WO2004055045A1 - サルモネラ抗原処方物、それを使用した抗体検査キット及びサブユニットワクチン - Google Patents

サルモネラ抗原処方物、それを使用した抗体検査キット及びサブユニットワクチン Download PDF

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antigen
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antibody
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PCT/JP2002/013148
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Hiroaki Ohta
Tomoya Ekawa
Yukiko Toyata
Satoru Yamamoto
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Caf Laboratories Inc.
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    • G01N2333/255—Salmonella (G)

Definitions

  • Salmonella antigen preparation preparation, antibody test kit and submit vaccine using it
  • the present invention relates to a Salmonella antigen formulation, and to a method using the Salmonella antigen formulation.
  • a test kit for distinguishing between field-infected animals and vaccinated animals
  • Salmonella bacteria are known to be pathogenic in both humans and animals.
  • Salmonella enteritidis (hereinafter referred to as SE) has been attracting attention as one of the causative bacteria of human food poisoning since the late 1980s.
  • SE Salmonella enteritidis
  • the SE-inactivated vaccine which is widely used, uses the antigen that inactivated the cells, that is, the one obtained by killing the SE cells with formalin as the central antibody. It contains a toxin (Enterotoxin) and is known to cause various side effects (eg, inhibit chicken weight gain) by vaccination.
  • toxin Enterotoxin
  • oil-based adjuvant vaccines which are known to induce excellent immune responses, also have the disadvantage of causing stress in vaccinated chickens.
  • the present inventors have already studied the types of antibodies produced between SE-inactivated vaccinated chickens and SE-infected chickens against various SE surface antigen substances. Examination of the difference revealed that there was a difference between the SE-inactivated vaccinated chicken and the SE-infected chicken against the flagellar antigen, one of the SE surface antigens.
  • polypeptides of 14 kDa, 17 kDa and 23 kDa are known as ciliary antigens, and they have been studied as antigens for subunit vaccines, respectively. It has not been reported that it is an effective antigen as a vaccine.
  • Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. 2001-186684 describes that flagella are regarded as suitable detectable marker antigens for the Salmonella vaccine, and that flagella in the wild-type form are flagella. Have been described that utilize Salmonella bacteria that retain the ability to induce antibodies to at least one of the flagellin or flagella antigenic determinants.
  • Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. 2002-80396 discloses that water-in-oil-in-water It is stated that a vaccine formulation in the form of an emulsion would attempt to solve this problem.
  • the SE-inactivated vaccine contains a large amount of antigen that killed bacterial cells, as described in problem (3),
  • the solution is to collect only those antigens that are effective in SE cells. It is considered useful to produce a multivalent vaccine as a subunit vaccine, but no effective SE antigen as a subunit vaccine has been reported so far.
  • SE FHC 53 kDa polypeptide
  • FliC flagellar antigen
  • SE FliC 9 kDa polypeptide plays an important immunohistological role in the antigen of SE-inactivated vaccine
  • SE subunit with low stress response containing this antigen is also important.
  • the present invention does not use a Salmonella antigen formulation as a marker antigen for discriminating between an animal infected with a field-type Salmonella and an animal vaccinated with a vaccine, and the Salmonella antigen-containing formulation contains flagella of Salmonella Flagellation in antigen An antigen comprising an expression product of 9 kDa polypeptide or its complex in 53 kDa is contained. This makes it possible to accurately distinguish an animal naturally infected with Salmonella from an animal infected by vaccination.
  • the antigen formulation may be used to identify chickens infected with Salmonella by transforming Salmonella species into Salmonella enteritidis, or an antigen consisting of a 9 kDa polypeptide complex, 53 Expression product in 33 kDa A 9 kDa polypeptide is fused with glutathione-1 S-transferase (hereinafter referred to as GST) to form a fusion protein to stabilize fixation on the support.
  • GST glutathione-1 S-transferase
  • a test kit that detects antibodies to Salmonella in a fluid sample consisting of serum samples, egg yolk samples or body fluids and tissue extracts by the enzyme antibody method
  • the antigens that react immunologically with antibodies to Salmonella A Salmonella antigen preparation shall be used, and a support carrying the Salmonella antigen preparation, and various control sera, serum diluents, conjugate diluents, and orthophene used together with the support in a test reaction.
  • An antibody test kit consisting of a range amine (hereinafter referred to as OPD) diluent shall be prepared.
  • FIG. 1 shows a PCR image of a 733-108 bp region of a sample according to the present invention by agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 2 shows a confirmed image of the molecular weight of the GST 9 kDa polypeptide according to the present invention.
  • FIG. 3 shows the WB reaction results of the sera derived from chickens inoculated with SE-inactivated vaccines A and E in this example.
  • FIG. 4 shows the WB reaction results of serum from chickens vaccinated with SE-inactivated vaccine B in this example.
  • FIG. 5 shows the WB results of sera from chickens inoculated with SE inactivated vaccines C and D in this example.
  • the SE fliC gene used in the antigen formulation of the present invention encodes flagellin (53 kDa), which is a major protein constituting the flagellar FliC of SE, and is composed of 1518 base pairs. It encodes 505 amino acids.
  • flagellin 53 kDa
  • SE-specific region of E-flagellin was isolated and purified by genetic engineering to produce SE FliC 9 kDa polypeptide or a complex thereof as follows.
  • primers SEF and SER for PCR were designed, and genomic DNA was purified from the cells of SE No. 15 and amplified using PCR as a template.
  • the PCR conditions were repeated 30 cycles, with one cycle consisting of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, elutriation at 6 ° C for 30 seconds, amplification at 72 ° C and 90 seconds.
  • the amplified DNA fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis (1% agarose gel) (see Fig. 1).
  • the amplified gene was subcloned into pCR2.1T vector, then replicated in E. coli and cloned. Tried.
  • one of the four clones thus isolated was used as a template to determine the nucleotide sequence using primers SEF, SER, SER3 and SER4. salt
  • the base sequence was determined by a DNA terminator method using DNA Auto Sequencer ABI 310 (Aplied Biological Instrument). The cycle sequence reaction conditions were denaturation at 96 ° C for 10 seconds, annealing at 50 ° C for 5 seconds, amplification at 72 ° C for 4 minutes, and 25 cycles were repeated.
  • the above culture solution is collected, 2501 of a protease inhibitor (manufactured by SIGMA) is added, and Triton X-100 is added thereto to a final concentration of 0.2%, and ethanol is added. Freezing and thawing were repeated three times in a bath and a water bath (60 ° C) to disrupt the bacteria.
  • the disrupted bacteria were centrifuged (13,500 rpm, 10 minutes, 4 ° C), and the centrifuged supernatant was passed through a GST rap FF 5 ml column (Amersham Pharmacia Biotech) to remove the fusion protein. After binding to the carrier in the ram, the column was eluted with 5 ml of 10 ⁇ reduced daltathione (50 mM Tris-HCl, pH 8.0). The eluted fusion protein was purified with PBS.
