto repetido que se discute más adelante en el Ejemplo I y las Figuras 16A y B indican que se ha estimulado una respuesta de células T. Esto significa que la célula cooperadora T está respondiendo a un determinante antigénico (epitopo) que difiere del epitopo de GLXA y está implicado en la estimulación de células B que produce un receptor de anticuerpo para GLXA-Ab_{3} que une GLXA. Además, la célula cooperadora T puede ser del tipo que produce citoquinas que se ha visto que están implicadas en infecciones protectoras de clamidias. Dos de éstas son INF gamma (interferón gamma) y TNF (factor de necrosis tumoral).

De acuerdo con esta invención, se proporciona: (1) producción de anticuerpos antiidiotípicos policlonales y monoclonales seleccionados para la imagen interna de un epitopo antigénico en GLXA, (2) caracterización de anticuerpos antiidiotípicos, (3) una vacuna que proporciona inmunización, neutralización y protección frente a la infección clamidial tanto in vitro como in vivo, y (4) un procedimiento para detectar la presencia de clamidias en una muestra biológica.

De acuerdo con esta invención, para producir una vacuna contra la infección de clamidias se produce en una primera etapa, por cualquier procedimiento convencional, un anticuerpo de GLXA.

El GLXA se obtiene y purifica por cualquier procedimiento actualmente disponible. Así, el GLXA se puede aislar en una columna de octilsefarosa y eluir con alcohol; aislar sobre DEAE sefarosa y eluir en solución acuoso de pH bajo o aislar en una columna de perlas de poliamida y eluir con una solución acuosa de pH bajo de KSCN (5 M).

En un procedimiento preferente, el GLXA se obtiene y purifica de material sobrenadante de cultivos de células infectadas por procedimientos actualmente disponibles, tales como cromatografía de exclusión en una columna Sepharose 6B-Cl en fosfato 0,075 M, NaCl 0,154 M, pH 2. El GLXA aparece en la fracción frontal de la columna y se detecta mediante un ensayo de quimioluminescencia usando un GLXA-Ab_{1} monoclonal conjugado con éster de acridinio. Usualmente, las fracciones que contienen el GLXA están contaminadas por ácidos nucleicos, pero no con proteína. Se combinan las fracciones de GLXA, se concentra la combinación y se trata con RNAasa y DNAasa a pH 8,0 durante aproximadamente 2 h a 37ºC. La mezcla se vuelve a cromatografiar en la misma columna y queda pura. Se puede almacenar a 4ºC (con o sin conservante).

El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. En la producción de un anticuerpo monoclonal, se obtiene un anticuerpo idiotípíco GLXA-Ab_{1} inmunizando un animal, usualmente un ratón, con GLXA como antígeno. Se identifican luego células inmunes de bazo, se aislan y se funden con células de linfoma o mieloma por contacto con un agente de fusión tal como etilenglicol, como puede ser por el procedimiento de Kohler y Milstein, Nature 256:459, 1975. Las células fusionadas se incuban luego en un medio selectivo tal como el medio HAT que evita el crecimiento de células malignas no fusionadas. Las células de hibridoma se clonan por dilución limitada y se ensaya el material sobrenadante en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales secretados de una especifidad deseada. Está depositado en la American Type Culture Collection un hibridoma adecuado para producir GLXA-Ab_{1}, identificado como ATCC H.B. 11300. También se pueden obtener anticuerpos monoclonales por crecimiento ascítico de hibridomas in vivo. Alternativamente, las células de linfocitos se pueden inmortalizar por exposición al virus de Epstein-Barr. El anticuerpo de idiotipo GLXA-Ab_{1} es útil para producir GLXA-Ab_{2} que, sorprendentemente, es activo en la inmunización contra una infección de clamidias o en su neutralización. Además, GLXA-Ab_{2} no es especifico para una especie pero es específico para un género en cuanto a que su actividad de inmunización o neutralización es útil en muchas especies animales. El GLXA-Ab_{2}monoclonal se puede producir tambiénutilizando hibridomas por el procedimiento descrito antes para GLXA-Ab_{1,} pero utilizando GLXA-Ab_{1} como antígeno. En la American Type Culture Collection está depositado un hibridoma adecuado para producir GLXA-Ab_{2,} identificado como ATCC H.B. 11301. También se puede producir GLXA-Ab_{2} como anticuerpo policlonal y, como anticuerpo policlonal, es activo para inmunización contra una infección de clamidias o para neutralizarla. Los anticuerpos policlonales se hacen de cualquier manera convencional en la que primeramente se inmuniza un animal con GLXA como antígeno y se aisla GLXA-Ab_{1} policlonal del suero del animal. Luego el GLXA-Ab_{1} policlonal o GLXA-Ab_{1} monoclonal se inyecta en un segundo animal de una especie diferente del primer animal y se recupera luego GLXA-Ab_{2} del suero del segundo animal.

Ambos, el GLXA-Ab_{2} monoclonal o el GLXA-Ab_{2} policlonal, son anticuerpos anti-antiidiotípicos que imitan un antígeno que comprende un exoantígeno glicolipídico clamidial específico para género (GLXA). Ambas formas de GLXA-Ab_{2} son útiles como vacuna para inmunizar un animal contra una infección clamidial específica para un género. Además, ambas formas de GLXA-Ab_{2} son útiles para ser administradas a un animal infectado con clamidias con el fin de neutralizar una infección clamidial de género específico.

También, de acuerdo con esta invención, se pueden preparar las vacunas del fragmento Fab adecuadas para inmunizar frente a la infección de clamidias o para neutralizarla a partir de fragmentos Fab de GLXA-Ab_{2}. Los fragmentos de Fab se pueden preparar de GLXA-Ab_{2} por cualquier medio convencional tal como exponiendo GLXA-Ab_{2} a papaína o por exposición a tripsina o cromotripsina, seguida de reducción o alquilación.

La vacuna se prepara mezclando GLXA-Ab_{2} IgG o el fragmento Fab de GLXA-Ab_{2} monoclonal en un disolvente adecuado, tal como un tampón acuoso de fosfato o similar para que resulte una concentración final de 1 mg por ml de proteína. Por ejemplo, para cada administración a una persona de tamaño normal, de 50 \mul (50 \mug) a 100 \mul (100 \mug) de la solución se diluyen a 4500 \mul, que se mezclan con 500 \mul de un coadyuvante farmacéuticamente aceptable tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio o similar (500 \mug) o fosfato de aluminio, de pH 6,0+0,1. La dosis particular variará de animal a animal dependiendo, por ejemplo, del peso del animal.

Los Ab_{2} policlonales o monoclonales de esta invención son también útiles para determinar si una muestra biológica está infectada con clamidias. El Ab_{2} se utiliza en forma marcada para determinar si Ab_{1} se une con determinantes antigénicos de clamidia en una muestra biológica. El Ab_{2} se puede marcar con una enzima, fluoroporo, un radioisótopo o un agente luminiscente, y la cuantía de la unión, si la hay, se puede determinar determinando la cuantía de una posterior reacción de la enzima, por fluorescencia o emisión de radiactividad o luminiscencia en la muestra biológica después de ser expuesta al Ab_{2} marcado. Se puede utilizar cualquier ensayo convencional en el que el Ab_{2} marcado o un fragmento Fab de Ab_{2} se expone a una muestra biológica para determinar la cuantía de unión. Por ejemplo, se puede inmovilizar una muestra biológica en un soporte sólido mediante, por ejemplo, fijación con metanol o etanol. La muestra se somete luego al Ab_{2} marcado o el fragmento Fab de Ab_{2}. Luego se determina la cuantía de la unión controlando la presencia del marcador. Además, se puede determinar Ab_{2} en una forma no marcada poniendo en contacto el Ab_{2} con la muestra biológica y determinando la concentración de los inmunocomplejos formados, si se han formado.

En otro aspecto de la invención, el GLXA-Ab_{2} monoclonal se puede utilizar para determinar el receptor de clamidias en la superficie de células eucarióticas tales como células epiteliales. Se puede complejar con biotina GLXA-Ab_{2} IgG o el fragmento Fab de GLXA-Ab_{2} monoclonal para formar un primer inmunocomplejo que luego, a su vez, se pone en contacto con las células para que se efectúe la unión del complejo con el receptor de células para GLXA-Ab_{2} monoclonal. Las células se incuban luego con avidina marcada que se une a la biotina del inmunocomplejo unido al receptor de la célula. Luego se detecta en la célula el marcador para identificar el receptor. Las células marcadas se pueden apartar de las células no marcadas por un separador de células convencional capaz de identificar la marca, tal como un marcador por fluorescencia. Una vez que se ha determinado de esta manera el receptor, se puede determinar el mecanismo de endocitosis celular respecto a clamidias. Entre los marcadores adicionales que se pueden utilizar están incluidos radioisótopos, enzimas y agentes luminiscentes.

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención y no la limitan.

Ejemplo 1

A lo largo de este estudio se usaron dos serovares de C. trachomatis. Los organismos de serovar B (cepa Har 36) se aislaron originalmente de raspados conjuntivales de un niño, se hicieron crecer a 37ºC en monocapa de células McCoy con medio esencial mínimo de Eagle con solución salina equilibrada de Hank (HMEM, Whittaker, MD) y se almacenaron a -70º C en el mismo medio con 10% de dimetilsulfóxido (Sigma Chemical Co., MO). El serovar C (TW-3-) se hizo crecer en un cultivo de tejido masivo en células McCoy. Los cuerpos elementales se purificaron por centrifugación a través de renografin, se pusieron en suspensión en solución salina tamponada con fosfato y se almacenaron a -70ºC.

Se obtuvieron originalmente de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) cobayas de una cepa Hartley exenta de clamidias y se criaron y mantuvieron en un animalario. En este estudio se usaron hembras de un año de edad.

Se obtuvieron de Bill Brock Farm (Hadly, MA) conejos hembra de Nueva Zelanda exentos de Pasteurella. Los conejos pesaban aproximadamente 2,7-3,6 kg cuando se recibieron y se usaron dentro de una semana después. Se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) ratones BALB/cByJ (H-2d). Se obtuvieron de Charles River Primates, Inc (Port Washington, NY) macacos jóvenes adultos que no tenían enfermedades clínicas oculares. Todos los primates se habían usado para una infección ocular anterior con cuerpos elementales de serovar C de C. trachomatis; algunos primates se habían inmunizado previamente con una proteína clamidial. Los primates desafiados en este estudio estaban exentos de la enfermedad y no eran inmunes. Se distribuyeron al azar antes de iniciar el experimento. Todos los experimentos se realizaron bajo anestesia.

Para la producciónn de anticuerpos antiidióticos policlonales, cada una de 6 cobayas se inmunizó subcutáneamente con 150 ug de GLXA-Ab_{1} monoclonal (89MS30) IgG en 1 ml de H_{2}O más 1 ml de suspensión de Maalox Plus (William H. Roger, Inc. PA). Tres semanas después, se hizo a las cobayas una inmunización de recuerdo con 100 ug de GLXA-Ab_{1} monoclonal en 1 ml de Maalox (hidróxido de aluminio, alum) y H_{2}O y recibieron inmunizaciones de recuerdo mensualmente.

Para la producción de anticuerpos anti-antiidiotípicos, se inmunizaron 3 ratones con IgGI isotipo antiidiotípico de cobaya absorbido, 300 ug en 1 ml de alum y 1 ml de H_{2}O, intradérmicamente en múltiples sitios y recibieron inmunización de recuerdo tres semanas después usando idéntico protocolo. Posteriormente, a los ratones se administró la inmunización de recuerdo a intervalos de un mes. Para la producción de anticuerpo anti-antiidiotípico monoclonal, GLXA-Ab_{2} (91 MS441) IgG, se inyectaron intraperitonealmente 50 ug de GLXA-Ab_{1} IgG conjugado con KLH en 5 ratones BALB/cByJ de 9 semanas de edad en una cantidad igual de coadyuvante completo de Freund (Sigma, MO). Se usó la misma cantidad para la posterior inyección de recuerdo el día 14 y después semanalmente durante 5 semanas en presencia de coadyuvante de Freund incompleto. Tres días antes de extraer el bazo se dio una inyección final de recuerdo. Para la protección del experimento de infección clamidial, se inmunizaron dos grupos de ratones BALB/cByJ (de 6 a 20 en cada grupo) con 50 ug de GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal o 50 ug de IgG normal de ratón por ratón subcutáneamente con o sin Maalox y se dio semanalmente durante tres meses una inyección de recuerdo.

