ES2754374T3 - Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección de IgG anti-Mycoplasma Hyorhinis en suero porcino - Google Patents

Abstract

Polipéptido p37 de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) purificado, recombinante, de origen no natural, no modificado post-traducción, que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 98% con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5; en el que el polipéptido es útil para la detección selectiva de anticuerpos contra M. hyorhinis.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección de IgG anti-Mycoplasma Hyorhinis en suero porcino

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/088.417 presentada el 5 de diciembre de 2014.

Antecedentes de la invención

Mycoplasma hyorhinis es un importante patógeno de la especie porcina que a menudo puede aparecer como coinfección respiratoria con patógenos virales 23, pero también se ha demostrado que causa la artritis y poliserositis en animales infectados. El impacto económico de la enfermedad asociada con M. hyorhinis en la industria porcina de Estados Unidos no ha sido evaluado previamente. No obstante, este organismo sigue siendo una fuente importante de enfermedades infecciosas en cerdos criados para la venta 234. Actualmente, no hay un ensayo de diagnóstico disponible para evaluar el grado de exposición a este patógeno en el campo, ni existe actualmente un procedimiento que permitiría a los investigadores la capacidad de monitorizar la respuesta serológica de los cerdos a las vacunas administradas contra este patógeno.

Mycoplasma hyorhinis es un patógeno importante en la industria porcina de Estados Unidos. Cada año las infecciones causadas por este patógeno impactan en la productividad de la industria porcina mediante el aumento de los costes veterinarios, disminución de la productividad y mortalidad. El género Mycoplasma consiste en pequeños organismos fastidiosos de aproximadamente 0,1 pm de tamaño y carecen de pared celular 6. Un número de especies patógenas de Mycoplasma que se han observado que infectan cerdos e inducen lesiones significativas tras la infección, incluyen M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, y M. hyosynoviae 78. M. hyopneumoniae es una causa importante de enfermedades respiratorias en cerdos, especialmente como una infección secundaria con circovirus porcino tipo 22 y virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino 3 M. hyosynoviae se ha demostrado que causa artritis grave en las articulaciones de los animales infectados y también induce un estado de portador en las amígdalas de los cerdos 910. M. hyorhinis es patógeno para los cerdos y los seres humanos711. En los seres humanos, M. hyorhinis ha sido implicado como agente causal en el carcinoma gástrico 11 y el cáncer de próstata 112 , aunque no es una causa común de enfermedad infecciosa clásica.

En los cerdos, el organismo puede encontrarse como residente comensal de la cavidad nasal y el tracto respiratorio 14 y se ha observado que la virulencia y patogenicidad varían entre las cepas 13. Cuando una cepa patógena infecta un animal, los signos clínicos más comunes son la artritis severa y poliserositis. De vez en cuando los animales pueden desarrollar otitis y conjuntivitis como resultado de la infección también 13 Las opciones de tratamiento incluyen antibióticos de tetraciclina, fluoroquinolona y macrólidos, así como tilosina y un conjunto de otros antimicrobianos 8.

Se ha realizado muy poca investigación para determinar qué factores específicos hacen que algunas cepas de M. hyorhinis sean virulentas, mientras que otras permanecen no patógenas. Una importante fuente de variabilidad en las cepas de M. hyorhinis con las lipoproteínas variables (VLP) que constituyen las principales proteínas de membrana expresadas por el organismo 1617. Las VLP pueden cambiar durante el transcurso de una infección a través de un mecanismo que implica la variación de fase, la regulación diferencial en la expresión de múltiples VLP, y cambios en el tamaño de VLP debido a la ganancia o pérdida de secuencias repetitivas que codifican grupos de 12-13 residuos de aminoácidos de longitud 18 Estos mecanismos pueden ser utilizados como un medio de escape continuo del sistema inmune del huésped, ya que la inmunidad dirigida contra estas proteínas puede resultar irrelevante cuando la población se desplaza a la utilización de una nueva VLP 19. Otra fuente potencial de virulencia en cepas de M. hyorhinis es la capacidad de al menos algunas cepas para modular la respuesta inmunitaria. Los estudios anteriores han demostrado que M. hyorhinis tiene la capacidad de suprimir la producción de IL-2 en células T murinas 21 y la activación de células T por células madre mesenquimales en ratas 22.

p37 de M. hyorhinis es una proteína que abarca la membrana de 43,5 kD que se piensa que funciona en la unión de pirofosfato de tiamina 23 y en la adherencia a las células huésped (cite). Su papel en cánceres gástricos humanos agravantes se cree que es resultado de su activación de la metaloproteasa de matriz 2 (MMP2) y la activación de la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico 20 p37 de M. hyorhinis se cree que se une al ácido siálico en la superficie de células a través de un motivo en “brazo de gitano” carboxi-terminal 24 y la unión de p37 a las células cancerosas se ha demostrado que facilita el aumento de la invasividad y la metástasis 2420. Un ensayo relevante utiliza sueros humanos para determinar si existe un vínculo entre M. hyorhinis y cáncer de próstata, 1 pero antes de la presente descripción, no se sabía si p37 de M. hyorhinis podría utilizarse para diagnosticar la exposición a M. hyorhinis a través de la vacunación o infección natural.