  • the test kit of the present invention is a kit for detecting an antibody against Salmonella in a serum sample, an egg yolk sample or other fluid sample by an enzyme-linked immunosorbent assay, and is coated with the above-mentioned Salmonella antigen preparation.
  • it is composed of various control serum, serum diluent, conjugate diluent and PD diluent.
  • Salmonella-positive and Salmonella-negative, non-cross-reactive sera are used as control sera.
  • Particularly advantageous for the quantification of Salmonella antibodies are control sera obtained from Salmonella-positive animals that have been immunized by field infusion or vaccine.
  • the subunit vaccine according to the present invention comprises the above-mentioned FliC9 kDa polypeptide antigen or an antigenic substance comprising a complex thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for the ELISA method.
  • each reagent and sample will be described in more detail assuming that the above-mentioned Salmonella antigen preparation is used for the ELISA method.
  • the present invention is not particularly limited thereto, and the present invention is not limited thereto. Is also good.
  • the support (hereinafter referred to as an ELISA plate) is obtained by coating a GST 9 kDa polypeptide antigen on a microplate. That is, the ELISA plate is prepared by melting the GST 9 kDa polypeptide purified as described above, diluting it with a coating buffer so that the protein concentration becomes 0.05 ⁇ g Z-well, and adding 2 to 2 microplates. Coat at 5 ° C for 1 hour, block for 1 hour at room temperature with 1% bovine albumin-PBS (sterile phosphate-buffered saline), then remove blocking solution, dry well well and seal It produced by doing. Coating used The inking buffer contains 2.93 g of sodium bicarbonate, 1.59 g of sodium carbonate, and 0.2 g of sodium azide in 100 ml, and pH 9.4 to 9 ⁇ Adjusted to 6.
  • the antigen formulation in which the FliC 9 kDa polypeptide is fused with GST, the antigen formulation can be easily coated on a microplate, and the produced ELISA plate can be stably prepared. The properties, uniformity and high-sensitivity coating were obtained. In addition, in order to maintain the detection accuracy, it is preferable to store the ELISA plate in a dark place at 2 to 5 ° C until use.
  • Salmonella-positive sera is prepared from chickens immunized with an SE-inactivated vaccine (Layer-Mune S E). 21 SPF chickens aged 1 to 70 days are inoculated subcutaneously with 1.0 dose of layer mune SE and bred in an isolator. Blood is collected 4 weeks after vaccination, serum separated, and immobilized at 56 ° C for 30 minutes. Perform an agglutination reaction (PD-RPA) with a commercially available chick leukemia diagnostic antigen, and dilute the serum with an agglutination titer of 8 times 500 times. This is preferably stored at 140 ° C until use, but may be lyophilized. Salmonella negative serum is prepared from 21-70 day old SPF chickens.
  • Serum diluent was prepared in sterile phosphate buffered saline (PBS), 10 ml of fetal calf serum, 1 ml of polysorbate 20, 0.02 g of sodium azide, 1% phenol red Adjust to 100 ml by adding 0.3 ml and gentamicin lml, dissolve using a stirrer, sterilize by filtration, aliquot into sterile containers and store at 2-5 ° C.
  • the conjugate diluent was adjusted to 100 ml by adding 2 ml of polysorbate 20, 1 ml of fetal calf serum, and 0.05 g of malachite green to PBS, and using a stirrer as with the serum diluent. Dissolve, filter sterilize, and subdivide into sterile containers at 2-5 ° C Save with.
  • the OPD diluent was adjusted to 1 000 ml by adding 21.0 g of citric acid monohydrate, 28.40 g of anhydrous sodium hydrogen phosphate and 1 ml of 30% hydrogen peroxide to distilled water, After dissolution, store at 2-5 ° C.
  • test procedure by the ELISA method using the reagent prepared as described above is shown below. At this time, bring each reagent to room temperature before use.
  • chicken serum or egg yolk is used as a sample.
  • the serum diluent was placed on a microplate for sample dilution (FALCON tissue culture microtest plate, flat bottom, low evaporation type, with a 96-hole lid) except for rows 1 to 8 in column A.
  • Dispense 1 / ⁇ l at a time dispense the primary diluent of the sample in 4 ⁇ l ⁇ ⁇ wells, and mix thoroughly with a plate mixer for 20 minutes to prepare the secondary diluent for the sample. (125-fold dilution).
  • the serum diluent was dispensed by 75 IX1 to all wells except for rows A to 8 of column A of the ELI SA plate supporting GST 9 kDa polypeptide antigen, and the secondary Add 25 ⁇ l of the diluent (final dilution is 500 times).
  • Salmonella-negative serum is dispensed into columns A to 4 of the ELIS II plate
  • Salmonella-positive serum is dispensed into columns 5 to 8 by 100 ⁇ l each, and reacted with the antigen at room temperature for 30 minutes.
  • Step 1 After the reaction of Step 1, the reaction solution is discarded, the well is washed three times with distilled water to remove water, and the enzyme-labeled anti-chicken IgG (I + L) heron serum is conjugated. Dilute 3000-fold dilutions with the diluent and dispense 100 ⁇ l to all wells. Incubate at room temperature for 30 minutes.
  • step 2 After the completion of the reaction in step 2, discard the reaction solution, wash the well three times with distilled water, remove water, and dilute orthophenylenediamine appropriately with OPD diluent to obtain a 0.05 mg gZ well. Dispense into each well and allow to react at room temperature for 10 minutes.
  • 3N sulfuric acid is dispensed 100 / ⁇ 1 to all the wells to stop the color development.
  • m—OD value (S—NC) / (PC—NC) (S: OD value of sample, PC: OD value of Salmonella positive serum, NC: OD value of Salmonella negative serum)
  • the SE inactivated vaccination group was divided into three groups, and samples were collected as follows.
  • a 9-kDa polyacrylamide gel was used for the rapid plate agglutination reaction (PD-RPA) using the commercially available CAF-SE Elisa (manufactured by us), which is used as a conventional test method for detecting SE antibodies, and the antigen for diagnosing chick leukemia.
  • the assay was performed with the peptide-coated ELISA of the present invention. The results are shown in Tables 1 to 3 (Table 1: 19 days old, Table 2: 420 Age, Table 3: 690 days old).
  • Antibody was detected in the same manner as in Example 1 for the yolk of 100 eggs collected from a farm from which SE was isolated from the environment about one year ago. Table 4 shows the results.
  • SE separation history SE was separated about one year ago. It has not been investigated since then.
  • the positive criterion for the m-OD value described above was 50% or more in the test using yolk from a group of chickens aged 65 to 720 days in the SE inactivated vaccine group. It must be a positive rate and must be all negative in tests using yolk from SE-contaminated farms and yolk from purchased SPF flocks (taken from eggs purchased from SPAFAS). .
  • the ELISA plate of the present invention can be used for marker detection, and an m-OD value of 0.1 or more is set as a positive criterion.