Se aisló GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Los ascites que contienen GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal se hicieron pasar primeramente a través de lana de vidrio para eliminar lípidos y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 min para eliminar precipitados. La columna de afinidad (1,5 x 9 cm) se rellenó con 2 ml de Sepharose CL48 de proteína A (ZYMED, CA) y se equilibró primeramente con un tampón de unión (glicina 1,5 M, NaCl 3 M, pH 8,9) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA). Se cargaron 2 ml de ascites diluidos con igual cantidad de tampón de unión en la columna a 0,6-0,8 ml/min. La columna se paró durante aproximadamente 30 min para permitir la unión y luego se enjuagó con aproximadamente tres volúmenes del lecho con tampón de unión. La IgG unida se eluyó con ácido cítrico 0,1 M, pH 3, en tubos de vidrio que contenían 50 ul de TBS 1 M, pH 8,0, para equllibrar el pH. La IgG se detectó por una absorción a 280 nm. Se reunió la absorción mayor que 0,1 y se dializó frente a PBS 0,075 M, pH 7,2, durante la noche. La pureza de la IgG aislada se confirmó por SDS PAGE en un PhastSystem (Pharmacia, NJ).

Ensayo inmunoabsorbente directo ligado a enzima

La respuesta específica de cobaya inmunizada con Ab_{1} IgG se detectó por un ensayo inmunoabsorbente directo ligado a enzima. Una placa de 96 pocillos con tiras eliminables de Immulon 2 (Dynatech, RI) se revistió con 0,4 ug de Ab_{1}IgG monoclonal por pocillo en tampón de revestimiento (NaHCO_{3} 0,015 M, glicina 0,3 M, 0,02% de NaN_{3} con polietilenglcol (PEG) 0,06 M), pH 9,6. La placa se almacenó a 4ºC durante la noche. Cada placa se enjuagó tres veces con 0,05% de Tween 20 en PBS 0,075 M y se bloqueó con 1% de BSA/PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. De nuevo, la placa se enjuagó tres veces. Los sueros o antisueros preinmunes de cobaya se diluyeron serialmente con PBS 0,075 M y se añadieron 100 ul de cada uno a cada pocillo por duplicado. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se enjuagó. Se añadió conjugado de peroxidasa de rábano picante de IgG de cabra anti-cobaya (H & L) 1:1000 (Jackson ImmunoReserach Labs, Inc PA), se incubó durante 1 hora y se enjuagó. Después de enjuagar, se añadió sustrato de TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, MD). Se determinó la absorbancia a 405 nm usando un lector de micropocillos de Vmax (Molecular Devices Corp., CA). De manera similar se ensayaron los antisueros de conejos inmunizados con IgGl de cobaya. Cada placa se revistió con IgGl de cobaya y el segundo antisuero era
conjugado de peroxidasa de rábano amargo de cabra anticonejo (H y L) (Jackson Immuno Research Labs. Inc, PA).

Preparación de la columna de cromatografía por afinidad

Se conjugó IgG de ratón normal (Jackson ImmunoResearch Labs Inc, PA) a Affi-Gel IO (Bio-Rad Laboratories, CA) como lo indica el fabricante. En resumen, 5 ml de suspensión de Affi-Gel IO se pasaron a un embudo de vidrio sinterizado conectado a un aspirador y se lavó éste con tres volúmenes de lecho con alcohol isopropílico y seguidamente tres volúmenes de agua desionizada enfriada con hielo. Se mezcló IgG normal de ratón (5 mg/ml, 10 ml) con Affi-gel IO en un vial. El acoplamiento se hizo a 4ºC durante la noche con una agitación suave extremo a extremo. Se rellenó una columna (0,9 x 5 ml) con el gel acoplado y se enjuagó con PBS 0,075 M, pH 7,2. Se controló la absorbancia de luz UV a 280 nm. La absorbancia más alta de esta porción se usó para conocer el contenido de proteína por el ensayo Bradford (Bio-Rad Laboratories, CA) con el fin de evaluar la conjugación.

Absorción de antisuero de cobaya con IgG de ratón normal

Una combinación de antisueros de cobaya se absorbió, 3, 4 y 5 semanas después de la inmunización, por cromatografía de afinidad en una columna de agarosa-IgG de ratón normal. La columna se preparó como se ha indicado antes. Se cargó en la columna el antisuero, aproximadamente un volumen vacía, y se incubó durante 30 min a 4ºC, eluyendo con PBS 0,075 M, pH 7,2. El antisuero se absorbió una segunda vez con una columna recientemente preparada.

Separación de isotipos de IgG de cobaya

Se cargaron en una columna de sefarosa conjugada con proteína A 5 ml de antisuero de cobaya que había sido absorbido por IgG de ratón normal y se enjuago con tampón de fosfato-citrato 0,02 M, pH 7,3. Las subclases IgG1 e IgG2 de inmunoglobulina de cobaya se eluyeron separadamente usando un gradiente escalonado de pH de 4,9 hasta que no se detectó proteína en el efluente. La columna se eluyó luego con un gradiente de pH bajo, pH 4,3. Después de diálisis frente a tampón de fosfato-citrato 0,02 M, pH 7,3, cada isotipo se sometió a una segunda tanda de separación de subclases.

Cuerpos elementales de serovar B de C. trachomatis (Har 36) se propagaron en una monocapa de células McCoy en una botella rodillo de 2 litros (Corning, PA) en HMEM habiendo añadido L-glutamina (concentración final 0,5 mM), NaHCO_{3} (concentración final 0,4 mM) y 10% de suero fetal bovino. En resumen, se eliminó de la botella el medio después de confluencia de la monocapa. Se inocularon 0,5-3,0 ml de suspensión de EBS (dependiendo de la densidad de los organismos) en 40 ml de medio de cobertura de ciclohexiimida (COM) (Whittacker, MD) con glutamina añadida y FBS y la botella se rodó a 3 rpm a 35ºC. Dos horas después, se añadieron 200 ml de COM y se continuó rodando durante 48-72 horas. Se obtuvo el material sobrenadante después de centrifugación para eliminar organismos.

Purificación del exoantígeno lipídico, GLXA

El GLXA es purificó en dos etapas a partir del material sobrenadante. Primeramente se hizo pasar el material sobrenadante a través de una columna CL48 de Octil-Sefarosa y se eluyó con etanol al 95% (Stuart and MacDonald, Current Microbiology, 11:123, 1984). El antígeno en etanol (contenido de antígeno equivalente a 50 ml de material sobrenadante de cultivo de células fuertemente infectadas) se concentró a aproximadamente 50 ul y se volvió a poner en suspensión en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,5, a 1 ml. Segundo, el antígeno así preparado se purificó por cromatografía de afinidad. La columna de afinidad se preparó conjugando GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal a Affi-Gel (Bio-Rad Laboiratories, CA) según las instrucciones del fabricante. Se centrífugo la muestra, se cargó en la columna de afinidad y se incubó durante 30 min a 4ºC. La columna se enjuagó con tampón de fosfato 0,1 M y se eluyó en tiocianato potásico (KSCN, Mallinckrodt, KY) aproximadamente 5 M durante aproximadamente 15-20 min y se dializó contra PBS 0,075 M durante la noche.

El GLXA usado en el inmunoensayo de transferencia de la unión de GLXA y GLXA-Ab_{3} monoclonal por GLXA-Ab_{2} monoclonal descrito más adelante se aisló por un procedimiento de exclusión de tamaños. Una columna de Sepharose 6BLC (2 x 100 cm) se equilibró con PBS 0,075 M. El material sobrenadante de un cultivo de células de serovar F de C. trachomatis se centrífugo primeramente a 5000 rpm para eliminar despojos de células y se cargaron aproximadamente 20 ml en la columna. El caudal era de 0,5 ml/min. El GLXA en el eluyente se detectó con el analizador Magic Lite (Ciba Corning Diagnostic Corp, MA). El protocolo se describe más adelante.

Inmunoensayo qumioluminométrico (Ensayo de inhibición)

La inhibición de la de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal a GLXA por GLXA-Ab_{2} de cobaya o GLXA-Ab_{3} de conejo (antisueros, IgG o isotipos de IgG) se detectó por inmunoensayo quimioluminométrico con un analizador Magic Lite (Ciba Corning Diagnostic Corp., MA). El protocolo para la inhibición era el siguiente: GLXA puriificado por afinidad se diluyó 1:5 con Reactivo A (Ciba Corning), se mezcló y se repartió alícuotamente en tubos de plástico (200 ul/tubo, Sarstedt, NJ). Se añadieron a cada tubo 100 ul de una solución neutralizante de Reactivo B (Ciba Corning) y se mezcló bien. A cada uno de los tubos anteriores se añadieron diluciones seriales de GLXA-Ab_{2} de cobaya o GLXA-Ab_{3}IgG de ratón, 50 ul, y se incubaron a temperatura ambiente. Una hora después de la incubación, se añadieron a la mezcla 100 ul de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal marcado con éster de acridinio (marcado con AE) en 1% de BSA/PBS (entre 220.000 y 240.000 unidades de luz relativas, RLU) y la mezcla se incubó durante 1 hora. Luego se añadieron a cada tubo anticuerpos anticlamidiales policlonales que estaban unidos por covalencia a partículas paramagnéticas (500 ul) y se incubó durante otra hora. El complejo inmune unido (partículas paramagnéticas-GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal marcado con GLXA-AE) se separa del no unido sometiendo la mezcla a un campo magnético. Las partículas se enjuagaron tres veces. El anticuerpo marcado con AE se midió con el analizador Magic Lite y se registraron las RLU. El porcentaje de inhibición se calculó como sigue:

% de inhibición = \frac{\text{RLU de control - RLU de ensayo}}{\text{RLU del control}} x 100

en la que el control representa PBS y ensayo representa el preinmune o el antisuero (o IgG) añadido, respectivamente.

Ensayo de inmunotransferencia de mancha

Para este ensayo se usó un aparato de transferencia de mancha Bio-rad. Una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) de 0,45 um, de Immobilon-NC (Millipore, MA) se revistió con GLXA purificado por afinidad o rLPS clamidial durante 18 h a 4ºC. La membrana se lavó luego con Tween 20 al 0,05% en tampón de PBS 0,075 M y se bloqueó durante 2 h a temperatura ambiente con 3% de BSA/PBS. Después de enjuagar, se añadieron diluciones seriales de GLXA-Ab_{3} IgG (90MS699) (aislado por cromatografía de afinidad de proteína A, véase antes) o Ab_{1} monoclonal (89MS30) IgG (100 ul por pocillo), se incubó a temperatura ambiente durante 2 h y se lavó para eliminar IgG no unido. La hoja de PVDF se quitó del aparato y se bloqueó con 3% de BSA/PBS durante dos horas agitando suavemente, luego se sondeó con una dilución 1:1000 de IgG de cabra anticonejo conjugado con peroxidasa (H y L) o IgG de conejo antirratón (H y L) (Jackson ImmunoResearch Labs., PA) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo conjugado no unido se eliminó por lavado en un disco de Petri durante 4 veces, 5 minutos, con agitación. La unión se detectó por el sistema de sustrato de peroxidasa de membrana CN (4-cloro-1-naftol) (Kirkegaard & Perry Inc., MD). Los ensayos se realizaron por duplicado.

Biotinilación de IgG

Se marcaron con biotina GLXA-Ab_{1} monoclonal IgG o GLXA-Ab_{3} IgG de conejo. En resumen, primeramente se dializó GLXA-IgG frente a borato sódico 0,1 M, pH 8,8, durante 4 h a 4ºC. Luego se añadieron 200 ug de éster de biotinaminocaproato N-hidroxisuccinimida (Sigma Chemical Co., MO) por mg de de IgG y se incubó a temperatura ambiente durante 4 h. Finalmente, se usaron 20 ul de NH_{4}Cl 1 M por 250 ul de éster y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para parar la reacción. Se dializaron los IgGs marcados frente a PBS 0,075 M durante 3 días a 4ºC.

