BR112020015166A2 - Proteínas manipuladas e métodos de uso - Google Patents

Abstract

proteínas manipuladas e métodos de uso.neste documento são conferidas proteínas que incluem, pelo menos, um domínio de células b e, pelo menos, um domínio de células t. também são conferidas composições que incluem uma ou mais das proteínas e métodos para o uso das proteínas.

Description

Patent File 0293.000055WO01

PROTEÍNAS MANIPULADAS E MÉTODOS DE USO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos E.U.A. Nº de Série 62/621.796, depositado em 25 de janeiro, 2018, o qual é incorporado na sua totalidade no presente documento por referência.

ANTECEDENTES

[0002] Atualmente, as infecções bacterianas representam cerca de 1,7 milhões de casos de infecções adquiridas em hospitais nos Estados Unidos (4,5 por 100 admissões), com uma taxa de mortalidade geral na faixa de 20% a 60% ou 99,000 mortes diretamente associadas a uma infecção adquirida em um hospital. Se estima que o impacto econômico devido a essas infecções custe, anualmente, entre 5 bilhões e 10 bilhões de dólares nos Estados Unidos.

[0003] As infecções bacterianas gram-negativas e as suas sequelas são frequentemente letais. Se estima que, apenas nos Estados Unidos, mais de 700,000 pacientes desenvolvam infecções bacterianas a cada ano. Desses, 160,000 realmente desenvolvem septicemia, resultando em 50,000 mortes anualmente. A maioria dessas são infecções adquiridas em hospitais devido a bacilos gram-negativos tais como E. coli (o patógeno mais comum isolado a partir de pacientes com sepse gram-negativa), seguidos com frequência por Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa.

[0004] As infecções causadas por bactérias gram- negativas, na família Enterobacteriaceae, continuam a ser uma preocupação significativa tanto nos cuidados com a saúde humana como no cenário da agricultura animal.

As bactérias da família Enterobacteriaceae são um grande grupo heterogêneo cujo habitat natural é o trato intestinal tanto de humanos como de animais.

A família inclui muitos gêneros e é subdividida em oito subgrupos, incluindo: Escherichieae, Edwardsielleae, Salmonelleae, Citrobactereae, Klebsielleae, Proteeae, Yersineae e Erwineae.

Muitas espécies da família Enterobacteriaceae são frequentemente patógenos oportunistas com significado clinicamente relevante, incluindo Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Serratia spp., Citrobacter spp., Morganella spp., Shigella spp. e Salmonella spp., estão entre os vinte principais organismos responsáveis por causarem infecção.

Quando ocorrem doenças clinicamente importantes, são frequentemente causadas por E. coli, mas outras podem infectar e causar doenças debilitantes.

Na maioria dos casos, as bactérias se tornam patogênicas quando atingem tecidos fora do seu ambiente intestinal normal quando as defesas normais do hospedeiro são inadequadas.

Isso é particularmente visto hoje em jovens ou idosos; frequentemente em estágios terminais de uma infecção primária devido a incompetência imunológica ou imunossupressão; permitindo que o organismo atinja a corrente sanguínea para causar sepse, resultando em morte ou sequelas secundárias.

[0005] A espécie mais importante é a Escherichia coli. Essas bactérias podem colonizar inofensivamente o trato gastrointestinal tanto de humanos como de animais como flora normal. No entanto, existem algumas cepas que evoluíram para E. coli patogênica, ao adquirirem fatores de virulência por meio de plasmídeos, ilhas de patogenicidade, transpósons e/ou bacteriófagos. Essas E. coli patogênicas podem ser categorizadas com base em sorogrupos, mecanismos de patogenicidade, sintomas clínicos ou fatores de virulência. Existem cinco categorias de Escherichia coli diarreiogênicas que provocam doenças transmitidas por alimentos e pela água nos seres humanos: as cepas enteropatogênicas (EPEC), entero-hemorrágicas (EHEC), enterotoxigênicas (ETEC), enteroinvasivas (EIEC) e enteroagregativas (EAEC). A virulência e patogênese de patógenos entéricos envolve ambos os fatores específicos do hospedeiro e do patógeno. Muitos determinantes de virulência específicos do patógeno contribuem para a patogênese dessas bactérias. A virulência bacteriana dessas bactérias é o resultado de muitos atributos diferentes, que contribuem frequentemente para diferentes passos da complicada série de eventos que reconhecemos como uma infecção. A infecção ocorre principalmente pelo consumo de água contaminada, alimentos ou pelo contato direto de pessoa a pessoa. Uma vez ingeridos, os estágios de infecção comuns aos patógenos entéricos podem incluir apego, colonização, proliferação, dano dos tecidos, invasão e disseminação.

[0006] A E. coli patogênica está se tornando cada vez mais resistente a múltiplas classes de antibióticos e está entre as espécies mais frequentemente encontradas no cenário clínico. Embora habite naturalmente no intestino humano, a E. coli pode causar doenças graves e morte e se tornou familiar como fonte de doença grave intestinal de origem alimentar. Apesar dessa notoriedade, o papel principal da bactéria como um patógeno extraintestinal é muitas vezes negligenciado: atualmente é a principal causa de infecções não complicadas do trato urinário (ITU), uma indicação resultando em 7-8 milhões de consultas médicas por ano apenas nos Estados Unidos. Usando o trato urinário como porta de entrada, a E. coli pode causar septicemias graves; choque endotóxico, muitas vezes resultando em morte. Essa bactéria também é conhecida por causar meningite ou pneumonia neonatal quando invade outras partes estéreis do corpo.

[0007] Os patógenos entéricos mais comumente reconhecidos que contribuem para infecções gastrointestinais demonstraram ser bactérias (por exemplo, Salmonella spp., Escherichia coli, Shigella spp. e Vibrio spp.). Nos Estados Unidos, patógenos entéricos transmitidos por alimentos e/ou fontes transmitidas pela água causam aproximadamente 76 milhões de doenças, 325,000 hospitalizações e 5,000 mortes a cada ano. Mais de 90% das doenças transmitidas por alimentos de causas conhecidas são de origem microbiana. Os custos associados com as despesas médicas e perdas de produtividade associadas com os agentes microbianos se estima que estejam entre US $ 5,6 e US $ 9,4 bilhões por ano. De fato, a transmissão de patógenos entéricos para populações humanas através do consumo de alimentos e água contaminados se tornou uma preocupação mundial. Os dados de vigilância compilados pela

Organização Mundial da Saúde estimam que as infecções gastrointestinais e as suas sequelas resultem em aproximadamente 4 a 6 milhões de mortes anualmente. Mais de 80% desses casos estão entre crianças menores de cinco anos, com mortalidade chegando a 4 milhões. A maioria dessas mortes ocorre em crianças com menos de 2 anos de idade. Nos Estados Unidos, a diarreia é a segunda doença infecciosa mais comum, sendo responsável por uma em cada seis doenças infecciosas. Em alguns países em desenvolvimento, as crianças têm mais de 12 episódios de diarreia por ano e as doenças diarreicas representam 15 a 34 por cento de todas as mortes.

[0008] Outros gêneros importantes incluem Salmonella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia spp. e Citrobacter spp. Essas bactérias podem induzir uma multitude de manifestações clínicas; tais como sepse; choque endotóxico; osteomielite; pneumonia; peritonite; endocardite; infecção de ferida; artrite reativa, meningite, infecções do trato urinário (ITU), insuficiência renal, síndrome de Guillaon-Barré, síndrome de Reiter, doença diarreica entérica e outros sintomas extraintestinais.

[0009] Em mamíferos, foi demonstrado que a resposta à lesão tecidual ou infecção bacteriana resulta em uma resposta inflamatória aguda. Essa resposta aumenta a permeabilidade capilar e a infiltração fagocítica, resultando nos sinais clínicos reconhecidos como inflamação: inchaço, febre, dor e vermelhidão. Se deixado por controlar, isso pode levar à morte. A ativação de fatores humorais e a liberação de citocinas mediam eventos sistêmicos coletivamente conhecidos como a fase aguda de resposta às proteínas, o que resulta em uma cascata de eventos fisiológicos e bioquímicos. A duração dessa resposta está diretamente relacionada com a gravidade da lesão e a magnitude da infecção sistêmica.

[0010] A diversidade de patógenos e fatores de virulência complicou o desenvolvimento de vacinas novas e melhoradas com proteção duradoura. A busca por uma vacina melhor é motivada pelos resultados de estudos epidemiológicos e de desafio, mostrando que a recuperação da infecção natural é frequentemente seguida por imunidade de longa duração, ao mesmo tempo que proporciona proteção cruzada contra múltiplas cepas e/ou sorotipos. Até à data, ainda não está disponível uma vacina eficaz para a prevenção dessas infecções.

SUMÁRIO DO PEDIDO

[0011] No presente documento são conferidas proteínas não naturais. Em uma modalidade, uma proteína inclui uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que a proteína protege um animal contra a infecção por E. coli.

[0012] Em uma modalidade, uma proteína inclui uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli. A proteína adicionalmente pode incluir duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0013] Em uma modalidade, uma proteína inclui uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, em que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli. A proteína adicionalmente pode incluir duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0014] Em uma modalidade, a proteína inclui um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17. Em uma modalidade, a proteína inclui um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22. O domínio de células B e o domínio de células T pode estar presente na ordem domínio células B - domínio células T.

[0015] Em uma modalidade, uma proteína inclui os aminoácidos 7-518 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, uma proteína inclui os aminoácidos 7-365 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, uma proteína inclui os aminoácidos 7-422 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 26. Em uma modalidade, uma proteína inclui os aminoácidos 7-461 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28.

[0016] Em uma modalidade, uma proteína inclui uma selecionada a partir da proteína 16-51 da Tabela 3 ou da proteína 52-63 da Tabela 4 ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da proteína 16-51 da Tabela 3 ou da proteína 52-63 da Tabela 3. A proteína pode adicionalmente incluir um ligante localizado entre um domínio de células B e um domínio de células T, ou entre cada domínio de células B e domínio de células T.

[0017] Em uma modalidade, uma proteína inclui um primeiro domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 1, um segundo domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-48 de SEQ ID NO: 1, um terceiro domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 49-88 de SEQ ID NO: 1, um quarto domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 89-103 de SEQ ID NO: 1, um quinto domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 104-133 de SEQ ID NO: 1 e um sexto domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-148 de SEQ ID NO: 1, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo, quarto e sexto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções por E. coli.

[0018] Em uma modalidade, uma proteína inclui um primeiro domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 2, um segundo domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 24-38 de SEQ ID NO: 2, um terceiro domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 39-75 de SEQ ID NO: 2, um quarto domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 76-90 de SEQ ID NO: 2 e um quinto domínio incluindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 91-101 de SEQ ID NO: 2, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo e quarto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções por E. coli.

[0019] Também é conferida uma composição que inclui uma ou mais das proteínas descritas no presente documento. Em uma modalidade, a composição inclui um portador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição inclui um adjuvante.

[0020] Também são conferidos métodos. Em uma modalidade, um método inclui administrar a um sujeito uma quantidade da composição descrita no presente documento eficaz para induzir o sujeito a produzir anticorpo que se liga especificamente à proteína, produzir células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas direcionadas para um epítopo de uma proteína presente na composição ou uma combinação das mesmas.

[0021] Em uma modalidade, um método é para tratar uma infecção em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

[0022] Em uma modalidade, um método é para tratar um sintoma em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

[0023] Em uma modalidade, um método é para diminuir a colonização em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um sujeito colonizado por um micróbio gram- negativo.

[0024] Em uma modalidade, um método é para tratar uma condição em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um sujeito com necessidade da mesma, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram-negativo.

[0025] Em uma modalidade, um método é para tratar uma infecção em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram- negativo, em que a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de uma composição descrita no presente documento.

[0026] Em uma modalidade, um método é para tratar um sintoma em um sujeito incluindo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-

negativo, em que a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de uma composição descrita no presente documento.

[0027] Em uma modalidade, um método é para diminuir a colonização em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito colonizado por um micróbio gram-negativo, em que a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de uma composição descrita no presente documento.

[0028] Em uma modalidade, um método é para tratar uma condição em um sujeito e inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito com necessidade da mesma, em que a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de uma composição descrita no presente documento, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram- negativo.

[0029] Em uma modalidade, o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico que é um membro da família Vibrionaceae, um membro da família Enterobacteriaceae, tal como E. coli ou Klebsiella spp., um membro da família Pasteurellaceae, um membro da família Pseudomonadaceae, ou uma Campylobacter spp. Em uma modalidade, o sujeito é um mamífero, tal como um humano ou um bovino, ou uma ave, tal como uma ave domesticada.

[0030] O sumário acima não se destina a descrever cada modalidade divulgada ou toda a implementação da presente invenção. A descrição que se segue exemplifica mais particularmente modalidades ilustrativas. Em vários lugares através do pedido, é conferida orientação por meio de listas de exemplos, exemplos que podem ser usados em várias combinações. Em cada instância, a lista recitada serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva. Definições

[0031] O termo "e/ou" significa um ou a totalidade dos elementos listados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos listados.

[0032] As palavras "preferido" e "preferencialmente" se referem a modalidades da invenção que podem proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. No entanto, outras modalidades também podem ser preferidas, nas mesmas ou em outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais modalidades preferidas não implica que outras modalidades não sejam úteis e não se destina a excluir outras modalidades do escopo da invenção.

[0033] Os termos "compreende" e as variações do mesmo não têm um significado limitativo onde esses termos aparecem na descrição e nas reivindicações.

[0034] É entendido que, sempre que modalidades forem descritas no presente documento com a linguagem " inclui", "incluem" ou "incluindo" e semelhantes, outras modalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" são também proporcionadas.

[0035] Salvo especificação em contrário, "um", "uma", "o/a" e "pelo menos um(a)" são usados indistintamente e significam um ou mais do que um.

[0036] Além disso, no presente documento, as recitações de gamas numéricas entre pontos extremos incluem todos os números incluídos dentro dessa gama (por ex., 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

[0037] Na descrição no presente documento, modalidades particulares podem ser descritas isoladamente para maior clareza. A menos que especificado expressamente de outra forma que as características de uma modalidade específica são incompatíveis com as características de outra modalidade, certas modalidades podem incluir uma combinação de características compatíveis descritos no presente documento em conexão com uma ou mais modalidades.

[0038] Para qualquer método divulgado neste documento que inclua passos discretos, os passos podem ser conduzidos em qualquer ordem possível. E, conforme apropriado, qualquer combinação de dois ou mais passos pode ser conduzida simultaneamente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0039] A FIG. 1 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-280. Os camundongos receberam duas vacinações com Trímero-1 conforme indicado (100 µg ou 150 µg), com três semanas de intervalo e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; ****P ≤ 0,0001)

[0040] A FIG. 2 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-13. Os camundongos receberam duas vacinações com Trímero-1 conforme indicado (100 µg ou 150 µg), com três semanas de intervalo e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; *P < 0,05; **P < 0,01)

[0041] A FIG. 3 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-J4. Os camundongos receberam duas vacinações com Trímero-1 conforme indicado (100 µg ou 150 µg), com três semanas de intervalo e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; **P < 0,01; ***P < 0,001)

[0042] A FIG. 4 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-374. Os camundongos receberam duas vacinações com Trímero-1 conforme indicado (100 µg ou 150 µg), com três semanas de intervalo e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; P > 0,05)

[0043] A FIG. 5 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-280. Os camundongos receberam duas vacinações, com 3 semanas de intervalo, com Trímero-1 conforme indicado (50, 100 ou 150 µg), e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; **P < 0,01; ****P ≤ 0,0001)

[0044] A FIG. 6 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-2 e placebo após desafio com APEC-280. Os camundongos receberam duas vacinações com 3 semanas de intervalo, conforme indicado (50, 100 ou 150 µg), e foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. (Teste Exato de Fisher; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P ≤ 0,0001)

[0045] A FIG. 7 mostra mortalidade cumulativa em vacinas Trímero-1 e placebo após desafio com APEC-280 após um período de repouso de 8 semanas. Os camundongos receberam duas vacinações com 3 semanas de intervalo, conforme indicado (50, 100 ou 150 µg), e foram desafiados após um período de repouso de 8 semanas. (Teste Exato de Fisher; ****P ≤ 0,0001)

[0046] As FIGs. 8A-B mostram títulos séricos de IgG. FIG. 8A. Títulos de IgG contra Trímero-2 em 3 semanas após a segunda vacinação. FIG. 8B. Títulos séricos de IgG contra Trímero-1 em 3 (preenchimento sólido) e 8 (preenchimento diagonal) semanas após a segunda vacinação. Os títulos foram determinados por ELISA com o antigênio da vacina, Trímero-1 ou Trímero-2, revestido na placa. (LOD, limite de detecção)

[0047] As FIGs. 9A-B mostram colonização da bexiga e do rim 7 dias após o desafio transuretral com UPEC-25, um isolado de ITU clínica. Camundongos vacinados receberam diferentes formulações de Trímero-1, conforme mostrado, seguido pela via de administração entre parênteses. Nos casos em que os camundongos receberam um reforço inicial heterólogo, a formulação e a via de iniciação são mostradas primeiro, seguidas pela formulação e via de reforço usadas para a segunda, terceira e quarta imunizações. O nível médio de colonização é indicado para a bexiga (figura 9A) e para o rim (figura 9B). (LOD, limite de detecção)

[0048] As FIGs. 10A-C mostram títulos de IgG e IgA em camundongos imunizados com diferentes formulações de Trímero-1. As formulações são conforme indicadas seguidas pela via de administração entre parênteses. Nos casos em que os camundongos receberam um reforço inicial heterólogo, a formulação e a via de iniciação são mostradas primeiro, seguidas pela formulação e via de reforço usadas para a segunda, terceira e quarta imunizações. O título de IgG

(preenchimento sólido) e IgA (preenchimento diagonal) no soro (FIG. 10A), urina (FIG. 10B) e fezes (FIG. 10C) foi determinado usando amostras agrupadas a partir de cada grupo. (LOD, limite de detecção)

[0049] As FIGs. 11A-B mostram colonização da bexiga e do rim 7 dias após o desafio transuretral com UPEC-25. Camundongos vacinados receberam doses crescentes de Trímero- 1 conforme indicado (25, 100 ou 200 µg), e o nível médio de colonização é mostrado para a bexiga (FIG. 11A) e para o rim (FIG. 11B). Os resultados da análise de fração mitigada são mostrados e marcados com um asterisco (*) se significativos. (LOD, limite de detecção)

[0050] As FIGs. 12A-C mostram títulos de IgG e IgA em camundongos imunizados com doses crescentes de Trímero-1. O título de IgG e IgA no soro (FIG. 12A), urina (FIG. 12B) e fezes (FIG. 12C) foi determinado em camundongos individuais a partir de cada grupo, e o título médio para cada grupo é indicado. (LOD, limite de detecção)

[0051] A FIG. 13 mostra os títulos séricos de IgG para Trímero-1 em bezerros. Dois bezerros foram vacinados subcutaneamente com Trímero-1 formulado em hidróxido de alumínio (bezerro #38 e #141). Os títulos para animais individuais foram determinados antes e após a vacinação. (LOD, limite de detecção)

[0052] A FIG. 14A mostra os perfis de proteínas eletroforéticas da membrana externa para Klebsiella pneumoniae, E. coli APEC-280 e E. coli CFT073 examinadas (linha 1, marcador de peso molecular; linha 2, - em branco; linha 3, - Klebsiella pneumoniae; linha 4, - E. coli APEC-

280; linha 5, - E. coli CFT073; e linha 6, - em branco). A análise por Western blot (Figura 14B) revelou que os antissoros positivos para Trímero-1 reagiram contra várias proteínas associadas à membrana de Klebsiella pneumoniae, E. coli CFT073 e APEC-280.

[0053] As FIGs. 15A-B mostram eficácia da vacina terapêutica em camundongos desafiados transuretralmente com E. coli cepa UPEC-25 antes da imunização com Trímero-1. Um dia após o desafio, os camundongos do grupo B (Trímero-1) foram imunizados com 100 μg de antigênio Trímero-1 administrado SC e 100 μg de antigênio Trímero-1 administrado IN. Os animais em placebo receberam vacina equivalente com o antigênio substituído por um volume igual de PBS. Os camundongos foram imunizados IN nos dias 4, 5 e 6 com a vacina Trímero-1 ou com placebo. A colonização de bexigas e rins foi avaliada no Dia 14. Os camundongos imunizados com Trímero-1 após o desafio têm significativamente menos bactérias presentes na bexiga e nos rins em comparação com os camundongos no grupo placebo (análise de fração mitigada).

[0054] As FIGs. 16A-B mostram anticorpos medidos na urina e no soro. Os camundongos foram vacinados com Trímero-1 conforme descrito na Figura 15. O painel A mostra os títulos séricos de IgG1 e IgG2a. O painel B mostra os níveis de anticorpos IgA medidos tanto no soro (eixo Y esquerdo) como na urina (eixo Y direito) para camundongos imunizados com Trímero-1. Para cada grupo, o nível de reatividade do anticorpo foi determinado contra o antigênio imunizante. Em todos os casos, os níveis médios de anticorpos foram mais elevados nos vacinados com Trímero-1 do que nos com placebos,

indicando que a imunização induziu uma resposta imune rápida e robusta, enquanto o desafio da ITU por si só não. (LOD, limite de detecção).

[0055] A FIG. 17 mostra títulos séricos de IgG em camundongos imunizados com Trímero-1, Trímero-2, Monômero- 1, Trímero-3 e Trímero-4. Os camundongos vacinados foram imunizados SC com 100 µg de antigênio, seguido três semanas depois por um reforço de IN com 50 µg de antigênio. Para cada grupo, os títulos foram determinados contra o antigênio imunizante. Os títulos de IgG não diferiram significativamente entre os grupos (ANOVA, P > 0,05). (LOD, limite de detecção).

[0056] As FIGs. 18A-B mostram o efeito do adjuvante, via e calendário na eficácia da vacina Trímero-1 contra ITU causada por UPEC-25. Todas as imunizações IN foram adjuvadas com esqualeno + dmLT. Todas as imunizações ID foram adjuvadas com AlOH + dmLT. A UFC total é mostrada para a bexiga (painel A) e rim (painel B). A fração mitigada para a vacina (B, C, E) comparada com o controle naive (A) é indicada onde significativa (*). Os valores das frações mitigadas em caixas indicam que a vacina também alcançou uma fração prevenida significativa quando comparada com o controle naive (A).

[0057] As FIGs. 19 A-F mostram a sorologia para camundongos imunizados com Trímero-1. Isso inclui os títulos séricos de IgG1 e IgG2a (painéis A, B), a proporção IgG1/IgG2a (painel C), IgA sérica (painel D), IgA urinária (painel E) e IgA urinária (painel F). Os camundongos foram imunizados conforme indicado na Tabela 20. Todas as imunizações IN foram adjuvadas com esqualeno + dmLT. Todas as imunizações ID foram adjuvadas com AlOH + dmLT. Os níveis de anticorpos foram determinados por ELISA contra o antigênio imunizante, Trímero-1. É indicada a significância entre os grupos (ANOVA com teste de Tukey para comparações múltiplas).

[0058] As FIGs. 20A-D mostram o efeito do adjuvante, via e calendário na indução de células T responsivas ao antigênio, conforme medido pela liberação de citocinas após a reestimulação in vitro de esplenócitos com Trímero-1 ou uma mistura de peptídeos do domínio T Trímero-1 por 48 horas. Os níveis de TNFα (painel A), IL-2 (painel B), IFNγ (painel C) e IL-17A (painel D) foram determinados em sobrenadantes celulares usando CBA. O nível de significância foi determinado por ANOVA, com comparações múltiplas determinadas por teste de Tukey (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). O nível de significância para os grupos de vacinas que diferem do controle naive é indicado diretamente por cima da barra. Os grupos de vacina que diferem significativamente uns dos outros são indicados com uma barra horizontal e o nível de significância é mostrado por cima da barra.