  • Cloacaspub blood and eggs are collected in about 10 times the volume of Hanatetrathionate basal medium (HTB), cultured at 37 ° C for 48 hours, and then streaked on ML CB and cultured for 48 hours. Later, SE positivity was determined, and the obtained colonies were transplanted to Tributosa agar medium and cultured for 24 hours, and then reacted with Salmonella immune serum O9 group to confirm the presence or absence of agglutination. At the time of necropsy, the oviduct collected aseptically was ligated on one side to remove the forming egg, then HTB was added from the other side, and the contents were taken out well, and the washed solution was used as a sample.
  • HTB Hanatetrathionate basal medium
  • liver and spleen For the liver and spleen, 5 g each of the liver and spleen were aseptically collected and homogenized by adding about 10 times the amount of HTB. After enrichment culture at 37 ° C for 48 hours, MCLB was streaked, and after 48 hours, SE positive was determined. The obtained colonies were transplanted to Tributossa agar medium and cultured for 24 hours, and then reacted with 9 groups of Salmonella immune sera to confirm the presence or absence of agglutination.
  • SE separation was observed at least once in all of the chickens in the inoculated group in Test Nos. 1 and 2, as shown in Table 5. After 2 weeks, there were two birds in which no SE separation was observed in Test No. 1 and one in Test No. 2. As shown in Tables 6 and 7, no SE separation was observed at any time from egg contents and blood.
  • the antibody detection method of the ELISA plate coated with GST 9 kDa polypeptide in SE-fed laying hens showed negative results for both serum and egg yolk. It is judged to be suitable for the marker detection method in tests using blood and egg yolk of vaccinated chickens and SE infected chickens.
  • Pectin A was inoculated into 5 26-day-old SPF chickens with 0.5 m1 Z birds
  • B was inoculated into 10 31-day-old SPF chickens with 0.5 ml / bird
  • C was inoculated.
  • D inoculate 0.25 m1 Z birds into 5 33-day-old SPF chickens
  • E 33-day-old SPF Four chickens were inoculated with 0.25 ml of feathers, and the serum obtained 4 weeks after each inoculation was used for the ELISA reaction using the CAF-SE ELISA and the ELISA plate of the present invention.
  • WB Western Blotting
  • SDS-PAGE SDS-PAGE using 10% polyatarylamide gel was performed using two types of polypeptides, and then transferred to a ditrocellulose membrane. After reacting for 90 minutes, a 20000-fold dilution of anti-chicken IgG IgG heron serum was used as the secondary serum, and reacted at room temperature for 90 minutes. Finally, 4-hydroxyl-naphthol was used as a substrate. Table 13 shows the results.
  • a and B are inoculated according to the dosage
  • n-9 m-OD value in ELISA reaction using a plate coated with GST-9 kDa polypeptide (0.1 or more is positive and less than 0.1 is negative)
  • the SE-inactivated vaccines C, D, and E were inoculated with half the amount specified in the dosage, so that some flocks showed low antibody titers, but in the WB method, 53 kD Bands were observed in all samples using both the a polypeptide and the GST 9 kDa polypeptide as antigens (see Figs. 3 to 5). It is thought to induce antibody production against 3 kDa polypeptide and 9 kDa polypeptide.
  • GST9kDa polypeptide is considered to be an antigen that plays an important role in colony formation by adhering to epithelial cells among SEFliC.

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Description

サルモネラ抗原処方物、それを使用した抗体検査キッ ト及びサブュニッ トワクチン
技術分野
この発明は、 サルモネラ抗原処方物、 及びこのサルモネラ抗原処方物を使用して 明
野外型感染動物とヮクチン接種動物とを識別するするための検査用キッ ト、並びに 田
サブュニッ トワクチンに関するものである。
背景技術