Tinción por inmunofluorescencia de células McCoy infectadas

Se hicieron crecer durante 24 horas, en cubreobjetos en una placa de 24 pocillos (Falcon, NJ), monocapas de células McCoy confluentes. Se extrajo de cada pocillo el medio antes de aplicar a cada pocillo 200 ul de cuerpos elementales de serovar B de C. trachomatis (Har 36) o 200 ul de HMEM solo. Las inclusiones que formaban unidades (IFU) eran aproximadamente 1000/200 ul. Inmediatamente después de la aplicación, se añadieron a cada pocillo 200 ul de medio cubriente de cicloheximida (COM) con L-glutamina y FBS. La mezcla se incubó a 37ºC durante dos horas y el medio se reemplazó con 1 ml de COM por pocillo. Las placas se cultivaron luego durante 48 horas a 37ºC en una incubadora con 5% de CO_{2}, humidificada.

Después de la incubación, los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS 0,075 M, durante 5 min cada vez. Los cubreobjetos se transfirieron luego cuidadosamente con tejido para eliminar tampón de los cubreobjetos. Luego se añadieron a cada cubreobjetos 400 ul de 50 ug/ml GLXA-Ab_{1} monoclonal marcado con biotina o 400 uln de 1,20/ml de GLXA-Ab_{3} marcado con biotina y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Los cubreobjetos se enjuagaron dos veces con PBS (5 min cada vez). Se añadieron 400 ul de fluoresceína-estreptavidina 1:50 en 1% de BSA/PBS y se incubó durante 1 hora, La fluorescencia se determinó por fotografía con una cámara Olympus 25, de 35 mm (película Kodak de blanco-negro ASA 400 TMAX) montada en un microscopio Zeiss A 7082 Oberkirchen, con iluminación de lámpara de halógeno de 12v/100 Hz.

Naturalización de clamidias por GLXA-Ab_{3} (9OMS699) in vivo Inóculos y muestras

Se inmunizaron por filtración IgG preinmune y GLXA-Ab_{3} IgG de conejo, IgG de ratón normal y GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal. Los IgG (0,2 mg/ml) se mezclaron (1:1) respectivamente con elementos complementarios (200 unidades que forman inclusión/20 ul) de serovar C de C. trachomatis (TW-3). Las mezclas y EBs no tratados (como control) se incubaron a 37ºC durante 4 min, sacudiendo suavemente cada 15 min.

Después de la incubación, se inocularon 2 ug de IgG más 100 IFU en 20 ul en el fórmix inferior de cada ojo de 8 monos, 4 con GLXA-Ab_{3} IgG más EBS, 2 con IgG preinmune más EBS y 2 con sólo EBs. Al mismo tiempo se usaron 100 ul de cada tipo de mezcla para infectar 10 pocillos de cubreobjetos de monocapa de células McCoy de 2 días en una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos para determinar la capacidad de infección del inóculo. Los procedimientos de cultivo se describen más adelante.

Se recogieron raspados conjuntivales barriendo el tarso interior, el fórmix lateral, el tarso y fórmix superiores y el fórmix medio un día antes de la inoculación y los días 2, 6, 9, 13 y 20 después de la inoculación. Los raspados se sumergieron inmediatamente en 2 ml de medio de recogida y se desmoronaron por agitación rotatoria durante 2 min en el medio de recogida.

Determinación de la capacidad de infección clamidial por cultivo de células

Los raspados conjuntivales se desmoronaron primeramente por agitación rotatoria durante dos minutos en el medio de recogida para recoger EBs de los raspados. Luego se inocularon 200 ul de este medio de recogida sobre cubreobjetos de monocapas de células McCoy. Se hicieron crecer las células en una placa de cultivo de 48 pocillos, 5 pocillos para cada muestra. Para un experimento de neutralización in vitro, se inocularon 100 ul de la mezcla sobre los cubreobjetos de la monocapa de 10 pocillos para cada muestra. Las placas inoculadas se centrifugaron luego a 1.000 x g durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se incubaron a 37ºC durante 2 horas y el medio se reemplazó con 1 ml de FBS al 10% en COM (Whittaker, MD). Las placas se cultivaron a 37ºC en una incubadora humidificada, con 5% de CO_{2}, durante 48 h. De cada pocillo, después de la incubación, se aspiró el medio de cultivo. Los cubreobjetos de monocapas se lavaron una vez con PBS 0,075 M, se fijaron con etanol durante 5 min y luego se enjuagaron dos veces con agua. Se añadieron 25 ul por pocillo de anticuerpo monoclonal anticlamidial de conejo marcado con fluoresceína, con contratinción de azul de Evans (Syva Co., CA) y se incubó durante 30 min a 37ºC. Después de la incubación, los pocillos se enjuagaron dos veces con H_{2}O y se montó un cubreobjetos en cada pocillo con fluido de montaje. Los cuerpos de inclusión se contaron invirtiendo la placa en un microscopio de fluorescencia.

Citología directa de anticuerpo marcado por fluorescencia (DFA)

El raspado conjuntival de cada ojo de primate infectado se apretó contra un portaobjetos de vidrio previamente lavado con alcohol. Los portas se secaron al aire y se fijaron con acetona fría durante 5 min. Se secaron luego y se cubrieron con 30 ul de reactivo de anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína con contratinción de azul de Evans (Micro Trak Chlamydia Direct Reagent, Syvo Co. CA). La incubación se realizó en una cámara de humedad cubierta. Después de 15 min, los portas se giraron sobre el borde para eliminar el exceso de agente de tinción y se enjuagaron con agua desionizada durante 10 segundos. Se dejó que los portas se secaran completamente al aire. En cada porta se puso un cubreobjetos con medio de montaje (Syva Co., CA) y se selló con esmalte de uñas. Los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia a 500 x y 125 x. El título infeccioso se puntuó según una escala semicuantitativa de 0-4+; 0 es negativo, 0,5 es negativo en una primera pasada y positivo en cualquier grado de segunda pasada; 1 es para de 1 a 9 inclusiones por pocillo en una primera pasada y así sucesivamente.

Examen clínico y puntuación

La respuesta clínica de cada ojo se evaluó según 10 señales clínicas (Taylor y otros, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 29:847, 1988): la respuesta folicular, la respuesta en la porción lumbar, limbal, tarsal superior, fórmix superior y fórmix inferior de la hiperemia de la conjuntiva o inyección bulbar, tarsal superior, fórmix superior, fórmix superior y fórmix inferior de la conjuntiva y descarga ocular. La respuesta clínica se puntuó según una escala de 0 a 3 para cada uno de las tres señales de inflamación conjuntiva para obtener una puntuación total para cada mono. El examinador desconocía el reparto de los monos. Para describir la respuesta de un grupo de monos se usaron las medias de la puntuación.

Análisis de los raspados conjuntivales mediante hibridación dirigida por RNA

Se preparó RNA total a partir de muestras de raspados conjuntivales tomados de monos tratados con GLXA-Ab_{3} o monos normales tratados con IgG de conejo un día antes del reto y los días 2, 6, 9, 12 y 20 después del reto. Las muestras de raspados se homogeneizaron primeramente en fenol al 65% en el tampón que contenía Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 10 mM, 1% de SDS. Se precipitó el RNA y se redisolvió en el mismo tampón. Esta preparación de RNA se sometió a extracción varias veces con fenol:cloroformo (3:1), se puso en suspensión y se trató extensamente con DNasa I. La calidad de la preparación de RNA se controló por visualización con bromuro de etidio-UV después de la separación en geles de formaldehído-agarosa.

La sonda usada era un fragmento de DNA que contenía el RNA ribosomal 16S y 23S y secuencias de flanco que se escindieron del clon de plásmido genómico clamidial pL2, 434Sci-IA (Cheema y otros, The Amer. J. Med. Sci. 302:262-268, 1991). El fragmento de DNA se marcó por translación de mella usando 32PdCTP, 800 Ci/mol (Amersham Corp., IL). La actividad específica para todas las sondas de fragmentos de restricción era de aproximadamente 106 cpm/ug de DNA. Las muescas para cada mancha de transferencia incluían 1 ug de RNA total derivado de mono o humano, 10 pg de C. trachomatis puro o RNA de serovar C (control positivo), 3 ug de levadura o RNA de rata, tampón solo y 1 ug de RNA de raspados de cada mono tomados antes de la infección (control negativo). El RNA se fijó a un filtro de 0,22 um (Schleicher and Schuell Corp., NH). Los resultados de la hibridación se visualizaron por autorradiografía a -70ºC usando película X-OMAT AR (Kodak, New York).

Producción y caracterización de anticuerpos monoclonaleas antiidiotípicos (GLXA-Ab_{2}) Conjugación de hemocianina de lapa californiana con GLXA monoclonal

Se aisló Ab_{1} monoclonal (89MS30) IgG de una columna de cromatografía de proteína A como se ha descrito antes. La conjugación de hemocianina de lapa californiana se efectuó usando glutaraldehído. En resumen, se mezclaron 1,5 mg de IgG con 0,05 mg de KLH (Sigma Chemical Co., MO) (aproximadamente 1 molar de IgG por 50 aminoácidos de KLH) en un volumen igual de glutaraldehído al 0,2% en PBS, se incubó a temperatura ambiente con una agitación suave. Una hora después se añadió glicina 1 M para tener una concentración final 0,02 M y se incubó durante otra hora a temperatura ambiente. El conjugado se dializó luego contra PBS durante la noche.

Producción de hibridoma de Ab_{1} antimonoclonal

Cuatro días después de la última inmunización de recuerdo (véase inmunización), se aislaron células de bazo de dos ratones que tenían el título máximo. La fusión se hizo con la línea Sp2/0-AgI4 de células de mieloma de ratón de acuerdo con las técnicas desarrolladas inicialmente por Kohler y Milstein (Nature, 1975) y modificadas (Golsby, A Practical Guide to Making Hybridomas in Nucleic Acid & Monoclonal Antibody Probes, Swaminathn & Prokask, Eds. Deller, NY, pág, 367, 1989). La capa de células alimentadoras era de bazos de ratones de 8 semanas de
edad.

Exploración de anticuerpo monoclonal antiidiotípico, 91 MS441 (GLXA-Ab_{2} monoclonal)

Se detectaron antisueros antiidiotípicos de ratones inmunizados y sustancias sobrenadantes de pocillos clonados por un ELISA sándwich (Uytdehaag y otros, J. Immunol., 134:1225, 1985; Hiroshima y otros, J. Immunol. 144: 224, 1990). En resumen, placas de microtítulo de Immulon II, de poliestireno (Dynatech Laboratories Inc, VA) se revistieron con 100 ul de Ab_{1} IgG monoclonal en tampón de carbonato 0,1 M, pH 8,9, durante la noche a 4ºC. Se eliminó el IgG no unido y las células se bloquearon con BSA al 3%/PBS durante 1 h a 37ºC. Después de un lavado, se añadieron antisueros de dilución lineal a 100 ul de sustancias sobrenadantes del cultivo de pocillos con células de hibridoma. Después de 1 hora de incubación a 37ºC y de lavado, se añadió a cada pocillo 1 ug de Ab_{1} monoclonal IgG conjugado con biotina y se detectó la radiactividad añadiendo estreptavidin-peroxidasa de rábano amargo (Jackson Immuno Resarch Labs., PA). Una hora después se añadió el sustrato de peroxidasa de TMB (Kirkergaard & Perry Laboratories Inc., MD). La absorbancia se midió a 405 nm en un lector de microplacas. Como controles positivo y negativo se usaron sueros inmunes tomados antes de la fusión (dilución 1:10) y medio solo.

Ensayo de inhibición de la unión

La inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA por antisuero de ratón y las sustancias sobrenadantes de los clones se determinó por el ensayo inmunoquimioluminométrico descrito antes.

Generación de ascites

A 10 ratones BALB/cByJ, de edad no requerida estrictamente, se inyectó intraperitonealmente pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano, Sigma Chemical Co., MO), 1 ml por ratón. 10 días después se inyectaron a los ratones aproximadamente 2 x 10^{6} células de hibridoma que producen GLXA-Ab_{2} monoclonal (91 MS441). Los ascites se cosecharon usando una aguja Vacutainer colectora de 20 g de sangre (Becton Dickinson, NJ) aproximadamente 10 días después. Los ascites se clarificaron por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

Isotipificación de IgG antiidiotípico

La isotipificación se hizo por ELISA. El material sobrenadante del clon 91 MS441 (100 ul) se revistió en cada pocillo y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de enjuagar y bloquear con 3% de BSA/PBS durante la noche, a cada pocillo se añadieron por duplicado 100 ul de antisuero específico para subclase de ratón: IgGI, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, cadena K o cadena \lambda (Bio-Rad Laboratories, CA). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El antisuero de conejo se detectó por sustrato de cabra anticonejo conjugado a peroxidasa de rábano amargo y sustrato de TMB (Kirkergaard & Perry Laboratories Inc, MC)

Purificación de GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal

GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal se purificó por cromatografía de afinidad en una columna de Proteína-G-sefarosa. Con la proteína G-sefarosa 4B (Zymed, CA), 5 ml, se rellenó la columna de 0,5 x 9 cm. Los ascites (2 ml) se diluyeron 1: 1 con tampón de fosfato 0,02 M, pH 7,3, y se cargaron en la columna y se lavaron con el mismo tampón hasta que no se detectó proteína. La IgG unida se eluyó con tampón cítrico 0,1 M-glicina, pH 2,6. Se recogió el eluyente en una fracción de 1 ml que contenía 50 ul de tampón Tris salino 1M, pH 8,0, para equilibrar el eluyente. Se combinaron las fracciones que tenían una absorción de luz UV por encima de 0,1 y se dializaron en PBS durante la noche a 4ºC. La IgG purificada se identificó por SDS-PAGE para confirmación.