[0059] As FIGs. 21A-D mostram o efeito de adjuvantes, vias e calendário na indução de Trímero-1 de células de memória T específicas do antigênio, conforme medido por ICS e citometria de fluxo após a reestimulação dos esplenócitos com Trímero-1 por 8 horas. O subconjunto de células e citocina são indicados no topo de cada gráfico. O nível de significância foi determinado por ANOVA, com comparações múltiplas determinadas por teste de Tukey (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). O nível de significância para os grupos de vacinas que diferem do controle naive é indicado diretamente por cima da barra. Os grupos de vacina que diferem significativamente uns dos outros são indicados com uma barra horizontal e o nível de significância é mostrado por cima da barra.

[0060] A FIG. 22 mostra a resposta sorológica de IgG à vacinação usando Trímero-1 em perus.

[0061] A FIG. 23 mostra a resposta sorológica de IgG à vacinação usando Trímero-1 em frangos.

[0062] A FIG. 24 mostra as sequências de aminoácidos de diferentes modalidades de proteínas descritas no presente documento e exemplos de sequências de nucleotídeos que codificam proteínas MoLE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS Proteínas

[0063] São proporcionadas no presente documento proteínas possuindo pelo menos dois tipos de domínios, um domínio de epitopo de células B e um domínio de epítopo de células T. Conforme usado no presente documento, "proteína" se refere amplamente a um polímero de dois ou mais aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Desse modo, por exemplo, os termos peptídeo e polipeptídeo estão incluídos dentro da definição de proteína. O termo proteína não conota um comprimento específico de um polímero de aminoácidos. As proteínas descritas no presente documento são constituídas por epítopos modulares ligados e podem ser referidas no presente documento como proteínas MoLE. Opcionalmente, dois ou mais dos domínios de uma proteína descritos no presente documento estão unidos por um ligante.

[0064] Em uma modalidade, uma proteína MoLE inclui pelo menos um domínio de células B selecionado a partir de FDRDYTTVWGQRAPLYYSPGYGPASLYDYKGRG (SEQ ID NO:12), SQGDDNYGLNLGKGFSAISGSSTPYVSKGLNSDRIPGTER (SEQ ID NO:13), e DESLRFYPFPTVNANKQATAFSSSQQDTDQ (SEQ ID NO:14), e pelo menos um domínio de células T selecionado a partir de ESRQLQLITQYYKSQ (SEQ ID NO:15), DPFNIDHIEVISGAT (SEQ ID NO:16), e VAQQNDDNEIIVSAS (SEQ ID NO:17). Em outra modalidade, uma proteína MoLE inclui pelo menos um domínio de células B selecionado a partir de REVKSGKKDKYNHWDLNYESRKP (SEQ ID NO:18), KNNQVHTLTPGESLDAWTMRGNLKQPNSKRETHNSRS (SEQ ID NO:19), e QEHGKFGNSTT (SEQ ID NO:20), e pelo menos um domínio de células T selecionado a partir de GISITGGNEKPDISI (SEQ ID NO:21) e EKVIREVKSGKKDKY (SEQ ID NO:22).

[0065] Uma proteína MoLE inclui, pelo menos, um domínio de células B e, pelo menos, um domínio de células T. Proteínas MoLE exemplares que incluem um domínio de células B e um domínio de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 12-17 em ordens diferentes são identificadas na Tabela

1. Proteínas MoLE exemplares que incluem um domínio de células B e um domínio de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 18-22 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 2. As Tabelas 1 e 2 mostram a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. Outras modalidades de uma proteína MoLE descrita no presente documento incluem dois domínios de células B e dois domínios de células T, três domínios de células B e três domínios de células T, etc. Em uma modalidade, os domínios estão presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células B seguido por um domínio de células T, por exemplo, na ordem do domínio de células B - domínio de células T quando a proteína MoLE inclui uma cópia de cada domínio, domínio de células B - domínio de células T - domínio de células B - domínio de células T quando a proteína MoLE inclui duas cópias de cada domínio, ou domínio de células B - domínio de células T - domínio de células B - domínio de células T - domínio de células B - domínio de células T quando a proteína MoLE inclui três cópias de cada domínio. Tabela 1. Exemplos de proteínas MoLE que incluem um domínio de células B e um domínio de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 12-17. Proteína domínio de domínio de MoLE células B, células T,

SEQ ID NO SEQ ID NO 1 12 15 2 12 16 3 12 17 4 13 15 5 13 16 6 13 17 7 14 15 8 14 16 9 14 17

[0066] Cada linha se refere à ordem dos domínios em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C-

terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 1 é a ordem SEQ ID NO: 12 e 15. Tabela 2. Exemplos de proteínas MoLE que incluem um domínio de células B e um domínio de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 18-22. Proteína domínio de domínio de MoLE células B, células T,

SEQ ID NO SEQ ID NO 10 18 20 11 18 21 12 19 20 13 19 21 14 20 20 15 20 21

[0067] Cada linha se refere à ordem dos domínios em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C- terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 10 é a ordem SEQ ID NO: 18 e 20.

[0068] Proteínas MoLE exemplares que incluem três domínios de células B e três domínios de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 12-17 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 3. A Tabelas 3 mostra a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. Um conjunto de domínios de células B e de células T é referido no presente documento como um módulo, por exemplo, cada proteína MoLE nas Tabelas 1-8 é um módulo. O conjunto de domínios de células B e de células T, que inclui uma cópia de cada uma das SEQ ID NOs: 12-17 é referido no presente documento como módulo I. Tabela 3. Exemplos de proteínas MoLE que incluem as SEQ ID NOs: 12-17. Proteína domínio domínio domínio domínio domínio domínio MoLE de de de de de de células células células células células células B, T, B, T, B, T,

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:12 NO:15 NO:13 NO:16 NO:14 NO:17 16 1 2 3 4 5 6 17 1 2 3 6 5 4 18 1 4 3 2 5 6 19 1 6 3 2 5 4 20 1 4 3 6 5 2 21 1 6 3 4 5 2 22 1 2 5 4 3 6 23 1 2 5 6 3 4 24 1 4 5 2 3 6 25 1 6 5 2 3 4 26 1 4 5 6 3 2 27 1 6 5 4 3 2 28 3 2 1 4 5 6 29 3 2 1 6 5 4 30 3 4 1 2 5 6 31 3 6 1 2 5 4 32 3 4 1 6 5 2 33 3 6 1 4 5 2

[0069] Cada linha se refere à posição do domínio em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C- terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 16 é a ordem SEQ ID NO: 12, 15, 13, 16, 14 e 17.

[0070] Em outra modalidade, proteínas MoLE exemplares que incluem três domínios de células B e dois domínios de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 18-22 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 4. A Tabela 4 mostra a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. O conjunto de domínios de células B e de células T, que inclui uma cópia de cada uma das selecionadas a partir de SEQ ID NOs: 18-22 é referido no presente documento como módulo II. Tabela 4. Exemplos de proteínas MoLE que incluem as SEQ ID NOs: 18-22. Proteína domínio domínio domínio domínio domínio MoLE de de de de de células células células células células B, T, B, T, B,

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:18 NO:21 NO:19 NO:22 NO:20 52 1 2 3 4 5 53 1 4 3 2 5 54 1 2 5 4 3 55 1 4 5 2 3 56 2 2 1 4 3 57 2 4 1 2 3 58 2 2 3 4 1 59 2 4 3 2 1 60 3 2 2 4 1 61 3 4 2 2 1 62 3 2 1 4 2 63 3 4 1 2 2

[0071] Cada linha se refere à posição do domínio em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C-

terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 1 é a ordem SEQ ID NO: 18, 21, 19, 22.

[0072] Em uma modalidade, uma proteína MoLE inclui pelo menos um domínio de células B selecionado a partir de SEQ ID NO:12-14, e pelo menos um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NO:21 e 22. Em outra modalidade, uma proteína MoLE inclui pelo menos um domínio de células B selecionado a partir de SEQ ID NO:18-20, e pelo menos um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NO:15-

17.

[0073] Proteínas MoLE exemplares que incluem um domínio de células B selecionado a partir das SEQ ID Nos:12-14 e um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NOs: 21- 22 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 5. Proteínas MoLE exemplares que incluem um domínio de células B selecionado a partir das SEQ ID Nos:18-20 e um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NOs: 15-17 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 6. As Tabelas 5 e 6 mostram a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. Tabela 5. Exemplos de proteínas MoLE que incluem um domínio de células B selecionado a partir das SEQ ID Nos:12- 14 e um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NOs: 21-22. Proteína domínio de domínio de MoLE células B, células T,

SEQ ID NO SEQ ID NO

[0074] Cada linha se refere à ordem dos domínios em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C- terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 64 é a ordem SEQ ID NO: 12 e 20. Tabela 6. Exemplos de proteínas MoLE que incluem um domínio de células B selecionado a partir das SEQ ID Nos:18- 20 e um domínio de células T selecionado a partir de SEQ ID NOs: 15-17. Proteína domínio de domínio de MoLE células B, células T,

SEQ ID NO SEQ ID NO 70 18 15 71 18 16 72 18 17 73 19 15 74 19 16 75 19 17 76 20 15 77 20 16 78 20 17

[0075] Cada linha se refere à posição do domínio em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C-

terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 70 é a ordem SEQ ID NO: 18 e 15.

[0076] Proteínas MoLE exemplares que incluem três domínios de células B selecionados a partir das SEQ ID Nos:12-14 e dois domínios de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 21-22 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 7. A Tabela 7 mostra a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. Tabela 7. Exemplos de proteínas MoLE que incluem as SEQ ID NOs:12-14 e 21-22. Proteína domínio domínio domínio domínio domínio MoLE de de de de de células células células células células B, T, B, T, B,

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:12 NO:21 NO:13 NO:22 NO:14 79 1 2 3 4 5 80 1 4 3 2 5 81 1 2 5 4 3 82 1 4 5 2 3 83 2 2 1 4 3 84 2 4 1 2 3 85 2 2 3 4 1 86 2 4 3 2 1 87 3 2 2 4 1 88 3 4 2 2 1

[0077] Cada linha se refere à posição do domínio em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C- terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 79 é a ordem SEQ ID NO:12, 21, 13, 22 e 14.

[0078] Proteínas MoLE exemplares que incluem três domínios de células B selecionados a partir das SEQ ID Nos:18-20 e três domínios de células T selecionados a partir de SEQ ID NOs: 15-17 em ordens diferentes são identificadas na Tabela 8. A Tabela 8 mostra a ordem dos domínios como domínio de células B seguido pelo domínio de células T; no entanto, os domínios podem estar presentes em uma proteína MoLE com um domínio de células T, seguida por um domínio de células B. Tabela 8. Exemplos de proteínas MoLE que incluem as SEQ ID NOs:18-20 e SEQ ID NOs:15-17. Proteína domínio domínio domínio domínio domínio domínio MoLE de de de de de de células células células células células células B, T, B, T, B, T,

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:18 NO:15 NO:19 NO:16 NO:20 NO:17 91 1 2 3 4 5 6 92 1 2 3 6 5 4 93 1 4 3 2 5 6 94 1 6 3 2 5 4 95 1 4 3 6 5 2 96 1 6 3 4 5 2

[0079] Cada linha se refere à posição do domínio em uma proteína MoLE a partir da extremidade N-terminal para a C- terminal. Por exemplo, a proteína MoLE 91 é a ordem SEQ ID NO: 18, 15, 19, 16, 20 e 17.

[0080] Uma proteína MoLE pode adicionalmente incluir repetições em tandem de um módulo, por exemplo, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 repetições em tandem. Em uma modalidade, uma proteína MoLE não tem mais do que 11 repetições em tandem de um módulo. Por exemplo, quando a proteína MoLE inclui uma cópia de cada tipo de domínio (domínio de células B - domínio de células T, tal como SEQ ID NO: 12 e 15), uma proteína MoLE com repetições em tandem pode incluir, mas não está limitada a, uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12-15- 12-15 (duas repetições em tandem) ou SEQ ID NO: 12-15-12-15- 12-15 (três repetições em tandem). Em outro exemplo, quando a proteína MoLE inclui duas cópias de cada tipo de domínio (domínio de células B - domínio de células T - domínio de células B - domínio de células T, tal como SEQ ID NO:12-15- 13-16), uma proteína MoLE com repetições em tandem pode incluir, mas não está limitada a, uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:12-15-13-16-12-15-13-16 (duas repetições em tandem). Em ainda outro exemplo, quando a proteína MoLE inclui o módulo I ou o módulo II presente como repetições em tandem, uma proteína MoLE com repetições em tandem pode ser, mas não está limitada a, pelo menos duas cópias do módulo I ou pelo menos duas cópias do módulo II.

[0081] Exemplos de proteínas MoLE divulgadas na Tabela 3 como proteína MoLE 16 incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e os aminoácidos 7-518 de SEQ ID NO: 8 (ver a FIG. 15). Em uma modalidade, uma proteína MoLE divulgada na Tabela 3 como proteína MoLE 16 inclui um marcador 6-His na extremidade N-terminal (SEQ ID NO: 8, também referida no presente documento como Trímero-1). A proteína MoLE na SEQ ID NO: 3 inclui uma cópia do módulo I, onde cada domínio de células B e de células T é opcionalmente unido por um ligante. A proteína MoLE na SEQ ID NO: 5 inclui três cópias do módulo I (um trímero), onde cada domínio de células B e de células T é opcionalmente unido por um ligante, e cada cópia do módulo I é também, opcionalmente, ligada por um ligante. O aminoácido X nas SEQ ID NOs: 3 e 5 mostra os locais do ligante opcional.

[0082] Exemplos de proteínas MoLE divulgadas na Tabela 4 como proteína MoLE 52 incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, e os aminoácidos 7-365 de SEQ ID NO: 10 (ver a FIG. 18). Em uma modalidade, uma proteína MoLE divulgada na Tabela 4 como proteína MoLE 52 inclui um marcador 6-His na extremidade N-terminal (SEQ ID NO: 10, também referida no presente documento como Trímero-2). A proteína MoLE na SEQ ID NO: 4 inclui uma cópia do módulo II, onde cada um dos domínios das células B e células T é opcionalmente unido por um ligante X. A proteína MoLE na SEQ ID NO: 6 inclui três cópias do módulo II, onde cada domínio de células B e de células T é opcionalmente unido por um ligante, e cada cópia do módulo II também é opcionalmente unida por um ligante. O aminoácido X nas SEQ ID NOs: 3 e 5 mostra os locais do ligante opcional.

[0083] Em uma modalidade, uma proteína MoLE descrita no presente documento inclui um ligante entre os domínios de células B e de células T. Um ligante é uma sequência de aminoácidos que une domínios proteicos em uma proteína de fusão. Um ligante pode ser flexível ou rígido e, em uma modalidade, é flexível. Em uma modalidade, um ligante pode ter pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 6 aminoácidos de comprimento. É expectável que não haja limite superior no comprimento de um ligante usado em uma proteína de fusão descrita no presente documento; no entanto, em uma modalidade, um ligante não tem mais do que 10, não tem mais do que 9, não tem mais do que 8 ou não tem mais do que 7 aminoácidos de comprimento. Muitos ligantes são conhecidos por um perito na técnica (ver Chen et al. 2013, Adv, Drug Deliv. Rev., 65(10):1357-1369). Exemplos específicos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, GSGS (SEQ ID NO: 23) e GPGPG (SEQ ID NO: 24). Uma proteína MoLE pode incluir mais de um tipo de ligante. Por exemplo, em uma proteína MoLE, alguns ligantes podem ser GSGS (SEQ ID NO: 23) e outros podem ser GPGPG (SEQ ID NO: 24).

[0084] As proteínas descritas no presente documento têm atividade imunológica. "Atividade imunológica" se refere à capacidade de uma proteína para provocar uma resposta imunológica em um animal. Uma resposta imunológica a uma proteína é o desenvolvimento em um animal de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo à proteína.

Normalmente, uma resposta imunológica inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes efeitos: produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas, direcionadas para um epítopo ou epítopos da proteína. "Epitopo" se refere ao local em um antigênio ao qual células B e/ou células T específicas respondem para que o anticorpo seja produzido.

A atividade imunológica pode ser protetora. "Atividade imunológica protetora" se refere à capacidade de uma proteína para provocar uma resposta imunológica em um animal que previne ou inibe a infecção por um micróbio gram-negativo, tal como E. coli.

Em uma modalidade, a cepa de E. coli CFT073 (ATCC® 700928™) é usada para avaliar a atividade imunológica protetora.

Se uma proteína possui atividade imunológica protetora pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os métodos descritos nos Exemplos 12-32. Por exemplo, uma proteína descrita no presente documento, ou uma combinação de proteínas descritas no presente documento, protege um animal contra o desafio com um micróbio gram-negativo, tal como E. coli.

Uma proteína descrita no presente documento pode ter atividade seroativa. "Atividade seroativa" se refere à capacidade de uma proteína para reagir com anticorpos presentes no soro convalescente de um animal infectado com um micróbio gram-negativo, tal como E. coli.

Uma proteína descrita no presente documento pode ter atividade imunorreguladora. "Atividade imunorreguladora" se refere à capacidade de uma proteína agir de maneira não específica no sentido de melhorar uma resposta imune a um antigênio particular.

Os métodos para determinar se uma proteína tem atividade imunorreguladora são conhecidos na técnica.

[0085] Uma proteína MoLE pode ser "estruturalmente semelhante" a uma proteína de referência se a sequência de aminoácidos da proteína MoLE possuir uma quantidade especificada de similaridade de sequência e/ou identidade de sequência em comparação com a proteína de referência. Desse modo, uma proteína pode ser "estruturalmente semelhante" a uma proteína de referência se, em comparação com a proteína de referência, essa possuir um nível suficiente de identidade de sequência de aminoácidos, similaridade de sequência de aminoácidos ou uma combinação das mesmas.

[0086] Uma proteína de referência pode ser qualquer proteína divulgada no presente documento, incluindo as proteínas listadas nas Tabelas 1-8. Em uma modalidade, uma proteína de referência é o módulo I (por exemplo, SEQ ID NO: 1) ou o módulo II (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Uma proteína de referência pode incluir repetições em tandem de qualquer proteína divulgada no presente documento, incluindo as proteínas listadas nas Tabelas 1-8. Em outra modalidade, uma proteína de referência inclui repetições em tandem do módulo I ou repetições em tandem do módulo II. Em outra modalidade, uma proteína de referência é módulo I ou módulo II que inclui um ou mais ligantes (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou 4, respectivamente, em que cada X é a localização de um ligante opcional, ou qualquer outra proteína MoLE divulgada na Tabela 3 ou 4, onde existe um ligante entre domínios), ou repetições em tandem do módulo I ou módulo II que inclui um ou mais ligantes. Em algumas modalidades, quando uma proteína de referência inclui um ou mais ligantes, o um ou mais ligantes não é considerado quando se determina se uma proteína é estruturalmente similar a uma proteína de referência. Em outra modalidade, uma proteína de referência é a SEQ ID NO: 5, 6, 8 ou 10.

[0087] Um domínio de células B e um domínio de células T pode ser "estruturalmente semelhante" a um domínio de referência se a sequência de aminoácidos do domínio possuir uma quantidade especificada de similaridade de sequência e/ou identidade de sequência em comparação com o domínio de referência. Desse modo, um domínio pode ser "estruturalmente semelhante" a um domínio de referência se, em comparação com o domínio de referência, esse possuir um nível suficiente de identidade de sequência de aminoácidos, similaridade de sequência de aminoácidos ou uma combinação das mesmas. Um domínio de células B que é estruturalmente semelhante a um domínio de células B de referência tem a atividade de células B. Um domínio de células R que é estruturalmente semelhante a um domínio de células T de referência tem a atividade de células T. Exemplos de domínios de células B de referência são as SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 18, 19 e 20. Exemplos de domínios de células T de referência são as SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 21 e 22. Semelhança de sequência de proteína e identidade de sequência de proteína

[0088] A similaridade estrutural de duas proteínas pode ser determinada ao alinhar os resíduos das duas proteínas (por exemplo, uma proteína candidata e qualquer proteína de referência apropriada descrita no presente documento) de modo a otimizar o número de aminoácidos idênticos ao longo dos comprimentos das suas sequências; são permitidas lacunas em qualquer uma ou em ambas as sequências ao fazer o alinhamento, a fim de otimizar o número de aminoácidos idênticos, embora os aminoácidos em cada sequência devam, no entanto, permanecer na ordem correta. Uma proteína candidata é a proteína que está sendo comparada com a proteína de referência. Uma proteína candidata pode ser isolada, por exemplo, a partir de um micróbio manipulado de forma a produzir a proteína candidata usando técnicas recombinantes ou sintetizada quimicamente ou enzimaticamente.

[0089] A similaridade estrutural de dois domínios pode ser determinada ao alinhar os resíduos dos dois domínios (por exemplo, um domínio candidato e qualquer domínio de referência apropriado descrito no presente documento) de modo a otimizar o número de aminoácidos idênticos ao longo dos comprimentos das suas sequências; são permitidas lacunas em qualquer uma ou em ambas as sequências ao fazer o alinhamento, a fim de otimizar o número de aminoácidos idênticos, embora os aminoácidos em cada sequência devam, no entanto, permanecer na ordem correta. Um domínio candidato é o domínio que está sendo comparada com o domínio de referência. Um domínio candidato pode ser isolado, por exemplo, a partir de um micróbio manipulado de forma a produzir o domínio candidato usando técnicas recombinantes ou sintetizado quimicamente ou enzimaticamente.

[0090] A menos que modificado de outra forma conforme descrito no presente documento, uma análise de comparação em pares de sequências de aminoácidos pode ser realizada usando o algoritmo BESTFIT no pacote GCG (versão 10.2, Madison WI). Alternativamente, as sequências de aminoácidos podem ser comparadas usando o programa Blastp do algoritmo de busca BLAST 2, conforme descrito por Tatiana et al. (FEMS Microbiol Lett, 174:247-250 (1999)), e disponível no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os valores padrão para todos os parâmetros de pesquisa do BLAST 2 podem ser usados, incluindo matriz = BLOSUM62; penalidade de intervalo aberto = 11, penalidade de intervalo de extensão = 1, intervalo x_devolução = 50, expectativa = 10, tamanho da palavra = 3 e filtro ligado.

[0091] Na comparação de duas sequências de aminoácidos, a similaridade estrutural pode ser referida em porcentagem de "identidade" ou pode ser referida em porcentagem de "similaridade". "Identidade" se refere à presença de aminoácidos idênticos. "Similaridade" se refere à presença não só de aminoácidos idênticos, mas também à presença de substituições conservadoras. Uma substituição conservadora de um aminoácido em uma proteína pode ser selecionada a partir de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, é bem conhecido na técnica da bioquímica de proteínas que um aminoácido pertencente a um grupo de aminoácidos com um tamanho ou característica particular (tal como carga, hidrofobicidade ou hidrofilicidade) pode ser substituído por outro aminoácido sem alterar a atividade de uma proteína. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e tirosina. Aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Desse modo, as substituições conservadoras incluem, por exemplo, Lys por Arg e vice-versa para manter uma carga positiva; Glu por Asp e vice-versa para manter uma carga negativa; Ser por Thr, de modo que um -OH livre seja mantido; e Gln por Asn para manter um -NH2 livre.

[0092] Desse modo, conforme usado no presente documento, a referência a uma proteína conforme descrita no presente documento e/ou a referência à sequência de aminoácidos de uma ou mais SEQ ID NOs pode incluir uma proteína com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de semelhança de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de referência.

[0093] Alternativamente, conforme usado no presente documento, a referência a uma proteína conforme descrita no presente documento e/ou a referência à sequência de aminoácidos de uma ou mais SEQ ID NOs pode incluir uma proteína com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%,

pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de referência.