サルモネラ属の細菌は人及び動物の両方に於いて病原性を示すことが知られて いる。 とりわけ、 サルモネラ 'ェンテリティディス （Salmonella enteritidis以下 S Eと云う） は、 人の食中毒の原因菌の一つとして 1 9 8 0年代後半より注目され てきた。 この S Eは多くの研究により、 養鶏場に於いて産生される殻付き卵を汚染 していることが知られるようになり、 養鶏場 (採卵場) に於ける S E対策が重要視 されている。
近年、養鶏場の S E対策として一般的な衛生管理を向上させることの他に、採卵 鶏の若齢期に S E不活化ワクチンを接種することが試みられている。 しかしながら、 この場合、 次のような問題点がある。
( 1 ) S E不活化ワクチンを接種した場合、 S E特異抗体は産生されるが、 この 産生された S E特異抗体は野外型 S Eの自然感染と血清学的に区別することがで きない。
( 2 ) 現在広く普及している S E不活化ワクチンは、 菌体を不活化した抗原、 即 ち S Eの菌体をホルマリンにより死菌としたものを中心抗体として使用している ため、 菌体内の毒素 （Enterotoxin) を含んでおり、 ワクチンを接種することによ り様々な副反応 （例えば鶏増体重を阻害する） を引き起こすことが知られている。 また、 不活化ワクチンの内、優れた免疫応答を誘導するものとして知られている油 性アジュバントワクチンも、接種鶏にス トレスを誘発するという欠点を持っている。
( 3 ) 現在、 養鶏場では S E以外のサルモネラ菌属、 例えばネズミチフス菌 (Salmonella typhimurium) 、 サルモネラ 'インファンテイスなどの汚染があり、 ヮクチネーションの回数を減らすためにも、サルモネラ菌属の多価ワクチンの開発 が要望されているが、多くのサルモネラの菌体を混合することは必要以上のストレ スを鶏に与えたり、 必要な抗原量を安定的に確保するのが困難であるため、 所望さ れる菌体抗原を用いた多価ワクチンは製造上困難とされている。
本発明者らは既に、 上記問題点 （ 1 ) を解決するために、 様々な S E表面抗原物 質に対し、 S E不活化ワクチン接種鶏と S E感染鶏との間に産生される抗体の種類 に差があるかどうか調べ、 S E表面抗原の 1つであるべん毛抗原に対して、 S E不 活化ワクチン接種鶏と、 S E感染鶏との間に差があることを明らかにしている。
S Eの表面抗原としては、 繊毛抗原として 1 4 k D a、 1 7 k D a及ぴ 2 3 k D aのポリぺプチドが知られ、夫々れサブュニッ トワクチンの抗原として研究されて いるが、 未だワクチンとして効果的な抗原であることの報告はなされていない。 一方、 日本公開特許公報特開 2 0 0 1— 1 8 6 8 7 4号公報には、 べん毛をサル モネラワクチンに関する適当な検出可能マーカー抗原とみなし、野生型形態に於い てはべん毛を保持するが、フラジェリン又はべん毛の抗原決定基の少なく とも一つ に対する抗体を誘導する能力をもはや有さないサルモネラ属の細菌を利用するも のとしたワクチンが記載されている
他方、 問題点 （2) のアジュバントによる問題に対して、 例えば日本公開特許公 報特開 2 0 0 2— 8 0 3 9 6号公報には、親水性油性アジュパントを使用して水中 油中水滴型エマルションとなしたワクチン製剤により解決しようとすることが記 載されているが、 S E不活化ワクチンは菌体を死滅させた抗原を大量に含んでいる ため、 問題点 （3) に示すように、 サルモネラ属全体の多価ワクチンを作成するこ とは困難とされている。 この解決策としては、 S E菌体の中で有効な抗原のみを取 り出し、サブュニットワクチンとして多価ワクチンを作成することが有用と考えら れるが、これまでサブュニットワクチンとしての有効な S E抗原は報告されていな い。
上記したように、 ワクチン接種鶏と野外型感染鶏とを容易に識別でき、 且つ被検 体に対してストレスの少ないサブュニッ ト S E不活化ワクチン或いは S E菌体を 含む多価サブュニッ ト S Eワクチンの開発が強く望まれているが、未だ有効なもの は確認されていない。 本発明者らは、 これに鑑みて鋭意研究を進めたところ、 S E べん毛抗原の主体を成す FliC (フラジェリン） である 5 3 k D aポリぺプチド （SE FHC)の中の一部 9 k D aポリぺプチドが鶏に接種された S E不活化ワクチンによ る特異抗体を特異的に検出することを見出し、 この S E FliC 9 k D aポリぺプチ ド又はその複合物を用いて、 S E感染鶏及び現在市販の S E不活化ワクチン接種鶏 を血清学的に検査するための抗原処方物及び検査キットを提供することを目的と する。
更には、 S Eのみならず、 S E fliCと高い相同性を示すべん毛抗原を持つサル モネラ菌属、 例えばサルモネラ ■ ダブリン （Salmonella dublin) の不顕性感染に 於いて、上記 S Eの場合と同様に血清学的検査用の抗原処方物及び検査キッ トを提 供する。
更には、 S E FliC 9 k D aポリぺプチドが S E不活化ワクチンの抗原に於いて、 免疫組織学的に重要な役割を担っていることから、この抗原を含んだストレス反応 の低い S Eサブュ-ッ トヮクチン或いはサルモネラサブュニッ トヮクチンを提供 する。 発明の開示
上記課題を解決するため、 本発明では、 野外型サルモネラ感染動物とワクチン接 種感染動物とを識別するマーカー抗原にサルモネラ抗原処方物を使用するものと なし、該サルモネラ抗原処方物にサルモネラ種のべん毛抗原中に於けるフラジェリ ン 5 3 k D a中の発現プロダク ト 9 k D aポリぺプチド又はその複合物からなる 抗原を含有させるものとする。 これにより、 サルモネラ菌に自然感染した動物とヮ クチン接種により感染した動物とを正確に識別することが可能となる。
また、 この際、 上記抗原処方物は、 サルモネラ種をサルモネラ ' ェンテリティデ イスとなしてサルモネラ菌に感染した鶏を識別するものとなしたり、 9 k D aポリ ぺプチドの複合物からなる抗原を、フラジヱリン 5 3 k D a中の発現プロダク ト 9 k D aポリぺプチドをグルタチオン一 S—トランスフェラーゼ （以下 G S Tと云 う） と融合させた融合蛋白質となして支持体上への定着を安定させるようになした りする。
また、 酵素抗体法により、 血清試料、 卵黄試科又は体液及び組織抽出液からなる 流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出する検査キッ トに於いて、サルモネ ラに対する抗体と免疫反応する抗原に上記サルモネラ抗原処方物を使用するもの とし、 該サルモネラ抗原処方物を担持させた支持体と、 該支持体と共に検査反応に 使用する種々のコン トロール血清、 血清希釈液、 コンジュゲート希釈液及びオルト フエ二レンジアミン （以下 O PDと云う） 希釈液とからなる抗体検査キッ トを作成 するものとする。
また、上記 S E FliC 9 k D aポリペプチド又はその複合物を一部に含ませたサ ルモネラサブュニッ トヮクチン或いは S Eサブュニッ トヮクチンを製造し、サルモ ネラ菌属の感染に対して鶏やその他の動物を防御するようにする。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明に係る試料のァガロースゲル電気泳動法による 7 3 3〜 1 0 0 8 b p領域の P C R像を示す。
図 2は、 本発明に係る G S T 9 k D aポリぺプチドの分子量の確認像を示す。 図 3は、本実施例に於ける S E不活化ワクチン A及ぴ E接種鶏由来血清の WB反 応成績を示す。 図 4は、本実施例に於ける S E不活化ワクチン B接種鶏由来血清の WB反応成績 を示す。
図 5は、本実施例に於ける S E不活化ワクチン C及び D接種鷄由来血清の WB応 成績を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の抗原処方物に使用される S E fliC遺伝子は、 S Eのべん毛 FliCを構成 する主要な蛋白質であるフラジェリ ン （5 3 k D a) をコードしており、 1 5 1 8 塩基対で構成され、 5 0 5個のアミノ酸をコードしている。 また、 S Eのアミノ酸 配列と他のサルモネラの N末端と C末端のアミノ酸配列及び塩基配列を比較する と、 かなり高いホモロジ一が存在することが確認された。 そこで、 本発明では、 s