Inmunoprecipitación de GLXA-Ab_{2} monoclonal por antisuero anticlamidial de otras especies

Se ensayaron por ELISA para reconocimiento de GLXA-Ab_{2} monoclonal anticuerpos policlonales de un paciente humano diagnosticado de infección clamidial y conejos inyectados con EBs clamidiales. El procedimiento era esencialmente el descrito antes con las excepciones siguientes. En resumen, la placa de ELISA se revistió con 1 ug de GLXA-Ab_{2} monoclonal por pocillo en PBS 0,075 M durante la noche a 4ºC. Los pocillos se enjuagaron con 0,05% de Tween 20 en PBS 0,075 M y se bloquearon con 3% de BSA/PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadieron a cada pocillo por duplicado 100 ul de dilución serial del suero del paciente (92MS273), suero humano de control (88MS356), antisuero de conejo (88MS188) o suero de conejo de control (92MS450). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron 3 veces y se añadieron 100 ul de IgG de cabra antihumano o de cabra anticonejo conjugado a peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Labs., MD). Se añadió el sustrato de TMS después de 1 hora de incubación. La placa se leyó en un lector Vmax de microplacas (Molecular Devices Corp.,
CA).

Protección frente a la infección clamidial por inmunización de GLXA-Ab_{2} en un modelo de infección de ratón Ensayo de inmunotransferencia de mancha de la unión de GLXA y GLXA-Ab_{3} originada por GLXA-Ab_{2} monoclonal

El ensayo de inmunotransferencia de mancha se hizo por el mismo procedimiento descrito antes. La excepción fue que la hoja de PVDF se revistió con GLXA purificado (100 ul) por senda en PBS 0,075 M. Antisueros tomados de ratones que se inmunizaron con GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal o IgG de ratón normal se diluyeron serialmente con 3% de BSA/PBS. El segundo anticuerpo era IgG de conejo antirratón conjugado con peroxidasa de rábano amargo (H y L). La fotografía se tomó con Kodak TMAX 100. La intensidad de tinción de la mancha de transferencia se midió por barrido con un densitómetro.

Inoculación y muestras

Se inocularon cuerpos elementales de serovar C de C. trachomatis (TW-3), 5000/20 ul, en cada ojo de los ratones que habían sido inmunizados con Ab_{2} monoclonal o IgG de ratón normal. El día anterior a la inoculación y los días 7, 10, 14, 21, 28 y 35 después de la inoculación, se rasparon las conjuntivas de cada ojo. La zona incluía el tarso inferior y el fórmix inferior, el fórmix lateral, el tarso y el fórmix superiores y el fórmix medio. Los raspados conjuntivales se sumergieron inmediatamente en el medio de recogida, se desmoronaron durante dos minutos por agitación y se mantuvieron en hielo hasta su cultivo.

Identificación del receptor en células huésped por GLXA-Ab_{2} monoclonal IgG Análisis FACS de la unión específica de GLXA-Ab_{2} monoclonal a células HECEC

Se hicieron crecer en un matraz de 75 cm^{3} a 37ºC con 5% de CO_{2} células epitéricas de glándula endometrial humana (HECEC). Alcanzada la confluencia, las células se extrajeron del matraz con un rascador de células (Baxter, IL) y se centrifugaron a 200 x g durante 5 min. Las células se enjuagaron una vez con FBS al 20% en tampón de Hanks (Whittker, MD) y se hicieron pasar a través de una aguja de jeringa 1 9G cuatro veces para obtener células individuales. A cada vial que contenía aproximadamente 1,5 x 10^{6} de células HECEC se añadieron diluciones seriales de GLXA-Ab_{2} monoclonal marcado con biotina o IgG de ratón normal marcado con biotina en tampón de Hank (100 ul) y se incubó sobre hielo durante 30 min. Cada vial se enjuagó dos veces con azida al 0,02% en tampón de Hank. Luego se añadieron 100 ul de estreptavidina conjugada con FITC y se incubó sobre hielo durante 30 min. Después de lavar dos veces, las células se mantuvieron en 400 ul de tampón envolvente sobre hielo. Como control de fondo se usaron células más estreptavidina conjugada con FITC y células solas. Inmediatamente se realizó citometría de flujo monocolor por barrido FACS (Becton Dickinson).

Detección y caracterización de anticuerpos antiidiotípicos policlonales Generación de anticuerpos antiidiotípicos frente a GLXA-Ab_{1} monoclonal en cobayas

El inmunógeno que se usó para producir los anticuerpos antiidiotípicos en cobayas era un anticuerpo monoclonal identificado como 89MS30 (GLXA-Ab_{1} monoclonal). Originalmente se produjo por inmunización de ratones BALB/cByJ con cuerpos elementales clamidiales propagados en huevo embriótico. Se fusionaron esplenocitos de ratones con células de mieloma Sp2/0-AgI4 y se exploró el clon. El clon (89MS30) reaccionó a todos los 15 serovares de C. trachomatis, C. pneumoniae y C. psittaci 6BC y meningoneumonitis de ratón por EIA, demostrando reconocimiento de un antígeno específico para género. La IgG se isotipificó como IgG2b por ELISa usando antisuero de conejo antirratón (Bio-Rad Laboratories, CA). El GLXA-Ab IgG monoclonal se aisló de los ascites con una columna de conjugado de sefarosa 4B de rec-proteína A (ZYMED, CA). Se inmunizaron cobayas no criadas (Hartley 13) y se les administró una inmunización de recuerdo de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal, 159 ug cada una, en presencia de Maalox® como coadyuvante. Los sueros y los antisueros preinmunes se obtuvieron por punción cardíaca y centrifugación. Cinco cobayas inmunizadas demostraron respuestas fuertes contra GLXA-Ab_{1} IgG por ELISA. Se demostró que el título de GLXA-Ab_{1} IgG antimonoclonal era de más de 1 a 20.000 una semana después de la primera inmunización de recuerdo. Estos antisueros de cobaya se mantuvieron crecientes dos semanas después de la inmunización de recuerdo., como se ve en la Fig. 1.

La Fig. 1 es una curva de unión de antisueros de cobaya a mAb, determinada por ELISA para antiidiotipos. Se presentan sueros preinmunes (\square); antisueros 3 semanas después de la inmunización (100); una semana después (\blacksquare) y dos semanas después de la inmunización de la inmunización (101). Cada valor representa la media de determinaciones duplicadas.

Absorción completa de antisuero de cobaya con IgG de ratón normal

Con el fin de eliminar anticuerpos antirratón de cobaya que están dirigidos contra epitopos que no son los idiotipos presentes en las regiones hipervariables de las moléculas de Ab_{1} monoclonal IgG, el antisuero de cobaya fue absorbido con IgG de ratón normal. La absorción se realizó por cromatografía de afinidad. La columna se hizo por conjugación de IgG de ratón normal a Affi-Gel 10. La conjugación se evaluó detectando la cantidad de proteína no unida por absorbancia a 280 nm. La densidad óptica más alta de una fracción era de 0,23, que contenía 0,18 mg de proteína según el ensayo Bradford (Bio-Rad Laboratories, CA). El IgG total de ratón usado en la conjugación eran 50 mg, lo que demostró que la conjugación había sido un éxito. Los antisueros de cobaya se cargaron en la columna y se eluyeron con PBS 0,075 M, pH 7,2. El procedimiento se repitió usando una columna preparada de nuevo. Se ensayaron los antisueros antes y después de la absorción y se compararon con sueros preinmunes en cuanto a la reactividad con IgG de ratón normal por ELISA. Se equilibró la concentración de cada antisuero para el ensayo. Cada pocillo se revistió con 1 \mug de IgG de ratón normal. Se añadieron diluciones seriales de antisueros de cobaya preabsorbidos (\bullet); preinmunizados (\blacksquare) y absorbidos (\square). PBS era el control de fondo (O). Como segundo anticuerpo se usó IgG de cabra anticobaya conjugado con peroxidasa de rábano amargo. (H & L). Cada valor representa la media de las determinaciones por duplicado. El resultado reveló que los sueros después de la absorción tenían la misma reactividad frente a IgG de ratón normal que los sueros preinmunes (Fig. 2). Los antisueros no absorbidos tenían 5 veces más reactividad, lo que indica que se habían eliminado completamente todos los anticuerpos específicos a epitopos que no eran idiotipos.

Inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA por antisuero de cobaya

Si los antisueros de cobaya contienen el anticuerpo antiidiotípico específico frente a moléculas de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal, el efecto directo es que inhibirían la unión de antígeno, GLXA, al anticuerpo monoclonal, GLXA-Ab_{1} monoclonal. En otras palabras, los antisueros se unen a la región determinante de la complementariedad de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal, impidiendo así su unión al sitio activo. Para ensayar esto, se realizó competición de la unión por inmunoensayo quimioluminométrico. Diluciones seriales de sueros de cobaya preinmunes, antisueros no absorbidos o antisueros absorbidos se incubaron con GLXA que se aisló por cromatografía de inmunoafinidad. Después de una hora a temperatura ambiente, las mezclas se incubaron con GLXA-Ab_{1} IgG conjugado con éster de acridinio durante una hora más. Se añadieron partículas paramagnéticas y se determinó una RLU. El porcentaje de inhibición se calcula como se ha mencionado antes. El antisuero antiidiotípico de cobaya absorbido exhaustivamente con IgG de ratón (\blacksquare) inhibe la unión de mAb_{1} a GLXA a aproximadamente las mismas diluciones que el antisuero de cobaya no absorbido (\square) por inmunoensayo quimioluminimétrico. Como controles se incluyeron suero preinmune (O); mAb_{1} (\bullet) e IX PBS (\blacklozenge). El porcentaje de inhibición se calculó como se describe en el texto. Como se representa en la Figura 3, cuando el antisuero de cobaya se diluyó 1:40, se inhibió 95% de la unión de Ab_{1} monoclonal a GLXA por antisueros no absorbidos y antisueros absorbidos en comparación con 15% para suero preinmune. Además, los antisueros no absorbidos tenían una inhibición casi idéntica a la de los antisueros absorbidos a una concentración equivalente de proteína, lo que indica que no se eliminaron por absorción anticuerpos antiidiotípios. Por tanto, se ha generado en cobayas un anticuerpo antiidiótico competitivo.

Perfil de subclases de GLXA-Ab_{1} IgGs antimonoclonales de cobaya

Experimentos previos habían demostrado que diferentes isotipos de antiidiotipos de cobaya ejercen efectos diferentes sobre la producción de idiotipos. Un isotipo de IgG_{1} intensifica la producción de idiotipos, mientras que el isotipo IgG_{2} inhibe el clon de idiotipo. Para ensayar la inhibición de diferentes isotipos de IgG antiidiotípico de cobaya, se aislaron subclases de IgG de antisueros antiidiotípicos de cobaya absorbidos. Se usó un gradiente de pH escalonado de tampón de fosfato-citrato. Se separaron y aislaron IgG_{1} y IgG_{2} en una columna de afinidad de proteína A. El perfil de elución de los isotipos IgG_{1} e IgG_{2} se presenta en la Fig. 4. La purificación de IgG se realizó por cromatografía de afinidad de proteína A. La separación de IgG_{1} e IgG_{2} se realizó con gradiente escalonado de tampón de fosfato-citrato. Cada tipo se identifica por inmunoelectroforesis (IEP) con IgG de cabra anticobaya para inmunoprecipitar bandas (Bethyl, TX). El primer pico que está compuesto por IgG_{1} se precipitó tanto por IgG_{1} de cabra anticobaya como por IgG_{2}, pero formaba una banda individual por antisuero de cabra anticobaya. El primer pico se repurificó luego por el mismo procedimiento.