Características de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido p37 de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) purificado, recombinante, de origen no natural, no modificado post-traducción, que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 98% con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5; donde el polipéptido es útil para la detección selectiva de anticuerpos contra M. hyorhinis.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas que comprende el polipéptido del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar una placa de ELISA, para usar como un componente del kit del segundo aspecto de la invención, que comprende las siguientes etapas: a) suspender el polipéptido del primer aspecto de la invención en tampón de carbonato/bicarbonato hasta una concentración de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, para producir una solución de recubrimiento;

b) añadir de aproximadamente 80 ml a aproximadamente 120 ml de la solución de recubrimiento a cada pocillo; c) incubar la placa durante al menos aproximadamente 12 horas a aproximadamente 4 °C;

d) extraer la solución de recubrimiento;

e) bloquear la placa;

f) lavar la placa; preparando de este modo la placa de ensayo ELISA.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar selectivamente la presencia de M. hyorhinis en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar la placa de ELISA del tercer aspecto de la invención;

b) proporcionar al menos una muestra experimental, al menos una muestra de control negativo y al menos una muestra que contiene anticuerpos específicos para al menos una especie de Micoplasma distinta de M. hyorhinis; c) diluir la muestra o muestras en tampón de bloqueo;

d) añadir una cantidad de muestra o muestras diluidas en los pocillos de la placa;

e) incubar las placas;

f) lavar los pocillos de las placas para extraer la muestra o muestras diluidas;

g) revelar las placas usando un cromógeno;

h) detener la reacción de cromógeno;

i) leer la placa a una longitud de onda apropiada para el cromógeno utilizado;

j) recoger y registrar los datos de absorbancia para los pocillos;

k) determinar que M. hyorhinis está presente cuando la muestra tiene significativamente más absorbancia que las muestras de control negativo; detectando de este modo selectivamente la presencia de M. hyorhinis en la muestra o muestras.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar selectivamente la presencia de anticuerpos contra P37 de M. hyorhinis en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos contra P37;

b) añadir una cantidad del polipéptido del primer aspecto de la invención a la muestra de ensayo, siendo la cantidad suficiente para producir un nivel detectable de actividad de unión por los anticuerpos anti-P37 en la muestra de ensayo; y

c) detectar la presencia de anticuerpos contra P37 unidos a dicho polipéptido en la muestra de ensayo.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico para el diagnóstico selectivo de la presencia en una muestra biológica de anticuerpos contra P37 de M. hyorhinis que comprende el polipéptido del primer aspecto de la invención; en el que incluso si la muestra biológica contiene anticuerpos contra M. hyosynoviae y M. hyopneumoniae contra P37 ortólogo, homólogo o parálogo, el kit no producirá un resultado positivo a menos que los anticuerpos contra M. hyorhinis estén presentes.

Se describe en el presente documento un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección selectiva de IgG anti-Mycoplasma hyorhinis en suero porcino, que puede contener anticuerpos específicos a otros múltiples Mycoplasma spp.

Se describen en el presente documento procedimientos para detectar selectivamente la presencia de Mycoplasma hyorhinis en una muestra biológica, incluso cuando las especies biológicas también contienen anticuerpos específicos a otros múltiples Mycoplasma spp.

Se describe en el presente documento un procedimiento de producción de un kit de ELISA selectiva, lo que produce un resultado positivo para Mycoplasma hyorhinis, a pesar de la presencia de anticuerpos de otras Mycoplasma spp.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Transferencia Western y gel de SDS-PAGE de fracciones de proteína p37 recombinantes. L1: estándar; L2: lisado de células completas L3: extracto soluble de BPER L4: extracto soluble de urea L5: proteína purificada. Esta figura muestra cómo la proteína p37 se divide durante la purificación y demuestra la pureza de la preparación final de antígeno;

la figura 2 es un gráfico que muestra la relación S/P anti-p37 porcina en el día 35, para los siguientes grupos de vacuna de M. hyorhinis (aislado 10-1625-1): A) 3,715x10A8, TRIGEN™ al 10%; B) 3,715x10A7, TRIGEN™ al 10%; C) ningún tratamiento. Estos resultados muestran que el ensayo descrito fue capaz de diferenciar entre animales vacunados y no vacunados;

la figura 3 es un gráfico que muestra la relación S/P media por grupo de estudio M. hyosynoviae en antígeno p37 de M. hyorhinis. Los grupos se vacunaron de la siguiente manera: A) 5,012x101A8, TRIGe N™ al 10%; B) 5,012x10A8, TS6 al 66%; C) 5,012x10A7, TRIGEN™ al 10%; D) 5,012x10A7, TS6 al 66%; y E) sin tratamiento. Este ensayo se llevó a cabo para verificar que los animales vacunados con M. hyosynoviae no experimentarían seroconversión contra el antígeno p37, que se utilizó en el ensayo de M. hyorhinis. Los resultados muestran que el suero de animales vacunados con el antígeno de M. hyosynoviae no reacciona positivamente en la prueba de M. hyorhinis;

la figura 4 es un gráfico que muestra los animales vacunados/no vacunados con M. hyopneumoniae en ensayos con M. hyorhinis y M. hyopneumoniae. Para el grupo A, veinte animales recibieron una vacuna de M. hyo comercial (NOMBRE DE LA VACUNA); y para el Grupo B, diecinueve animales recibieron una vacuna de PCV2 comercial (CIRCOVAC®). Los resultados muestran que el suero de los animales vacunados con M. hyopneumoniae no reacciona positivamente en la prueba de M. hyorhinis;