E フラジェリンの S E特異的な領域の単離精製を遺伝子工学的に行い、 S E FliC 9 k D aポリべプチド又はその複合物を以下のようにして生成した。
A. S E fliC遺伝子の単離と解析
1. P C R法による fliCの増幅及ぴクローニング
既知の塩基配列を基に、 P CR用プライマー S E F及ぴプライマー S ERを設計 し、 S E No. 1 5の菌体よりゲノム DNAを精製し、 これをテンプレートとし て P CR法により増幅した。 P C Rの条件は、 変性 94°C、 30秒間、 ァユーリ ン グ 6 ◦ °C、 30秒間、 増幅 7 2 °C、 9 0秒間を 1サイクルとして 3 0サイクル繰り 返した。 また、 増幅された DNAフラグメントはァガロースゲル電気泳動法 （1 % ァガロースゲル） により確認した （図 1参照） 。 この増幅した P CR断片 （DNA) 中の不純な DN Aを除去して精製するために、 増幅した遺伝子を p C R 2. 1 Tベ クタ一にサブクローニングした後、 大腸菌内で複製し、 クローニングを試みた。
2. fliC遺伝子の塩基配列の決定
クローニング後、 単離した 4クローンの内 1クローンをテンプレートとし、 プラ イマ一 S E F、 S ER、 S ER 3、 S ER 4を用い、 塩基配列の決定を試みた。 塩 基配列の決定には、 DNAオートシークェンサ一 AB I 3 1 0 (Aplied Biological Instrument) を用い、 ダイターミネータ一法により行った。 サイクルシー クエンス反応条件は変性 9 6°C、 1 0秒間、 アニーリング 5 0°C、 5秒間、 増幅 7 2°C、 4分間を 1サイクルとして 2 5サイクル繰り返した。
B. 融合蛋白質の発現及び精製
3. 発現クローンの作製
S E特異的である fliC遺伝子の塩基配列中 7 3 5 b pから l O l O b pの領域 のクローニングを試みた。 7 3 3 b pから 1 00 8 b pを増幅させる attBアダプタ 一プライマーを attBlSEFepi及び attB2SERepiを設計し、 fliC遺伝子の塩基配列を 決定したクローンを鎳型にし、 変性 94°C、 3 0秒間、 アニーリング 5 5 °C、 3 0 秒間、 増幅 7 2°C、 30秒間を 1サイクルとして 3 0サイクルの条件で P C Rを行 つた。 得られた DN Aフラグメントを attPサイ トを含むドナーベクター （p DON R™) に接続した。 その後、 大腸菌 （DH 5 a に形質転換し、 エン ト リークロ ーンが構築されたことを確認し、このエントリークローンをデスティネーションべ クタ一 （p DE S TTMl 5) に移し換え、 大腸菌 （B L 2 1— S 1 TM) に形質転 換して、 発現クローンを作製した （図 2参照） 。 上記ベクター及び大腸菌は Invitrogen社のものを使用した。
4. 融合蛋白質の大量発現
次に、 融合蛋白質を大量に発現させ、 精製することを試みた。
形質転換体のオーバーナイ トカルチヤ一を 1 m 1作製し、これを L B液体培地 1 00 m lに添加し、 3 7 °Cで O D 6。。が 0. 5になるまで約 6時間培養したあと、 引き続き終濃度が 0. 3 Mとなるように塩化ナトリゥムを添加し、 3 0°Cで 1 2時 間培養した。
5. 融合蛋白質の精製
上記培養液を集菌し、 プロテアーゼインヒ ビター （SIGMA製） を 2 5 0 1加 え、 これに終濃度 0. 2%となるようにトライ トン X— 1 00を加え、 ェタノール バス及ぴウォーターバス (60°C) にて 3回凍結融解を繰り返し、 菌を破砕した。 破砕した菌を遠心分離し （ 1 3, 5 00 r pm、 1 0分、 4 °C) 、 その遠心上清を G S T r a p F F 5m lカラム （Amersham Pharmacia Biotech製) に通し、 融 合蛋白質を力ラム内の担体に結合させた後、 1 0 πιΜ還元型ダルタチオン （ 50m M Tris-HCl, p H 8. 0) 5 m 1で溶出した。 溶出した融合蛋白質は P B Sで透 祈し精製標品とした。
本発明に於ける検査キッ トは、 酵素抗体法により、 血清試料、 卵黄試料又はその 他の流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキッ トであり、上記 サルモネラ抗原処方物でコーティングされた支持体の他に、種々のコント口ール血 清、 血清希釈液、 コンジュゲート希釈液及び◦ P D希釈液で構成される。 コント口 ール血清としては、サルモネラ陽性及びサルモネラ陰性の非交差反応血清が使用さ れる。 とりわけサルモネラ抗体定量用に有利なのは、 フィールドィンフエクシヨ ン 又はワクチネーシヨンにより免役されたサルモネラ陽性の動物から得られたコン ト口ール血清である。
本発明に於けるサブユニッ トワクチンは、 上記 FliC9 k D aポリペプチド抗原 或いはその複合物からなる抗原性物質と医薬上許容される担体とから構成される。 以下、 上記サルモネラ抗原処方物を E L I S A法に用いるものと して、 各試薬、 試料を更に詳細に説明するが、 本発明はこれらに特に制限されるものではなく、 他 の酵素抗体法に用いてもよい。
支持体 （以下 E L I S Aプレートと云う） は、 G ST 9 k D aポリぺプチド抗原 をマイクロプレートにコーティングさせたものである。 即ち、 E L I SAプレート は、 上記の如く精製した G S T 9 k D aポリぺプチドを融解後、 蛋白濃度で 0. 0 5 μ gZゥエルとなるよぅコーティング緩衝液で希釈し、マイクロプレートゥエル に 2〜 5 °Cで 1晚コーティングを行い、 1 %牛アルブミン一 P B S (滅菌リン酸緩 衝生理食塩水） を用いて室温で 1時間ブロッキング行い、 その後ブロッキング液を 除去してゥエルを充分に乾燥させシールすることにより作製した。使用したコーテ イング緩衝液は、 1 0 0 0 m 1中に炭酸水素ナトリ ウム 2. 9 3 g、 炭酸ナトリウ ム 1. 5 9 g、 アジ化ナトリウム 0. 2 gを含有し、 p H 9. 4〜 9 · 6に調整さ れたものである。
この際、 FliC 9 k D aポリペプチドを G S Tと融合させた抗原処方物を使用す ることにより、 該抗原処方物をマイクロプレート上にコーティングし易く、 また作 製された E L I S Aプレートも良好な安定性及ぴ均一性並びに高感度のコーティ ングを得るものとなった。 また、 E L I S Aプレートは、 検出精度を維持するため に、 使用時まで 2〜 5 °Cの暗所にて保存することが好ましい。
サルモネラ陽性血清は、 S E不活化ワクチン （レイヤーミュ一ン S E) で免役し た鶏より作製する。 2 1〜 7 0日齢の S P F鶏にレイヤーミューン S Eを 1. 0 ド ース皮下接種し、 アイソレーターの中で飼育する。 ワクチン接種 4週間後に採血し、 血清分離を行い、 5 6°Cで 3 0分間非動化する。 市販のひな白痢診断用抗原により 凝集反応 （P D— R PA) を行い、 凝集価 8倍を示す血清を 5 0 0倍希釈する。 こ のものは、使用時まで一 4 0°Cで保存するのが好ましいが、 凍結乾燥させても良い。 サルモネラ陰性血清は、 2 1〜 7 0 日齢の S P F鶏より調整する。 採血後、 上記 サルモネラ陽性血清と同様に血清分離及び非動化を行い、 P D _R P Aで陰性であ ることを確認してプールし、 牛胎児血清を用いて 1 0倍希釈する。 このものを 5 m 1容のパイアル瓶に 1 0 0 μ 1ずつ分注して凍結乾燥する。 また、使用時まで 2〜 5 °Cの暗所に保存することが好ましい。