[0094] Uma proteína MoLE estruturalmente semelhante a uma proteína de referência possui atividade imunológica (incluindo atividade imunológica protetora, atividade seroativa e/ou atividade imunorreguladora). Um domínio de células B que é estruturalmente semelhante a um domínio de células B de referência tem a atividade de células B, e um domínio de células T que é estruturalmente semelhante a um domínio de células T de referência tem a atividade de células T. Um domínio de células B candidatas possui atividade de células B se o anticorpo produzido por imunização de um animal com o domínio de células B candidatas se ligar especificamente ao domínio de células B de referência. Um domínio de células T candidatas possui atividade de células T se células de um camundongo imunizado com as células T candidatas forem estimuladas a produzir citocinas quando expostas ao domínio de células T de referência.

[0095] Uma proteína conforme descrita no presente documento também pode ser projetada de modo a incluir uma ou mais sequências adicionais, tais como, por exemplo, a adição de aminoácidos C-terminais e/ou N-terminais. Em uma modalidade, aminoácidos adicionais podem facilitar a purificação capturando colunas ou usando anticorpos. Tais aminoácidos adicionais incluem, por exemplo, marcadores ricos em histidina que permitem a purificação de proteínas em colunas de níquel. Em uma modalidade, aminoácidos adicionais são aqueles que podem sinalizar para acilação ou promover a captação da mucosa. Tais técnicas de modificação de genes e sequências adicionais adequadas são bem conhecidas nas técnicas da biologia molecular.

[0096] Uma proteína descrita no presente documento pode incluir uma ou mais modificações. Uma "modificação" de uma proteína inclui uma proteína que é quimicamente ou enzimaticamente derivatizada em um ou mais aminoácidos constituintes. Tal modificação pode incluir, por exemplo, uma modificação da cadeia lateral, uma modificação da estrutura, uma modificação N-terminal e/ou uma modificação C-terminal, tal como, por exemplo, acetilação, hidroxilação, metilação, amidação e fixação de uma porção de carboidratos e/ou de lipídeos, um cofator e semelhantes, e combinações dos mesmos. As proteínas modificadas conforme descritas no presente documento podem reter a atividade biológica - tal como, por exemplo, atividade imunológica - da proteína não modificada ou podem exibir uma atividade biológica reduzida ou aumentada em comparação com a proteína não modificada. Polinucleotídeos

[0097] Uma proteína descrita no presente documento também pode ser identificada em termos do polinucleotídeo que codifica a proteína. Desse modo, a presente divulgação proporciona polinucleotídeos que codificam uma proteína conforme descrita no presente documento ou hibridam, sob condições padrão de hibridação, com um polinucleotídeo que codifica uma proteína conforme descrita no presente documento e os complementos dessas sequências de polinucleotídeos.

[0098] Conforme usado no presente documento, a referência a um polinucleotídeo conforme descrito no presente documento e/ou a referência à sequência de ácidos nucleicos de uma ou mais SEQ ID NOs pode incluir polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de polinucleotídeos de referência.

[0099] Nesse contexto, "identidade de sequência" se refere à identidade entre duas sequências de polinucleotídeos. A identidade da sequência é geralmente determinada ao alinhar as bases dos dois polinucleotídeos, por exemplo, alinhando a sequência de nucleotídeos da sequência candidata e uma sequência de nucleotídeos que inclui uma sequência de nucleotídeos divulgada no presente documento, tal como os nucleotídeos 19-1569 de SEQ ID NO: 7 (que codificam um exemplo do módulo I) ou os nucleotídeos 19-1110 de SEQ ID NO: 9 (que codificam um exemplo do módulo II) de modo a otimizar o número de nucleotídeos idênticos ao longo dos comprimentos das suas sequências; são permitidas lacunas em qualquer uma ou em ambas as sequências ao fazer o alinhamento, a fim de otimizar o número de nucleotídeos compartilhados, embora os nucleotídeos em cada sequência devam, no entanto, permanecer na ordem correta. Uma sequência candidata é a sequência que está sendo comparada com uma sequência conhecida - por ex., uma sequência de nucleotídeos que inclui uma sequência de nucleotídeos descrita no presente documento, por exemplo, nucleotídeos 19-1569 de SEQ ID NO: 7 ou nucleotídeos 19-1110 de SEQ ID NO: 9. Por exemplo, as duas sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando o programa Blastn do algoritmo de busca BLAST 2, conforme descrito por Tatusova et al., (FEMS Microbiol Lett., 174:247-250 (1999)), e disponível na internet em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Os valores padrão para todos os parâmetros de pesquisa do BLAST 2 podem ser usados, incluindo recompensa por correspondência = 1, penalidade por incompatibilidade = -2, penalidade de intervalo aberto = 5, penalidade de intervalo de extensão = 2, intervalo x_devolução = 50, expectativa = 10, tamanho da palavra = 11 e filtro ligado.

[0100] Finalmente, um polinucleotídeo pode incluir qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína conforme descrito no presente documento. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo pode ser deduzida a partir da sequência de aminoácidos que deve ser codificada pelo polinucleotídeo. Composições

[0101] Uma composição conforme descrita no presente documento pode incluir pelo menos uma proteína descrita no presente documento, ou um número de proteínas que é um número inteiro maior que um (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três e por diante), em qualquer combinação. A menos que um nível específico de similaridade e/ou identidade de sequência seja expressamente indicado no presente documento

(por exemplo, pelo menos 80% de similaridade de sequência, pelo menos 85% de similaridade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, etc.), a referência à sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO identificada inclui variantes tendo os níveis de similaridade de sequência e/ou os níveis de identidade de sequência descritos no presente documento.

[0102] Uma proteína produzida de forma recombinante pode ser expressa a partir de um vetor que permite a expressão da proteína quando o vetor é introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Uma célula hospedeira pode ser construída de modo a produzir uma ou mais proteínas descritas no presente documento e, portanto, pode incluir um ou mais vetores que incluem pelo menos um polinucleotídeo codificando uma proteína descrita no presente documento. Desse modo, cada vetor pode incluir um ou mais polinucleotídeos conforme descrito no presente documento - isto é, um polinucleotídeo que codifica uma proteína conforme descrita no presente documento. Exemplos de células hospedeiras incluem, mas não estão limitados a, E. coli.

[0103] Opcionalmente, uma proteína descrita no presente documento pode ser ligada covalentemente a uma proteína portadora de modo a melhorar as propriedades imunológicas da proteína. As proteínas portadoras úteis são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, subunidade B da toxina da cólera e enterotoxina lábil ao calor mutante. O acoplamento químico de uma proteína descrita no presente documento pode ser realizado usando métodos conhecidos e rotineiros. Por exemplo, vários reagentes de ligação cruzada homobifuncionais e/ou heterobifuncionais tais como bis(sulfossuccinimidil)suberato, bis(diazobenzidina), adipimidato de dimetila, pimelimidato de dimetila, superimidato de dimetila, suberato de dissuccinimidila, glutaraldeído, m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, 4-((N- maleimidometil)ciclo-heano-1-carboxilato de sulfosuccinimidila, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de sulfossuccinimidila e (1-etil-3-(dimetil- aminopropil)carbodiimida podem ser usados (Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, geralmente e Capítulo 5, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, NI (1988)).

[0104] Uma composição descrita no presente documento adicionalmente inclui opcionalmente um portador farmaceuticamente aceitável. "Farmaceuticamente aceitável" se refere a um diluente, portador, excipiente, sal, etc., que é compatível com os outros ingredientes da composição e não é prejudicial para o receptor da mesma. Tipicamente, a composição inclui um portador farmaceuticamente aceitável quando a composição é usada conforme descrito no presente documento. Exemplos de portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão e geralmente excluem produtos sanguíneos tais como, por exemplo, sangue completo e/ou plasma. As composições, conforme descritas no presente documento, podem ser formuladas em preparações farmacêuticas em uma variedade de formas adaptadas à via de administração escolhida, incluindo vias adequadas para estimular uma resposta imune a um antigênio. Desse modo, uma composição conforme descrita no presente documento pode ser administrada por vias conhecidas, incluindo, por exemplo, oral; parentérica incluindo intradérmica, transcutânea e subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.; e topicamente, tal como intranasal, intrapulmonar, intramamária, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutânea e retal, etc. Se prevê que uma composição possa ser administrada a uma superfície da mucosa, tal como por exemplo administração à mucosa nasal ou respiratória (por exemplo, através de um vaporisador ou aerossol), a fim de estimular a imunidade mucosal, tal como a produção de anticorpos IgA secretores, em todo o corpo do animal.

[0105] Uma composição conforme descrita no presente documento também pode ser administrada através de um implante de liberação sustentada ou retardada. Os implantes adequados para uso são conhecidos e incluem, por exemplo, os divulgados na Publicação Internacional No. WO 2001/037810 e/ou Publicação Internacional No. WO 1996/001620. Os implantes podem ser produzidos em tamanhos pequenos o suficiente para serem administrados por aerossol ou vaporizador. Os implantes também podem incluir nanoesferas e microesferas.

[0106] Uma composição é administrada em uma quantidade suficiente para proporcionar uma resposta imunológica a uma proteína descrita no presente documento. A quantidade de proteína presente em uma composição pode variar. Por exemplo, a dosagem de proteína pode ser entre 0,01 microgramas (μg) e 3000 miligramas (mg), tipicamente entre 10 μg e 2000 ug. Para uma composição injetável (por exemplo, subcutânea, intramuscular, etc.), a proteína pode estar presente na composição em uma quantidade tal que o volume total da composição administrada seja de 0,5 mL a 5,0 mL, tipicamente 1,0-3,0 mL. A quantidade administrada variará dependendo de vários fatores, incluindo, mas não limitado a, proteínas ou células específicas escolhidas, o peso, condição física e idade do animal e da via de administração. Desse modo, o peso absoluto da proteína incluída em uma dada forma de dosagem unitária pode variar e depende de fatores tais como a espécie, idade, peso e condição física do animal, bem como do método de administração. Tais fatores podem ser determinados por um perito na técnica.

[0107] As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Todos os métodos de preparação de uma composição incluindo um portador farmaceuticamente aceitável incluem o passo de associar o composto ativo (por exemplo, uma proteína descrita no presente documento) a um portador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas por colocar o composto ativo, uniformemente e intimamente, em associação com, por exemplo, um portador líquido, um portador sólido finamente dividido, ou ambos, e depois, se necessário, moldar o produto nas formulações desejadas.

[0108] Uma composição incluindo um portador farmaceuticamente aceitável também pode incluir um adjuvante. Um " adjuvante " se refere a um agente que pode atuar de maneira não específica para aprimorar uma resposta imune a um antigênio específico reduzindo, desse modo, potencialmente a quantidade de antigênio necessária em qualquer composição imunizante e/ou a frequência de injeção necessária de modo a gerar uma resposta imune adequada ao antigênio de interesse. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo, IL-1, IL-2, emulsificantes, dipeptídeos de muramila, brometo de dimetildiocradecilamônio (DDA), avridina, hidróxido de alumínio, óleos, saponinas, alfa- tocoferol, polissacarídeos, parafinas emulsionadas (disponíveis sob o nome comercial EMULSIGEN a partir da MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), ISA-70, RIBI e outras substâncias conhecidas na técnica.

[0109] Em outra modalidade, uma composição pode incluir um modificador de resposta biológica, tal como, por exemplo, IL-2, IL-4 e/ou IL-6, TNF, IFN-alfa, IFN-gama e outras citocinas que afetam as células imunes. Uma composição também pode incluir um antibiótico, conservante, antioxidante, agente quelante, etc. Tais componentes são conhecidos na técnica. Métodos de Uso

[0110] Também são conferidos métodos de uso das composições descritas no presente documento. Os métodos incluem a administração a um animal de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento. Conforme usado no presente documento, uma "quantidade eficaz" de uma composição descrita no presente documento é a quantidade capaz de provocar a resposta desejada no receptor. A composição pode ser administrada num momento em que o anticorpo materno pode estar presente, por exemplo, tão cedo quanto um dia de idade, ou num momento posterior durante a vida do animal. O animal pode ser, por exemplo, aves

(incluindo, por exemplo, frangos ou perus), bovinos (incluindo, por exemplo, gado), caprinos (incluindo, por exemplo, cabras), ovinos (incluindo, por exemplo, ovelhas), porcinos (incluindo, por exemplo, suínos), bisontes (incluindo, por exemplo, búfalos), equinos (incluindo, por exemplo, cavalos), um animal de companhia (incluindo, por exemplo, um cachorro ou um gato), membros da família Cervidae (incluindo, por exemplo, veados, alce, caribu e rena) ou um ser humano. Exemplos de animais de companhia incluem cães e gatos. Em uma modalidade, um animal é um camundongo. Em uma modalidade, um animal é um animal com cascos.

[0111] Os métodos descritos no presente documentos se referem a micróbios gram-negativos. Conforme usado no presente documento, um micróbio gram-negativo inclui, mas não está limitado a, membros da família Vibrionaceae (incluindo, por exemplo, Vibrio cholerae), Campylobacter spp. (incluindo, por exemplo, C. jejuni), membros da família Enterobacteriaceae (incluindo, por exemplo, Klebsiella spp., E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Proteus spp., Serratia spp., e Yersinia spp.), membros da família Pasteurellaceae, preferencialmente Pasturella spp. (incluindo, por exemplo, P. multocida e P. haemolytica), e membros da família Pseudomonadaceae, preferencialmente Pseudomonas spp., (incluindo, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa). Exemplos de Klebsiella spp. inclui K. pneumoniae e K. oxytoca. Exemplos de Salmonella spp. inclui Salmonella enterica serovars Bredeney, Dublin, Agona, Blockley, Enteriditis, Typhimurium, Hadar, Heidelberg, Montevideo, Muenster, Newport senftenberg, Salmonella cholerasuis, e S. typhi. Exemplos de cepas de E. coli incluem, por exemplo, sorotipos de E. coli O1a, O2a, O78, e O157; diferentes de O:H incluindo 0104, 0111, 026, 0113, 091; estirpes hemolíticas de E. coli enterotoxigênicas tais como K88+, F4+, F18ab+, e F18ac+; cepas enteropatogênicas (EPEC), entero-hemorrágicas (EHEC), enteroinvasivas (EIEC) e enteroagregativas (EAEC) de E. coli; e E. coli capaz de causar infecções extraintestinais, tais como cepas uropatogênicas. Em uma modalidade, o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico.

[0112] Em algumas modalidades, um método adicionalmente pode incluir administrações adicionais (por exemplo, uma ou mais administrações de reforço) da composição ao animal de modo a melhorar ou a estimular uma resposta imune secundária. Um reforço pode ser administrado em um momento após a primeira administração, por exemplo, uma a oito semanas, preferencialmente duas a quatro semanas, após a primeira administração da composição. Os reforços subsequentes podem ser administrados uma, duas, três, quatro ou mais vezes por ano. Sem pretender ser limitado pela teoria, é esperado que, em algumas modalidades, não sejam necessários reforços anuais, pois um animal será desafiado no campo pela exposição a micróbios expressando proteínas tendo epítopos que estão estruturalmente relacionados com epítopos presentes nas proteínas da composição administrada ao animal.

[0113] Em uma modalidade, um método inclui a produção de anticorpo para uma proteína descrita no presente documento, por exemplo, ao induzir a produção de anticorpo em um animal ou por técnicas recombinantes. O anticorpo produzido inclui um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína presente na composição. Na presente modalidade, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz que resulta na produção de anticorpo no animal. Os métodos para determinar se um animal produziu anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína presente em uma composição descrita no presente documento podem ser determinados usando métodos de rotina. Também é conferido um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína descrita no presente documento, e composições incluindo tais anticorpos.

[0114] Conforme usado no presente documento, um anticorpo que se pode "ligar especificamente" a uma proteína é um anticorpo que interage com o epítopo do antigênio que induziu a síntese do anticorpo ou que interage com um epítopo estruturalmente relacionado. Pelo menos alguns dos epítopos presentes nas proteínas descritas no presente documento são epítopos que são conservados nas proteínas de diferentes espécies e diferentes gêneros de micróbios. Por conseguinte, o anticorpo produzido usando uma proteína descrita no presente documento é expectável que se ligue a proteínas expressas por mais de uma espécie de micróbio e proporcione proteção de amplo espectro contra micróbios gram-negativos.

[0115] Em uma modalidade, um método inclui o tratamento de uma infecção em um animal, causada por um micróbio gram- negativo. Conforme usado no presente documento, o termo "infecção" se refere à presença de um micróbio gram-negativo em um corpo de animal, que pode ou não ser clinicamente aparente. O tratamento de uma infecção pode ser profilático ou, alternativamente, pode ser iniciado após o animal ser infectado pelo micróbio.

O tratamento profilático - por exemplo, iniciado antes de um sujeito ser infectado por um micróbio ou enquanto qualquer infecção permanece subclínica - é referido no presente documento como tratamento de um sujeito "em risco" de infecção.

Conforme usado no presente documento, o termo "em risco" se refere a um animal que pode ou não possuir realmente o risco descrito.

Desse modo, normalmente, um animal "em risco" de infecção por um micróbio é um animal presente em uma área onde os animais foram identificados como infectados pelo micróbio e/ou é provável que sejam expostos ao micróbio, mesmo que o animal ainda não tenha manifestado qualquer indicação detectável de infecção pelo micróbio e independentemente de se o animal pode abrigar uma quantidade subclínica do micróbio.

Por conseguinte, a administração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após o animal ter primeiro contato com o micróbio.

O tratamento iniciado após o primeiro contato do animal com o micróbio pode resultar na redução da gravidade dos sintomas e/ou sinais clínicos da infecção pelo micróbio, removendo completamente o micróbio, e/ou redução da probabilidade de ocorrência de uma infecção clinicamente evidente em comparação com um animal ao qual a composição não é administrada.

O método inclui administrar uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um animal tendo, ou em risco de ter, uma infecção causada por um micróbio gram-negativo e determinar se o número de micróbios que causam a infecção diminuiu.

Na presente modalidade, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para reduzir o número de micróbios especificados em um animal ou reduzir a probabilidade de o animal experimentar uma infecção clinicamente evidente em comparação com um animal ao qual a composição não é administrada. Os métodos para determinar se uma infecção é causada por um micróbio gram- negativo são rotineiros e conhecidos na técnica, uma vez que são métodos para determinar se a infecção diminuiu. O tratamento bem-sucedido de uma infecção microbiana gram- negativa em um animal é divulgado nos Exemplos 12-32, que demonstram a proteção contra doenças causadas por E. coli em um modelo de camundongo através da administração de uma composição descrita no presente documento. Esse modelo de camundongo é um modelo comumente aceite para o estudo de doenças causadas por E. coli.

[0116] Em outra modalidade, um método inclui o tratamento de um ou mais sintomas ou sinais clínicos de certas condições em um animal os quais podem ser causados por infecção por um micróbio gram-negativo. O método inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um animal tendo, ou em risco de ter, uma condição, ou exibindo sintomas e/ou sinais clínicos de uma condição e determinação se pelo menos um sintoma e/ou sinal clínico da condição é alterado, preferencialmente, reduzido. Em uma modalidade, o animal tem uma condição causada por uma cepa enteropatogênica (EPEC), entero-hemorrágica (EHEC), enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC) e/ou enteroagregativa (EAEC) de E. coli. Os sintomas e/ou os sinais clínicos causados por uma infecção microbiana gram- negativa são conhecidos do perito na técnica. Exemplos de sintomas e/ou sinais clínicos incluem, mas não estão limitados a, sepse; choque endotóxico; osteomielite; pneumonia; peritonite; endocardite; infecção de ferida; artrite reativa, meningite, infecções do trato urinário (ITU), insuficiência renal, síndrome de Guillian-Barre, síndrome de Reiter, doença diarreica entérica e outras doenças extraintestinais. Exemplos de condições incluem, mas não estão limitados a, mastite, derramamento fecal de um micróbio, metrite, estrangulamento, infecções intra- uterinas, doença de odema, enterite, infecções reprodutivas crônicas e laminite.

[0117] O tratamento de sintomas e/ou sinais clínicos associados com condições causadas por infecção por um micróbio gram-negativo pode ser profilático ou, alternativamente, pode ser iniciado após o desenvolvimento de uma condição descrita no presente documento. Conforme usado no presente documento, o termo "sintoma" se refere a evidência subjetiva de uma doença ou condição vivenciada pelo paciente e causada por infecção por um micróbio. Conforme usado no presente documento, o termo "sinal clínico" ou, simplesmente, "sinal" se refere a evidência objetiva de doença ou condição causada por infecção por um micróbio. Os sintomas e/ou sinais clínicos associados com as condições referidas no presente documento e as avaliações de tais sintomas são rotineiros e conhecidos na técnica. O tratamento que é profilático, por exemplo, iniciado antes que um sujeito manifeste sintomas ou sinais de uma condição causada por um micróbio, é referido no presente documento como tratamento de um sujeito que "está em risco" de desenvolver a condição. Desse modo, normalmente, um animal "em risco" de desenvolver uma condição é um animal presente em uma área onde os animais tendo a condição foram diagnosticados e/ou provavelmente expostos a um micróbio causador da doença, mesmo que o animal ainda não tenha manifestado sintomas ou sinais de qualquer condição causada pelo micróbio. Por conseguinte, a administração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após a ocorrência das condições descritas no presente documento. O tratamento iniciado após o desenvolvimento de uma condição pode resultar na diminuição da gravidade dos sintomas ou sinais de uma das condições ou na remoção completa dos sintomas ou sinais. Na presente modalidade, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para impedir a manifestação de sintomas ou sinais de uma doença, diminuir a gravidade dos sintomas ou sinais de uma doença e/ou remover completamente os sintomas ou sinais.

[0118] Também é conferido um método para diminuir a colonização por um micróbio gram-negativo, por exemplo, bloqueando os locais de ligação de um micróbio gram-negativo, incluindo tecidos do sistema esquelético (por exemplo, ossos, cartilagem, tendões e ligamentos), sistema muscular, (por exemplo, músculos esqueléticos e lisos), sistema circulatório (por exemplo, coração, vasos sanguíneos, capilares e sangue), sistema nervoso (por exemplo, cérebro, medula espinhal e nervos periféricos), sistema respiratório (por exemplo, nariz, pulmões, traqueia, brônquios, bronquíolos, alvéolos), sistema digestivo (por exemplo, boca, glândulas salivares, esôfago, fígado, estômago, intestino grosso e delgado), sistema excretor (por exemplo, rim, ureter, bexiga e uretra), sistema endócrino (por exemplo, hipotálamo, hipófise, tireoide, pâncreas e glândulas adrenais), sistema reprodutivo (por exemplo, ovários, oviduto, útero, vagina, glândulas mamárias, testículos e vesículas seminais), sistemas linfáticos/imunológicos (por exemplo, linfa, nódulos e vasos linfáticos, glóbulos brancos ou mononucleares, tais como macrófagos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e linfócitos, incluindo células T e células B) e linhagens celulares específicas (por exemplo, células precursoras, células epiteliais, células estaminais) e similares.