la figura 5 es un gráfico que muestra la respuesta S/P media para los animales vacunados con M. hyorhinis (aislado 10-1625-1), a niveles de dosis variadas y formulados con diversos adyuvantes. Grupos: A) 3,998x108, Trigen al 10%; B) 3,998x107, Trigen al 10%; C) 3,998x106, Trigen al 10%; D) 3,998x108, TS6 al 10%; E) 3,998x107, TS6 al 10%; F) 3,998x106, TS6 al 10%; G) 3,998x108, TS6 al 66%; H) 3,998x107, TS6 al 66%; I) 3,998x106, TS6 al 66%; W) 1,06x108 no concentrado, Trigen al 10%; X) 1,06x107 no concentrado, Trigen al 10%; Y) 1,06x106 no concentrado, Trigen al 10%; y J) Controles. Los resultados muestran que se obtiene una respuesta óptima usando TS6 a un volumen del 66%. Un ajuste de la dosis se puede ver claramente a través de nivel de dosis en cada conjunto de grupos de adyuvantes. Este resultado demuestra la capacidad de la prueba para medir la magnitud de la respuesta inmunitaria contra el antígeno.

Figura 6 Alineación ClustalW de secuencias de p37 de cepas de M. hyorhinis frente a la secuencia de la proteína recombinante p37-His. Esta alineación demuestra que el antígeno p37 se conserva entre diferentes cepas y comparte homología con la proteína recombinante descrita.

Descripción detallada de la invención

En el trabajo descrito en este documento se usó un enfoque relacionado para determinar si p37 podría ser utilizado como un marcador de diagnóstico para medir la exposición a M. hyorhinis a través de la vacunación y la exposición natural en cerdos. Estudios anteriores han demostrado que la proteína contiene cierta similitud con otras proteínas presentes en las especies de Mycoplasma15 y hemaglutinina del virus de gripe A24 a nivel de aminoácido y estructural. En la presente descripción, la proteína p37 se utilizó como un medio para medir la respuesta de IgG de la especie porcina a la vacunación con vacunas de M. hyorhinis inactivadas de células completas derivadas de tres diferentes cepas del patógeno. El ensayo se validó adicionalmente para asegurar que los resultados de la prueba no se confundirían por la vacunación con M. hyopneumoniae o M. hyosynoviae. Por último, el ensayo se utilizó para estimar el grado de exposición que podría presentarse al probar los animales en el campo con el fin de tener una idea acerca de la prevalencia de este patógeno en una granja típica.

En particular, la proteína p37 de M. hyorhinis expresada de forma recombinante fue utilizada para controlar la exposición al patógeno en el campo, así como la magnitud de la respuesta de IgG en los animales vacunados. Los resultados indicaron que el ensayo tenía un alto grado de especificidad en términos de su capacidad para distinguir animales vacunados con M. hyorhinis frente a otras especies de Mycoplasma importantes, por ejemplo, M. hyopneumoniae y M. hyosynoviae. Las vacunas que se utilizan para proteger a los animales contra este patógeno parecen inducir una fuerte respuesta de anticuerpos contra la proteína p37. Además, el grado de prevalencia en campo determinada utilizando el ELISA en las piaras probadas varió del 27% hasta como máximo el 67%.

Definiciones.

Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y que puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

El término "polipéptido inmunogénico o antigénico", tal como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína según la descripción comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier conjunto de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis simultánea de grandes conjuntos de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína y la reacción de los péptidos con anticuerpos, mientras que los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen completamente en el documento PCT/US2004/022605.

Como se discute en el presente documento, la descripción abarca fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido actúe para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en el composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de manera que la resistencia a una nueva infección se verá reforzada y/o disminuirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas y/o signos clínicos de la enfermedad normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.

Por "animal" se entiende mamíferos, aves y similares. Animal o huésped, tal como se usa en el presente documento, incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y linces), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado, terneros, novillos, toros), porcino (por ejemplo, cerdo), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), hurones, focas y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo recién nacido, embrionario y etapas fetales.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Cabe indicar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos, tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

Realizaciones.

En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido p37 de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) purificado, recombinante, de origen no natural, no modificado post-traducción, que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 98% con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, donde el polipéptido es útil para la detección selectiva de anticuerpos contra M. hyorhinis.

En una realización, el polipéptido tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5.

En otra realización, la invención proporciona un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas que comprende el polipéptido de M. hyorhinis descrito en este documento.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para producir una placa de ELISA, para usar como un componente del kit de ELISA descrito, que comprende las siguientes etapas:

a) suspender el polipéptido en tampón de carbonato/bicarbonato hasta una concentración de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, para producir una solución de recubrimiento;

b) añadir de aproximadamente 80 ml a aproximadamente 120 ml de la solución de recubrimiento a cada pocillo; c) incubar la placa durante al menos aproximadamente 12 horas a aproximadamente 4 °C;

d) extraer la solución de recubrimiento;

e) bloquear la placa;

f) lavar la placa; preparando de este modo la placa de ensayo ELISA.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar selectivamente la presencia de M. hyorhinis en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar la placa de ELISA de la reivindicación 4;

b) proporcionar al menos una muestra experimental, al menos una muestra de control negativo y al menos una muestra que contiene anticuerpos específicos para al menos una especie de Micoplasma distinta de M. hyorhinis; c) diluir la muestra o muestras en tampón de bloqueo;

d) añadir una cantidad de muestra o muestras diluidas en los pocillos de la placa;

e) incubar las placas;

f) lavar los pocillos de las placas para extraer la muestra o muestras diluidas;

g) revelar las placas usando un cromógeno;

h) detener la reacción de cromógeno;

i) leer la placa a una longitud de onda apropiada para el cromógeno utilizado;

j) recoger y registrar los datos de absorbancia para los pocillos;

k) determinar que M. hyorhinis está presente cuando la muestra tiene significativamente más absorbancia que las muestras de control negativo; detectando de este modo selectivamente la presencia de M. hyorhinis en la muestra o muestras.