Inhibición de la unión por subclases de IgG de cobaya

Nuevamente, la competición por diferentes subclases de IgG se hizo por el procedimiento de inmunoensayo quimioluminométrico usando anticuerpos antiidiotípicos de cobaya de los isotipos IgG_{1} o IgG_{2}. La Figura 5 muestra que 0,4 \mug de IgG eran capaces de inhibir la unión de CLXA-Ab_{1} a GLXA en 50%. En la Figura 5 se representa la inhibición de la unión de mAb_{1} a GLXA por isotipos antiidiotípicos de cobaya. La unión de mAb_{1} a GLXA fue inhibida por IgG_{1} (\bullet) antiidiotípico de cobaya y parcialmente por IgG_{2} (\blacksquare) en el ensayo quimioluminométrico. Como controles se usaron mAb_{1} homólogo no conjugado (O) o PBS (\square). La inhibición porcentual de la unión se calculó como se ha descrito antes. La inhibición total se produjo cuando se usaron 100 \mug. Esta era esencialmente la misma concentración necesaria cuando se usó GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal no marcado. La IgG_{2}, si presentaba inhibición, era pequeña, aproximadamente de 20% de la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA con 1,0 \mug. Estos datos demostraron que la subclase IgG_{1} de IgG antiidiotípico era al menos 5 veces más inhibidora que la subclase IgG_{2}.

Generación de anticuerpos anti-antiidiotípicos (GLXA-Ab_{2}) en conejos por IgG_{1} de cobaya

La evidencia obtenida demuestra que IgG_{2} antiidiotípico de cobaya era contra la región hipervariable de GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal y también que inhibía su unión a GLXA. El criterio final de una imagen integral de los anticuerpos antiidiotípicos es confirmar estructuralmente que Ab_{2} es Ab_{2}\beta, no Ab_{2}\alpha o Ab_{2}\varepsilon. Puesto que Ab_{2} se une a la porción de armazón de inmunoglobulinas, también puede inhibir la unión de Ab_{1} al antígeno cognado. Para confirmar que IgG_{1} antiidiotípico de cobaya es Ab_{2}\beta, se usó el isotipo IgG_{1} para producir un anticuerpo anti-antiidiotípico (GLXA-Ab_{3}) que puede reconocer el epitopo de GLXA en un animal que nunca se ha expuesto al antígeno GLXA (Ertl y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2850, 1988). Se inmunizaron tres conejos blancos de Nueva Zelanda con IgG_{1} antiidiotípico de cobaya en presencia de un coadyuvante, Maalox® (alum). Los antisueros de un conejo (S2) se ensayaron contra IgG_{1} por ELISA (Fig. 6). La reactividad específica de antisueros de conejo para IgG_{1} de cobaya se determinó por ELISA. Se usó IgG_{1} de cobaya como antígeno y como segundo anticuerpo se usó conjugado de HRP de IgG de cabra anticonejo. El título corresponde a antisueros de conejo antiidiotípicos 3 semanas después de la inmunización (\); 1 semana (\blacksquare) y 3 semanas (101) (después de la inmunización de recuerdo). Como control se usó suero preinmune (\square). El título aumentaba con el tiempo después de la inmunización. El título era mucho mayor que 20.000 en comparación con sueros preinmunes 3 semanas después de inmunización de recuerdo.

Anticuerpos anti-antiidiotípicos de conejos reconocen GLXA

Para detectar la reactividad de antisueros de conejo frente a GLXA se usó el aparato de transferencia de mancha (Bio-Rad Laboratories, CA). Se ensayaron por el ensayo de inmunotransferencia de mancha antisueros de 2 conejos. Puesto que GLXA-Ab_{1} monoclonal es reactivo por cruce a LPS clamidial, una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) se revistió con GLXA y rLPS clamidial. Ambos antisueros de conejos reconocían GLXA y LPS con alta reactividad. Cuando se usó IgG de conejo (S2) (90MS699), las manchas eran positivas a una concentración de 0,006 \mug por senda. La IgG no inmune no reaccionaba. La IgG aislada de este antisuero se ensayó en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA, puesto que el GLXA-Ab_{3} producido por la imagan interna, HLXA-Ab_{2} exhibiría una unión similar. Esto se confirmó, como lo revela la Fig. 7. Se evalúan en cuanto a la unión en el ensayo quimioluminométrico dilución serial de IgG preinmune (\square), anticuerpo de Ab_{3} de conejo (\blacksquare), mAb_{1} (\bullet). La inhibición porcentual se obtuvo de determinaciones duplicadas. La inhibición por GLXA-Ab_{3} aumenta con la concentración, pero es aproximadamente 5 veces menos inhibidora en comparación con Ab_{1} monoclonal no marcado. Esto demuestra que el anticuerpo IgG_{1} antiidiotípico de cobaya es la imagen interna del antígeno, GLXA. Se ensayó de GLXA-Ab_{3} IgG para el reconocimiento de cuerpos elementales de C. trachomatis in vitro.

Se conjugaron GLXA-Ab_{1} monoclonal y GLXA-Ab_{3} IgG con biotina por glutaldehído. Se incubaron GLXA-Ab_{1} monoclonal o GLXA-Ab_{3} marcados con monocapa de células McCoy en cubreobjetos que se habían infectado con cuerpos elementales de serovar B de C. trachomatis (Har 36) durante 48 horas. Como control se usaron monocapas no infectadas. La configuración de la tinción por fluorescencia de los cuerpos elementales por GLXA-Ab_{1} IgG monoclonal y GLXA-Ab_{3} IgG policlonal demostró que GLXA-Ab_{3} no sólo reconocía la forma purificada, sino también la forma nativa de GLXA.

Neutralización de la infección clamidial en primates por GLXA-Ab_{3} IgG (90MS699)

La siguiente cuestión concernía a la capacidad de GLXA-Ab_{1} o GLXA-Ab_{3} para neutralizar cuerpos elementales de clamidias y proteger así células huésped de la infección. Los enfoques experimentales utilizados para responder a esta cuestión implicaban la neutralización de la infección en células cultivadas y la neutralización de la infección en las conjuntivas de primates.

GLXA-Ab_{3} neutraliza in vivo la infección clamidial mientras que GLXA-Ab_{1} monoclonal no lo hace

La neutralización en conjuntivas de primates se determinó por preincubación de organismos con IgG de anticuerpo y detectando el efecto sobre la infección ocular. La fracción de IgG de GLXA-Ab_{1} monoclonal o Ab_{3} se incubó con cuerpos elementales de serovar C de C. trachomatis Como controles actuaron IgG de ratón normal o preinmune de conejo, así como ninguna adición de inmunoglobulina. La mezcla se inoculó en cada ojo del primate. Un día antes y un día después de la incubación se tomaron raspados de la conjuntiva por barrido de diferentes zonas de las conjuntivas (véase antes). La infección clamidial ocular en los primates se determinó mediante ensayo de cultivos de células, que incluía una segunda pasada en días posteriores a la infección. Como se presenta en la Tabla 1, se infectaron tres primates con EBs tratados con GLXA-Ab_{1} monoclonal, en el ojo izquierdo; EBs tratados con GLXA-Ab_{3} en el ojo derecho. Al mismo tiempo, se infectaron dos primates con EBs tratados con IgG de ratón normal (representados como NI) o EBs solos en el ojo izquierdo y el derecho alternativamente. El mismo procedimiento se aplicó a IgG de conejo preinmune (representado como N3). Todos los ojos inoculados con EBs tratados con GLXA-Ab_{1} monoclonal fueron positivos al menos una vez (primates nº. 515, 84 y 26). Sin embargo, sólo un ojo tratado con GLXA-Ab_{3} fue positivo una vez, el día 10 después de la infección, dos de ellos nunca fueron positivos (primates nº. 515, 84 y 26). Los ojos inoculados con IgG de ratón normal o de conejo preinmune fueron positivos al menos una vez (primates nº. 563, 20, 17 y 329). Los EBs no tratados (representados como C) produjeron infección en dos de los cuatro ojos implicados (primates nº. 563, 20, 17 y 329). Aunque los puntos de los datos son diminutivos, revelan que el GLXA-Ab_{1} monoclonal no neutraliza clamidias en conjuntivas de primates. Por otra parte, ello sugiere que el GLXA-Ab_{3} es neutralizador. Con el fin de confirmar que GLXA-Ab_{3} neutraliza, se realizaron varios ensayos, entre los que se incluyeron: (A) neutralización en cultivo de células, (B) neutralización en conjuntiva de primates, (C) detección por ensayo clínico de cultivos, (D) detección por citología directa de anticuerpos por fluorescencia, (E) hibridación de sonda de RNA específica para clamidias y (F) determinación de la severidad de la infección por puntuación clínica.

TABLA 1 Neutralización de infección clamidial en la conjuntiva de primates por Ab_{3} pero no mAb_{1}

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GLXA-Ab_{3} neutraliza la infección clamidial in vitro

El ensayo de cultivo de células in vitro se realizó con GLXA-Ab_{3} y anticuerpo de conejo preinmune. Los IgGs de conejo preinmune y de GLXA-Ab_{3} (90MS699) se aislaron por cromatografía de afinidad de proteína A. La mezcla de 10 ug de cada IgG y 100 ul de EBs de serovar C (1000 IFU/ml) o EBs solos se inocularon en pocillos que contenían monocapas de células McCoy. Se usaron 10 pocillos por muestra. La inclusión de cuerpos se detectó por un anticuerpo anticlamidias monoclonal FITC-conjugado 48 horas después de la conjugación. IFU/ml estaba basado en 15 campos por pocillo. Como se recoge en la Tabla 2, Ab_{3} IgG reducía la capacidad de infección tres veces más en comparación con IgG preinmune, 5 veces más en comparación con EBs slols, lo que indicaba la neutralización por GLXA-Ab_{3}.

TABLA 2 Neutralización in vitro de la infección clamidial por Ab_{3} IgG

EBs tratado con	Media de IFU/15 campos + S.E.M.

Ab_{3}	34,1 + 7,2
IgG normal	93,8 + 22,4
Nada	155,3 + 5,5

GLXA-Ab_{3} neutraliza la infección clamidial en primates

En este experimento, 8 primates se distribuyeron al azar en tres grupos. Cuatro primates recibieron en los ojos EBs purificados previamente incubados con GLXA-Ab_{3} IgG (ocho ojos), dos recibieron EBs inoculado previamente con IgG preinmune (cuatro ojos) y dos recibieron EBs no tratado (cuatro ojos). El día del examen, se tomaron los raspados conjuntivales y se hizo un cultivo de células. Puesto que no había diferencias significativas entre los receptores de IgG preinmune y EBs solos, los resultados se presentan como 8 ojos experimentales y 8 ojos de control. Los resultados de los cultivos de células se expresan como IFU/ml sobre la base de recuento de inclusiones en 15 campos para dos pocillos por muestra. Como se ve en la Tabla 3, 20 días después del reto, 1 entre 8 ojos era positivo en comparación con ocho entre ocho ojos que eran positivos en el grupo de control. Cuando se examinaron los resultados acumulados, con GLXA-Ab_{3}, 9 entre 40 (22,5%) eran positivos, a diferencia de los 36 entre 40 (90%) que eran positivos sin GLXA-Ab_{3}.

TABLA 3 Neutralización de la infección clamidial en conjuntivas de primates por Ab_{3} IgG en el ensayo de cultivo de células*

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En un ensayo paralelo, se realizó también un ensayo citológico directo de anticuerpo por fluorescencia para evaluar los números de EBs de los raspados conjuntivales. Las muestras de secreciones conjuntivas se fijaron sobre portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo monoclonal marcado con FITC contra C. trachomatis. Se consideró positivo cuando en cada porta (Micro Trak, Syva Co. CA) se vieron 5 o más cuerpos elementales característicos. Como se ve en la Tabla 6, se detectaron EBs en el grupo tratado con GLXA-Ab_{3} en sólo dos ocasiones, el día 6 y el 12 después de la infección, en tanto que los restantes fueron positivos hasta el día 20. Sólo un ojo fue negativo de EBs en el grupo no tratado el día 2, que probablemente era un artefacto. Se detectaron EBs en todos los ojos de este grupo para el resto del experimento. El último día del ensayo (día 20), ninguno de los ojos tratados con GLXA-Ab_{3} era positivo, mientras que 8 de los 8 eran positivos en el grupo combinado de control. Además, los resultados de DFA y de cultivos son completamente congruentes.