[0119] A colonização decrescente em um animal pode ser realizada profilacticamente ou, alternativamente, pode ser iniciada após o animal ser colonizado pelo micróbio. O tratamento que é profilático - por exemplo, iniciado antes de um sujeito ser colonizado por um micróbio ou enquanto qualquer colonização permanece não detectada - é referido no presente documento como tratamento de um sujeito "em risco" de colonização pelo micróbio. Desse modo, normalmente, um animal "em risco" de colonização por um micróbio é um animal presente em uma área onde os animais foram identificados como colonizados pelo micróbio e/ou é provável que sejam expostos ao micróbio, mesmo que o animal ainda não tenha manifestado qualquer indicação detectável de colonização pelo micróbio e independentemente de se o animal pode abrigar um subnúmero de colonização do micróbio. Por conseguinte, a administração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após o animal ter primeiro contato com o micróbio. O tratamento iniciado após o primeiro contato do animal com o micróbio pode resultar na redução da extensão da colonização pelo micróbio, removendo completamente o micróbio, e/ou redução da probabilidade de o animal se tornar colonizado pelo micróbio em comparação com um animal ao qual a composição não é administrada. Desse modo, o método inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento a um animal colonizado por, ou em risco de ser colonizado por, um micróbio gram-negativo. Na presente modalidade, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para diminuir a colonização do animal pelo micróbio, onde diminuir a colonização se refere a um ou mais de: redução da extensão da colonização pelo micróbio, removendo completamente o micróbio, e/ou redução da probabilidade de o animal se tornar colonizado pelo micróbio em comparação com um animal ao qual a composição não é administrada. Os métodos para avaliar a colonização de um animal por um micróbio são rotineiros e conhecidos na técnica. Por exemplo, a colonização de um trato intestinal animal por um micróbio pode ser determinada por medição da presença do micróbio nas fezes do animal. É expectável que a diminuição da colonização de um animal por um micróbio reduza a transmissão do micróbio para outros animais da mesma espécie ou de espécies diferentes.

[0120] Também é conferido o uso de anticorpo para dirigir um micróbio expressando uma proteína tendo um epítopo estruturalmente relacionado com um epítopo presente em uma proteína descrita no presente documento. Uma composição descrita no presente documento pode ser usada para conferir imunização ativa ou passiva contra infecção bacteriana. Geralmente, a composição pode ser administrada a um animal para proporcionar imunização ativa.

No entanto, a composição também pode ser usada para induzir a produção de produtos imunes, tais como anticorpos, que podem ser coletados a partir do animal produtor e administrados a outro animal para proporcionar imunidade passiva.

Componentes imunológicos, tais como anticorpos, podem ser coletados para preparar composições (preferencialmente contendo anticorpos) a partir de soro, plasma, sangue, colostro, etc. para terapias de imunização passiva.

As composições de anticorpos incluindo anticorpos monoclonais e/ou anti-idiotipos também podem ser preparadas usando métodos conhecidos.

Os anticorpos quiméricos incluem regiões constantes derivadas de seres humanos tanto de cadeias pesadas como leves e regiões variáveis derivadas de murinos que são específicas de antigênio (Morrison et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA, 1984, 81(21):6851-5; LoBuglio et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA, 1989, 86(11):4220-4; Boulianne et al., Nature, 1984, 312(5995):643-6.). Anticorpos humanizados substituem a constante e estrutura murina (FR) (da região variável) pelas contrapartes humanas (Jones et al., Nature, 1986, 321(6069):522-5; Riechmann et al., Nature, 1988, 332(6162):323-7; Verhoeyen et al., Science, 1988, 239(4847):1534-6; Queen et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 1989, 86(24):10029-33; Daugherty et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19(9): 2471-6.). Alternativamente, podem ser usadas certas cepas de camundongos que foram geneticamente manipuladas para produzirem anticorpos que são quase completamente de origem humana; após a imunização, as células B desses camundongos são colhidas e imortalizadas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Bruggeman e Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 1997, 8(4):455-8; Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol., 1995;13(1):65-93; Lonberg et al., Nature, 1994, 368:856-9; Taylor et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:6287-95.). As composições de anticorpos passivos e os seus fragmentos, por exemplo, scFv, Fab, F(ab')2 ou Fv ou outras formas modificadas dos mesmos, podem ser administradas a um receptor na forma de soro, plasma, sangue, colostro e similares. No entanto, os anticorpos também podem ser isolados a partir do soro, plasma, sangue, colostro e similares, usando métodos conhecidos para uso posterior em uma forma concentrada ou reconstituída, tal como, por exemplo, soluções de lavagem, pensos impregnados e/ou agentes tópicos e semelhantes. As preparações de imunização passiva podem ser particularmente vantajosas para o tratamento de doenças sistêmicas agudas ou imunização passiva de animais jovens que não receberam níveis adequados de imunidade passiva através do colostro materno. Os anticorpos úteis para imunização passiva também podem ser úteis para conjugar com vários fármacos ou antibióticos que podem ser diretamente direcionados para bactérias que expressam, durante uma infecção sistêmica ou localizada, uma proteína tendo um epítopo estruturalmente relacionado com um epítopo presente em uma proteína descrita no presente documento.

[0121] Modelos animais, em particular modelos de camundongo, estão disponíveis para avaliar experimentalmente as composições descritas no presente documento. Esses modelos de camundongos são modelos comumente aceites para o estudo de doenças causadas por micróbios gram-negativos. Nos casos em que um micróbio gram-negativo causa doenças em um animal, por exemplo uma vaca, o hospedeiro natural pode ser usado para avaliar experimentalmente as composições descritas no presente documento.

[0122] No entanto, a proteção em um modelo de camundongo não é a única forma de avaliar se uma composição pode conferir proteção a um animal contra a infecção por um micróbio gram-negativo. A resposta imune adaptativa consiste em duas divisões principais: a resposta humoral (anticorpo) e a resposta celular (células T). Após a infecção por um patógeno bacteriano, as células dendríticas no local da infecção encontram antigênios microbianos e produzem moléculas de sinalização tais como, por exemplo, receptores de superfície e citocinas em resposta a padrões moleculares conservados associados com a bactéria específica. Esses sinais são moldados pela natureza do patógeno e, idealmente, conduzem às respostas apropriadas de anticorpos e de células T que protegem o hospedeiro da doença. Enquanto algumas doenças bacterianas são controladas principalmente por meio de funções de anticorpos, outras requerem respostas de células T ou ambas as respostas de anticorpos e de células T para proteção. O objetivo da biologia da vacina é identificar as respostas imunes que fornecem proteção e, em seguida, projetar uma vacina para reproduzir uma ou mais dessas respostas em seres humanos.

[0123] Os anticorpos podem ter muitas funções diferentes ao conferirem proteção contra infecções, tal como, por exemplo, fixação de complemento, opsonização, neutralização e/ou aglutinação. Além disso, algumas subclasses de anticorpos são melhores que outras em funções específicas; por exemplo, para fixação do complemento, existe a seguinte hierarquia para subclasses de IgG humana: IgG3>IgG1>IgG2>IgG4.

[0124] As funções imunológicas dos anticorpos podem ser estudadas em uma variedade de maneiras. Por exemplo, os Western blots são usados para identificar a ligação específica de antigênio com base no tamanho das proteínas separadas, enquanto o ensaio imunossorvente padrão ligado a enzima (ELISA) é usado para produzir informações quantitativas sobre os títulos de anticorpos dentro do soro. Os estudos de ligação à superfície do anticorpo são usados para determinar se o anticorpo no soro é capaz de reconhecer antigênios na superfície de bactérias intactas, um importante indicador de se os anticorpos têm potencial para funcionar in vivo. Desse modo, um perito na técnica reconhece que os ensaios de ligação a anticorpos, tais como um Western blot, ELISA (por exemplo, usando antissoros humanos) e/ou a ligação à superfície se correlacionam positivamente com os antigênios que se ligam especificamente, proporcionando atividade imunológica contra infecção microbiana. No entanto, um perito na técnica reconhece adicionalmente que a falta de ligação ao anticorpo em um ensaio tal como, por exemplo, um Western blot, ELISA ou ensaio de ligação à superfície, não significa que o antigênio testado não confira atividade imunológica contra a infecção microbiana.

[0125] Os anticorpos podem mediar a morte bacteriana ao bloquearem a aquisição de nutrientes ou iniciarem a perfuração da membrana mediada por complemento que leva à lise osmótica. Os anticorpos bactericidas podem ser analisados ao misturarem soro com culturas vivas e medindo a presença de bactérias viáveis sob condições apropriadas conhecidas pelos peritos na técnica. Técnicas tais como testes de opsonofagocitose (OPA), nas quais anticorpos e bactérias ligadas ao complemento são combinados com fagócitos humanos ou de camundongos para determinar níveis de morte bacteriana, são úteis para estudar a função dos anticorpos. Um ensaio de explosão oxidativa semelhante pode ser usado para avaliar o nível de espécies reativas de oxigênio (ERO) por neutrófilos frescos de humanos ou camundongos após a interação com anticorpos e bactérias ligadas ao complemento.

[0126] Em alguns casos, se pode determinar que uma proteína descrita no presente documento possui atividade imunológica mediada por células contra um micróbio gram- negativo e, portanto, a proteína pode exibir atividade imunológica na ausência de induzir a produção de anticorpos. As células T citotóxicas ou CD8 matam principalmente as células infectadas diretamente através de vários mecanismos efetores, enquanto as células T CD4 auxiliares funcionam de modo a fornecerem sinalização importante no caminho das citocinas. Essas classes de células T podem ser adicionalmente subdivididas com base nas citocinas que produzem, e diferentes subclasses são eficazes contra diferentes patógenos bacterianos. As células T são frequentemente estudadas através da avaliação dos seus fenótipos com citometria de fluxo, onde os anticorpos são usados para visualizar os níveis de marcadores de superfície específicos que permitem a classificação das células T como, por exemplo, uma células T CD4+ recentemente ativada, uma célula T CD8+ de memória, etc. Adicionalmente, as citocinas e outros produtos das células T podem ser estudados ao isolar as células T do tecido linfoide e reestimulando as mesmas com antigênio cognato. Após a estimulação do antigênio, as células T produzem citocinas que podem ser visualizadas por, por exemplo, coloração de citocina intracelulares acoplada à citometria de fluxo, ou coletando os sobrenadantes celulares e usando a tecnologia de esferas Luminex para medir simultaneamente citocinas 15-25.

[0127] Desse modo, além dos modelos de camundongo, os peritos na técnica reconhecem que a atividade imunológica compatível com os métodos descritos no presente documentos se pode correlacionar com qualquer um ou mais dos seguintes: Dados de Western blot mostrando que o soro de animais expostos a um patógeno microbiano contém anticorpo que se liga especificamente a uma proteína descrita no presente documento, dados de Western blot mostrando que o soro de animais expostos à proteína descrita no presente documento contém anticorpo que se liga especificamente a um micróbio gram-negativo, ensaios de ligação à superfície celular demonstrando que o anticorpo que se liga especificamente a uma proteína descrita no presente documento se liga especificamente a um micróbio gram-negativo, dados de opsonofagocitose e indução de citocinas.

[0128] Também é conferido um método para detectar anticorpos que se liga especificamente às proteínas descritas no presente documento.

Esses métodos são úteis para, por exemplo, detectar se um animal possui anticorpo que se liga especificamente a uma proteína descrita no presente documento e diagnosticar se um animal pode ter uma condição causada por um micróbio expressando proteínas que compartilham epítopos com as proteínas descrita no presente documentos.

Tais sistemas de diagnóstico podem estar em forma de kit.

Os métodos incluem o contato de um anticorpo com uma preparação que inclui uma proteína descrita no presente documento para resultar em uma mistura.

O anticorpo pode estar presente em uma amostra biológica, por exemplo, sangue, leite ou colostro.

Adicionalmente, o método inclui incubar a mistura sob condições para permitir que o anticorpo se ligue especificamente à proteína para formar um complexo proteína:anticorpo.

Conforme usado no presente documento, o termo "complexo proteína:anticorpo" se refere ao complexo que resulta quando um anticorpo se liga especificamente a uma proteína.

A preparação que inclui as proteínas descritas no presente documento também pode incluir reagentes, por exemplo um tampão, que proporcionam condições apropriadas para a formação do complexo proteína:anticorpo.

O complexo proteína:anticorpo é então detectado.

A detecção de anticorpos é conhecida na técnica e pode incluir, por exemplo, imunofluorescência ou peroxidase.

Os métodos para detectar a presença de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas descritas no presente documento podem ser usados em vários formatos que foram usados para detectar anticorpos, incluindo radioimunoensaio e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima.

Kits

[0129] Também são conferidos kits. Em uma modalidade, um kit é para detectar anticorpo que se liga especificamente à proteína descrita no presente documento. O anticorpo detectado pode ser obtido a partir de um animal com suspeita de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo. Em outra modalidade, um kit é para detectar uma proteína descrita no presente documento. Em ainda outra modalidade, um kit é para usar uma proteína descrita no presente documento, tal como usar uma proteína para produzir anticorpo, tratar uma condição ou tratar uma infecção.

[0130] O kit inclui pelo menos uma das proteínas descrita no presente documentos (por exemplo, uma, pelo menos duas, pelo menos três, etc.) ou um anticorpo descrito no presente documento em um material de embalagem adequado em uma quantidade suficiente para pelo menos um ensaio ou uso. Opcionalmente, outros reagentes, tais como tampões e soluções, também estão incluídos. Por exemplo, um kit também pode incluir um reagente de forma a permitir a detecção de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína descrita no presente documento, tal como um anticorpo secundário marcado de forma detectável, concebido de modo a se ligar especificamente a um anticorpo obtido a partir de um animal. Instruções para uso do anticorpo ou proteína empacotada também são tipicamente incluídas. Conforme usado no presente documento, a frase "material de embalagem" se refere a uma ou mais estruturas físicas usadas para alojar o conteúdo do kit. O material de embalagem é construído por métodos rotineiros, geralmente de modo a fornecer um ambiente estéril e livre de contaminantes. O material de embalagem pode ter um rótulo que indica que as proteínas podem ser usadas de modo a detectar anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína descrita no presente documento, ou usando uma proteína descrita no presente documento. Adicionalmente, o material de embalagem contém instruções indicando como é que os materiais do kit são empregues para detectar o anticorpo ou para administrar uma proteína a um animal. Conforme usado no presente documento, o termo "embalagem" se refere a um recipiente tal como vidro, plástico, papel, papel alumínio e similares, capaz de reter dentro de limites fixos as proteínas e outros reagentes, por exemplo, um anticorpo secundário. Desse modo, por exemplo, uma embalagem pode ser um poço de placa de microtítulo ao qual foram afixadas quantidades de proteínas em microgramas. Uma embalagem também pode conter um anticorpo secundário. "Instruções de uso" normalmente incluem uma expressão tangível descrevendo a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro do método de ensaio, tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturadas, períodos de tempo de manutenção para misturas de reagentes/amostras, temperatura, condições de tampão e semelhantes.

MODALIDADES EXEMPLARES

[0131] Modalidade 1. Uma proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que a proteína protege um animal contra a infecção por E. coli.

[0132] Modalidade 2. Uma proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli.

[0133] Modalidade 3. A proteína de qualquer uma das Modalidades 1 ou 2 em que a proteína adicionalmente compreende duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0134] Modalidade 4. A proteína de qualquer uma das Modalidades 1 a 3 em que a proteína compreende pelo menos três cópias da sequência de aminoácidos, em que as três ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0135] Modalidade 5. Uma proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, em que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli.

[0136] Modalidade 6. A proteína da Modalidade 5 em que a proteína adicionalmente compreende duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0137] Modalidade 7. A proteína das Modalidades 5 ou 6 em que a proteína compreende pelo menos três cópias da sequência de aminoácidos, em que as três ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

[0138] Modalidade 8. A proteína de qualquer uma das Modalidades 1-7, em que a proteína inclui um ligante presente em um resíduo X.

[0139] Modalidade 9. A proteína da Modalidade 8, em que a proteína inclui um ligante presente em cada resíduo X.

[0140] Modalidade 10. A proteína da Modalidade 8 ou 9 em que pelo menos um ligante compreende a sequência de aminoácidos GSGS (SEQ ID NO:23).

[0141] Modalidade 11. Uma proteína não natural compreendendo um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.

[0142] Modalidade 12. Uma proteína não natural compreendendo um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.

[0143] Modalidade 13. A proteína da Modalidade 11 ou 12 em que o domínio de células B e o domínio de células T estão presentes na ordem domínio células B - domínio células T.

[0144] Modalidade 14. Uma proteína não natural compreendendo os aminoácidos 7-518 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou os aminoácidos 7-365 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0145] Modalidade 15. Uma proteína não natural compreendendo os aminoácidos 7-422 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou os aminoácidos 7-461 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

[0146] Modalidade 16. Uma proteína não natural selecionada a partir da proteína 1-9 da Tabela 1, proteína 10-15 da Tabela 2, proteína 16-51 da Tabela 3, proteína 52- 63 da Tabela 4, proteína 64-69 da Tabela 5, proteína 70-78 da Tabela 6, proteína 79-90 da Tabela 7, ou proteína 91-126 da Tabela 8, ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequencia com a sequência de aminoácidos da proteína 1-9 da Tabela 1, proteína 10-15 da Tabela 2, proteína 16-51 da Tabela 3, proteína 52-63 da Tabela 4, proteína 64-69 da Tabela 5, proteína 70-78 da Tabela 6, proteína 79-90 da Tabela 7, ou proteína 91-126 da Tabela 8.

[0147] Modalidade 17. A proteína da Modalidade 16, em que a proteína adicionalmente compreende um ligante localizado entre um domínio de células B e um domínio de células T.

[0148] Modalidade 18. A proteína da Modalidade 16, em que a proteína adicionalmente compreende um ligante localizado entre cada domínio de células B e domínio de células T.

[0149] Modalidade 19. Proteína não natural, compreendendo: um primeiro domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO:1, um segundo domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-48 de SEQ ID NO:1, um terceiro domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 49-88 de SEQ ID NO:1, e um quarto domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 89-103 de SEQ ID NO:1, um quinto domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 104- 133 de SEQ ID NO:1, e um sexto domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-148 de SEQ ID NO:1, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo, quarto e sexto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções com E. coli.

[0150] Modalidade 20. Proteína não natural, compreendendo: um primeiro domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:2, um segundo domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 24-38 de SEQ ID NO:2, um terceiro domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 39-75 de SEQ ID NO:2, e um quarto domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 76-90 de SEQ ID NO:2, e um quinto domínio compreendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 91-101 de SEQ ID NO:2, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo e quarto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções com E. coli.

[0151] Modalidade 21. A proteína de qualquer uma das Modalidades 1-10, 19 ou 20, em que o animal é uma ave, um bovino, um caprino, um ovino, um porcino, um bisonte, um equino, um animal de companhia, um membro da família Cervidae ou um ser humano.

[0152] Modalidade 22. A proteína de qualquer uma das Modalidades 1-10, 19 ou 20, em que a E. coli é CFT073.

[0153] Modalidade 23. Uma composição compreendendo a proteína de qualquer uma das Modalidades 1-20.

[0154] Modalidade 24. A composição da Modalidade 23 compreendendo adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável.

[0155] Modalidade 25. A composição da Modalidade 23 ou 24, compreendendo adicionalmente um adjuvante.

[0156] Modalidade 26. Um método compreendendo: administrar a um sujeito uma quantidade da composição de qualquer uma das Modalidades 23 a 25 eficaz para induzir o sujeito a produzir anticorpo que se liga especificamente à proteína, produzir células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas direcionadas para um epítopo de uma proteína presente na composição, ou uma combinação das mesmas.

[0157] Modalidade 27. Um método para tratar uma infecção em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das Modalidades 23 a 25 a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

[0158] Modalidade 28. Um método para tratar um sintoma em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das Modalidades 23 a 25 a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

[0159] Modalidade 29. Um método para diminuir a colonização em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das Modalidades 23 a 25 a um sujeito colonizado por um micróbio gram-negativo.

[0160] Modalidade 30. Um método para tratar uma condição em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das Modalidades 23 ou 25 a um sujeito com necessidade da mesma, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram-negativo.

[0161] Modalidade 31. O método de qualquer uma das Modalidades 26 a 30, em que o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico que é um membro da família Vibrionaceae, um membro da família Enterobacteriaceae, um membro da família Pasteurellaceae, um membro da família Pseudomonadaceae ou uma Campylobacter spp.

[0162] Modalidade 32. Um método para tratar uma infecção em um sujeito, o método compreendendo:

administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição de qualquer uma das Modalidades 1 a 24.

[0163] Modalidade 33. Um método para tratar um sintoma em um sujeito compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição de qualquer uma das Modalidades 1 a 24.

[0164] Modalidade 34. Um método para diminuir a colonização em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito colonizado por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição de qualquer uma das Modalidades 1 a 24.

[0165] Modalidade 35. Um método para tratar uma condição em um sujeito, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito em necessidade da mesma, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição de qualquer uma das Modalidades 1 a 24, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram-negativo.

[0166] Modalidade 36. O método de qualquer uma das Modalidades 32 a 35, em que o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico que é um membro da família Vibrionaceae, um membro da família Enterobacteriaceae, um membro da família Pasteurellaceae, um membro da família Pseudomonadaceae ou uma Campylobacter spp.

[0167] Modalidade 37. O método de qualquer uma das Modalidades 26 a 36, em que o sujeito é um mamífero ou uma ave.

[0168] Modalidade 38. O método da Modalidade 37, em que o mamífero é um ser humano ou um bovino.

[0169] Modalidade 39. O método da Modalidade 37, em que a ave é uma ave domesticada.

[0170] Modalidade 40. O método da Modalidade 39, em que a ave domesticada é um frango ou um peru.