En aún otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar selectivamente la presencia de anticuerpos contra P37 de M. hyorhinis en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos contra P37;

b) añadir una cantidad del polipéptido a la muestra de ensayo, siendo la cantidad suficiente para producir un nivel detectable de actividad de unión por los anticuerpos anti-P37 en la muestra de ensayo; y

c) detectar la presencia de anticuerpos contra P37 unidos a dicho polipéptido en la muestra de ensayo.

En el presente documento se describe un procedimiento para detectar selectivamente la presencia de anticuerpos contra P37 contra M. hyorhinis en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos contra P37;

b) añadir una cantidad de un fragmento inmunogénico de polipéptido a la muestra de ensayo, siendo la cantidad suficiente para producir un nivel detectable de actividad de unión por los anticuerpos anti-P37 en la muestra de ensayo; y

c) detectar la presencia de anticuerpos contra P37 unidos a dicho polipéptido en la muestra de ensayo.

Un kit de diagnóstico para el diagnóstico selectivo de la presencia en una muestra biológica de anticuerpos de P37 contra M. hyorhini; en el que incluso si la muestra biológica contiene anticuerpos contra M. hyosynoviae y M. hyopneumoniae contra P37 ortólogo, homólogo o parálogo, el kit no producirá un resultado positivo a menos que los anticuerpos contra M. hyorhinis estén presentes. En una realización, este kit contiene el polipéptido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5.

Se describe en el presente documento un procedimiento de detección de la exposición a M. hyorhinis en un animal o en una muestra biológica de dicho animal, que comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia de una respuesta inmunitaria al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 5.

Ejemplos

Ejemplo 1.

Materiales y procedimientos

Análisis de secuencias del gen de p37:

La secuencia del gen de p37 de M. hyorhinis se tradujo en Clone Manager y se realizó una búsqueda BLASTP26 contra la base de datos “nr” de NCBI. Todas las proteínas con una identidad máxima mayor que o igual a 35% se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1

Secuenciación de genes de P37 de aislados de M. hyorhinis:

Se inocularon cepas de M. hyorhinis en medio de cultivo de Mycoplasma y se cultivaron durante tres días a 37 °C. A continuación, un volumen de 10 ml de cada cultivo se centrifugó a 7500xG durante 20 minutos con el fin de sedimentar las células. Después de esta centrifugación, se desechó el sobrenadante y se obtuvo ADN genómico a partir del sedimento celular mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Brevemente, los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato y se añadió 1 ml de una mezcla 1:1 de fenol:cloroformo. A continuación, las muestras se homogeneizaron mediante mezclado vigoroso. A continuación, la separación de fases se consiguió mediante centrifugación de las muestras a 19000xG durante un minuto. La fase acuosa se extrajo de cada muestra y se colocó en un tubo nuevo. A continuación, se añadió un volumen igual de cloroformo a cada tubo y las muestras se mezclaron a mano. Las muestras se centrifugaron a continuación de nuevo durante 1 minuto a 19000xG y la fase acuosa se extrajo a un nuevo tubo. A cada muestra, se añadió un 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M. A continuación, se añadieron tres volúmenes de etanol al 100% a cada muestra y se dejó que las muestras se incubaran en hielo durante quince minutos. A continuación, las muestras se centrifugaron a 14000xG durante treinta minutos a 4 °C para sedimentar el ADN. Se extrajo el sobrenadante de cada tubo y los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de etanol al 70% v/v para eliminar cualquier contaminante restante. Las muestras se centrifugaron a continuación de nuevo a 14000xG durante 15 minutos a 4 °C. Finalmente, los gránulos se resuspendieron en tampón Tris 10 mM y se congelaron a -20 °C hasta que fueron enviados para la secuenciación de PCR. Las secuencias de genes de p37 de diversos aislados listados en la tabla 2 se amplificaron usando el siguiente conjunto de cebadores directo e inverso; directo 5' GGGATTGAAGTGGTTGTCTGATTTAAG 3' (SEQ ID NO: 1), inverso 5' CAATGAACCAGATGCAGAACAATC (SEQ ID NO: 2). Los ensayos de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 pl con GoTaqH PCR SuperMix (Promega Inc., Madison, WI, EE.UU.) con 0,2 mM de cada cebador y 10 ng de ADN genómico de cada aislado, respectivamente. Las condiciones del ciclado de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y extensión a 68 °C durante 90 segundos y una elongación final a 72 °C durante 5 min. Todos los productos de PCR se visualizaron después de la electroforesis en geles de agarosa al 1,0% desarrollada a 7,0 V/cm mediante tinción con bromuro de etidio (EtBr) y se secuenciaron mediante el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi Sanger.