TABLA 4 Neutralización de la infección clamidial por Ab_{3} usando un ensayo de citometría directa de anticuerpo por fluorescencia (DFA)*

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El GLXA-Ab_{3} atenúa sustancialmente la replicación clamidial en la infección conjuntival

Para entender más el mecanismo de la neutralización, se había examinado RNA ribosomal específico clamidial de los raspados conjuntivales por sonda de DNA (Cheema y otros, The Ameri. J. Med. Sci. 302:261-268, 1991). Se extrajo RNA total de raspados conjuntivales tomados de ojos de primates. Como control se usó RNA de EBs de serovar C, humanos o de levaduras. Para detectar RNA clamidial específico en un ensayo Northern de hibridación por transferencia de mancha, se usó DNA ^{32}P-clamidial que codifica genes ribosomales de RNA 16S y 23S. Como se presenta en la Figura 8, los ojos de control (infectados con IgG de conejo preinmune más EBs o EBs solos) presentan uniformemente niveles significativos de RNA clamidial en todos los momentos examinados; muestras de RNA similares preparadas de los ojos de un organismo tratado con GLXA-Ab_{3} muestran niveles significativamente atenuados de RNA clamidial. Se extrajo RNA ribosomal clamidial de raspados conjuntivales de cuatro primates infectados con EBs tratados con Ab_{3} IgG (\bullet en la Fig. 8), dos tratados con IgG de ratones preinmunes (O en la Fig. 8) y dos con sólo EBs (\blacksquare en la Fig. 8). La intensidad relativa de la señal de los autorradiogramas de transferencia de mancha Northern se expresa usando una escala arbitraria. Los valores medios se derivaron de los valores de cada uno de los dos ojos de cada primate en el momento de medición. Esto indica que la neutralización acaece en la etapa muy temprana de la infección.

El grado de inflamación conjuntival después de inoculación con EBs previamente incubados con GLXA-Ab_{3} o IgG preinmune o sin incubación previa se evaluó por la respuesta clínica. La respuesta clínica se estimó sobre la base de un total de puntuaciones clínicas de la enfermedad (TCDS) derivadas de 10 rasgos clínicos de la inflamación (Taylor y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29:1847, 1988). Las puntuaciones acumulativas de la enfermedad se obtuvieron para cada grupo de primates examinando 10 signos existentes en la conjuntiva. Las puntuaciones se hicieron en una escala de 0 a 3 para cada 10 signos de inflamación de la conjuntiva. Las puntuaciones totales de la inflamación se obtuvieron para cada primate infectado con EBs tratado con Ab_{3} (\bullet) o con IgG de conejo preinmune (O). Como se ve en la Figura 9, los receptores de GLXA-Ab_{3} desarrollaron una enfermedad clínica muy pequeña y ésta declinó después del día 8. Los animales de control continuaron desarrollando una enfermedad severa 21 días después del reto. Este hallazgo patológico es consistente con los datos de cultivo de células, DFA y de hibridización de RNA.

Generación y caracterización de líneas de células de hibrodoma que producen anticuerpos Producción de células de hibridomas antiidiotípicos

Cinco ratones singeneicos (BALB/cByJ) se inmunizaron intra-peritonealmente con GLXA-Ab_{1} monoclonal IgG conjugado a KLH en presencia de coadyuvante completo de Freund. Se detectaron por ELISA sándwich los antisueros antiidiotípicos contra GLXA-Ab_{3} IgG monoclonal. El título era de aproximadamnete 1:1000 tres semanas después de la inmunización (datos no representados). Las fusiones se hicieron entre células Sp2/0-AgI4 y células de bazo de dos ratones que tenían el título más alto frente a GLXA-Ab_{1} monoclonal. El tamaño de los bazos era aproximadamente dos veces el tamaño de un bazo normal. Los clones se exploraron por el mismo procedimiento del ensayo de antisueros de ratón.

Como control se usó en todos los ensayos explorativos la combinación de antisueros de ratones o sueros preinmunes diluidos 1:10. Entre los 283 pocillos explorados, 8 se consideraron positivos contra mAbI con un título de dos veces o más que el control negativo. Estos hibridomas se clonaron. Un clon (91 MS441) tenía el título más alto en ELISA y se propagó. Se produjeron los ascites y se aisló IgG. Se identificó el isotipo de IgG como IgGI, que tenía una cadena K ligera (Bio-Rad Laboratories, CA). Los resultados de la fusión se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5 Resumen de la fusión para anticuerpos antiidiotípicos

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IgC que secreta hibridoma (91MS441) inhibe la unión de GLXA-Ab_{1} a GLXA

El material sobrenadante de clones positivos se ensayó en cuanto a la inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} a GLXA por el ensayo quimioluminométrico. Se encontró inhibición total de la unión en material sobrenadante de 4 clones sin dilución. Dos semanas después se encontró un solo clon (91 MS441) que era estable. Como se representa en la Figura 10, a una dilución de 1:10, el material sobrenadante de este clon inhibe la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA en un 80%, en comparación con 0% de un clon no positivo (91 MS442) de la misma fusión. Se ensayaron por el inmunoensayo quimioluminométrico diluciones seriales del material sobrenadante del clon 91MS441 (\bullet en la Fig. 10) y el clon negativo 91MS442 (O en la Fig. 10). El porcentaje se obtiene como media del duplicado. Esto demuestra que se produjo un clon antiidiotípico. Se identifica como GLXA-Ab_{2}. El GLXA-Ab_{2} monoclonal es reconocido por el paciente y antisueros anticlamidia de conejo.

Como imagen interna de un determinante antigénico, el anticuerpo antiidiotípico sería reconocido por cualquier antisuero específico que lo sea contra este epitopo independientemente de la especie. Con el fin de comprobar esta propiedad del IgG producido por el clon (91 MS441), se usó suero humano de un paciente diagnosticado clínicamnete como positivo de clamidias. Puesto que el isotipo de GLXA-Ab_{2} monoclonal es IgGI, la purificación de IgG se hizo por cromatografía de afinidad de proteína G. GLXA-Ab_{2} IgG aislado revistió una placa de microtítulos y se ensayó su reactividad con el suero del paciente (91MS253) por ELISA. Como control negativo se usó suero sin infección clamidial (88MS356) diagnosticada clínicamente. Los resultaron revelaron que el suero del paciente tenía un título de más de 1:2000 frente a GLXA-Ab_{2} monoclonal Fig. 11). El ensayo se hizo por ELISA. Diluciones del antisuero obtenido de un paciente diagnosticado de infección clamidial (\blacksquare) y un individuo no diagnosticado (\square) se incubaron con mAb_{2} IgG que revestía los pocillos de poliestireno. El segundo anticuerpo era conjugado de peroxidasa de cabra antihumano. Los datos se presentan como media de duplicados. Esto demuestra que el antisuero humano infectado tiene el anticuerpo específico contra GLXA-Ab_{2} monoclonal, lo que implica que GLXA-Ab_{2} monoclonal es la imagen interna de GLXA.

También se ensayó de forma similar el reconocimiento epecífico de GLXA-Ab_{2} monoclonal por antisuero anticlamidial de conejo (88MS188). El antisuero de conejo se produjo por inoculación de EBs. Como se representa en la Fig. 12, el antisuero de conejo tiene una unión mayor a GLXA-Ab_{2} que el suero preinmune, pero inferior a la esperada. La diferencia entre la unión se ve en el factor de dilución de 1:1000. La placa de poliestireno se revistió con Ab_{2} IgG, 1 \mug/ppocillo. A cada pocillo se añadieron por duplicado diluciones seriales de antisuero de conejo específico para EBs clamidiales (\blacksquare) o suero de conejo preinmune (\square). La unión específica del antisuero se detectó por IgG de ratón anticonejo (H & L), conjugado de HRP y sustrato de TMB. Este revela que el antisuero de conejo que lo es contra clamidias tiene el anticuerpo específico que reconoce GLXA-Ab_{2} monoclonal, una evidencia adicional de que HLXA-Ab_{2} monoclonal es una imagen interna.

Antisueros de GLXA-Ab_{2} monoclonal de ratones singeneicos reconocen GLXA

El anticuerpo antiidiotípico como imagen interna puede causar antisueros específicos para un antígeno en animales que nunca han sido expuestos a ese antígeno. En este caso, si el GLXA-Ab_{2} monoclonal (91 MS441) es la imagen interna de GLXA (que presenta la misma estructura antigénica), produciría un anticuerpo anti-GLXA en ratones BALB/cByJ de la misma cepa a pesar del hecho de que nunca han sido expuestos a GLXA. En un experimento inicial, se inmunizaron 8 ratones con Ab_{2} IgG, cuatro ratones con IgG de ratón normal. En la inyección subcutánea no se usó coadyuvante. 7 días y 14 días después de la inmunización y una inmunización de recuerdo, se obtuvieron anticuerpos de estos ratones sacrificando la mitad de los ratones en cada grupo. El ensayo de inmunotransferencia de mancha se realizó con GLXA purificado. La mancha de transferencia reveló que los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal IgG tenían un título de 1:800 en comparación con 1:100 o menos los ratones inmunizados con IgG de ratón normal. Las manchas se cuantificaron con un densitómetro. Cuando se diluyeron a 1:100 después de la primera inmunización de recuerdo, los antisueros de los cuatro ratones se unían a GLXA, mientras que no se vio unión en el grupo de control incluso cuando la dilución era de 1:50. Esto demuestra que este antisuero es elicitado solamente por el paratopo del antiidiotipo porque los receptores son singeneicos.

GLXA-Ab_{3} de ratones singeneicos inhibe la unión de Ab_{3} monoclonal a GLXA

Antisueros de GLXA-Ab_{3} que se unen específicamente a GLXA se ensayaron también en cuanto a la inhibición de la unión de Ab_{1} monoclonal a GLXA por el inmunoensayo quimioluminométrico. A una dilución de 1:25, el HLXA-Ab_{2} inhibe 90% de la unión en comparación con una inhibición del 18% por el antisuero de control el día 8 después de la inmunización. Ésta es igual a la inhibición demostrada por 10 ug de GLXA-Ab_{1} monoclonal no marcado. La misma inhibición se encontró en el antisuero el día 14, una semana después de la primera inmunización de recuerdo con la misma cantidad (50 \mug/ratón) de IgG. Se señala que el porcentaje de inhibición cayó del 70% el día 7 a aproximadamente 50% el día 14 cuando se diluyó 1:100.

La inmunización con GLXA-Ab_{2} monoclonal protege los ratones frente a la infección clamidial

En este estudio se usaron ratones BALB/cByJ como un modelo animal de infección ocular clamidial. El primer experimento se realizó con 39 ratones. 20 ratones se inmunizaron subcutáneamente con 50 \mug de GLXA-Ab_{2} monoclonal y 19 con IgG normal de ratón sin coadyuvante. Se les administró un total de tres inyecciones, distanciadas una semana. Una semana después de la última inyección, se inocularon los ratones con cuerpos elementales de serovar C de C. trachomatis (5000 IFU en cada ojo). De cada ojo de los ratones se tomaron raspados conjuntivales los días 0, 7, 14 y 21 después de la infección. Se recolectaron muestras de raspados conjuntivales y se cultivaron en monocapas de células McCoy durante 48 horas. Se hizo el recuento de cuerpos de inclusión y se consideraron 5 inclusiones como positivo en 15 campos. Como se representa en la Fig. 13, los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal tenían la mitad de capacidad infectiva en comparación con ratones inmunizados con IgG de ratón normal. En un segundo experimento (20 ratones en cada grupo) se repitió la inmunización de forma similar. Sin embargo, los ratones recibieron 10^{6} IFU por ojo, 100 veces el número de EBs usado en el primer experimento. 20 ratones se inmunizaron subcutáneamente con mAb_{2} (\bullet) y 19 con IgG normal de ratón (O) (50 \mug de IgG/ratón). Se retaron ocularmente con EBs de serovar C de C. trachomatis después de inmunizar tres veces en un intervalo de una semana. Cada ojo recibió 5000 IFU. Un día antes y un día después del reto, se tomó una muestra conjuntival de cada ojo y se cultivaron las células. El porcentaje de ojos positivos está basado en el número de ojos positivos entre todos los ojos examinados en un grupo. Sorprendentemente, en los ratones se encontró casi la misma curva de protección (Fig. 14), lo que sugiere que el GLXA-Ab_{2} monoclonal provoca una vigorosa respuesta defensiva del huésped. Después de inmunizar tres veces en un intervalo de una semana, 20 ratones se inmunizaron con Ab_{2} IgG (\bullet) y 20 con IgG normal de ratón (O) recibieron aproximadamente 5 x 10^{4} a 5 x 10^{6}) de EBs de serovar C de chlamydia trachomatis por ojo. Las inclusiones de conjuntivales de clamidias se ensayaron por cultivo de células obtenidas de los raspados conjuntivales. Los valores son la media de los resultados de cultivo de primera y segunda pasada, excepto el día
28.