[0171] Modalidade 41. O método de qualquer uma das Modalidades 31 ou 36, em que o membro da família Enterobacteriaceae é E. coli ou Klebsiella spp. Exemplos

[0172] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem. Deve ser entendido que os exemplos, materiais, quantidades e procedimentos particulares devem ser interpretados de maneira ampla, de acordo com o âmbito e o espírito da invenção, conforme estabelecido no presente documento. Exemplo 1 Seleção de isolados de E. coli

[0173] Quatro cepas patogênicas aviárias de E. coli foram usadas nos seguintes estudos de sepse em camundongos. As cepas aviárias foram isoladas de bandos comerciais de frango e de peru mostrando sinais clínicos de colibacilose. Os isolados aviários receberam as seguintes designações; APEC- 280 (frango); APEC-13 (frango); APEC-374 (frango) e APEC-J4 (peru). Exemplo 2 Preparação de estoques de sementes de E. coli

[0174] Para preservar os isolados originais, foi preparado um estoque principal de sementes de cada isolado através da inoculação do isolado apropriado em 200 mL de caldo de soja tríptico (TSB, Difco Laboratories, Detroit, Michigan) contendo 300 µM de 2,2-dipiridila (Sigma-Aldrich St. Louis, Mo.). A cultura foi cultivada enquanto se agitava a 200 rpm por 6 horas a 37 °C e coletada por centrifugação a 10,000 x g. O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 100 mL de caldo TSB contendo 20% de glicerol e foi dispensado de modo estéril em frascos criogênicos de 2 mL (1 mL por frasco) e armazenado a -90 °C até ao uso. O estoque principal de sementes foi expandido para uma semente em funcionamento. Um frasco da semente principal previamente preparado foi inoculado em 200 mL de TSB, contendo 300 µM de 2,2-dipiridila (Sigma). A cultura foi cultivada enquanto se agitava a 200 rpm por 6 horas a 37 °C e coletada por centrifugação a 10,000 x g. O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 100 mL de caldo TSB contendo 20% de glicerol e foi dispensado de modo estéril em frascos criogênicos de 2 mL (1 mL por frasco) e armazenado a -90 °C até ao uso. Exemplo 3 Síntese e Clonagem das Proteínas Trímero-1 e Trímero-2

[0175] As sequências codificadoras de ADN (SEQ ID NO: 7 e 9) para a proteína Trímero-1 (SEQ ID NO: 8) e para a proteína Trímero-2 (SEQ ID NO: 10) foram produzidas por síntese química (InVitrogen GeneArt; Life Technologies Inc., Grand Island, NI) e inseridas no vetor pMK-RQ usando locais de restrição NdeI e XhoI flanqueadores concebidos nos terminais 5-iniciador e 3-iniciador, respectivamente. Uma sequência codificando uma série de seis histidinas foi concebida imediatamente após o códon de início da metionina AUG no terminal 5-iniciador. Os construtos Trímero-1 e Trímero-2 foram subclonados no vetor de expressão pET29b usando os locais de restrição NdeI e XhoI flanqueadores e transformados em E. coli BL21(DE3) usando técnicas padrão de ADN recombinante. Os clones foram selecionados e verificados por sequenciação de ADN (ACGT, Inc., Wheeling, IL). Exemplo 4 Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes

[0176] Os polipeptídeos recombinantes Trímero-1 e Trímero-2 foram expressos em E. coli e purificados usando métodos padrão. Resumidamente, foram usados estoques bacterianos congelados (100 µL) para inocular 20 mL de caldo Luria-Bertani (LB) contendo o antibiótico seletivo apropriado (canamicina para pET29b) e a cultura foi cultivada a 37 °C em uma incubadora com agitação a 250 rpm. Após 16 horas, a cultura foi diluída em 1 L de Caldo LB contendo o antibiótico seletivo apropriado, cultivada a uma densidade óptica (600 nm) de 0,6 e induzida através da adição de IPTG a 1 M a uma concentração final de 1 mM. Alternativamente, para lotes maiores, a cultura foi usada para semear um fermentador de 10 L que foi induzido com IPTG para uma concentração final de 1 mM. Os grânulos de células bacterianas foram colhidos por centrifugação a 4,000 x g por 20 minutos a 4 °C, lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS, 8,0 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 e 0,24 g/L KH2PO4 pH 7,4) e armazenado a -80 °C até à lise. Os corpos de inclusão insolúveis foram enriquecidos por tratamento com BugBuster (Millipore) e foram solubilizados em um tampão de ureia a 8M. Cromatografia de permuta aniônica (AEX) foi utilizada para remover a endotoxina seguida por um segundo passo de cromatografia AEX para permutar a amostra em um tampão final consistindo em fosfato de sódio a 20 mM, N-Octil-β-D-glucopiranósido a 51 mM (nOG), cloreto de sódio a e ureia a 300 mM (pH 9,5). A concentração de proteína foi determinada usando o método BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL) e a pureza do polipeptídeo foi medida por SDS- PAGE e densitometria (LI-COR Odyssey; LI-COR, Lincoln, NE). Exemplo 5 Preparação de E. coli resistente ao Ácido Nalidíxico

[0177] Os isolados de E. coli selecionados a partir do Exemplo 1 foram tornados resistentes ao ácido nalidíxico. O objetivo de induzir resistência a um antibiótico conhecido na cepa de desafio é ser capaz de diferenciar a cepa de desafio de outras cepas de E. coli que podem contaminar amostras desafiadas devido à sua prevalência no ambiente. Para induzir resistência a antibióticos, cada isolado foi cultivado em concentrações crescentes de ácido nalidíxico. Resumidamente, duas soluções de estoque de 1 litro de TSB contendo 35 g de Soja Tríptica; 5 g de extrato de levedura e 2,2-dipiridila a 25 µg foram preparadas e submetidas a autoclave por 30 minutos e subsequentemente resfriadas até

4 °C. Ácido nalidíxico foi adicionado a um frasco de TSB por filtração por membrana através de um filtro de 0,2 µm até uma concentração final de 150 µg/mL. O TSB contendo 150 µg/mL de ácido nalidíxico foi diluído em 20 mL de estoque (tubos cônicos de 50 mL) usando o TSB sem ácido nalidíxico como diluente para obter as seguintes concentrações: 0 (sem ácido nalidíxico); 25 µg/mL; 50 µg/mL; 75 µg/mL; 100 µg/mL e 150 µg/mL não diluído.

[0178] Os isolados foram removidos do armazenamento congelado e semeados em ágar de sangue de ovelha e incubados a 37 °C por 24 horas, altura em que uma única colônia foi colhida e inoculada de forma estéril em um dos tubos de ácido não-nalidíxico e incubada por 3 horas a 37 °C enquanto era agitada a 200 rpm. Três horas após a inoculação 2 mL da cultura foram transferidos para 20 mL de tubos de 25 µg/mL de ácido nalidíxico que foi preaquecido até 37 °C. As culturas foram deixadas a crescer a 37 °C enquanto eram rapidamente agitadas a 200 rpm por 3 horas. Esse processo foi repetido duas vezes e depois transferido para a concentração seguinte de ácido nalidíxico. Se não ocorreu crescimento, o processo foi repetido na concentração anterior e depois transferido para a próxima concentração crescente. Isso foi feito para cada concentração até o crescimento ser estabelecido na concentração mais elevada de ácido nalidíxico. Uma vez estabelecido o crescimento ao nível de 150 µg/mL, as culturas foram então semeadas em EMB contendo 150 µg/mL de ácido nalidíxico. Uma única colônia de cada isolado foi selecionada e transferida para 100 mL de TSB contendo 150 µg/mL de ácido nalidíxico (meio conforme descrito acima). As culturas foram deixadas crescer a 37 °C por 4,5 horas ou até que fosse alcançado uma DO de 1,0 a 540 nm. As culturas foram centrifugadas a 8,000 rpm por 20 minutos, momento em que os grânulos foram descartados e os sedimentos ressuspensos em 90 mL de meio TSB conforme descrito acima, mas contendo 20% de glicerol e 25 µg/mL de 2,2-dipiridila. Alíquotas de um mL de cada suspensão bacteriana foram dispensadas em frascos criogênicos de 2 mL e armazenadas a -90 °C até ao uso. Exemplo 6 Preparação de Estirpes de Desafio de E. coli

[0179] De modo a utilizar esses isolados como estirpes de desafio, cada isolado foi doseado em camundongos para determinar um LD-80 aproximado. Resumidamente, as cepas resistentes ao ácido nalidíxico previamente preparadas no Exemplo 5 foram subcultivadas a partir de estoques congelados; 100 µL/100 mL em TSB preparado de fresco contendo 35 g de TSB; 5 g de extrato de levedura e 2,2-dipiridila a 25 µg/litro. As culturas foram agitadas a 100 rpm por 14 horas altura em que cada uma foi subcultivada no mesmo meio, conforme descrito acima, que foi preaquecido a 37 °C. A partir das culturas durante a noite, foram transferidos de forma estéril 100 µL para 20 mL do meio TSB. As culturas foram deixadas a crescer durante 2 horas, enquanto se agita a 200 rpm a 37 °C. Após o período de tempo de 2 horas, 10 mL de cada cultura foram transferidos para 100 mL de TSB preaquecido e incubados a 37 °C. As culturas foram deixadas a crescer até se atingir uma DO de 1,2 a 540 nm; altura em que a cultura foi centrifugada a 8,000 rpm por 15 minutos e cada isolado foi ressuspenso em 50 mL de PBS frio pH 7,2. As culturas foram mantidas em gelo até ao uso. Exemplo 7 Passagem em Série em Camundongos

[0180] Para aumentar a virulência de cada isolado, cada organismo foi passado em série nas novas espécies hospedeiras (camundongos). Resumidamente, utilizando as culturas conforme descrito acima no Exemplo 3, dois camundongos foram injetados subcutaneamente tanto com 0,1 ou 0,2 cc a 1,0 x 109 UFC/mL de cada isolado. Vinte e quatro horas após a inoculação os camundongos estavam mórbidos, mas não morreram. Os camundongos foram submetidos a eutanásia por deslocamento cervical e cada fígado foi cultivado usando uma ansa flamejada que foi semeada em ágar de sangue e ágar azul de metileno de eosina (EMB) contendo 150 µg/mL de ácido nalidíxico. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas. Um número de colônias a partir da dose de 0,2 tinha crescido tanto na placa de EMB como na placa de sangue, indicando que os isolados se haviam tornado sistêmicos. Essas colônias foram riscadas para isolamento e passadas novamente através de camundongos usando o mesmo regime. Dessa vez, a dose de 0,2 cc teve aproximadamente 20-50 colônias. Isso foi repetido; fígados cultivados e as placas tinham mais de 100 colônias. Os isolados cultivados no fígado foram passados mais duas vezes em camundongos (cinco passagens em série no total), o que resultou na morte de todos os camundongos 24 horas após o desafio; demonstrando claramente que cada um dos isolados se adaptou para crescer nas novas espécies hospedeiras pelo aumento da virulência com a morte como parâmetro de resultado. Exemplo 8 Preparação de Sementes de Trabalho Congeladas (5 Passagens em Camundongos)

[0181] Os isolados de E. coli resistentes a ácido nalidíxico com 5 passagens em camundongo foram subcultivados a partir de placas de EMB e expandidos em sementes de trabalho congeladas. Brevemente, colônias únicas a partir das placas EMB foram subcultivadas em 20 mL de TSB contendo 32 g de TSB; 5 g de extrato de levedura e 2,2-dipiridila a 25 µg/litro. As culturas foram deixadas a agitar a 200 rpm por 2 horas, altura em que foram subcultivadas no mesmo meio que foi preaquecido até 37 °C. Após o período de 2 horas, 10 mL de cada cultura foram transferidos para 100 mL de TSB preaquecido conforme descrito acima, exceto que a concentração de 2,2-dipiridila foi de 25 µg/L. Essas culturas foram deixadas a crescer até atingirem uma DO de 1,0 a 540 nm altura em que foram centrifugadas a 8,000 rpm por 10 minutos e ressuspensas em 90 mL de solução fria de TSB conforme descrito acima, além da adição de 20% de glicerol. Alíquotas de um mL de cada suspensão bacteriana foram dispensadas em frascos criogênicos de 2 mL; etiquetadas e armazenadas a -90 °C até ao uso. Exemplo 9 Passagem em Série de APEC-280 em Frangos

[0182] A semente de trabalho anterior APEC-280 do Exemplo 1 que foi tornada resistente ao ácido nalidíxico conforme descrito no Exemplo 5 foi passada em frangos e expandida para uma nova semente de trabalho.

Isso foi feito para melhorar a virulência do isolado APEC-280. Resumidamente, dois frangos leghorn de sete semanas de idade isentos de patógenos obtidos a partir da Valo BioMedia, (Adel, IA) foram injetados IV quer com 0,1 ou com 0,2 cc a 1,0 x 108 UFC/mL do isolado APEC-280. Vinte e quatro horas após a inoculação os frangos estavam mórbidos, mas não morreram.

Os frangos foram submetidos a eutanásia por deslocamento cervical e cada fígado foi cultivado usando uma ansa flamejada e semeada em ágar de sangue e ágar EMB contendo 150 µg/mL de ácido nalidíxico.

As placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas.

Um número de colônias a partir da dose de 0,2 tinha crescido tanto na placa de EMB como na placa de sangue, indicando que os isolados se haviam tornado sistêmicos.

Essas colônias foram riscadas para isolamento e passadas novamente através de frangos usando o mesmo regime.

Dessa vez, a dose de 0,2 cc teve aproximadamente 20-50 colônias.

Isso foi repetido; fígados foram cultivados e as placas tinham agora mais de 100 colônias.

Os isolados cultivados no fígado foram, uma vez mais, passados consecutivamente mais duas vezes em frangos (cinco passagens em série no total), o que resultou na morte de todos os frangos 24 horas após o desafio; demonstrando claramente que o isolado APEC-280 se adaptou para crescer nas novas espécies hospedeiras pelo aumento da virulência com a morte como parâmetro de resultado.

Essa semente foi expandida para uma nova semente de trabalho usando a mesma metodologia de cultura do Exemplo 8 e usada como a cepa de desafio em frangos e perus conforme descrito nas experiências seguintes.

Exemplo 10 Preparação de Dose Letal de Sepse

[0183] Os isolados de E. coli, agora resistentes ao ácido nalidíxico e virulentos em camundongos, foram titulados em doses de forma a induzir a mortalidade em 80-100% dos camundongos desafiados por via subcutânea. Resumidamente, 24 horas antes do desafio, 100 mL de TSB contendo 35 g de soja tríptica; 5 g de extrato de levedura e 25 µg/mL de 2,2- dipiridila por litro foram inoculados a partir dos estoques congelados (100 µL) do Exemplo 8 e incubados por 14 horas a 37 °C enquanto se agitava a aproximadamente 100 rpm. Catorze horas após a inoculação da cultura acima; 100 µL foram então inoculados em 20 mL de TSB preaquecido conforme descrito acima em tubos cônicos de 50 mL; incubados a 37 °C enquanto se agitava a 200 rpm até uma DO de 0,8 a 540 nm. Uma vez que as culturas atingiram uma DO de 0,8; 10 mL de cada cultura foram inoculados esterilmente em 100 mL de TSB preaquecido contendo 35 g de soja tríptica; 5 g de extrato de levedura e 25 µg/mL de 2,2-dipiridila por litro; incubados a 37 ºC, enquanto se agitava a 200 rpm, até se atingir uma DO de 0,92- 0,95 a 540 nm. Imediatamente após atingir a DO desejada, as culturas foram transferidas para frascos de centrífuga de 250 mL, altura em que foram adicionados 100 mL de PBS a 4 °C para parar o crescimento. As culturas foram centrifugadas por 20 minutos usando um rotor JA14 Beckman a 8,000 x g. Após centrifugação, os sobrenadantes foram removidos usando pipetas individuais de 50 mL e os sobrenadantes foram descartados. Depois, foram novamente adicionados 20 mL de PBS a 4 °C aos grânulos individuais e ressuspensos uniformemente por pipetagem. A suspensão bacteriana foi transferida para um tubo cônico de 50 mL e submetida a vórtice vigorosamente (30 segundos) para dispersar uniformemente os grânulos bacterianos. Cada suspensão bacteriana foi transferida para um frasco de centrífuga estéril de 250 mL, altura em que foi reposto para o seu volume original de 100 mL pela adição de 80 mL de 4 °C de PBS e se misturou completamente. Exemplo 11 Titulação de Dose Letal de Sepse

[0184] As suspensões bacterianas do Exemplo 10 foram testadas em camundongos em diferentes diluições: 1) 0,1 cc direto de suspensão bacteriana não diluída, 2) suspensão de estoque diluída 1: 2 (1 mL em 1 mL) em PBS frio pH 7,4; 3) suspensão de estoque diluída 1:10 (1 mL em 9 mL) em PBS frio pH 7,4 e 4) suspensão estoque diluída 1:100 (1 mL em 99 mL) em PBS frio pH 7,4. Cada diluição foi administrada a 10 camundongos por injeção subcutânea usando um volume de 0,1 cc. Os camundongos foram observados por 7 dias após o desafio quanto à mortalidade. Esses dados mostraram que a suspensão bacteriana não diluída derivada a partir dos isolados APEC- 280, APEC-13, APEC-374 e APEC-J4 matou 100% dos camundongos dentro de um período de 24 horas, em comparação com a suspensão de estoque diluída 1:2, que matou 30% dos camundongos após 24 horas e 50% dos camundongos no período de 48 horas. Além disso, nenhum camundongo que recebeu a diluição 1:10 morreu dentro do período de observação. Com base nessa avaliação preliminar, a dose de desafio dos isolados APEC foi determinada como sendo uma diluição de 1:2 da suspensão de estoque de aproximadamente 2,0 x 108 UFC/mL. Desse modo, os isolados de APEC congelado de 5 Passagens em Camundongo foram usados a uma dose de camundongo de aproximadamente 2,0 x 107 UFC em um volume de 0,1 mL. Exemplo 12 Ensaio de Imunoabsorção Ligado à Enzima (ELISA)

[0185] A resposta imunológica a proteínas recombinantes individuais foi determinada pela medição dos títulos de IgG por ELISA. Resumidamente, 100 µL de polipeptídeo a 2 µg/mL, solubilizado em ureia a 5 M, foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de EIA/RIA (Corning/Costar 3590) e incubados durante a noite a 4 °C. Todos os passos restantes foram realizados à temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem de PBS (PBS contendo Tween 20 a 0,05%), seguido pela adição de 200 µL/poço de tampão de amostra consistindo em PBS contendo Tween 20 a 0,05% e albumina de soro bovino a 1%. Após 90 minutos, o tampão de amostra foi substituído por 100 µL/poço de tampão de amostra PBS. As diluições em série 1:3 dos antissoros primários foram efetuadas na placa pela adição de 50 µL à primeira fila, misturando 10 vezes e transferência de 50 µL para a fila seguinte. A placa foi incubada por 90 minutos seguida por três lavagens e adição de 100 µL/poço de um anticorpo IgG anticamundongo de cabra conjugado com HRP, específico para cadeia pesada (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Após um período de incubação de 90 minutos, a placa foi lavada quatro vezes seguida pela adição de 100 µL de TMB (BioFx; Surmodics, Eden Prairie, MN)/poço. A cor foi deixada a desenvolver por 30 minutos e a reação foi interrompida pela adição de 100 µL de reagente de interrupção (BioFx). A absorvância foi medida no comprimento de onda de 450 nm e o título foi calculado como o inverso da diluição correspondente a uma absorvância de 1,0. Os controles incluíram um soro primário padronizado incluído em cada placa para monitorar a variabilidade do ensaio e os poços que não foram revestidos para subtrair o anterior. O limite de detecção para o ensaio foi o inverso da diluição inicial no soro. Exemplo 13 Avaliação da Eficácia da Vacina em Camundongos Desafiados com Diferentes Cepas e Sorotipos de E. coli Visão Geral Experimental das Experiências de Sepse

[0186] O objetivo global dos seguintes estudos foi avaliar a eficácia de Trímero-1 e Trímero-2 como antigênios de vacinas para controlar várias condições de doença causadas por bactérias gram-negativas. Quatro cepas diferentes de E. coli foram usadas para os seguintes desafios experimentais; APEC-280, APEC-13, APEC-J4 e APEC-374 do Exemplo 8.

[0187] Nesse primeiro estudo, se avaliou a eficácia do Trímero-1 contra o desafio com quatro cepas diferentes de E. coli: APEC-280; APEC-13; APEC-J4 e APEC-374. Os parâmetros resultantes usados para avaliar a eficácia da vacina foram 1) eficácia de uma proteína única, Trímero-1, contra desafio sistêmico e 2) capacidade do Trímero-1 de se proteger contra diferentes cepas e/ou sorotipos.

[0188] Resumidamente, 180 camundongos Harlan CF-1 fêmeas obtidos a partir do Charles River Laboratory (Wilmington,

MA) pesando 16-22 gramas foram igualmente divididos em 4 grupos experimentais (45 camundongos/grupo) designados como 1-4 (Tabela 9). Cada um desses grupos foi adicionalmente dividido em três subgrupos, de modo que cada subgrupo consistia em 15 camundongos designados agora como 1 (A, D, E); 2 (F, I, J); 3 (K, N, O) e 4 (P, S, T) (Tabela 9). Cada subgrupo representou uma formulação de vacina consistindo em um controle de placebo adjuvante e Trímero-1 formulado com 100 µg ou 150 µg de proteína total. Desse modo, todos os grupos consistiram em um placebo adjuvante e duas formulações de vacina com doses diferentes de Trímero-1. Tabela 9. Concepção Experimental.

Volume Antigênio Gru- Camun- Vac- Adju- de Vacinas Via de Cepa de Total pos dongos ina vante Vacina # Vacinação Desafio (ug) (uL) Grupo -1 A 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC APEC-280 Trí- D 15 mero 100 AlOH 100 2 SC -1 APEC-280 Trí- E 15 mero 150 AlOH 100 2 SC -1 APEC-280 Grupo -2 F 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC APEC-13

Trí- I 15 mero 100 AlOH 100 2 SC -1 APEC-13 Trí- J 15 mero 150 AlOH 100 2 SC -1 APEC-13 Grupo -3 K 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC APEC-J4 Trí- N 15 mero 100 AlOH 100 2 SC -1 APEC-J4 Trí- O 15 mero 150 AlOH 100 2 SC -1 APEC-J4 Grupo -4 P 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC APEC-374 Trí- mero AlOH 100 2 SC APEC-374 S 15 -1 100 Trí- mero 150 AlOH 100 2 SC APEC-374 T 15 -1

[0189] Os camundongos foram alojados em gaiolas de policarbonato (Ancore Corporation, Bellmore, NI) com 5 camundongos por gaiola com comida e água conferidas ad libitum. Todos os camundongos foram deixados a se aclimatar uma semana antes da primeira vacinação. Os camundongos foram vacinados duas vezes em intervalos de 21 dias e desafiados 21 dias após a segunda vacinação. Os grupos foram desafiados com uma das quatro linhagens de desafio (Tabela 9). Exemplo 14 Preparação de Vacinas e Vacinação

[0190] As vacinas contendo a proteína Trímero-1 recombinante foram preparadas a 100 µg e 150 µg de proteína por dose em PBS formulado com 20 por cento (v/v) de Alhydrogel (Invivogen, San Diego, CA) em um volume final de 0,1 mL (Tabela 9). As vacinas de placebo foram preparadas substituindo PBS pela suspensão aquosa de proteína da formulação descrita acima. Os camundongos foram vacinados duas vezes com intervalos de 21 dias. Exemplo 15 Preparação de Organismos de Desafio

[0191] Os quatro isolados de E. coli APEC-280; APEC-13; APEC-J4 e APEC-374 conforme descritos anteriormente no Exemplo 1 foram usados como cepas de desafio. Resumidamente, cada isolado a partir de um estoque congelado do Exemplo 8 foi riscado em uma placa de ágar de sangue e incubado a 37 °C por 18 horas. Uma única colônia foi subcultivada em 50 mL de TSB (Difco) contendo 25 µg por mL de 2,2'dipiridila (Sigma). As culturas foram deixadas crescer por 12 horas a 37 °C enquanto rodavam a 100 rpm, altura em que foram subcultivadas 1:100 até um volume final de 50 mL de TSB conforme descrito acima. As subculturas foram incubadas a 37 °C por 3 horas enquanto rodavam a 200 rpm e deixadas atingir uma densidade óptica (540 nm) de 0,6-0,8. Cada cultura foi então subcultivada um tempo final transferindo 10 mL para 90 mL de TSB preaquecido contendo 25 µg por mL de 2,2'dipiridila e incubada a 37 °C por aproximadamente 4 horas enquanto rodava a 200 rpm até ser atingida uma densidade óptica de 0,90-0,95 a 540 nm. O crescimento de cada cultura foi interrompido através da adição de 100 mL de PBS a 4 °C. As culturas foram então centrifugadas a 10,000 x g por 15 minutos a 4 °C para granular as bactérias. Os granulados bacterianos foram lavados uma vez por centrifugação em PBS a 4 ° C. Vinte e cinco mililitros de PBS frio foram adicionados a cada granulado bacteriano e submetidos vigorosamente a vórtice por 30 segundos de forma a ressuspender completamente os granulados. Isso foi seguido por 75 mL de PBS frio adicionado a cada suspensão bacteriana para um volume final de 100 mL. Cada cultura foi então diluída 1:2 em PBS frio e usada para o desafio. Imediatamente antes do desafio, 1 mL da suspensão bacteriana final foi diluída em séries de 10 vezes e plaqueadas em ágar de sangue e ágar de EMB (contendo 100 µg/mL de ácido nalidíxico) para enumerar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por dose de camundongo. Exemplo 16 Desafio

[0192] Vinte e um dias após a segunda vacinação, todos os camundongos do grupo 1 (A, D, E); 2 (F, G, J); 3 (K, N, O) e 4 (P, S, T) (Tabela 9) foram desafiados subcutaneamente com 0,1 mL da cepa de desafio apropriada. O grupo 1 (A, D, E) foi desafiado com APEC-280 a 1,0 x 107 unidades formadoras de colônias. O grupo 2 (F, G, J) foi desafiado com APEC-13 a 4,5 x 107 unidades formadoras de colônias.

O grupo 3 (K, N, O) foi desafiado com APEC-J4 a 8,0 x 107 unidades formadoras de colônias; enquanto que o grupo 4 (P, S, T) foi desafiado com APEC-374 a 5,5 x 107 unidades formadoras de colônias.