Tabla 2. Origen de los aislados usados para el análisis de secuencia de gen de p37. Los aislados se seleccionaron de todos los Estados Unidos

Clonación molecular de la proteína p37:

La información de secuencia para p37 de M. hyorhinis derivó de la secuencia de Genbank M37339.1. A continuación, esta secuencia se optimizó en los codones para la expresión en E. coli cambiando el codón de inicio a ATG, los codones de triptófano a TGG, de manera que el gen resultante se podrían expresar de manera eficiente en un huésped de E. coli. A continuación, se sintetizó un gen sintético en Genscript (how to site them) y la secuencia resultante se obtuvo en un vector pUC57. El gen se amplificó a partir del vector usando los cebadores p37 F (GACGACGACAAGATGCAGGCCT CT GCAGTCGAC) (SEQ ID NO: 3) y p37 R (GAGGAGAAGCCCGGTTATTTAATCGCCTTTTCGTAG) (SEQ ID NO: 4) usando un protocolo de PCR estándar. Una vez amplificado, el gen se purificó a partir de la mezcla de reacción usando un kit de limpieza de PCR de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, el gen purificado se ligó en un vector pET30-LIC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, el vector ligado se transformó en células electrocompetentes One Shot-Top 10 (Invitrogen) y las células transformadas se sembraron en medio de selección (agar LB con KAN 50 mg/ml). A continuación, los clones se desarrollaron durante la noche en medio selectivo (caldo LB con KAN 50 mg/ml) y el plásmido se recogió utilizando un kit de extracción de plásmido de Qiagen. A continuación, el plásmido purificado de cada clon se cribó por la presencia de un inserto usando (cebadores de inserción específicos para el vector). Se seleccionaron los clones positivos y se enviaron para la secuenciación (Operon). A continuación, el plásmido se transformó en células de E. coli BL-21 (DE3) mediante electroporación y los transformantes fueron seleccionados por incubación durante la noche en medio selectivo (agar LB con Kan 50 mg/ml)

Expresión y purificación de la proteína p37:

Se inoculó un único clon de BL-21 en 200 ml de medio de autoinducción (T-BONE necesita obtener el nombre comercial) y se desarrolló durante la noche en un matraz de agitación a 37 °C con agitación a 250 rpm. El día siguiente, las células se centrifugaron a 5000xg durante 25 minutos y los sobrenadantes se desecharon. A continuación, el sedimento se resuspendió en 20 ml de un tampón de lisis comercial (BPER Thermo Pierce) y se homogeneizó suavemente pipeteando la suspensión arriba y abajo sobre el sedimento. A continuación, se añadió DNasa (Sigma) a una concentración de 20 U/ml y se dejó que la mezcla resultante se incubara durante dos horas a temperatura ambiente en un dispositivo de mezcla Nutator. A continuación, la extracción se centrifugó a 7500xG durante 30 minutos. El sobrenadante se retuvo para el análisis por SDS-PAGE y transferencia Western. El sedimento se resuspendió en urea 8 M y se dejó incubar durante dos horas a temperatura ambiente en un dispositivo de mezcla Nutator. Esta suspensión se centrifugó a continuación a 7500xG y se pasó a través de un filtro 0,2 pm para eliminar cualquier sólido insoluble. Antes de la purificación de una muestra de la urea y el tampón de lisis, las fracciones se ensayaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western para determinar qué fracción de la proteína se había dividido. La fracción de urea fue seleccionada en base a los resultados de este análisis. A continuación, se preparó una columna de afinidad de níquel de 2 ml de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante usando (insertar resina de afinidad y columnas desechables Pierce). A continuación, se pasaron 10 ml de tampón de equilibración (insertar fórmula para tampón B) a través de la columna. A continuación, toda la fracción soluble de urea pasó a través de la columna. A continuación, la columna se lavó usando 20 ml de tampón de lavado (insertar fórmula para el tampón C). Finalmente, la columna se eluyó usando 5 ml de tampón de elución (insertar fórmula para tampón E). La concentración de proteína de la solución resultante se determinó mediante ensayo BCA (Thermo Pierce) según las instrucciones del kit.

SDS-PAGE y transferencia de western:

Se realizó un análisis SDS-PAGE y transferencia Western de p37 en dos geles separados en paralelo. Se mezclaron muestras de 100 ml con 20 ml de tampón de carga (insertar información Pierce) y se pusieron a ebullición durante 5 minutos para reducir y desnaturalizar las proteínas. A continuación, se cargaron 10 ml de patrones de proteína (insertar información Pierce) y 20 ml de la muestra a ebullición en un gel de SDS-PAGE en gradiente del 4-20% (insertar información Pierce). El gel se sometió a electroforesis bajo una corriente constante de 85V durante 90 minutos. Después de la electroforesis, los geles se lavaron en agua destilada durante 10 minutos para eliminar el SDS residual. Uno de los dos geles, a continuación, se tiñó utilizando una tinción de proteínas a base de Coomassie comercial (insertar información Pierce) durante una hora en un mezclador de mesa. A continuación, el gel se lavó brevemente en agua destilada para eliminar la tinción residual y a continuación se dejó incubar en agua destilada con mezclado durante la noche para eliminación la tinción del gel antes de la visualización. El otro gel se utilizó para el análisis de transferencia western y se empapó en tampón de desarrollo (insertar tampón tris-glicina) durante diez minutos antes de transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis. El protocolo de la electroforesis para la transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana consistía en una transferencia de una hora a 85V. Después de la transferencia, la membrana se extrajo del gel y se permitió el bloqueo durante la noche a 4 °C en un tampón de bloqueo comercial (Pierce). Después del bloqueo, la membrana se incubó a continuación con un conjugado Ni:HRP (insertar KPL) a una dilución 1/2000 con agitación suave a 37 °C durante una hora. A continuación, la transferencia se enjuagó dos veces en PBS-T a cinco minutos por lavado con agitación suave antes de que un enjuague final en PBS. A continuación, se dejó revelar la membrana durante aproximadamente tres minutos usando un sustrato de DAB mejorado con metal (insertar información Pierce aquí) antes de detener la reacción mediante lavado de la transferencia con agua destilada.