血清希釈液は、 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 （以下 P B Sと云う） に牛胎児血清 1 0 m 1、 ポリソルベート 2 0を 1 m 1、 ァジ化ナトリウム 0. 0 2 g、 1 %フエノ ールレッ ド 0. 3 m l 、 ゲンタマイシン l m l を加えて 1 0 0 0 m l に調整し、 ス ターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、 滅菌容器に小分けして 2〜 5 °Cで保存する。 コンジユゲート希釈液は、 P B Sにポリソルベート 2 0を 2m 1、 牛胎児血清 1 m l、 マラカイ トグリーン 0. 0 5 gを加えて 1 0 0 0 m lに調整し、 血清希釈液 と同様にスターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、 滅菌容器に小分けして 2〜 5 °C で保存する。
O P D希釈液は、 蒸留水にクェン酸一水和物 2 1. 0 1 g、 無水リン酸一水素ナ トリウム 28. 40 g、 30 %過酸化水素水 l m l を加えて 1 000m lに調整し、 溶解後、 2〜5°Cで保存する。
上記の如く調整した試薬を用いた E L I S A法による検査手順を以下に示す。 こ の際、 各試薬は使用する前に室温に戻しておく。
まず、 検査用試科を準備する。
試料としては鶏の血清或いは卵黄を用いたりする。該試料を 1 m 1シリ ンジで 0. 6 m 1 をマイクロテス トチューブに取り、等量の血清希釈液を加えてよく混合し、 試料の 1次希釈液を作製する （2倍希釈） 。 次いで、 試料希釈用マイクロプレート (FALCON製の組織培養用マイクロテス トプレート平底、 低蒸発タイプ、 9 6穴 の盖付きもの） に A段の 1〜 8列を除いて、 血清希釈液を 2 50 1 /ゥエルずつ 分注し、 試料の 1次希釈液を 4 μ 1 Ζゥエルずつ分注して、 20分間プレートミキ サ一で充分に攪拌して試科の 2次希釈液を調整しておく （ 1 2 5倍希釈） 。
1. 1次血清との反応 （試料との反応）
上記希釈用マイクロプレートの Α段の 1〜 4列にサルモネラ陰性血清（ 5 00倍 希釈） 、 5〜 8列にサルモネラ陽性血清 （ 1 0 00倍希釈） を分注する。 一方、 G S T 9 k D aポリべプチド抗原を担持させた E L I SAプレートの A段 1〜8列 を除いた全てのゥエルに血清希釈液を 7 5 IX 1ずつ分注し、上記試料の 2次希釈液 を 2 5 μ 1ずつ加える （最終希釈が 5 00倍となる） 。 更に、 該 E L I S Αプレー トの A段 1〜 4列にサルモネラ陰性血清、 5〜 8列にサルモネラ陽性血清を夫々れ 1 00 μ 1ずつ分注し、 室温で 3 0分間、 抗原と反応させる。
2. 2次血清との反応 （コンジュゲートとの反応）
1の反応が終了後、 反応液を捨て、 蒸留水でゥエルを 3回洗浄し、 水分を除去し た後、 酵素で標識された抗ニヮ トリ I g G (Η+ L) ゥサギ血清をコンジユゲート 希釈液で 3000倍希釈となしたものを、全てのゥエルに 1 00 μ 1ずつ分注し、 室温で 3 0分間反応させる。
3. 基質との反応 （発色）
2の反応が終了後、 反応液を捨て、 蒸留水でゥエルを 3回洗浄し、 水分を除去し た後、 オルトフエ二レンジァミンを O P D希釈液で適宜希釈したものを 0. 0 5 m gZゥエルとなるように各ゥエルに分注し、 1 0分間室温で反応させる。
4. 反応の停止
3の反応が終了後、 3規定硫酸を全てのゥエルに 1 0 0 /^ 1ずつ分注し発色を停 止させる。
5. 抗体価の決定
4の反応停止後、 プレートリーダ一で各試料の吸光度を （OD) を 4 9 0 nmで 測定し、 m— OD値 （修正 OD値） を次式により計算する。
m— OD値 = (S—NC) / (P C— NC) ( S ：試科の OD値、 P C ：サル モネラ陽性血清の OD値、 NC ： サルモネラ陰性血清の OD値を示す）
以下、 本発明を実施例により詳細に説明する。
(実施例 1 )
• マーカー検出系としての試み及び m— OD値における陽性基準の設定
S E不活化ワクチン接種群を 3群と'し、 以下の通り試料を採取した。
( 1 ) 8 1〜 9 3 日齢で市販の S E不活化ワクチン（レイヤーミューン S E— NB) を接種した 1 9 2日齢の鶏群より鶏卵 1 8個、 （2) 4 9〜 5 4日齢及び 7 0〜 8 9日齢でレイヤーミユーン S Eを接種した 4 2 0日齢の鶏群より鶏卵 1 9個、（ 3) 5 7 , 5 8日齢及ぴ 9 6〜 9 9日齢でレイヤーミュ一ン S Eを接種した 6 9 0日齢 の鶏群より鶏卵 2 2個を採取した。従来の S E抗体検出試験法として使用される市 販の C AF— S Eエリーザ （弊社製） 及びひな白痢診断用抗原を用いた急速平板凝 集反応 （PD— R PA) を 9 k D aポリぺプチドをコ一ティングした本発明の E L I S A法と共に行った。 結果を表 1〜 3に示す （表 1 : 1 9 2日齢、 表 2 : 4 2 0 日齢、 表 3 ： 6 9 0日齢） 。
(表 1 )
Figure imgf000013_0001
a) 市販の SEェリ一ザ
b) GST-9kDa ポリペプチドをコーティングしたプレートを用いたエリーザ c) ELISA I ： 0.2以上、 ELISA Π -9 ： 0.1以上が陽性を示す。
(表 2 )
Figure imgf000013_0002
(表 3 )
検体 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ELISA I 0.08 0.20 0.22 0.09 0.13 0.16 0.68 0.23 0.32 0.06
Π-9 0.02 0.33 0.22 0.06 0.10 0.10 0.09 0.13 0.09 0.01
PD-R] PA 一 ― 一 一 一 ― ― ― 一 ― 検体 No. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ELISA I 0.46 0.17 0,32 0.18 0.40 0.10 0.19 0.27 0.30 0.41
Π-9 0.18 0.28 0.36 0.26 0.21 0.24 0.14 0.33 0.10 0.14
PD-R] PA ― ― 一 ― ― 一 ― ― 検体 No. 21 22
ELISA I 0.19 0.14
Π -9 0.32 0.03
PD-R] PA ― ―
(比較例 1 )
約 1年前に環境から S Eが分離された農場より採取した 1 0 0個の卵の卵黄に ついて、 実施例 1 と同様に抗体の検出を行った。 結果を表 4に示す。
(表 4)
検体 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ELISA I 0:02 0.04 0.22 0.06 0.08 0.04 0.01 0.04 0.07 0.04
Π-9 0.02 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.03 0.02 0.01 0.02
PD-RPA ― ― ― ― ― ― ― ― ― 検体 No. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ELISA I 0.04 0.03 0.01 0.06 0.02 0.00 0.04 0.07 0.10 0.09
Π-9 0.02 0.02 0.01 0.02 0.01 0.01 0.02 0.03 0.03 0.01
PD-RPA ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― 検体 No. 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
ELISA I 0.06 0.03 0.09 0.09 0.18 0.04 0.06 0.00 0.02 0.05
Π-9 0.07 0.02 0.02 0.05 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02
PD-R] PA ― ― ― ― ― ― ― ― 一 一 検体 No. 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
ELISA I 0.05 0.03 0.07 0.04 0.10 0.07 0.03 0.03 0.05 0.01