A mortalidade foi registrada diariamente por 10 dias após o desafio.

A Tabela 10 mostra a mortalidade total e a porcentagem de sobrevivência de todos os grupos após o desafio para o período de observação de 10 dias.

Tabela 10. Mortalidade Total e Porcentagem de "Qualidade de Vida" Após o Desafio Usando APEC-280, APEC 13, APEC J4 e APEC 374. Trata- Número de Mortos nos Dias Desafio Mortal- Sobrevi-

mentos Indicados Após o Desafio Cepa idade vência

Total Percen-

tual

Grupo-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A) 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 15/15 0

Placebo 280

Adjuvado

D) 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 6/15 60

Trímero- 280

1 100 µg

E) 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 3/15 80

Trímero- 280

1 150 µg

Grupo-2

F) 0 7 2 0 2 2 0 0 0 0 APEC-13 13/15 13

Placebo

Adjuvado

I) 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC-13 3/15 80

Trímero-

1 100 µg

J) 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 APEC-13 4/15 73

Trímero-

1 150 µg

Grupo-3

K) 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 APEC-J4 10/15 33

Placebo

Adjuvado

N) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC-J4 0/15 100

Trímero-

1 100 µg

O) 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC-J4 1/15 93

Trímero-

1 150 µg

Grupo-4

P) 3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 15/15 0

Placebo 2 374

Adjuvado

S) 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 10/15 33

Trímero- 0 374

1 100 µg

T) 2 11 1 0 0 0 0 0 0 0 APEC- 14/15 7 Trímero- 374 1 150 µg Exemplo 17 Resultados do Desafio

[0193] Ambas as doses de Trímero-1 mostraram excelente eficácia contra o desafio sistêmico usando APEC-280; APEC- 13 e APEC-J4 (Tabela 10; Figuras 1, 2 e 3). A Tabela 10 e a Figura 1 mostram a porcentagem de sobrevivência do grupo 1 (A, D, E); desafiado com APEC-280. Ambos os níveis de dose de 100 µg e 150 µg do Trímero-1 foram altamente protetores contra o desafio com APEC-280 e foram estatisticamente significativos em comparação com os controles de placebo. A sobrevivência porcentual do grupo 1 (D) no nível de dose de 100 µg foi de 60%; (6 de 15 camundongos morreram) enquanto o nível de dose de 150 µg do grupo 1 (E) foi mais eficaz, mostrando uma sobrevivência porcentual de 80% (3 de 15 camundongos morreram). Todos os camundongos (15 em 15) do grupo de controle de placebo 1 (A) morreram dentro de 48 horas após o desafio (Tabela 10; Figura 1).

[0194] Os resultados foram comparáveis ao usar APEC-13 como a cepa de desafio. O grupo 2 (F, I, J) desafiado com APEC 13, conforme ilustrado na Figura 2, mostrou diferenças estatisticamente significativas na mortalidade geral entre os dois grupos de vacinas em comparação com os controles de placebo. A sobrevivência porcentual do grupo 2 de Trímero-1 (I) no nível de dose de 100 µg foi de 80%; (3 de 15 camundongos morreram) (Tabela 10; Figura 2). Em comparação, o grupo 2 de Trímero-1 (J) no nível de dose de 150 µg também foi protetor, mostrando uma porcentagem de sobrevivência de 73% e tendo apenas morrido 4 dos 15 camundongos (Tabela 10; Figura 2). Todos os grupos de vacinas desafiados com APEC- 13 sobreviveram a taxas estatisticamente mais elevadas que os controles de placebo. Treze dos quinze camundongos de controle de placebo morreram ao longo de um período de seis dias com uma taxa de sobrevivência de apenas 13%.

[0195] Resultados semelhantes foram obtidos no grupo 3 (K, N, O) desafiado com APEC J4 (Tabela 10; Figura 3). Os resultados mostraram proteção estatisticamente significativa sobre os controles de placebo para Trímero-1 em ambos os níveis de dose de 100 µg e 150 µg. Por exemplo, a Figura 3 mostra que o grupo 3 de Trímero-1 (N) teve uma taxa de sobrevivência de 100% na dose de 100 µg, isto é, nenhum dos camundongos morreu neste grupo. O nível de dose de 150 µg de Trímero-1 também foi altamente eficaz com uma sobrevivência percentual de 93%, com a morte de apenas 1 em cada 15 camundongos. A mortalidade cumulativa de 67% (10 em 15) ocorreu no grupo de controle de placebo 3 (K), com mortes a ocorrerem dentro de 3 dias após o desafio (Tabela 10; Figura 3).

[0196] Em contraste com o outro isolado de E. coli testado, apenas se obteve proteção moderada contra o desafio por APEC-374 (Tabela 10; Figura 4). Pode ser necessário um maior nível de investigação em relação a essa cepa de desafio, em contraste com as outras três cepa de E. coli. Por exemplo, níveis mais elevados de proteção contra essa cepa podem exigir uma dose única de antigênio mais elevada ou uma imunização adicional.

[0197] No geral, esses estudos demonstraram que o Trímero-1 protegia contra várias cepas diferentes de E.coli em um modelo letal de sepse de murino. Exemplo 18 Eficácia do Trímero-1 e Trímero-2 contra um Desafio de E. coli virulento em Um Modelo de Sepse de Camundongo

[0198] A eficácia do Trímero-1 e Trímero-2 recombinantes foi avaliada usando um desafio de E. coli virulenta viva com APEC-280 em camundongos, com a morte como ponto final. Os parâmetros de saída usados para avaliar a eficácia da vacina contra o APEC-280 foram: 1) titulação da dose antigênica de Trímero-1 e Trímero-2 para estabelecer a gama de proteção contra APEC-280; 2) duração da proteção do Trímero-1 tanto 3 como 8 semanas após a vacinação e 3) correlação dos títulos de anticorpos com a sobrevivência.

[0199] Resumidamente, 165 camundongos Harlan CF-1 fêmeas obtidos a partir do Charles River Laboratory (Wilmington, MA) pesando 16-22 gramas foram igualmente divididos em 11 grupos de tratamento (n = 15 camundongos/grupo) designados como indicado (Tabela 11). Os camundongos foram vacinados duas vezes em intervalos de 21 dias e desafiados com APEC- 280 a 3 ou 8 semanas após a segunda vacinação. Os camundongos foram alojados em gaiolas de policarbonato (Ancore Corporation, Bellmore, NI) com 5 camundongos por gaiola com comida e água conferidas ad libitum. Todos os camundongos foram deixados a se aclimatar uma semana antes da primeira vacinação. Exemplo 19 Preparação de Vacinas e Vacinação

[0200] As vacinas contendo Trímero-1 ou Trímero-2 foram preparadas em três concentrações diferentes para estabelecer um intervalo de dose apropriado da proteína recombinante específica.

O trimero-1 também foi avaliado para determinar a duração da imunidade (DOI) a 3 e 8 semanas após a segunda vacinação.

Níveis de dose de 50 µg, 100 µg e 150 µg de proteína total foram preparados em PBS formulado com 20 por cento (v/v) de Alhydrogel (Invivogen, San Diego, CA) em um volume final de 0,1 mL (Tabela 11). Para avaliar a duração da imunidade; os camundongos foram divididos em dois grupos.

Os camundongos dos grupos A-I foram usados para estabelecer a duração da imunidade a 3 semanas após a segunda vacinação para o Trímero-1 e o Trímero-2, enquanto os camundongos dos grupos J-P foram usados para avaliar a duração da imunidade 8 semanas após a segunda vacinação (Tabela 11). Os camundongos dos grupos A-I foram vacinados duas vezes com intervalos de 21 dias com a formulação de vacina apropriada e desafiados 21 dias após a segunda vacinação; os camundongos nos grupos M-P foram vacinados usando o mesmo regime, mas foram desafiados 8 semanas após a segunda vacinação (Tabela 11). O sangue foi coletado a partir de ambos os grupos no dia da primeira vacinação e novamente 24 horas antes do desafio.

Os camundongos dos grupos A e P serviram como controle de placebo.

As vacinas de placebo dos grupos A e P foram preparadas substituindo PBS pela suspensão aquosa de proteínas conforme descrito no procedimento acima.

Tabela 11. Concepção Experimental.

Per- Desafio Anti- Volume Via de íodo Cepa Camun- gênio Adju- de Grupo Vacina # Vac Vacin- de dongos Total vante Vacina ação Rep- (µg) (uL) ouso A 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC 3 APEC-280 Trí- C 15 150 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 3 Trí- D 15 100 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 3 Trí- E 15 50 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 3 Trí- AlOH G 15 150 100 2 SC APEC-280 mero-2 3 Trí- AlOH H 15 100 100 2 SC APEC-280 mero-2 3 Trí- AlOH I 15 50 100 2 SC APEC-280 mero-2 3 Trí- 8 M 15 150 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 Trí- 8 N 15 100 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 Trí- 8 O 15 50 AlOH 100 2 SC APEC-280 mero-1 P 15 PBS N/A AlOH 100 2 SC 8 APEC-280 Exemplo 20 Preparação de Organismo de Desafio

[0201] O isolado de E. coli APEC-280 descrito anteriormente no Exemplo 1 foi usado como a cepa de desafio.

Resumidamente, o isolado a partir de um estoque congelado do Exemplo 8 foi riscado em uma placa de ágar de sangue e incubado a 37 °C por 18 horas.

Uma única colônia foi subcultivada em 50 mL de TSB (Difco) contendo 25 µg por mL de 2,2'dipiridila (Sigma). A cultura foi deixada crescer por 12 horas a 37 °C enquanto rodavam a 100 rpm, altura em que foram subcultivadas 1:100 até um volume final de 50 mL de TSB conforme descrito acima.

A cultura foi incubada a 37 °C por 3 horas enquanto rodavam a 200 rpm e deixada atingir uma densidade óptica (540 nm) de 0,6-0,8. A cultura foi então subcultivada um tempo final transferindo 10 mL para 90 mL de TSB preaquecido contendo 25 µg por mL de 2,2'dipiridila (Sigma) e incubada a 37 °C por aproximadamente 4 horas enquanto rodava a 200 rpm até ser atingida uma densidade óptica de 0,92-0,95 a 540 nm.

O crescimento da cultura foi interrompido através da adição de 100 mL de PBS a 4 °C.

A cultura foi então centrifugada a 10,000 x g por 15 minutos a 4 °C para granular as bactérias.

O granulado bacteriano foi lavado uma vez por centrifugação em PBS a 4 ° C.

O granulado final foi novamente suspenso em 100 mL de PBS frio.

Essa cultura foi então diluída 1:2 em PBS frio e usada para o desafio.

Imediatamente antes do desafio, 1 mL da suspensão bacteriana final foi diluída em séries de 10 vezes e plaqueadas em ágar de sangue e ágar de EMB (contendo 100 µg/mL de ácido nalidíxico) para enumerar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por dose de camundongo.

Exemplo 21 Resultados do Desafio

[0202] Após a segunda vacinação, todos os camundongos nos grupos A-I (3 semanas DOI) e M-P (8 semanas DOI) foram subcutaneamente provocados com 0,1 mL a 1,0 x 107 unidades formadoras de colônias (UFC) do isolado APEC-280 virulento para avaliar a eficácia protetora das proteínas recombinantes.

A mortalidade foi registrada diariamente por 10 dias após o desafio.

A Tabela 12 mostra a mortalidade total e a porcentagem de sobrevivência de todos os grupos após o desafio com APEC-280 para o período de observação de 10 dias.

Tabela 12. Mortalidade Total e Porcentagem de "Qualidade de Vida" Após o Desafio Usando APEC-280. Tratamentos Duração Desafio Número de Sobrevivência da Cepa Mortos/ Porcentual

Imunidade Número de (%)

(DOI) Testados

(% de

Mortalidade)

A) Placebo 3 APEC- 15/15 (100) 0

Adjuvado 280

C) Trímero-1 3 APEC- 1/15 (7) 93

150µg 280

D) Trímero-1 3 APEC- 8/14 (57) 43

100µg 280

E) Trímero-1 3 APEC- 12/15 (80) 20

50µg 280

G) Trímero-2 3 APEC- 6/13 (46) 54

150µg 280

H) Trímero-2 3 APEC- 4/15 (27) 73 100µg 280 I) Trímero-2 3 APEC- 6/15 (40) 60 50µg 280 M) Trímero-1 8 APEC- 2/15 (13) 87 150µg 280 N) Trímero-1 8 APEC- 1/14 (7) 93 100µg 280 O) Trímero-1 8 APEC- 11/14 (79) 21 50µg 280 P) Placebo 8 APEC- 14/15 (93) 7 Adjuvado 280

[0203] O Trímero-1 mostrou excelente imunogenicidade (Figura 8) e eficácia contra o desafio sistêmico com o isolado APEC-280 em ambos os períodos de repouso de 3 e 8 semanas após o desafio (Tabela 12, Figuras 5 e 7). O Trímero- 2 também era imunogênico (Figura 8) e mostrou proteção após um período de repouso de 3 semanas após o desafio (Tabela 12, Figura 6); não foi testado após um período de repouso de 8 semanas. Quando o desafio foi administrado 3 semanas após a segunda vacinação, os resultados mostraram proteção estatisticamente significativa sobre os controles de placebo para ambos os Trímero-1 e Trímero-2 em níveis de doses múltiplas; grupos A-I (Tabela 12; Figuras 5 e 6). O Trímero- 1 do grupo C no nível de dose de 150 µg foi altamente eficaz, mostrando uma sobrevivência percentual de 93%, tendo apenas morrido 1 em cada 15 camundongos. O Trímero-1 do grupo E no nível de dose de 50 µg foi o único grupo que não foi estatisticamente significativo, mostrando apenas uma sobrevivência de 20% (Tabela 12; Figura 5). Adicionalmente, a proteção foi diretamente correlacionada com a dose da proteína Trímero-1, conforme ilustrado na Figura 5. Conforme demonstrado, uma resposta de dose bem definida pode ser observada com o Trímero-1: conforme a concentração de antigênio diminuiu de 150 µg para 50 µg, a mortalidade aumentou (Tabela 12 e Figura 5). Por comparação, os camundongos (15 em 15) nos controles de placebo (grupo A) morreram dentro de 48 horas após o desafio (Tabela 12).

[0204] O Trímero-2 também foi eficaz quando desafiado 3 semanas após a segunda vacinação. A Figura 6 mostra a porcentagem de sobrevivência para a vacina recombinante Trímero-2 (grupos G-I). Todas as três doses de Trímero-2 mostraram uma diferença estatisticamente significativa na mortalidade geral em comparação com os controles de placebo.

[0205] A diferença nesses resultados entre o Trímero-1 e o Trímero-2 pode ser devida à chance aleatória ou variação no modelo animal no momento do desafio.

[0206] No presente estudo, foi comparada a duração da imunidade para o Trímero-1 após o desafio em ambos os períodos de repouso de 3 e 8 semanas. A eficácia observada após um período de repouso de 8 semanas foi semelhante à do período de repouso de 3 semanas, com as duas doses principais de 150 e 100 µg atingindo significância estatística (Figura 7). Exemplo 22 Resultados de sorologia

[0207] As Figuras 8A e 8B mostram uma comparação da resposta de anticorpos à vacinação para o Trímero-2 após um período de repouso de 3 semanas e para o Trímero-1 após os períodos de repouso de 3 e 8 semanas.

Os camundongos foram sangrados 24 horas antes do desafio.

A resposta serológica à vacinação foi analisada em soro combinado usando o ELISA do Exemplo 12, com o antigênio da vacina (Trímero-1 ou Trímero-2) revestido na placa.

O Trímero-2 induziu elevados níveis de IgG sérica que eram comparáveis, independentemente da dose (Figura 8A). O trímero-1 também induziu uma resposta de anticorpo à proteína sem um efeito de dosagem claro (Figura 8B). Os resultados mostram um título decrescente a partir dos períodos de repouso de 3 a 8 semanas para cada dose de Trímero-1 administrada; (Figura 8B). Isso é provavelmente devido a um declínio natural ao longo do período de 3 a 8 semanas após a segunda vacinação ter sido administrada.

No entanto; esse declínio no título de anticorpo não se correlacionou com uma diminuição na eficácia; uma vez que não houve diferença estatística na proteção do período de repouso de 3 semanas em comparação com o de 8 semanas nas duas doses ideais administradas (100 µg e 150 µg) (Tabela 12; Figuras 5, 6 e 7). No entanto, esse não foi o caso de camundongos vacinados com o nível de dose de 50 µg, embora houvesse uma resposta de anticorpo comparável à vacinação; a mortalidade aumentou à medida que a dose da vacina diminuiu de 150 µg para 50 µg de proteína total.

A falta de eficácia em camundongos vacinados com o nível de dose de 50 µg indica que a proteção não é completamente dependente de uma resposta de anticorpo, mas também pode ser impulsionada por uma resposta mediada por células.

Exemplo 23 Imunização Mucosal com Trímero-1

[0208] A superfície mucosal é o principal local de infecção de muitas bactérias, incluindo gram-negativas, cujos portais de entrada incluem o trato gastrointestinal, pulmão e trato urinário. Uma resposta imune protetora que inclui a produção de IgA na superfície mucosal pode ser crítica para a concepção de uma vacina eficaz contra esses tipos de infecções. No entanto, a entrega mucosal de antigênios proteicos pode ser desafiadora em termos de proteção do antigênio e melhoria da sua translocação para o tecido linfoide associado à mucosa. Para contornar essas dificuldades, uma variedade de sistemas de entrega e adjuvantes da mucosa foi desenvolvida. Apesar disso, atualmente não há como prever se uma proteína será absorvida e apresentada de maneira a induzir uma forte resposta imune mucosal. Para testar essa capacidade, as vacinas foram administradas por via intranasal usando uma formulação que continha a toxina da cólera (CT), que é um adjuvante conhecido por promover uma resposta imune mucosal.

[0209] Camundongos CBA/J fêmeas (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram recebidos com 5-6 semanas de idade e aclimatizados por 1 semana antes da imunização. Os camundongos foram alojados sob condições de SPF com 5 camundongos por gaiola com comida e água conferidas ad libitum. Três imunizações de 100 µg dadas com duas semanas de diferença foram administradas em um volume total de 20 µL, administradas por via intranasal (IN) a 10 µL/narina (Tabela 13). Os antigênios da vacina foram diluídos em PBS e misturados com toxina da cólera para produzir 2 µg/dose. A ovalbumina, que tem sido usada como um antigênio modelo por muitos pesquisadores e é capaz de induzir uma resposta mucosal, foi incluída como um comparador. O sangue e a urina foram colhidos 2 semanas após a terceira vacinação e avaliados para IgG por ELISA, realizado conforme descrito no Exemplo 12 acima. Um anticorpo IgA anticamundongo de cabra conjugado com HRP, anticorpo secundário específico de cadeia pesada (Jackson Immunoresearch), foi substituído no procedimento de modo a quantificar os níveis de IgA. Tabela 13. Concepção experimental para imunização mucosal com Trímero-1. Anti- Volume gênio(s) Camun- de imuni- dongo Antigênio/dose Vacina zante(s) (N) (µg) Adjuvante (µL) # Vac Via Placebo 5 NA 2 ug CT 20 3 EM Ovalbumina 5 100 2 ug CT 20 3 EM Trímero-1 5 100 2 ug CT 20 3 EM Exemplo 24 Resultados de sorologia

[0210] Os níveis de IgG no soro foram aproximadamente três vezes superiores para a ovalbumina em comparação com o Trímero-1, mas foi observada uma boa resposta contra os dois antigênios (Tabela 14). O nível de IgA sérico produzido contra o Trímero-1 foi comparável ao da ovalbumina. Na urina, o Trímero-1 induziu níveis ligeiramente mais elevados de IgA e níveis comparáveis de IgG. Não foram detectados anticorpos contra ovalbumina ou Trímero-1 no placebo. Os resultados indicam que o Trímero-1 é capaz de induzir uma resposta imune mucosal que é comparável à de um antigênio modelo, tal como a ovalbumina. Tabela 14. IgG e IgA produzidas no soro e na urina em resposta à vacinação intranasal (IN) com Trímero-1. Anti- Título Proteína gênio(s) Dose Adju- IgG IgA alvo em imuni- (ug) vante ELISA Soro Urina Soro Urina zante(s) Placebo NA CT Ovalbumina; ND ND ND ND Trímero-1 Ovalbumi 100 CT Ovalbumina 9,5x104 18 1,2x103 142 na Trímero- 100 CT Trímero-1 3,1x104 14 2,0x103 229 1 ND, não detectado Exemplo 25 Resposta Imune Mucosal e Proteção Contra Infecção do Trato Urinário por Diferentes Formulações do Trímero-1.

[0211] O objetivo desse estudo foi avaliar uma variedade de formulações e regimes de imunização com iniciador-reforço para avaliar o potencial do Trímero-1 para induzir uma resposta imune mucosal e também para proteger contra a infecção do trato urinário (ITU) por E. coli. As formulações adjuvantes usadas para o iniciador (primeira vacinação) e reforço (segunda, terceira e quarta vacinações) são mostradas na Tabela 15. A toxina da cólera (CT) e a toxina lábil mutante dupla (dmLT) são adjuvantes mucosais bem estabelecidos e foram empregues apenas nas vacinas IN. O esqualeno forma uma nanoemulsão de óleo em água e tem sido usado tanto para vacinação mucosal e sistêmica, enquanto o hidróxido de alumínio é normalmente usado apenas para a via sistêmica.

O lipídeo de monofosforila A (MPLA) é um agonista de TLR4 capaz de causar um deslocamento para um tipo Th1 de resposta imune.

Tabela 15. Adjuvantes iniciadores e de reforço usados para testar a indução de uma resposta mucosal e a proteção contra infecções do trato urinário.

Início Reforço

Grupo Adjuvante Via Adjuvante Via

A Nenhum (PBS) IN Nenhum (PBS) IN

C Toxina da Cólera (CT) IN CT IN

E CT + esqualeno (50%) IN CT + esqualeno IN

(50%)

G Toxina lábil mutante dupla IN dmLT IN

(dmLT)

H Hidróxido de alumínio SC CT IN

(20%) (AlOH)

I AlOH + lipídeo de SC CT IN monofosforila A (MPLA)

J Esqualeno SC CT IN

Tabela 16. Concepção Experimental.

Adju- Per- Desafio Volume Camun- Antigênio vante íodo Cepa de Grupo dongo Vacina Total/Dose # Vac de Vacina (N) (µg) Rep- (µL) ouso A PBS Ver a 3 (Place N/A Tabela 20 4 UPEC-25 bo) 15 3 C Trí- 5 100 20 4 UPEC-25 mero-1 3 E Trí- 100 4 20 4 UPEC-25 mero-1 3 G Trí- 100 5 20 4 UPEC-25 mero-1 3 H Trí- 100 4 20 4 UPEC-25 mero-1 3 I Trí- 100 5 20 4 UPEC-25 mero-1 3 J Trí- 100 5 20 4 UPEC-25 mero-1 3

[0212] Camundongos C3H/HeOuJ fêmeas (The Jackson Laboratory) foram recebidos com 5-6 semanas de idade e aclimatizados por 1 semana antes da imunização. Os camundongos foram alojados sob condições de SPF com 5 camundongos por gaiola com comida e água conferidas ad libitum. Os camundongos foram imunizados com 100 µg de Trímero-1 quatro vezes, com duas semanas entre cada uma das três primeiras vacinações e um intervalo de quatro semanas entre a terceira e a quarta vacinações. Todas as vacinas foram formuladas e administradas conforme descrito nas Tabelas 15 e 16. As composições incluíram CT (Sigma, St. Louis, MO) a 2 µg/dose, dmLT (conferido por John Clements, Tulane University, Nova Orleans, LA) a 2 µg/dose, esqualeno (Addavax; InvivoGen, San Diego, CA) preparado de acordo com as recomendações do fabricante a uma concentração final de 50% (v/v), AlOH (Alhydrogel, InvivoGen) a uma concentração final de 20% (v/v) e MPLA (InvivoGen) a 10 µg/dose. As imunizações subcutâneas (SC) foram injetadas em um volume de 100 µL e as imunizações IN foram administradas em um volume de 20 µL (10 µL por narina).