Ensayo de ELISA:

La proteína p37 de M. hyorhinis purificada se suspendió en tampón carbonato/bicarbonato (Sigma) y se recubrieron 100 ml/pocillo sobre la superficie de placas Immulon 2HB a una concentración de 100 mg/ml. Las placas se dejaron incubar durante la noche a 4 °C y la solución de recubrimiento se extrajo antes de bloquear las placas. Las placas se bloquearon con 300 ml/pocillo de bloque de Neptuno (Immunochemistry Technologies LLC) y se dejaron incubar durante dos horas a 37 °C. Las placas se lavaron a continuación una vez en PBS-T usando un conjunto de lavadores de placa para aspirar el tampón de bloqueo, se añadieron 300 ml/pocillo de tampón de lavado a la placa y a continuación se aspiró el tampón de lavado. A continuación, las muestras, diluidas 1/1000 en Superblock, se añadieron a la placa por duplicado en volúmenes de 100 ml y se dejaron incubar durante una hora a 37 °C. A continuación, las placas se lavaron tres veces en PBS-T usando la misma configuración de volumen que el primer lavado. Se añadió conjugado (IgG anti-cerdo de cabra marcado con peroxidasa H&L de KPL) a la placa a una dilución 1/5000 y se dejó incubar durante una hora a 37 °C. Después de la incubación del conjugado, las placas se lavaron cuatro veces en PBS-T y se revelaron usando cromógeno TMB (KPL). El cromógeno se añadió a 100 ml/pocillo y se dejó revelar durante diez minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 1 N de ácido sulfúrico añadido a la placa a 100 ml/pocillo. A continuación, las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm y los datos de absorbancia se exportaron a Excel. En Excel, se determinó la absorbancia media de los dos pocillos Superblock y se restó de la de cualquier otro pocillo en la placa. A continuación, se determinó la absorbancia media de las muestras duplicadas y controles. Por último, la absorbancia media de cada muestra y el control negativo se dividió por la de los sueros de control positivo para obtener las relaciones muestra/positivos utilizadas para determinar el estado positivo/negativo de los animales.

Ejemplo 2.

ELISA de M. hyosynoviae y M. hyopneumoniae:

ELISA de optimización:

Se establecieron diluciones óptimas para el recubrimiento de antígenos sobre placas y para antisueros para utilizar en el ensayo a través de un procedimiento en damero estándar. A continuación, se usó antisuero de la prueba 1 en el ensayo para el desarrollo de los controles positivos y negativos y para establecer un umbral positivo/negativo para su uso en una prueba adicional. Basándose en los valores S/P descritos de los animales vacunados que recibieron la vacuna sin diluir, y de los animales no vacunados, se estableció un punto de corte de 0,15 S/P que describió el número mínimo de falsos positivos (1 animal) y no falsos negativos. Un falso positivo se definió como un no vacunado que reaccionó en el ensayo con un S/P mayor que el punto de corte. Un falso negativo se definió como un vacunado que no reaccionó en el ensayo a un nivel más elevado que el punto de corte. Los valores de corte fueron probados entre 1,0 y 0,1 utilizando datos del conjunto de suero de la prueba 1.

Ejemplo 3. Pruebas con animales

Prueba 1: Estudio con M. hyorhinis

Se obtuvieron veinticuatro animales con buena salud de un proveedor comercial y se colocaron en una instalación limpia hasta que llegaron a ocho semanas de vida. Los animales de ensayo recibieron dos vacunaciones de vacuna con M. hyorhinis inactivado formulada a diferentes niveles de dosis utilizando, tal como se muestra en la Tabla 3. Las vacunas se administraron en los días 0 y 21. Vacuna se administró IM en una dosis de 2 cc. Las muestras de suero se obtuvieron de los animales en el día 35 para las pruebas en el ELISA.

T l M. h rhini - r 1 r l m r n l fi r 2

Prueba 2: Estudio con M. hyosynoviae

Se obtuvieron cincuenta animales con buena salud de un proveedor comercial y se colocaron en una instalación limpia hasta que llegaron a diez semanas de vida. Estos animales recibieron dos vacunaciones de vacuna con M. hyosynoviae inactivado formulada a diferentes niveles de dosis utilizando dos adyuvantes diferentes, tal como se muestra en la Tabla 4. Las vacunas se administraron en los días 0 y 21. La vacuna se administró IM en una dosis de 2 cc. Se obtuvieron muestras de suero de animales en el día 35 para las pruebas en el ELISA de M. hyorhinis, así como un ELISA de M. hyosynoviae similar a uno publicado por Nielsen et al.28.