En un tercer experimento, en la inmunización se usó hidróxido de aluminio (alum). 10 ratones se inmunizaron con GLXA-Ab_{2} monoclonal en presencia del coadyuvante Maalox®, 8 ratones se inmunizaron sin Maalox® y 16 se inmunizaron con IgG normal de ratón en presencia de Maalox®. El procedimiento de inmunización es el mismo de los casos anteriores. Cuando en la inmunización se usó Maalox®, el título de los antisueros anti-antidiotípicos de los ratones se duplicó al ensayar contra GLXA por transferencia de mancha. Los títulos más altos de los antisueros en ratones tratados con coadyuvante demuestran una protección más efectiva de la infección ocular en comparación con los ratones tratados sin alum (Fig. 15). 10 ratones se inmunizaron con Ab_{2} IgG más alum (\bullet), 8 con Ab_{2} IgG sin alum (O) y 16 con IgG normal de ratón más alum (\blacksquare). Una semana después de la última inmunización de recuerdo, los ratones se infectaron ocularmente y la infección conjuntival se detectó por cultivo de células el día que se indica. Sin embargo, los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal estaban significativamente menos infectados que los que recibieron IgG normal de ratón más alum. Además, la infección disminuyó después de otro reto el día 28. En el cuarto experimento, 8 ratones se inmunizaron con GLXA-Ab_{2} monoclonal y 8 con IgG normal de ratón en presencia de alum. Los protocolos de inmunización e inoculación eran los mismos de antes. Sin embargo, como se ve en la Fig 16(A), el día 7, ambos grupos tenían el mismo grado de infección, estando infectados 50% de los ojos. No obstante, a partir del día 10 empieza a manifestarse un diferencia significativa de la infección entre los dos grupos. Para el grupo inmunizado con GLXA-Ab_{2} monoclonal IgG, el día 14 dos de ocho ojos eran positivos. El día 22, uno de ocho. Ningún ojo era positivo el día 28, viéndose una regresión clara de la infección. A diferencia, de los ratones inmunizados con IgG de ratón normal, el día 14, seis de ocho ojos eran positivos y siguieron siéndolo hasta el día 42. El número de ojos infectados empezó a caer el día 28 en este grupo, lo que se cree que es un proceso de recuperación natural. En un experimento final, los ratones del experimento anterior con infección totalmente depurada fueron retados nuevamente con EBs con el fin de evaluar si la inmunidad estaba asociada con la memoria. Un factor significativo en términos de protección es la capacidad de los ratones preinmunizados para depurar los organismos de sus ojos mucho antes que los no inmunizados. Se ve claramente que este es el caso con ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal (Figura 16(B)). Esto demuestra que el GLXA-Ab_{2} monoclonal no sólo es capaz de inducir una respuesta inmune protectora, sino también una respuesta inmune de memoria.

Después de inmunizar tres veces en un intervalo de una semana, 20 ratones inmunizados con Ab_{2} IgG (\bullet) y 20 inmunizados con IgG normal de ratón (O) recibieron aproximadamente de 5 x 10^{4} a 5 x 10^{6} EBs de serovar C de chlamydia trachomatis por ojo. Las inclusiones clamidiales conjuntivales se ensayaron por cultivo de células obtenidas de raspados conjuntivales. Los valores son la media del cultivo de primera y segunda pasada excepto el día 28.

Este ejemplo ilustra que un anticuerpo antiidiotípico que imita GLXA protege ratones como modelo animal de una infección ocular clamidial. El anticuerpo monoclonal mAb_{1} (89MS30) que se usó para producir anticuerpos antiidiotípicos se obtuvo por inmunización con EBs entero y se exploró en cuanto a su reacción con un antígeno específico para género. Se ha usado para identificar GLXA y demostró una unión específica a la porción de polisacárido de GLXA. Se encontró también que este anticuerpo era reactivo por cruce con cLPS.

El GLXA primero y cPLS son antígenos claramente diferentes. Se encontró GLXA en RBs, EBs, membranas de inclusión, membranas de células huésped y se extendió al espacio de inclusión, el citoplasma de las células infectadas y en los alrededores. Se obtuvo del material sobrenadante de cultivos de células infectadas. Mientras que se encontró cLPS tanto en EBs como en RBS (principalmente RBs), cLPS no se secreta o desparrama de células infectadas, sino que está holgadamente unido a RBs. Estructuralmente, tienen diferente restos de polisacáridos. GLXA tiene un único resto de azúcar: gulosa o derivados de gulosa, manosa y galactosa, probablemente dispuestos en unidades repetidas de los ácidos gulurónico y manurónico. Sólo se encontraron dos ácidos grasos asociados con el antígeno, en comparación con al menos 12 en cLPS. En tanto que cLPS tiene el trisacarido lineal típico de ácido 2-ceto-3-desoxioctonoico (KDO) (núcleo común) y polisacáridos como glucosamina y heptosa. Serológicamente, el GLXA-Ab_{1} monoclonal se une específicamente al bloque que repite gulosa y manosa. Por su parte, en el epitopo específico del género de cLPS, el determinante específico es el enlace 2-8. Obviamente, es muy improbable que GLXA y cLPS compartan el mismo epitopo. Se sabe que anticuerpos, sean policlonales o monoclonales, producidos por inmunización de EBs entero o por cPLS purificado, que son específicos para cLPS, no tienen funciones neutralizantes o protectoras. Visto el análisis de la composición, se sugiere que la gulosa junto con la manosa y galactosa forman el epitopo específico de GLXA. Por otra parte, cLPS, además del trisacárido de KDO como epitopo, tiene otros epitopos en la región de KDO y también otras porciones de sacárido. Estas últimas estructuras han demostrado una amplia reacción por cruce con LPS de otras bacterias gram negativas. Puesto que el epitopo protector de GLXA está constituido por una serie de restos de azúcar, es más razonable creer que algunos de los de cLPS son compartidos parcialmente con
GLXA.

Hay algunas otras posibilidades en cuanto a la reacción por cruce. Por ejemplo, (1) GLXA y cLPS no comparten cualquier similaridad primaria, pero estructuralmente forman un motivo similar de unión; (2) aunque GLXA-Ab_{1} monoclonal se une a cLPS, GLXA y cLPS no tienen similaridad en el sitio de unión del anticuerpo. El anticuerpo monoclonal puede ser multiespecífico, esto es, puede reconocer un epitopo completamente diferente.

A partir de la discusión anterior, se cree que el GLXA-Ab_{1} monoclonal es específico para el epitopo GLXA, la posibilidad de que GLXA y cLPS compartan algunos restos de azúcar o la mera similaridad de estructura pueden explicar la reactividad por cruce.

Anticuerpos antiidiotípicos, GLXA-Ab_{3} y GLXA-Ab_{2} monoclonal El anticuerpo antiidiotípico es un inmunógeno potente y de larga vida

Se inyectó en cobayas GLXA-Ab_{1} monoclonal subcutáneamente en ausencia de coadyuvante de Freund. Las cuatro cobayas inmunizadas desarrollaron anticuerpos antiidiotípicos de alto título, específicos para Ab_{1} monoclonal, que se encontraron al cabo de sólo 3 semanas después de la primera inmunización. El título era de aproximadamente 1:5000 por ELISA. Los antisueros antiidiotípicos producidos contenían una concentración relativamente alta de GLXA-Ab_{2} que es específico para la región hipervarible de GLXA-Ab_{1} monoclonal. Esto se manifestó después de dos absorciones por IgG de ratón normal. Cuando se usó como inmunógeno en tres conejos el isotipo IgG_{1} de anticuerpos antiidiotípicos de cobaya, el título del anticuerpo antiidiotípico era de más de 1:20.000 dos meses después de la inmunización. Esto demuestra que la propia inmunoglobulina es un inmunógeno muy potente. Esto es cierto no sólo para la inmunización de interespecies, sino también para inmunización singeneica. Con GLXA-Ab_{2} monoclonal antiidiotípico, la inmunización se realizó en ratones singeneicos sin KLH-conjugación o codayuvante de Freund. Los ratones desarrollaron GLXA-Ab_{3} de título alto poco tiempo después (9 días) de la inmunización. El protocolo usado en este estudio es diferente del de la mayoría de los procedimentos, que usan un conjugado o coadyuvante de Freund para una capacidad inmunogénica más alta. Esto indica que la inmunoglobulina como antígeno es más inmunogénica comparativamente con la mayoría de los antígenos peptídicos aislados o sintéticos.

Una vacuna exitosa no sólo requiere que sea un buen inmunógeno, sino que también dure mucho (preferiblemente, durante el tiempo de vida fuera del huésped). La inmunidad producida por el idiotipo es válida durante mucho tiempo. La capacidad de inhibir la unión de GLXA-Ab_{1} a GLXA por GLXA-Ab_{2} de cobaya de tres cobayas inmunizadas se ha controlado durante hasta 77 semanas. Con sólo tres inmunizaciones de recuerdo, la inhibición un año después de la postinmunización es casi equivalente a la de antisueros recogidos en las etapas tempranas después de inmunizar. Esto indica que la inmunidad originada por el anticuerpo idiotípico GLXA-Ab_{1} monoclonal tiene una memoria a largo plazo. Puesto que la semivida de una molécula de anticuerpo o la mayoría de células que producen anticuerpo es de aproximadamente unas pocas semanas, el intervalo de inmunización de recuerdo (seis meses) está mucho más allá del intervalo de vida de las células B y las inmunoglobulinas. Es una estimulación constante dentro del retículo idiotípico lo que mantiene este anticuerpo antiidiotípico a un cierto nivel. No se ha visto en este caso el cambio de especifidad idiotípica durante este tiempo.

Una imagen interna de GLXA, diferencia isotípica

En este estudio, se separaron GLXA-Ab_{2} IgG1 e IgG2 de cobaya. No se evaluó la función reguladora de estos dos isotipos para el idiotipo. Sin embargo, la diferencia entre las subclases IgG1 e IgG2 se ha encontrado en la inhibición de la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA. Con un sistema nuevo, el inmunoensayo quimioluminométrico, la incubación y la detección final se realizaron en solución y no en fase sólida como en ELISA, aminorando así considerablemente la posibilidad de la inhibición por impedimento. Los resultados han revelado que GLXA-Ab_{2} IgG_{1} inhibía 100% de la unión, mientras que IgG2 inhibía 50% a la misma conncentración. Esto sugirió que IgG1 de GLXA-Ab_{2} tiene una afinidad alta a unirse al idiotipo o ser más como el antígeno, GLXA. Esto demuestra una diferencia isotípica en su capacidad de unión al idiotipo, que refleja la diferencia en sus respectivos sitios activos. IgG1 tiene una capacidad de unión al idiotipo diferente de la de IgG1. Hay varios ejemplos de idiotipos dominantes, por ejemplo, el idiotipo A5A de anticuerpos carbohidrato de anticepa A o el idiotipo T15 de anticuerpos de fosforilcolina. No está claro si hay una preferencia de isotipo de anticuerpo antiidiotípico en diferentes sistemas. Este hallazgo sugiere que un cierto isotipo de GLXA-Ab_{2} es la imagen interna, mientras que otros no lo son.

GLXA-Ab_{2} monoclonal como imunógeno de GLXA clamidial

El objetivo de hacer anticuerpos antiiditípicos monoclonales es: (1) tener una fuente constante de anticuerpo antiidiotípico para estudio de una vacuna; (2) identificar un posible receptor de GLXA en células huésped, y (3) caracterizar más el epitopo en GLXA. Esto permite entender las funciones biológicas de GLXA en términos de densidad del epitopo, su papel en el mecanismo de la infección y la función protectora frente a la infección clamidial in vivo. La producción de anticuerpos antiidiotípicos monoclonales se realizó en ratones singeneicos BALB/cBYJ. En la primera fusión, una estable, se seleccionó un clon muy inhibidor (91MS441) explorado entre 283 clones. En la segunda fusión, se seleccionó otro clon (91MS442) aunque no es tan inhibidor como el clon 91MS441 en el inmunoensayo qumioluminométrico. El GLXA-Ab_{2} monoclonal producido por este clon (91MS441) ha revelado ser la imagen interna del antígeno clamidial, GLXA.