[0213] Os títulos de IgG e IgA foram avaliados por ELISA no soro, urina e fezes duas semanas após a quarta vacinação (Semana 10). O sangue foi processado para o soro e a urina foi coletada por um período de 2-3 dias. Os sedimentos fecais foram suspensos em 150 µL/aglomerado de PBS contendo um coquetel inibidor de proteinase, 1% de albumina de soro de bovino, Tween 20 a 0,05%, glicerol a 50%, azida de sódio a 0,1%. Os grânulos foram processados em vórtice de modo a obter uma pasta homogênea. Os detritos sólidos foram removidos por centrifugação a 12,000 x g por 5 a 10 minutos e o sobrenadante foi retido para testagem. Todas as amostras de soro, urina e fezes foram armazenadas a -20 °C até serem testadas por ELISA (Exemplo 12).

[0214] Os camundongos foram desafiados após um período de repouso de 3 semanas. Em resumo, os camundongos foram anestesiados com cetamina/xilazina, a bexiga foi cateterizada usando tubo de polietileno estéril (tubo de polietileno BD INTRAMEDIC™, diâmetro interno/externo de

0,28/0,61 mm) com 1 polegada de comprimento. Um volume de 20 µL de bactérias foi administrado transuretralmente (TU) usando uma bomba de infusão de seringa a uma taxa de 1 µL por segundo. De forma a aumentar a porcentagem de camundongos naive de controle que desenvolvem infecção crônica da bexiga e rim, o desafio foi administrado em duas doses como uma infecção primária, seguida por superinfecção contendo o mesmo número de UFC, que foi entregue dentro de 1-2 horas da infecção primária.

[0215] 7 dias após a infecção, a bexiga e o rim esquerdo foram colhidos e homogeneizados em 200 µL e 400 µL, respectivamente, de PBS. Diluições de dez vezes dos homogenatos foram semeadas em ágar Levine EMB e incubadas a 37 °C durante a noite. As colônias foram contadas e expressas como a UFC total por bexiga ou rim. Com base no esquema de diluição, o limite de detecção calculado (LOD) foi de 8 UFC para a bexiga e 16 UFC para o rim. Exemplo 26 Preparação do Organismo de Desafio para a ITU

[0216] UPEC-25 é um isolado clínico de E. coli obtido a partir de um paciente com uma infecção do trato urinário. Os estoques congelados de UPEC-25 foram preparados como se segue. O isolado foi plaqueado em ágar de sangue e incubado a 37 °C durante a noite. Uma colônia única foi inoculada em 25 mL de TSB seguida por incubação durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm. No dia seguinte, o organismo foi subcultivado a uma diluição de 1/100 em TSB e incubado a 37 °C com agitação a 250 rpm. O crescimento foi monitorado a cada 1-2 horas usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm. A uma DO de 0,6-0,8, as células foram sedimentadas por centrifugação a 5,000 x g (4 °C) por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o granulado celular foi ressuspenso no volume de cultura original de PBS, seguido por centrifugação a 5,000 x g (4 °C) por 10 minutos. Após a remoção do sobrenadante, o aglomerado foi ressuspenso em um décimo do volume original em TSB contendo 20% de glicerol, distribuído em frascos criogênicos e imediatamente congelado e armazenado a -80 °C.

[0217] A dose de desafio para ITU foi preparada como se segue. No dia 1, uma alíquota de um frasco criogênico foi rapidamente descongelada e misturada por vórtice e um volume de 20 µL foi transferido para 10 mL de caldo de LB em um tubo cônico de 50 mL. A cultura foi incubada sem agitação (isto é, estacionária) a 37 °C por 20-24 horas. No Dia 2, 10 µL da cultura foram subcultivados em 10 mL de caldo de LB e incubados sem agitação, durante a noite a 37 °C. No dia 3, a cultura de 10 mL foi transferida para um balão de 1 L contendo 500 mL de caldo de LB preaquecido, incubada em condições estacionárias a 37 °C e deixada crescer até uma DO de aproximadamente 0,6, o que normalmente ocorria durante um período de 2-3 horas. As células foram colhidas por centrifugação por 10 minutos a 5,000 x g, 4 °C e ressuspensas em um volume apropriado de PBS estéril para atingir a dose de desafio alvo em um volume de 20 µL. A dose de desafio real administrada foi determinada por diluição em série e plaqueamento em ágar de EMB. Exemplo 27 Resultados do Desafio

[0218] Todos os grupos vacinados mostraram proteção contra infecção do trato urinário 7 dias após o desafio com UPEC-25, independentemente do adjuvante ou regime de vacinação (Figura 9A e 9B). A dose de desafio foi de 8,5 x 107 UFC, tanto para a infecção primária quanto para a superinfecção. O nível médio de colonização na bexiga foi reduzido em quase dois logs ou mais e, no grupo E, nenhuma bactéria foi recuperada de dois dos quatro camundongos, indicando que a infecção havia desaparecido. Um dos três camundongos do grupo H também eliminou a infecção. Os resultados nos rins foram paralelos aos da bexiga, sugerindo que o Trímero-1 era capaz de proteger contra cistite bem como pielonefrite usando uma variedade de formulações e regimes de vacinas. Exemplo 28 Resultados de sorologia

[0219] Títulos de IgG e IgA no soro, urina e fezes são mostrados nas Figuras 10A, B e C, respectivamente. O Trímero- 1 induziu IgG no soro para títulos superiores a 1 x 104 em todas as seis formulações de vacinas. A IgA sérica também foi produzida, em níveis mais baixos que eram comparáveis em todos os seis grupos imunizados. Pouca ou nenhuma IgG foi detectada na urina, enquanto a IgA foi detectada em todos os grupos. A IgG fecal foi detectada apenas no grupo I, que foi iniciado com uma mistura de AlOH e MPLA. A IgA fecal foi produzida nos grupos H e I, os quais foram iniciados com uma formulação contendo AlOH. Os resultados reforçam as observações anteriores do Exemplo 24 de que o Trímero-1 é capaz de induzir uma resposta imune mucosal, conforme demonstrado por IgA no soro, urina e fezes. Eles também estendem essa observação para uma variedade de formulações diferentes, algumas das quais são capazes de induzir níveis mensuráveis de IgA e/ou IgG fecal. Exemplo 29 Resposta Imune Aumentada e Proteção Contra Infecção do Trato Urinário com Doses Crescentes de Trímero-1

[0220] Camundongos C3H/HeOuJ foram imunizados com a formulação do grupo E de CT + esqualeno, conforme descrito no Exemplo 25. A formulação da vacina continha qualquer um de 25, 100 ou 200 µg de Trímero-1 por dose (Tabela 17). As vacinas foram administradas IN a 10 µL/narina, com a dose mais elevada de 200 µg administrada em dois ciclos sucessivos de imunização. Os camundongos receberam quatro vacinas, com duas semanas de diferença, com um período de repouso de duas semanas antes do desafio. Sangue, urina e fezes foram coletados após a quarta vacinação, imediatamente antes do desafio. Essas amostras foram processadas individualmente e avaliadas quanto à sorologia, conforme descrito anteriormente no Exemplo 25. Os camundongos foram desafiados com UPEC-25 e processados para UFC na bexiga e rim, conforme descrito nos Exemplos 25 e 26. Tabela 17. Concepção Experimental.

Anti- Per- Cepa Vol- Camun- gênio Via de íodo de Vac- Adju- ume Grupo dongo Total/ # Vac Vacin- de Des- ina vante de (N) Dose ação Rep- afio Vac- (µg) ouso ina (sem- (µL) anas) 2 UPEC A 14 PBS N/A N/A 20 4 EM -25 Trí- CT + 2 UPEC B 12 mero- 25 esqua- 20 4 EM -25 1 leno Trí- CT + 2 UPEC C 12 mero- 100 esqua- 20 4 EM -25 1 leno Trí- CT + 2 UPEC 2 x D 12 mero- 200 esqua- 4 EM -25 20 1 leno Exemplo 30 Resultados do Desafio

[0221] Os camundongos receberam uma dose de desafio de 2,5 x 106 UFC, tanto para a infecção primária quanto para a superinfecção. Sete dias após a infecção, os camundongos vacinados apresentaram colonização reduzida na bexiga (Figura 11A). Todos os três grupos vacinados apresentaram uma fração mitigada positiva, indicando a fração de vacinados que reduziu a UFC em relação ao placebo. Isso foi estatisticamente significativo para a dose de 100 µg. O nível médio de colonização foi reduzido em mais de três logs na bexiga para ambas as doses de 100 µg e 200 µg e a colonização se correlacionou com a dose da vacina. No rim, a vacinação também mitigou a colonização na totalidade dos três grupos, com ambas as doses de 25 µg e 200 µg atingindo significância (Figura 11B). A redução na colonização observada na dose de

100 µg foi maior do que a mostrada no Exemplo 27, substanciando adicionalmente a capacidade protetora do Trímero-1 em um número maior de animais. Exemplo 31 Resultados de sorologia

[0222] Os níveis de IgG no soro e na urina aumentaram paralelamente com a dose imunizante de Trímero-1 (Figura 12A, B). As IgA do soro, urina e fecais mostraram uma tendência semelhante relacionada com a dose, com o nível mais elevado observado para a dose de 200 µg (Figura 12A, B, C). Os níveis de IgG e IgA específicas para antigênio no soro, urina e fezes estavam abaixo do limite de detecção no placebo (dados não mostrados). Esses dados adicionalmente suportam o conceito de que o Trímero-1 induz uma resposta imune mucosal, conforme indicado pela produção de IgA no soro e nas fezes, bem como na urina e, demonstrando que uma resposta mucosal estava presente localmente, no local da infecção. Exemplo 32 Hiperimunização de Novilhos Holstein com Trímero-1 e Preparação de Anticorpo Policlonal

[0223] Quatro novilhos Holstein de 4 meses de idade, identificados por etiquetas nas orelhas, foram divididos em dois grupos iguais, designados como Grupos A (números de etiquetas 141, 38) e Grupo B (números de etiquetas 143, 50). Os novilhos foram vacinados subcutaneamente quatro vezes com intervalos de 21 dias usando o Trímero-1 preparado em dois adjuvantes diferentes: hidróxido de alumínio e ENABL C3 (Vaxliant, Omaha, NE). A vacina do Grupo A foi preparada utilizando 400 µg por dose de proteína total em PBS, formulada com 20 por cento de Rehydragel HPA (General Chemical; Berkeley Heights; Nova Jersey) em um volume injetável final de 2 mL. A suspensão de antigênio/hidróxido de alumínio foi agitada por 24 horas a 4 °C para permitir a máxima adsorção da proteína para o adjuvante.

[0224] A vacina do Grupo B foi preparada usando 400 µg de proteína total por dose em PBS, formulada com 20% de ENABL C3 (Vaxliant Omaha, NE) em um volume injetável final de 2 mL.

[0225] Vinte e um dias após a quarta vacinação, 2,0 litros de sangue de cada novilho foram aglomerados separadamente e deixados coagular a 4 °C por 24 horas. O soro foi separado a partir do sangue total por centrifugação a 3,000 x g por 30 minutos. O soro; aproximadamente 800 mL por amostra foram novamente centrifugados a 10,000 x g por 30 minutos para remover quaisquer detritos celulares contaminantes e depois submetidos a alíquotas em volumes de 25 mL em tubos cônicos estéreis de 50 mL (Fisher Scientific) e congelados a -80 °C até ao uso. Os títulos séricos foram avaliados por ELISA, conforme descrito no Exemplo 12, com o Trímero-1 revestido na placa e usando o conjugado de IgG HRP antibovino de cabra (Jackson Immunoresearch) como o secundário. Cada bezerro respondeu imunologicamente à vacinação, gerando títulos elevados após a quarta vacinação.

[0226] A Figura 13 mostra a resposta imunológica de bezerros (# 38 e # 141) do grupo A a anticorpos IgG específicos para antigênios, conforme analisado por ELISA, demonstrando que o Trímero-1 é imunogênico em bovinos. Os títulos para animais individuais foram determinados antes e após a vacinação. (LOD, limite de detecção). Exemplo 33 Reatividade Cruzada de Anticorpos com Proteínas de Membrana a partir de Klebsiella pneumoniae e Cepas Múltiplas de E. coli

[0227] O soro hiperimunizado do Grupo B produzido contra a proteína Trímero-1 do Exemplo 32 foi usado para avaliar a reatividade cruzada com antigênios associados a membrana de bactérias de diferentes gêneros e espécies. As proteínas de membrana foram derivadas a partir de Klebsiella pneumoniae de origem bovina, E. coli CFT073 de origem humana e um isolado de E. coli patogênico aviário de E. coli designado por APEC-280. Os perfis proteicos da membrana externa foram examinados por SDS-PAGE. Resumidamente, cada um dos isolados a serem examinados foi inoculado em TSB contendo 300 μM de 2,2-dipiridila e incubado a 37 °C. Após incubação por 12 horas, as culturas foram subcultivadas (1:100) em 500 mL do mesmo meio e incubadas a 37 °C. Após 8 horas, cada cultura foi centrifugada a 10,000 x g por 20 minutos, ressuspensa em 40 mL de tampão de choque osmótico (7,3 g/L de Tris Base; 1,86 g/L de EDTA, pH 8,9) e interrompida por sonicação, para render uma suspensão. As suspensões foram centrifugadas a 32,000 x g por 12 minutos de modo a clarificar ou a remover os detritos celulares grandes. Os sobrenadantes foram coletados e solubilizados pela adição de lauroilsarcosinato de sódio a 4% a 4 °C por 24 horas. As frações enriquecidas com proteínas da membrana externa foram coletadas por centrifugação a 32,000 x g por 2,5 horas a 4 °C. Os aglomerados de proteína foram ressuspensos em 200 μL de tampão Tris (pH 7,2).

[0228] Os extratos purificados de cada isolado foram submetidos a electroforese seguida por análise por Western blot usando o soro hiperimunizado de Trímero-1 do grupo B (conforme descrito no Exemplo 32). Em resumo, as preparações da membrana externa foram fracionadas por tamanho em um gel SDS-PAGE usando um gel de empilhamento de 4% e gel de resolução de 7,5%. Uma amostra de 10 μL da fração da membrana externa foi combinada com 10 µL de tampão de amostra redutora de SDS (Tris-HCL a 62,5 mM, pH 6,8, glicerol a 20%, SDS a 2%, β-mercaptoetanol a 5%) e fervida por 4 minutos. As amostras foram submetidas a eletroforese a 18 mA de corrente constante por 5 horas a 4 °C, usando uma célula Protein II xi e fonte de alimentação modelo 1000/500 (BioRad Laboratories, Richmond, CA). A Figura 14A mostra os perfis de proteínas eletroforéticas da membrana externa para cada isolado examinado (linha 1 - Marcador de Peso Molecular, linha 2 - em branco, linha 3-Klebsiella pneumoniae, linha 4 - E. coli APEC 280, linha 5 - E. coli CFT073 e linha 6 - em branco).

[0229] A análise por Western blot revelou que os antissoros positivos para Trímero-1 reagiram contra várias proteínas associadas à membrana de Klebsiella pneumoniae (linha 3), E. coli APEC-280 (linha 4) e E. coli CFT073 (linha 5) (Figura 14B). Esses resultados sugerem que o anticorpo produzido em resposta à proteína Trímero-1 reage de maneira cruzada com proteínas de diferentes gêneros e espécies de bactérias gram-negativas.

Exemplo 34 A eficácia do Trímero-1 como Agente Terapêutico Contra uma Infecção Existente por E. coli Virulenta em um Modelo de ITU de Camundongo

[0230] A eficácia terapêutica do Trímero-1 recombinante foi avaliada usando um desafio de E. coli virulenta viva com UPEC-25 em camundongos, com a colonização da bexiga e do rim como ponto final. Os parâmetros de saída usados para avaliar a eficácia da vacina contra o UPEC-25 foram 1) nível de colonização na bexiga e no rim 14 dias após a infecção e 2) correlação dos títulos de anticorpos com a sobrevivência.

[0231] Resumidamente, 30 camundongos C3H/HeOuJ fêmeas obtidos a partir do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) com 5-6 semanas de idade foram igualmente divididos em 2 grupos de tratamento (n = 15 camundongos/grupo) designados como indicado (Tabela 18). Os camundongos foram vacinados cinco vezes em intervalos de 1 a 3 dias após serem desafiados com UPEC-25 no dia 0. Os camundongos foram alojados em gaiolas de policarbonato (Ancore Corporation, Bellmore, NI) com 5 camundongos por gaiola com comida e água conferidas ad libitum. Todos os camundongos foram deixados a se aclimatar uma semana antes da primeira vacinação. Tabela 18. Concepção Experimental.

Anti- Volume Via de Camun- Vac- gênio Adju- de Desafio Grupo # Vac Vacin- dongos ina Total vante Vacina Cepa ação (µg) (uL) A 15 PBS N/A AlOH+dmLT 100 1 SC UPEC-25 esqualeno 20 4 IN +dmLT Trím AlOH+dmLT 100 1 SC B 15 ero- 100 esqualeno UPEC-25 20 4 IN 1 +dmLT Exemplo 35 Preparação de Vacinas e Vacinação

[0232] As vacinas continham Trímero-1 ou placebo apenas adjuvante. O Trimero-1 foi usado para determinar a duração da imunidade terapêutica (DOI) a 2 semanas após a infecção inicial. As vacinas foram preparadas combinando 100 µg de Trímero-1 em PBS salino tamponado com fosfato, formulado com 2 µg de toxina lábil ao calor mutante dupla (dmLT) por dose, em um volume final quer de 0,1 mL (para imunização primária SC, incluindo 20% [v/v] Alhydrogel [Invivogen, San Diego, CA]) ou 0,02 mL (para imunização IN, incluindo 50 por cento [v/v] de esqualeno [Addavax, Invivogen, San Diego, CA]) (Tabela 18). As vacinas de placebo foram preparadas substituindo PBS pela suspensão aquosa de proteínas conforme descrito no procedimento acima. Os camundongos foram vacinados cinco vezes no total. A primeira vacinação foi uma vacinação dupla no dia 1 após o desafio, durante a qual cada camundongo recebeu uma vacinação subcutânea e uma vacinação intranasal no mesmo dia. Posteriormente, os camundongos receberam apenas uma única imunização intranasal por dia, começando no dia 4 e repetindo a intervalos de 1 dia por três dias no total (ou seja, nos dias 4, 5 e 6). O sangue foi coletado a partir de ambos os grupos no dia anterior ao desafio e 10 dias após o desafio.

Exemplo 36 Preparação de Organismo de Desafio

[0233] UPEC-25 é um isolado clínico de E. coli obtido a partir de um paciente com uma infecção do trato urinário. O estoque congelado e a cultura de desafio de UPEC-25 foram preparados conforme descrito anteriormente no Exemplo 26. Exemplo 37 Resultados do Desafio

[0234] Todos os camundongos nos grupos A-B foram desafiados transuretralmente com 0,02 mL contendo 1,4 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC) do isoladoUPEC-25 virulento conforme descrito no Exemplo 25, de modo a avaliar a eficácia protetora da vacina com Trímero-1. A colonização da bexiga e do rim foi avaliada sacrificando camundongos 2 semanas após a infecção e enumerando bactérias no tecido, plaqueando homogenatos de tecido em meio seletivo.

[0235] O Trímero-1 mostrou excelente eficácia e imunogenicidade na redução da colonização após desafio transuretral com isolado UPEC-25 a 2 semanas após o desafio. A redução na colonização da bexiga (Figura 15A) e do rim (Figura 15B) no grupo B (imunização com Trímero-1) foi significativa pela fração mitigada em comparação com o grupo A (placebo). Esses dados indicam que a imunização com Trímero-1 de um animal com uma infecção do trato urinário preexistente pode reduzir significativamente a colonização bacteriana tanto na bexiga como no rim dos animais infectados. Exemplo 38 Resultados de sorologia

[0236] As Figuras 16A-B mostram a resposta do anticorpo à vacinação com Trímero-1 para as subclasses de IgG1 e 2a séricas (painel A) e IgA no soro e IgA secretora na urina (painel B). Os camundongos foram sangrados 24 horas antes do desafio e os títulos no soro pré-imune estavam na linha de base, semelhante aos títulos de placebo mostrados no painel. Sangue e urina também foram coletados no Dia 11, para os quais são mostrados os resultados. A resposta serológica à vacinação foi analisada em amostra de soro individual e de urina usando o método ELISA do Exemplo 12, com o antigênio da vacina (Trímero-1) revestido na placa. O Trímero-1 induziu uma resposta de anticorpo à proteína, incluindo a produção de IgG1, IgG2a e IgA no soro (painéis A e B) e IgA secretora (painel B) na urina. Alguns dos camundongos placebo mostraram produção de IgA secretora para Trímero-1 na urina, em resposta à infecção (painel B). Exemplo 39 Síntese, Clonagem, Expressão e Purificação de Trímero- 3, Trímero-4 e Monômero-1

[0237] As sequências de codificação e polipeptídeo de ADN para Trímero-3 (SEQ ID NO: 25 e 26), Trímero-4 (SEQ ID NO: 27 e 28) e Monômero-1 (SEQ ID NO: 29 e 30) foram sintetizadas e clonadas conforme descrito no Exemplo 3. O Trímero-3 foi criado ao substituir os domínios de células B do Trímero-1 pelos do Trímero-2, produzindo um polipeptídeo com os domínios de células B do Trímero-2 e os domínios de células T do Trímero-1. Da mesma forma, o Trímero-4 foi criado ao substituir os domínios de células B do Trímero-2 pelos do Trímero-1. Um construto adicional, Monômero-1, consistia no módulo II (SEQ ID NO: 4) com um marcador His anexado aos terminais N e ligantes GSGS entre os domínios das células B e T (SEQ ID NO: 29 e 30). Os polipeptídeos recombinantes Trímero-3, Trímero-4 e Monômero-1 foram expressos e purificados conforme descrito no Exemplo 4. Exemplo 40 Imunogenicidade Comparativa do Trímero-1, Trímero-2, Trímero-3, Trímero-4 e Monômero-1

[0238] Um objetivo principal do presente estudo foi determinar se a troca dos domínios das células B entre o Trímero-1 e o Trímero-2 geraria polipeptídeos (Trímero-3 e Trímero-4) capazes de induzir uma resposta imune. Um segundo objetivo era determinar se um único módulo de MoLE (Monômero- 1) seria imunogênico.