T l 4 M. h n vi - r 2 r l m r n l fi r

Prueba 3: Estudio con M. hyopneumoniae:

En este ensayo se utilizó un conjunto de muestras de suero que contenían 40 sueros de animales que recibieron una vacuna contra PCV2 o una vacuna contra M. hyopneumoniae. Los animales se obtuvieron de un grupo con buena salud y se vacunaron IM en los días 0 y 21 utilizando una dosis de 2 cc. Los animales que habían recibido la vacuna contra PCV2 fueron considerados no vacunados con el fin de recopilar los resultados. Los animales que recibieron la vacuna contra M. hyopneumoniae se consideraron como vacunados. Los sueros tomados cuando los animales tenían 8 semanas de vida en el día 35 del protocolo de estudio se probaron usando un ELISA de M. hyopneumoniae y un ELISA de M. hyorhinis disponibles comercialmente.

T l M. h n m ni - r r l m r n l fi r 4

Prueba 4: Estudio con M. hyorhinis 2 (conjunto de pruebas)

Se obtuvieron ciento diecinueve animales con buena salud de un proveedor comercial y se colocaron en una instalación limpia hasta que llegaron a diez semanas de vida. Estos animales recibieron dos vacunaciones de vacuna de M. hyorhinis inactivado formulada a diferentes niveles de dosis utilizando dos adyuvantes diferentes, tal como se muestra en la Tabla 6. Las vacunas se administraron en los días 0 y 21. La vacuna se administró IM en una dosis de 2 cc. Las muestras de suero se obtuvieron de los animales en los días 0, 21 y 35 para la prueba en ELISA.

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Prueba 5: Prevalencia en el campo

Se utilizaron doscientos cincuenta muestras de suero que se habían enviado a nuestro laboratorio para pruebas de diagnóstico no relacionadas para estimar la seroprevalencia de anticuerpos contra el antígeno p37. Estas muestras se obtuvieron a partir de una variedad de animales de múltiples localizaciones en los Estados Unidos. Las muestras se sometieron a las pruebas de ELISA, tal como se describe anteriormente, y los resultados se compilaron en términos del número de animales que dieron positivo para el anticuerpo en el ensayo.

Resultados

Una búsqueda BLAST de proteínas con homología a la proteína p37 utilizada en este estudio muestra que están altamente conservadas en las cepas de M. hyorhinis. Entre los homólogos identificados durante el análisis BLAST, uno originado de M. conjunctivae y uno de M. ovipneumoniae que no han sido aislados previamente de cerdos. Sin embargo, una M. conjunctivae parece estar genéticamente relacionada con otras especies de Mycoplasma que infectan a los cerdos 25. Una proteína homóloga de M. flocculare, una cepa comensal que encuentra comúnmente en los cerdos 27 también se encontró en la búsqueda. Debido a la práctica común de la vacunación de cerdos contra M. hyopneumoniae, se evaluó la interferencia de la vacunación contra este patógeno en el ensayo (Tabla 1).

Los aislados de M. hyorhinis analizados en este estudio se tomaron de ubicaciones geográficamente dispersas y durante un período de cuatro años, lo que indica que ha habido poca deriva temporal en la secuencia de p37 y que, incluso a grandes distancias geográficas, hay muy poca diferencia en la secuencia de proteínas entre cepas. La secuencia de la proteína recombinante que se utilizó para el ELISA contiene siete diferencias en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con las secuencias aisladas. Sin embargo, es evidente a partir de la reactividad en el ELISA que éstas no impiden la unión del anticuerpo al antígeno.

El gel SDS-PAGE y la transferencia Western muestran el fraccionamiento del antígeno en cuerpos de inclusión durante la expresión en el huésped de E. coli. Esto no fue sorprendente ya que p37 es una proteína unida a la membrana y habría sido difícil de expresar en una forma soluble. Además, la purificación de la fase de cuerpo de inclusión dio lugar a una preparación muy pura, que es importante con el fin de evitar la interferencia en el ensayo de anticuerpos producidos contra E. coli que es probable que esté presente en el cerdo, en particular en animales más viejos.

La prueba inicial del estudio de concepto que se realizó para determinar si el ensayo de p37 podría detectar anticuerpos contra M. hyorhinis demostró con éxito que se podía detectar una respuesta inmunitaria en animales vacunados que no estaban presentes en los controles. Un estudio posterior realizado usando un ajuste de la dosis de M. hyorhinis inactivado en dos adyuvantes diferentes demostró que podíamos obtener una respuesta más potente cuando se utiliza un adyuvante diferente que el utilizado en nuestro estudio inicial. Además, fuimos capaces de ver que la respuesta en el ELISA disminuye a medida que se disminuyó la dosis del antígeno, lo que indica que este ensayo puede tener valor también como un medio de medición semicuantitativa de la respuesta inmunitaria.

Los dos ensayos restantes se realizaron con el fin de determinar si anticuerpos producidos en respuesta a la vacunación con otras especies de Mycoplasma que se sabe que infectan a los cerdos podrían interferir con el ensayo. Los resultados de estas dos pruebas demuestran que los animales que habían sido vacunados con M. hyosynoviae y M. hyopneumoniae no reaccionaron positivamente en el ensayo, lo que indica que el ensayo tiene la suficiente especificidad para medir el anticuerpo producido contra M. hyorhinis y no detectará el anticuerpo contra cualquiera de M. hyosynoviae o M. hyopneumoniae.