Π-9 0.03 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.01 0.04 0.02 0.02
PD-R] PA 一 ― 一 一 ― ― ― ― ― ― 検体 No. 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
ELISA I 0.02 0.08 0.05 0.10 0.11 0.02 0.05 0.04 0.04 0.10
Π-9 0.02 0.02 0.02 0.05 0.03 0.02 0.03 0.02 0.03 0.05
PD-RPA ― 一 一 一 ― ― ― ― ― 一 検体 No. 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
ELISA I 0.05 0.08 0.05 0.19 0.08 0.06 0.07 0.06 0.05 0.04
Π -9 0.04 0.01 0.01 0.04 0.02 0.02 0.03 0.03 0.02 0.02
PD-Rlコ A ― ― ― ― ― 一 ― 一 ― 検体 No. 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
ELISA I 0.14 0.07 0. 10 0.05 0.07 0.01 0.09 0.07 0. 10 0.04
Π -9 0.02 0.03 0.02 0.02 0.04 0.02 0.02 0.05 0.06 0.03
PD-Rl PA ― 一 ― ― ― ― ― 一 ― 検体 No. 7 1 72 73 74 75 76 77 78 79 80
ELISA I 0.06 0.10 0.27 0.14 0.05 0.04 0.10 0.06 0.06 0.05
Π -9 0.03 0.03 0.05 0.05 0.05 0.02 0.01 0, 01 0.02 0.03
PD-RPA ― 一 ― ― ― ― ― ― 一 ― 検体 No. 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
ELISA I 0.06 0.08 0. 12 0.09 0. 13 0.05 0.09 0.07 0. 14 0. 12
Π -9 0.04 0.03 0.02 0.02 0.03 0.02 0.02 0.03 0.03 0.05
PD-RPA ― ― ― 一 ― ― ― ― 一 ― 検体 No. 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
ELISA I 0.02 0.06 0.07 0.12 0.11 0.09 0.08 0.04 0.06 0.11
Π -9 0.02 0.03 0.03 0.02 0.04 0.04 0.02 0.02 0.01 0.05
PD-R] PA ― ― ― 一 ― ― ― ― ― ―
* SE分離歴：約 1年前に SEが分離された。 これ以降は調べられていなレ、。 ここに、 上記した m— O D値における陽性基準は、 S E不活化ワクチン接種群の 中で 6 5 0〜 7 2 0日齢の鶏群由来の卵黄を用いた試験に於いて 5 0 %以上の陽 性率となること、且つ S E汚染農場由来の卵黄及び購入した S P F鶏群由来の卵黄 (SPAFAS社より購入した鶏卵より採取） を用いた試験に於いて全て陰性となるこ とを条件とした。
•成績及び考察
C A F— S Eエリ一ザを用いた卵黄中の S E特異抗体検出率は、 日齢と共に低下 することが明らかとなり、 P D— R P A法では、 1 9 2日齢鶏群由来の卵黄で 1例 の陽性が認められたのみであるが、 本発明の E L I S Aプレートに於いては、 in— 00値で0. 1以上を陽性とした場合、 1 9 2日齢及ぴ 4 2 0日齢鶏群由来卵黄を 用いた場合約 9 5 %の陽性率、 6 9 0日齢鶏群由来卵黄でも陽性率は約 7 0 %であ つた。 また、 S E分離農場からの卵黄では、 本発明の E L I S Aプレートに於いて m— OD値 0. 1以上を示す検体は 1例もなく、 1 0 0検体の最大 m— O D値は、 0. 0 7であった。 また、 表には示さなかったが、 購入した S P F鶏群由来卵黄は、 本発明の E L I S Aプレートでは全て陰性であった。 また、 卵黄の代わりに血清を 用いた場合もほぼ同様の結果が得られた。
以上により、 本発明の E L I S Aプレートは、 マーカー検出としての使用を可能 にするものと考察し、 m— OD値 0. 1以上を陽性基準に設定される。
(実施例 2)
•産卵中の S E投与鶏を用いた各種抗体検出法による抗体応答の経時的観察 過去 5年間、 S E分離歴のない農場の 2 4 0日齢ハイライン系ホワイ トレグホン 2 0羽を用いて、 S E投与試験を 2回行った （各試験につき、 投与群と非投与対照 群を 5羽ずつ設定し、 同時に試験を行った） 。 感染鶏舎内へ鶏を導入する前に鶏舎 内及び鶏群のプール盲腸便について S E分離を行い、夫々れ陰性であることを確認 した後、 次の投与試験を行った。 S E N o . 1 5株を 3 X 1 09〜 1 01°C F U /羽となるように、 2日開けて 2回経口投与し、 接種 3日後、 1週間後、 2週間後、 4週間後、 6週間後、 8週間後、 1 0週間後にクロァカスヮブ、 卵及び血液を採取 して S E分離を行った。 結果を表 5〜 7に示す （表 5 ： クロアカスヮブ、 表 6 ：卵 内容、 表 7 ：血液） 。 また、 試験最終日に剖検を行い、 盲腸内容、 肝臓、 脾臓及び 輸卵管を採取して S E分離を行った。 結果を表 8に示す。 また、 採取した血液及び 卵を用いて、 CAF— S Eエリーザ、 本発明の E L I S Aプレートでの反応性を調 ベると共に、 ひな白痢診断用抗原を用いた急速平板凝集反応 （PD— R P A) を行 つた。 結果を表 9〜 1 2に示す （表 9 ：試験 N o . 1における血液中の経時的な抗 体検査成績、 表 1 0 ：試験 N o. 1における卵黄中の抗体検査成績、 表 1 1 ：試験 N o . 2における血液中の抗体検査成績、 表 1 2 ：試験 N o . 2における卵黄中の 抗体検查成績） 。
尚、 各検体からの S E分離は以下の方法により行った。
クロアカスヮブ、 血液及び卵は約 1 0倍量のハーナテトラチオン酸塩基礎培地 (HTB) に採取し、 3 7 °Cで 4 8時間培養後にそれを ML CBに画線塗抹し、 4 8時間培養後に S E陽性を判定し、そこで得られたコロニーをトリブトソーャ寒天 培地に移植して 24時間培養後、サルモネラ免疫血清 O 9群との反応を行い凝集性 の有無を確認した。 剖検時に無菌的に採取した輸卵管は、 片方を結紮し形成中の卵 を取り除いた後、 もう一方から HT Bを加え内容物をよくもんで取り出し、 その洗 浄液を試料とした。 肝臓及び脾臓は夫々れ 5 gずつを無菌的に採取した後、 約 1 0 倍量の HTBを加えてホモゲナイズしたものを試科とした。これらを 3 7°Cで 4 8 時間増菌培養した後 MC L Bに画線塗抹し、更に 4 8時間後に S E陽性を判定した。 そこで得られたコロニーをトリブトソーャ寒天培地に移植して 24時間培養後、サ ルモネラ免疫血清◦ 9群との反応を行い凝集性の有無を確認した。
(表 5 ) SE投与群におけるクロアカスヮブからの SE分離成績
Figure imgf000017_0001
a) + : SE分離陽性
b) - ： SE分離陰性 (表 6 ) SE投与群における卵内容からの SE分離成績
Figure imgf000018_0001
(表 7 ) SE投与群における血液からの SE分離成績
Figure imgf000018_0002
(表 8 ) SE投与群における剖検時 (投与 10週後）の盲腸内容、 輸卵管内容物、 肝臓及び脾臓からの SE分離成績
5式験 検体 投与後経過日数或いは週数
No. No, 盲腸内容 輸卵管内容物 肝臓 脾臓
1 ― ― ―
2 + ― ― ―
1 3 ― ― ― ―
4 + ― ― ―
5 一 ― ―
投経過予後数週数いあはる日
11 ― ― ―
12 ― ― 一
2 13 + ― 一 一
14 + 一 一 一
15 ― ―
(表 9 ) 試験 No.1における血液中の経時的な抗体検査成績