[0239] Camundongos CBA/J fêmeas foram adquiridos e alojados conforme descrito no Exemplo 25. Os camundongos foram distribuídos em grupos e uma amostra de sangue foi colhida antes da imunização. A imunização primária consistiu em uma dose de 100 µg de antigênio formulada em AlOH a 20% mais 2 µg de dmLT e administrada SC (Tabela 19). Três semanas depois, os camundongos foram reforçados com uma dose de 50 µg de antigênio formulada em esqualeno a 50% mais 2 µg de dmLT e administrados IN. Duas semanas após o reforço, foi obtida uma amostra de sangue e o nível de IgG sérica contra o antigênio imunizante foi determinado por ELISA (Exemplo 12). Tabela 19. Concepção Experimental Camun- Anti- Anti- Adju- Via de Volume Grupo # Vac dongos gênio gênio vante Vacinação de

(N) imuni- Total/ Vacina zante Dose (µL) (µg) AlOH + 100 SC 1 100 dmLT B 4 Trímero-1 esqualeno 50 IN 1 20 + dmLT AlOH + 100 SC 1 100 dmLT C 3 Trímero-2 esqualeno 50 IN 1 20 + dmLT AlOH + 100 SC 1 100 Monômero- dmLT D 4 1 esqualeno 50 IN 1 20 + dmLT AlOH + 100 SC 1 100 dmLT E 4 Trímero-3 esqualeno 50 IN 1 20 + dmLT AlOH + 100 SC 1 100 dmLT F 4 Trímero-4 esqualeno 50 IN 1 20 + dmLT Exemplo 41 Resultados de sorologia

[0240] A imunização com títulos de anticorpos IgG induzidos por Trímero-3 ou Trímero-4 foi equivalente aos produzidos por Trímero-1 ou Trímero-2 (Figura 17). Isso indica que a imunogenicidade dos domínios das células B e a provisão de ajuda das células T foram suficientes, independentemente de quais os domínios das células B e T que foram codificados dentro dos trímeros. A resposta do anticorpo ao Monômero-1 foi ligeiramente reduzida, mas não significativamente reduzida, em comparação com os trímeros e, em particular, com o Trímero-2, que contém os mesmos domínios de células B que o Monômero-1. Uma resposta reduzida ao Monômero-1 não é inesperada, considerando que o Monômero- 1 tem um terço do tamanho do Trímero-2 e proteínas menores tendem a ser menos imunogênicas. No entanto, esses dados indicam que os domínios B e T permanecem altamente imunogênicos em diferentes combinações dentro da configuração do trímero e também quando administrados em uma forma, menor, de monômero. Exemplo 42 Efeito do adjuvante, via e Calendário na Sorologia, Respostas das células T e Proteção contra ITU

[0241] Camundongos C3H/HeOuJ fêmeas foram adquiridos e alojados conforme descrito no Exemplo 25. Dos 15 camundongos por grupo, 3 foram terminados 1 dia antes do desafio e usados para estudos de células T, enquanto os 12 restantes foram desafiados para determinar a eficácia da vacina. Os camundongos nos Grupos B, C e E foram imunizados com 100 µg de Trímero-1 formulado com o adjuvante de acordo com as vias descritas na Tabela 20. Os camundongos imunizados foram avaliados em paralelo com os camundongos naive como um controle negativo (Grupo A). Os camundongos nos grupos B e C receberam um total de quatro vacinas com duas semanas de diferença com um repouso de duas semanas. O grupo E foi vacinado duas vezes, com quatro semanas de diferença, com um repouso de quatro semanas. Sangue e urina foram coletados após a última vacinação, mesmo antes do desafio. As amostras foram processadas individualmente (Exemplo 23) e avaliadas por ELISA conforme descrito no Exemplo 12, com várias modificações. As IgA sérica e de urina foram medidas usando um conjugado HRP específico para IgA de cadeia pesada e as amostras foram testadas em uma única diluição (1:100 para soro e 1:10 para urina) e foram diretamente reportadas como densidade óptica (DO). Os camundongos foram desafiados com UPEC-25 e processados para UFC na bexiga e rim 14 dias após a infecção usando a metodologia descrita nos Exemplos 25 e

26.

[0242] Os camundongos usados para estudos de células T foram submetidos a eutanásia e os seus baços foram removidos e processados para lise dos glóbulos vermelhos. Os linfócitos do baço (1 x 106 células em 0,2 mL de RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10%) foram cultivados com 12,5 µg de antigênio por 48 horas e a liberação de citocinas em sobrenadantes de células foi medido de acordo com o protocolo do fabricante (BD Cytometric Bead Array (CBA), BD Biosciences, San Jose, CA). Para coloração de citocina intracelular (ICS), os esplenócitos foram cultivados a 2 x 106 células/poço e foram estimuladas com antigênio por 6 horas. O antigênio consistia em 12,5 µg de Trímero-1 para CBA e ICS e também uma mistura dos domínios de células T correspondentes do Trímero-1 para CBA. O transporte foi bloqueado pela adição de brefeldina (GolgiPlug) por 2 horas, após o que foi realizada a fixação/permeabilização e coloração celular de acordo com o protocolo do fabricante (BD Biosciences, San Jose, CA). As células foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCanto, BD Biosciences, San Jose, CA) com uma estratégia de exclusão para excluir as células B220/CD45r+, CD11c+ e CD11b+ e determinar a porcentagem de CD3+CD4+CD44+ específico para antigênio e Células de memória T CD3+CD8+CD44+ produzindo TNFα e IFNγ.

Tanto para CBA como para ICS, os esplenócitos não estimulados serviram como controle negativo e esses valores foram subtraídos para calcular a resposta líquida ao antigênio.

Tabela 20. Concepção Experimental

Per-

Anti- Vol- íodo Cepa Camun- gênio ume de Via de de Gru- Vac- Adju- # de dongo Total/ Vac- Vacin- Rep- po ina vante Vac Des- (N) Dose ina ação ouso afio (µg) (µL) (sem-

anas)

Nen- UPEC- A 15 N/A N/A N/A 0 N/A N/A hum 25

Esqua- Trí- UPEC- B 15 100 leno + 20 4 IN 2 mero-1 25 dmLT

AlOH + 50 1 ID dmLT Trí- UPEC- C 15 100 Esqua- 2 mero-1 25 leno + 20 3 IN dmLT

Trí- AlOH + UPEC- E 15 100 50 2 ID 4 mero-1 dmLT 25 Exemplo 43 Resultados do Desafio

[0243] Os camundongos receberam uma dose de desafio de 1,8 x 106 UFC, tanto para a infecção primária quanto para a superinfecção. 14 dias após a infecção, os Grupos B e C, que foram imunizados pela via mucosal IN e adjuvados em esqualeno + dmLT, tanto para o iniciador quanto para o reforço (grupo B) ou somente para o reforço (grupo C), mostraram eficácia superior em termos da fração mitigada e evitada em comparação com uma vacinação estritamente parenteral com ID adjuvante em AlOH + dmLT (Grupo E) (Figura 18). Essa tendência foi a mesma para a colonização da bexiga e do rim. O nível médio de colonização na bexiga e no rim foi reduzido em mais de 3 logs na bexiga e 2 logs no rim para os Grupos B e C, com ambos os grupos se registrando no LOD ou abaixo do mesmo. Esses dados conferem evidências de que o uso de uma via de vacinação mucosal pode melhorar a eficácia de uma vacina UTI. Adicionalmente também suportam a eficácia protetora do Trímero-1 como antigênio de vacina, conforme demonstrado nos Exemplos 27 e 30, de modo a prevenir ITU nesse modelo clínico relevante. Exemplo 44 Resultados de sorologia

[0244] Os títulos de IgG1 foram significativamente mais baixos no Grupo A em comparação com o Grupo E, mas os títulos médios de IgG2a foram equivalentes, sugerindo que a troca de classe ocorreu em resposta à vacinação por cada um dos regimes de vacina usados nos Grupos B, C e E (Figura 19). A razão de IgG1 para IgG2a indicou que os regimes dos Grupos B e C induziram um tipo TH1 de resposta mais polarizada do que o regime do Grupo E. Diferenças na indução de IgA sérica também foram aparentes, com o Grupo C mostrando a resposta mais elevada, possivelmente devido à entrega melhorada ou imunogenicidade do iniciador ID, seguida por três imunizações IN mucosais. Também foi evidente o aumento da IgA sérica nos Grupos B e C protegidos, imunizados por mucosa, em relação à imunização parenteral no Grupo E. A associação da imunidade mucosal com a eficácia da vacina foi adicionalmente suportada pelos níveis de IgG e IgA na urina, onde a IgG é derivada a partir dos níveis circulantes no soro e foi mais elevada no Grupo E, mas a IgA é mais provável que seja produzida localmente, devido às vias de comunicação celular que conectam a exposição IN ao antigênio com uma resposta imune localizada no trato geniturinário (Grupos B e C). No geral, os dados sorológicos indicam que as vacinas Trímero-1 mais eficazes (Grupos B e C) corresponderam à administração mucosal iniciando uma resposta imune polarizada TH1 e produção de IgA secretora na urina. Desse modo, a capacidade para administrar Trímero-1 e outros MoLEs por via mucosal parece ser vantajosa para iniciar uma resposta imune eficaz no portal de entrada. Exemplo 45 Resultados para o Desenvolvimento de Células T Responsivas a Antigênio

[0245] A indução de células T responsivas ao antigênio foi avaliada como um indicador potencial da eficácia da vacina.

A liberação de TNFα, IL-2, IFNγ e IL-17A mostrou diferenças distintas entre os três grupos vacinados (Figura 20). Os esplenócitos foram estimulados com Trímero-1 (o antigênio da vacina) ou uma mistura de peptídeos consistindo nos domínios de células T usados no Trímero-1. Em geral, as respostas ao Trímero-1 intacto foram mais elevadas, mas foram refletidas pela resposta aos peptídeos, estabelecendo que os domínios das células T usados para construir o Trímero-1 eram antigênicos e estavam envolvidos na resposta das células T ao Trímero-1. As respostas mais fortes foram observadas para o regime do Grupo B, o qual correspondeu ao maior nível de proteção no estudo de desafio, enquanto as respostas e proteção mais fracas das células T foram observadas no Grupo E (Exemplo 43). TNFα e IL-2 são pró-inflamatórios e estimulam a proliferação de linfócitos, respectivamente.

IFNγ e IL-17 promovem o desenvolvimento de uma resposta TH1 e imunidade mucosal, respectivamente, o que corresponde ao viés de TH1 e à produção de IgA secretora mostrada no Exemplo 44. O fornecimento de auxílio de células T e respostas de células T efetoras através da produção de citocinas está bem estabelecido como um mecanismo de proteção contra a infecção.

Os resultados mostram que o Trímero-1, administrado por via mucosal com um adjuvante apropriado, é capaz de induzir respostas significativas de células T específicas do antigênio que estão associadas com a sua eficácia como antigênio de vacina.

Exemplo 46 Resultados para Indução de Células de Memória T

[0246] A indução de células de memória T é essencial para que uma vacina induza imunidade adaptativa durável e de longo prazo. Em camundongos, CD44 é um marcador de superfície celular para células de memória T e foi usado para quantificar o nível de células T específicas de antigênio que foram induzidas pelo Trímero-1 dentro dos subconjuntos CD4 e CD8 (Figura 21). O regime de vacina do Grupo B induziu a porcentagem mais elevada de células de memória T nos subconjuntos CD4+ TNFα+, CD4+ IFNγ+ e CD8+ IFNγ+ e, com a única exceção das células T CD4+ IFNγ+ no Grupo E, esse foi o único grupo a mostrar níveis significativos de células de memória T em comparação com o controle naive (Grupo A) e outros grupos de vacinas (C e E). Adicionalmente, esses dados estabelecem a importância do regime de vacinas e, em particular, a eficácia melhorada que pode ser obtida quando o antigênio da vacina, tal como o Trímero-1, é capaz de provocar uma resposta imune mucosal. Exemplo 47 A Resposta Sorológica à Vacinação de Trímero-1 em Perus

[0247] Essa experiência avaliou a resposta sorológica à vacinação em perus vacinados com Trímero-1. Resumidamente, sessenta (N = 60) aves de capoeira de peru Nicholas com 1 dia de idade (crias obtidas da Select Genetics, Willmar MN) foram colocadas em uma instalação de isolamento, levedadas e criadas até quatro semanas de idade. Os perus foram vacinados duas vezes em intervalos de 21 dias e no dia 42 (21 dias após a segunda vacinação) foi retirado sangue de todas as aves de forma a avaliar a resposta de anticorpos ao Trímero-1.

Exemplo 48 Preparação da Vacina do Trímero-1

[0248] A vacina contendo a proteína Trímero-1 recombinante foi preparada com 100 µg e 500 µg por dose de proteína total em PBS formulada com Rehydragel HPA a 25%; (General Chemical; Berkeley Heights; Nova Jersey) em um volume injetável final de 0,5 mL. A suspensão de antigênio/hidróxido de alumínio foi agitada por 24 horas a 4 °C para permitir a máxima adsorção da proteína para o adjuvante. A vacina de placebo foi preparada conforme descrito acima em PBS menos o antigênio na suspensão aquosa da formulação final. A formulação final da vacina foi plaqueada em ágar de sangue para determinar a esterilidade da vacina antes do uso. Tabela 21. Concepção Experimental.

Antigênio Volume Número Via de Gru- Adju- Peru Vacina Total de de Vacin- po vante (µg) Vacina Vacinas ação A 20 Placebo N/A AlOH 0,5 mL 2 SC B 20 Trímero-1 100 AlOH 0,5 mL 2 SC C 20 Trímero-1 500 AlOH 0,5 mL 2 SC Exemplo 49 Vacinação

[0249] Às 4 semanas de idade, todas as aves foram marcadas com bandas numeradas nas asas e alocadas aleatoriamente em três grupos iguais (20 aves por grupo) designados como Grupos A a C. Os perus do Grupo A foram vacinados com placebo, enquanto as aves dos Grupos B e C receberam as vacinas Trímero-1 a 100 µg e 500 µg, respectivamente. Todas as aves foram vacinadas por via subcutânea na região inferior do pescoço duas vezes em intervalos de 21 dias. O sangue foi coletado de todas as aves na primeira vacinação (pré-imune) e novamente aos 21 dias após a primeira vacinação. O soro foi coletado a partir do sangue coagulado e armazenado a - 80 °C. Exemplo 50 Resultados de sorologia

[0250] A resposta sorológica à vacinação foi analisada em soro aglomerado por ELISA com o antigênio de vacina (Trímero- 1) revestido na placa e calculado como o título geométrico médio. A Figura 22 mostra uma comparação da resposta do anticorpo à vacinação no Placebo, Trímero-1 a (100 µg) e (500 µg). Os resultados mostram a resposta sorológica à vacinação 42 dias após a primeira vacinação. As vacinas de Trímero-1 nos regimes de dose de 100 µg e 500 µg induziram anticorpo de IgG, embora não houvesse diferença na resposta do anticorpo entre as duas doses diferentes de vacina dadas. Exemplo 51 A Resposta Sorológica à Vacinação com Trímero-1 em Frangos

[0251] Esse estudo avaliou a resposta sorológica da vacinação de Trímero-1 em frangos. Resumidamente, vinte (N = 20) frangos Leghorn livres de patógenos específicos foram obtidas a partir da Valo BioMedia, (Adel, IA) e criados até 7 semanas de idade antes do início do estudo. Os frangos foram marcados com bandas numeradas de asas, distribuídos aleatoriamente em dois grupos iguais (10 aves por grupo), designados como Grupos A e B e misturados durante todo o período do estudo. Os frangos foram vacinados duas vezes no dia 21 e no dia 42 (21 dias após a segunda vacinação) foi retirado sangue de todas as aves. Exemplo 52 Preparação de Vacinas e Vacinação

[0252] A vacina contendo a proteína Trímero-1 recombinante foi preparada com 200 µg de proteína total por dose em PBS. A suspensão aquosa de Trímero-1 foi formulada em uma emulsão de água em óleo. A composição da vacina foi: 44,44% de suspensão de antigênio em PBS, 50% de óleo mineral branco, 3% de Span85 e 2,56% de Tween85 para dar uma dose de 200 µg de proteína total em um volume injetável de 0,5 mL. A vacina de placebo foi preparada substituindo PBS pela suspensão aquosa de proteína da formulação descrita acima. Os frangos do grupo A foram vacinadas com a vacina de placebo, enquanto as do grupo B receberam a vacina de Trímero-1 adjuvado com óleo. As aves foram vacinadas por via subcutânea na região inferior do pescoço duas vezes em intervalos de 21 dias. O sangue foi coletado de todas as aves na primeira vacinação (pré-imune), 14 dias após a primeira vacinação e novamente aos 21 dias após a primeira vacinação ou no momento do desafio. O soro foi coletado a partir do sangue coagulado e dividido em dois conjuntos de amostras duplicados e armazenado a -80 °C. Tabela 22. Concepção Experimental.

Anti- Volume Número Via de Fran- gênio Adju- Grupo Vac-ina de de Vacin- go Total vante Vacina Vacinas ação (µg)

Emulsão A 10 Placebo N/A 0,5 mL 2 SC de Óleo Trímero- Emulsão B 200 0,5 mL 2 SC 10 1 de Óleo Exemplo 53 Resultados de sorologia

[0253] A Figura 23 mostra a resposta sorológica à vacinação usando o Trímero-1 como a proteína de captura em um ELISA (linha 1, pré-imune; linha 2, placebo 14 dias; linha 3, placebo 28 dias; linha 4, Trímero-1 14 dias; e linha 5, Trímero-1 28 dias). A proteína Trímero-1 induziu uma resposta imune à vacinação em contraste com os controles de placebo.

[0254] A divulgação completa de todas as patentes, pedidos de patente e publicações e material disponível eletronicamente (incluindo, por exemplo, submissões de sequências nucleotídicas em, por exemplo, GenBank e RefSeq e submissões de sequências de aminoácidos em, por exemplo, SwissProt, PIR, PRF, PDB e as traduções das regiões codificadoras anotadas no GenBank e RefSeq) citadas no presente documento são incorporadas por referência na sua totalidade. Materiais suplementares referenciados em publicações (tais como tabelas suplementares, figuras suplementares, materiais e métodos suplementares e/ou dados experimentais suplementares) são incorporados, do mesmo modo, por referência na sua totalidade. No caso de existir alguma inconsistência entre a divulgação do presente pedido e a(s) divulgação(ões) de qualquer documento incorporado no presente documento por referência, a divulgação do presente pedido prevalecerá. A descrição detalhada e os exemplos anteriores foram conferidos apenas para maior clareza de entendimento. Nenhuma limitação desnecessária deve ser entendida a partir dos mesmos. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, pois estarão incluídas variações óbvias para um perito na técnica na invenção definida pelas reivindicações.

[0255] A não ser que indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de componentes, pesos moleculares e assim por diante, usadas na especificação e nas reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, a não ser que indicado de outro modo contrário, os parâmetros numéricos apresentados na especificação e nas reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se busca obter pela presente invenção. Pelo menos, e não como uma tentativa de limitar a doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser pelo menos interpretado à luz dos diversos dígitos significativos relatados e através da aplicação de técnicas de arredondamento comuns.

[0256] Embora as escalas e parâmetros numéricos que apresentam o escopo amplo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são relatados o mais precisamente possível. Todos os valores numéricos, no entanto, contêm uma gama necessariamente resultante do desvio padrão encontrado nas suas respectivas medições de teste.

[0257] Todos os títulos são para a conveniência do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue o título, a menos que especificado.

Claims (41)

Reivindicações

1. Proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, caracterizada pelo fato de que a proteína protege um animal contra a infecção por E. coli.

2. Proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, caracterizada pelo fato de que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli.

3. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína adicionalmente compreende duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

4. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende pelo menos três cópias da sequência de aminoácidos, em que as três ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

5. Proteína não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, caracterizada pelo fato de que a proteína reage com soro convalescente a partir de um animal infectado com E. coli.

6. Proteína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína adicionalmente compreende duas ou mais cópias da sequência de aminoácidos, em que as duas ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

7. Proteína, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende pelo menos três cópias da sequência de aminoácidos, em que as três ou mais cópias estão presentes como uma repetição em tandem.

8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizada pelo fato de que a proteína inclui um ligante presente em um resíduo X.

9. Proteína, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína inclui um ligante presente em cada resíduo X.

10. Proteína, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante compreende a sequência de aminoácidos GSGS (SEQ ID NO:23).

11. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.

12. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de células B selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20 e um domínio de células T selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.

13. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12, caracterizada pelo fato de que o domínio de células B e o domínio de células T estão presentes na ordem domínio células B - domínio células T.

14. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende os aminoácidos 7-518 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou os aminoácidos 7-365 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

15. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende os aminoácidos 7-422 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou os aminoácidos 7-461 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

16. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir da proteína 1-9 da Tabela 1, proteína 10-15 da Tabela 2, proteína 16-51 da Tabela 3, proteína 52-63 da Tabela 4, proteína 64-69 da Tabela 5, proteína 70-78 da Tabela 6, proteína 79-90 da Tabela 7, ou proteína 91-126 da Tabela 8, ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da proteína 1-9 da Tabela 1, proteína 10-15 da Tabela 2, proteína 16-51 da Tabela 3, proteína 52-63 da Tabela 4, proteína 64-69 da Tabela 5, proteína 70-78 da Tabela 6, proteína 79-90 da Tabela 7, ou proteína 91-126 da Tabela 8.

17. Proteína, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a proteína adicionalmente compreende um ligante localizado entre um domínio de células B e um domínio de células T.

18. Proteína, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a proteína adicionalmente compreende um ligante localizado entre cada domínio de células B e domínio de células T.

19. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO:1, um segundo domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-48 de SEQ ID NO:1, um terceiro domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 49-88 de SEQ ID NO:1, e um quarto domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 89-103 de SEQ ID NO:1, um quinto domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 104- 133 de SEQ ID NO:1, e um sexto domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 34-148 de SEQ ID NO:1, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo, quarto e sexto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções com E. coli.

20. Proteína não natural caracterizada pelo fato de que compreende:

um primeiro domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:2, um segundo domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 24-38 de SEQ ID NO:2, um terceiro domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 39-75 de SEQ ID NO:2, e um quarto domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 76-90 de SEQ ID NO:2, e um quinto domínio compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com os aminoácidos 91-101 de SEQ ID NO:2, em que o primeiro, terceiro e quinto domínios têm atividade de células B e o segundo e quarto domínios têm atividade de células T e em que a proteína protege um animal contra infecções com E. coli.

21. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19 e 20, caracterizada pelo fato de que o animal é uma ave, um bovino, um caprino, um ovino, um porcino, um bisonte, um equino, um animal de companhia, um membro da família Cervidae, ou um ser humano.

22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 19 e 20, caracterizada pelo fato de que a E. coli é CFT073.

23. Composição caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um adjuvante.

26. Método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um sujeito uma quantidade da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 e 25, eficaz para induzir o sujeito a produzir anticorpo que se liga especificamente à proteína, produzir células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas direcionadas para um epítopo de uma proteína presente na composição, ou uma combinação das mesmas.

27. Método para tratar uma infecção em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 e 25, a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

28. Método para tratar um sintoma em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 e 25, a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo.

29. Método para diminuir a colonização em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 e 25, a um sujeito colonizado por um micróbio gram-negativo.

30. Método para tratar uma condição em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 e 25, a um sujeito com necessidade da mesma, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram-negativo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico que é um membro da família Vibrionaceae, um membro da família Enterobacteriaceae, um membro da família Pasteurellaceae, um membro da família Pseudomonadaceae ou uma Campylobacter spp.

32. Método para tratar uma infecção em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23 e 24.

33. Método para tratar um sintoma em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende:

administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito tendo ou em risco de ter uma infecção causada por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23 e 24.

34. Método para diminuir a colonização em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito colonizado por um micróbio gram-negativo, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23 e 24.

35. Método para tratar uma condição em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um sujeito em necessidade da mesma, em que a composição compreende anticorpo que se liga especificamente a uma proteína da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23 e 24, em que o sujeito tem ou está em risco de ter uma condição causada por um micróbio gram- negativo.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o micróbio gram-negativo é um micróbio patogênico que é um membro da família Vibrionaceae, um membro da família Enterobacteriaceae, um membro da família Pasteurellaceae, um membro da família Pseudomonadaceae ou uma Campylobacter spp.

37. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero ou uma ave.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano ou um bovino.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a ave é uma ave domesticada.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a ave domesticada é um frango ou um peru.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 e 36, caracterizado pelo fato de que o membro da família Enterobacteriaceae é E. coli ou Klebsiella spp.