En resumen, el antígeno p37 puede usarse como un medio para controlar la respuesta a la vacunación con M. hyorhinis inactivado. La prueba muestra un alto grado de selectividad hacia anticuerpos producidos contra esta especie y la proteína p37 está bien conservada, lo que debería permitir el control de la respuesta frente a muchas, si no todas, las cepas que circulan actualmente en los Estados Unidos. También hemos sido capaces de medir la magnitud de la respuesta inmunitaria utilizando este ensayo que dio lugar a una mejora en nuestra vacuna inactivada mediante el uso de un nuevo sistema de adyuvantes.

Fuentes y fabricantes

a) Thermo Pierce-3747 N Meridian Rd, Rockford, IL 61101

b) Sigma-Aldrich-3050 Spruce St, St. Louis, MO 63103

c) fabricante de T-BONE

d) Kirkegaard & Perry Laboratories- 910 Clopper Road, Gaithersburg, MD 20878

e) Immunochemistry Technologies LLC- 9401 James Avenue South, Suite 155, Bloomington, MN 55431 f) IDEXX- One IDEXX Drive, Westbrook, ME 04092

Referencias 1*345678

1. Urbanek C, Goodison S, Chang M, et al.: 2011, Detection of antibodies directed at M. hyorhinis p37 in the serum of men with newly diagnosed prostate cancer. BMC Cancer 11: 233-238.

2. Hansen MS, Pors SE, Jensen HE, et al.: 2010, An investigation of the pathology and pathogens associated with porcine respiratory disease complex in Denmark. J Comp Pathol 143: 120-131.

3. Palzer A, Ritzmann M, Wolf G, Heinritzi K: 2008, Associations between pathogens in healthy pigs and pigs with pneumonia. Vet Rec 162:267-271.

4. Kim B, Lee K, Han K, et al.: 2010, Development of in situ hybridization for the detection of Mycoplasma hyorhinis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues from naturally infected pigs with polyserositis. J Vet Med Sci 72: 1225-1227.

5. Dudler R, Schmidhauser C, Parish RW, et al.: 1988, A mycoplasma high-affinity transport system and the in vitro invasiveness of mouse sarcoma cells. EMBO J 7: 3963-3970.

6. Razin S, Hayflick L: 2010, Highlights of mycoplasma research- An historical perspective. Biologicals 38: 183-190.

7. Minion FC: 2002, Molecular pathogenesis of mycoplasma animal respiratory pathogens. Front Biosci 7: 1410­ 1422.

8. Kobisch M, Friis NF: 1996, Swine mycoplasmoses. Rev Sci Tech 15: 1569-1605.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido p37 de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) purificado, recombinante, de origen no natural, no modificado post-traducción, que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 98% con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5; en el que el polipéptido es útil para la detección selectiva de anticuerpos contra M. hyorhinis.

2. Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO: 5.

3. Kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas que comprende el polipéptido según la reivindicación 1 o 2.

4. Procedimiento para fabricar una placa de ELISA, para usar como un componente del kit, según la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas:

a) suspender el polipéptido, según la reivindicación 1 o 2, en tampón de carbonato/bicarbonato hasta una concentración de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, para producir una solución de recubrimiento;

b) añadir de aproximadamente 80 ml a aproximadamente 120 ml de la solución de recubrimiento a cada pocillo; c) incubar la placa durante al menos aproximadamente 12 horas a aproximadamente 4 °C;

d) extraer la solución de recubrimiento;

e) bloquear la placa;

f) lavar la placa; preparando de este modo la placa de ensayo ELISA.

5. Procedimiento in vitro para detectar selectivamente la presencia de M. hyorhinis en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar la placa de ELISA, según la reivindicación 4;

b) proporcionar al menos una muestra experimental, al menos una muestra de control negativo y al menos una muestra que contiene anticuerpos específicos para al menos una especie de Micoplasma distinta de M. hyorhinis; c) diluir la muestra o muestras en tampón de bloqueo;

d) añadir una cantidad de muestra o muestras diluidas en los pocillos de la placa;

e) incubar las placas;

f) lavar los pocillos de las placas para extraer la muestra o muestras diluidas;

g) revelar las placas usando un cromógeno;

h) detener la reacción de cromógeno;

i) leer la placa a una longitud de onda apropiada para el cromógeno utilizado;

j) recoger y registrar los datos de absorbancia para los pocillos;

k) determinar que M. hyorhinis está presente cuando la muestra tiene significativamente más absorbancia que las muestras de control negativo; detectando de este modo selectivamente la presencia de M. hyorhinis en la muestra o muestras.

6. Procedimiento in vitro para detectar selectivamente la presencia de anticuerpos contra P37 de M. hyorhinis en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos contra P37;

b) añadir una cantidad del polipéptido, según la reivindicación 1 o 2, a la muestra de ensayo, siendo la cantidad suficiente para producir un nivel detectable de actividad de unión por los anticuerpos anti-P37 en la muestra de ensayo; y

c) detectar la presencia de anticuerpos contra P37 unidos a dicho polipéptido en la muestra de ensayo.

7. Kit de diagnóstico para el diagnóstico selectivo de la presencia en una muestra biológica de anticuerpos contra P37 de M. hyorhinis que comprende el polipéptido, según la reivindicación 1 o 2; en el que incluso si la muestra biológica contiene anticuerpos contra M. hyosynoviae y M. hyopneumoniae contra P37 ortólogo, homólogo o parálogo, el kit no producirá un resultado positivo a menos que los anticuerpos contra M. hyorhinis estén presentes.