Es interesante señalar que la capacidad inhibidora de GLXA-Ab_{3} de ratón disminuye con el tiempo ligeramente pero claramente. La dosificación del antiidiotipo ha sido un factor en la intensificación del idiotipo o la supresión del idiotipo. Estos resultados de inhibición demuestran que, después de la administrar dos veces GLXA-Ab_{2} IgG, la inhibición es más alta que la de sueros obtenidos después de administrar tres veces. Esto indica que 50 ug son demasiados para una dosis o demasiado para administraciones repetidas. Por otra parte, también demuestra que una cantidad menor es suficiente para inmunidad protectora. La razón para escoger IgG normal de ratón como control negativo en la inmunización y no un clon no reactivo es que prevendría cualquier posible influencia de un clon específico.

GLXA-Ab_{1} y GLXA-Ab_{3} monoclonales presentan la misma estructura de unión de antígeno

GLXA-Ab_{3} de conejos y ratones inmunizados reconocían GLXA purificado por afinidad por el inmunoensayo de transferencia de mancha, aunque no había exposición previa a GLXA o infección. La unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA se inhibe a medida que aumenta la concentración de GLXA-Ab_{3}. Esto indica que el anti-antiidiotipo tiene una actividad antigénica equivalente como idiotipo, esto es, que reconocen el mismo epitopo. Además, se demostró la misma reactividad antigénica de GLXA-Ab_{1} y GLXA-Ab_{3} monoclonales de conejos frente a GLXA en la tinción inmunofluorescente de las inclusiones en cultivo de células McCoy infectadas. El experimento sugirió la similitud estructural de anticuerpos. El uso de de GLXA-Ab_{2} monoclonal que imita GLXA para identificar su papel sería valioso para entender el mecanismo de la protección del antiidiotipo. El experimento se realizó con células epidérmicas de carcinoma humano (A431) así como células epiteliales de glándula endometrial humana (HEGEC). Se usaron esas células por ser de origen humano. Se realizó un experimento preliminar de unión por tinción directa de anticuerpo detectada con citómetro de flujo FACScan (Becton Dicknson, N.J.). Puesto que la separación de estas células epiteliales en una suspensión de células individuales es muy difícil sin usar anzimas o una separación violenta, especialmente de células HEGEC, la población de células está constituida por singletes, dobletes y multipletes. La población de células individuales se situó en el acceso justo encima de restos de células. Puesto que las células de control teñidas con IgG normal de ratón estaban exactamente en el mismo acceso, se cree que ambos grupos son comparables. Además, la unión es directa, GLXA-Ab_{2} monoclonal IgG o IgG normal de ratón estaba marcada con biotina. La intensidad de GLXA-Ab_{2} monoclonal unido específicamente a las células huésped (HEGEC) aumenta a medida que aumenta la concentración de anticuerpo. La IgG de ratón normal no tiene esa unión incluso a la concentración más alta. Si se puede repetir este hallazgo y demostrar que es válido, GLXA es una adhesina o un ligando que se une a células HEGEC. Estas son algunas razones para creer que GLXA es una adhesina o un ligando. Primero, como se ha mencionado antes, la neutralización de GLXA-Ab_{3} se puede producir en la etapa muy temprana. Esto se ha demostrado por no encontrar significativamente RNA ribosomal específico clamidial en muestras conjuntivales tomadas de primates inoculados con EBs tratados con GLXA-Ab_{2}. Esto sugirió que GLXA-Ab_{3} bloqueba la entrada de EBs en el huésped. Segundo, se encontró que GLXA intensifica la infección aproximadamente tres veces cuando se preincubaron células McCoy con GLXA. Sólo si GLXA como adhesina o ligando facilita la unión de agregación de EBs a células huésped, puede producirse este resultado. Realmente, los EBs pueden usar este mecanismo para infectar células huésped porque GLXA se secreta de células infectadas.

Un posible mecanismo del papel de GLXA puede ser el siguiente: Los EBs se agregan a las células huésped por GLXA en EBs o por GLXA libre que se secretaron por las cáliulas huésped al entorno. Esto hace micho más fácil y eficiente para GLXA absorber las células del entorno. Los EBs pueden agregarse luego a las células huésped por GLXA sobre EBs, uniéndose así a las células huésped. Parece que el mecanismo es mucho más eficiente que una agregación uno a uno.

Neutralización de una infección clamidial por GLXA-Ab_{3}

En el ensayo preliminar de neutralización in vitro se encontraron más inclusiones clamidiales en EBs de serovar B de C. trachomatis tratado con GLXA-Ab_{1} que en el tratado con Ab_{3} de conejo. Esto reveló que el GLXA-Ab_{3} neutralizaba la infección, mientras que GLXA-Ab_{1} monoclonal no lo hacía. GLXA-Ab_{3} neutralizaba la infección en cultivo de células, mientras que no lo hacía. GLXA-Ab_{1}. Este resultado in vitro se repitió in vivo en dos experimentos posteriores con el modelo de infección de primates. Se confirmó que GLXA-Ab_{3} neutralizaba la infección clamidial tanto in vitro como in vivo.

La comprensión del mecanismo de esta neutralización resulta del experimento de hibridación de RNA específico para clamidias. A los primates se inocularon ocularmente EBs tratados con GLXA-Ab_{3} o con IgG normal de ratón. Se detectó RNA clamidial en los raspados conjuntivales tomados de primates en diferentes días antes y después de inoculación. El ensayo de hibridación de RNA usado en este estudio es una manera muy sensible de detectar infección clamidial en muestras que son inequívocamente negativas por cultivo de células de DFA o ambas. El RNA sustancialmente bajo encontrado en primates tratados con Ab_{3} proporciona la evidencia de que la neutralización se produce en una etapa muy temprana de la infección, antes de la internalización de los organismos. Esto sugiere que el GLXA puede ser una adhesina o un ligando que funciona en la etapa de agregación.

El papel de la inmunidad humoral en la protección contra la infección clamidial ha sido discrepante durante mucho tiempo. Sin embargo, se ha visto que tanto in vitro como in vivo la inmunidad humoral puede jugar algún papel en la prevención de la infección clamidial.

Protección de ratones contra la infección clamidial por inmunización con GLXA-Ab_{2} monoclonal

El modelo de infección clamidial ocular en ratones BALB/cByJ se empleó en un estudio de vacunas con GLXA monoclonal-IgG de anticuerpo antiidiotípico monoclonal. Es un modelo para serovares de C. trachomatis que sólo infectan seres humanos. En los experimentos de inmunización, se usó (GLXA-Ab_{2}) IgG monoclonal (50 \mug/ratón) para inmunizar subcutáneamente de 6 a 20 ratones en cada grupo, en presencia de coadyuvante o sin coadyuvante. Los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal presentan un claro título de GLXA-Ab_{3} detectable una semana después de una sola inmunización. El sistema usado en este estudio es sinergeneico: GLXA-Ab_{1} monoclonal, GLXA-Ab_{2} monoclonal o GLXA-Ab_{3} monoclonal, todos producidos en la misma cepa de ratones. Presentan genéticamente las mismas inmunoglobulinas. La única "estructura foránea" es el sitio específico de unión de cada anticuerrpo tipo (GLXA-Ab_{1} monoclonal o GLXA-Ab_{2} monoclonal). Como control negativo se usó IgG normal de ratón de la misma cepa. Consistentemente, los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} monoclonal desarrollaron un título de GLXA-Ab_{3} significativamente alto frente a GLXA purificado en comparación con el grupo de control. El título medio era de 1:3200, en comparación con 1:200 en los ratones inmunizados con IgG de ratón normal. Esto demuestra claramente que la produccción de anticuerpo de GLXA-Ab_{3} en ratones sinergeneicos está ocasionado por la región hipervariable, la estructura que imita el GLXA. Además, el GLXA-Ab_{3} de estos ratones inhibía la unión de GLXA-Ab_{1} monoclonal a GLXA tan eficientemente como GLXA-Ab_{1} monoclonal no marcado. Los experimentos demuestran que GLXA-Ab_{2} imita un epitopo individual de GLXA.

La protección de ratones contra la infección ocular por C. trachomatis se demostró consistentemente en cuatro experimentos individuales in vitro. Los ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal o IgG de ratón normal (tres veces sobre base semanal) se infectaron en los ojos por inoculación de EBs (5000 IFU/ojo). Se tomaron raspados conjuntivales en diferentes días antes y después de la infección. Las inclusiones se detectaron por cultivo de células. Los ojos de ratones inmunizados con GLXA-Ab_{2} IgG monoclonal tienen una recuperación significativamente corta (9 días después de la inoculación ocular, en comparación con 28 días del control inmunizado con IgG normal de ratón). El título de GLXA-Ab_{3} se correlaciona bien con los resultados de cultivos de células. Esto demuestra que GLXA-Ab_{2}, que simula un epitopo de GLXA individual, es un inmunógeno efectivo que induce una fuerte respuesta inmune protectora contra la infección clamidial. Esto revela que reside un epitopo protector individual en GLXA clamidial.

Prospección del mecanismo de la neutralización y protección

Este ejemplo es la primera demostración de que un GLXA-Ab_{1} monoclonal no neutralizante puede producir in vivo un GLXA-Ab_{3} neutralizante a través de un anticuerpo antiidiotípico (GLXA-Ab_{2}). El hecho central es que el GLXA-Ab_{1} producido por inmunización con EBs clamidiales no neutraliza o protege primates de la reinfección, mientras que GLXA-Ab_{3} producido por GLXA-Ab_{2} de cobaya neutralizaba la infección y que la inmunización con GLXA-Ab_{2} protege los ratones de la reinfección.

Claims

1. Una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal antiidiotípico para inducir en un animal un anticuerpo antiidiotípico que reconoce un antígeno que comprende un exoantígeno glicolipídico (GLXA) de clamidias específico para género, en la que el anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo de IgG1.

2. Una linea continua de células híbridas que produce el anticuerpo monoclonal antiidiotípico de la reivindicación 1.

3. La línea continua de células híbridas de ATCC nº. de acceso H.B. 11301.

4. Un anticuerpo monoclonal obtenible por la línea de células de la reivindicación 3.

5. Una linea de células según la reivindicación 2, en la que la linea de células es un híbrido de una célula de bazo inmune que produce un anticuerpo antiidiotípico que induce en un animal un anticuerpo anti-antiidiotípico que reconoce un antígeno que comprende un exoantígeno glicolipídico de clamidias (GLXA) específico para género.

6. Una vacuna que comprende un anticuerpo antiidiotípico producido por la línea continua de células ATCC nº. de acceso H.B. 11301.

7. Una vacuna según la reivindicación 6, que además comprende el coadyuvante hidróxido de aluminio.

8. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 para uso en un ser humano.

9. Una composición biológicamente activa para inmunizar un mamífero contra una infección clamidial, en la que la composición se selecciona entre el grupo constituido por:

(i) un anticuerpo antiidiotípico monoclonal que induce en el mamífero un anticuerpo anti-antiidiotípico que reconoce un antígeno que comprende un antígeno glicolipídico de clamidias (GLXA) específico para género, en el que el anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo de IgG1;

(ii) un fragmento de Fab de un anticuerpo antiidiotípico monoclonal que induce en el mamífero un anticuerpo anti-antiidiotípico que reconoce un antígeno que comprende un GLXA de clamidias específico para género, y

(iii) mezclas de (i) y (ii).

10. La composición biológicamente activa de la reivindicación 9, que además comprende un coadyuvante farmacéuticamente aceptable.

11. El uso de una composición biológicamente activa para la producción de un medicamento para inmunizar un mamífero contra una infección clamidial, en el que la composición se selecciona entre el grupo constituido por:

(iii) mezclas de (i) y (ii).

12. La composición de la reivindicación 10 o el uso de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo antiidiotípico se produce por la línea continua de células ATCC nº. de acceso H.B. 11301.

13. La composición de la reivindicación 10 o el uso de la reivindicación 11, en el que el mencionado mamífero es un ser humano.