SE投与群 非投与対照群 検体 No. 3 4 6 7 8 9
0曰 ELISA 0.02 0.00 0.04 0.05 0.00 0.01 0.03 0.04 0.04
Π -9 0.01 0.00 0.01 0.01 0.00 0.01 0.01 0.01 0.00
PD-MPA
3曰 ELISA 0.05 0.03 0.05 0.05 0.06 0.02 0.03 0.03 0.04
Π -9 0.01 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA
1週 ELISA 0.11 0.09 0.05 0.08 0.05 0.02 0.04 0.04 0.07
Π -9 0.02 0.01 0.01 0.03 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA + +
2週 ELISA 0.08 0.10 0.11 0.12 0.10 0.03 0.07 0.05 0.04
Π -9 0.01 0.02 0.01 0.04 0.03 0.02 0.02 0.01 0.01
PD-MPA + + + + +
4週 ELISA 0.04 0.03 0.05 0.04 0.02 0.02 0.02 0.05 0.04
Π -9 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00 0.01 0.01 0.02 0.01
PD-MPA + +
6週 ELISA 0.05 0.02 0.04 0.05 0.03 0.02 0.05 0.07 0.03
Π -9 0.01 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01
PD-MPA +
8週 ELISA 0.05 0.03 0.07 0.07 0.09 0.05 0.07 0.07 0.05
Π -9 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01
PD-MPA
10週 ELISA 0.05 0.04 0.08 0.10 0.06 0.06 0.05 0.07 0.09
Π -9 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02
PD-MPA +
* ELISA I ：市販の SEエリーザを用いた ELISA反応における m-OD値
(0.2以上を陽性、 0.2未満を陰性とする）
* ELISA II -9： GST-9kDa ポリペプチドをコーティングしたプレートを用い
過数いはある日
た ELISA反応における m-OD値 （0.1以上を陽性、 0.1未満を陰性とする） * PBSで 1 0 0倍に希釈した血清と、 同様に 1 0 0倍に希釈したひな白痢診 断用菌液を混合し、 5 2 °Cで 2時間反応を行い、 その後 2〜 5 °Cに 1晚静 置後凝集像を観察し、 陽性コントロールとして設定した SE不活化ワクチン 接種 4週後の血清と同様の凝集像を呈したものを陽性 （+ ) と判定する。 (表 1 0 ) 試験 No.1における卵黄中の抗体検査成績
SE投与群 非投与対照群 検体 No. 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0曰 ELISA 0.02 0.02 0.01 0.04 0.02 0.03 0.05 0.09 0.08 0.05
Π -9 0.01 0.00 0.00 0.01 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA
3 曰 ELISA 0.02 0.03 0.01 0.07 0.03 0.02 0.05 0.05 0.04 0.04
Π -9 0.01 0.00 0.00 0.02 0.01 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA
ELISA 0.01 0.04 0.01 0.06 0.00 0.01 0.05 0.06 0.08 0.04
Π -9 0.00 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.01 0.01 0.00 0.00
PD-MPA
2週 ELISA 0.18 0.09 0.10 0.07 0.03 0.03 0.06 0.06 0.04 0.03
Π -9 0.01 0.00 0.00 0.04 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00
PD-MPA
4週 ELISA 0.04 0.03 0.04 0.05 0.03 0.02 0.02 0.05 0.04 0.03
Π -9 0.01 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA
6週 ELISA 0.07 0.03 0.05 0.11 0.05 0.03 0.08 0.05 0.04 0.06
Π -9 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01 0.01 0.02 0.00 0.01 0.01
PD-MPA
8週 ELISA 0.04 0.05 0.03 0.05 0.04 0.01 0.07 0.06 0.07 0.06
Π -9 0.01 0.00 0.01 0.01 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01
PD-MPA
10週 ELISA 0.05 0.02 0.02 0.07 0.04 0.01 0.06 0.06 0.04 0.04
Π -9 0.01 0.01 0.00 0.01 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0,01
PD-MPA
* PD-MPA : PBSで 1 0倍に希釈した卵黄と、 同様に 0 0に希釈したひな 白痢診断用菌液を混合し 5 2でで 2時間反応を行い その後 2〜 5 °Cに 1 晚静置後凝集像を観察し、 陽性コントロールと して設定した SE不活化ワク チン接種 4週後の血清と同様 凝集像を呈したものを陽性 （+ ) と判定す る。
：表 1 1 ) 試験 No.2における血液中の抗体検査成績
Figure imgf000021_0001
(表 1 2 ) 試験 No.2における卵黄中の抗体検査成績
Figure imgf000022_0001
•成績と考察
各試料からの S E分離を行った結果、クロアカスヮブからは表 5に示すとおり、 試験 N o . 1及ぴ 2において接種群の全ての鶏より少なく とも 1度は S E分離が認 められたが、 2週間後以降から S E分離が認められない個体が、 試験 N o . 1では 2羽、 試験 N o . 2では 1羽存在した。 卵内容物及び血液からは、表 6及び 7に示すとおり、何れの時期に於いても S E 分離は認められなかった。
盲腸内容、 肝臓、 脾臓及び輸卵管からは、 表 8に示すとおり、 盲腸内容からのみ 試験 N o . 1の 5羽中 2羽において S E分離が認められた。 尚、 対照群に於いては 全ての試料について陰性であった。
また、 血液及び卵黄中の抗体を調べた結果、 表 9〜1 2に示すとおり、 CAF— S Eエリーザに於いては、 2群の検体 N o . 1 3 , 1 4及び 1 5の血液が 1 , 2, 4週後の時点で陽性を示し、 検体 N o . 1 1 , 1 4及び 1 5の卵黄が血液で陽性が 見られたのよりもやや遅れて 2， 4， 6週後の時点で陽性を示した。 一方、 本発明 の 9 k D aポリぺプチドをコ一ティングした E L I S Aプレートでは、全ての検体 が陰性を示した。
以上より、 S E投与産卵鶏に於いても G S T 9 k D aポリぺプチドをコ一ティン グした E L I S Aプレー トの抗体検出法は、血清及び卵黄共に全てに陰性を示すこ とから、 S E不活化ワクチン接種鶏と S E感染鶏の血淸及び卵黄を用いた検査に於 いてマーカ一検出法に適していると判断される。
(実施例 3)
•市販されている S E不活化ワクチン接種鶏由来血清を用いた試験
市販の S E不活化ワクチンが 5 3 k D aポリぺプチドに対する抗体産生能を有 しているかどうかについて検討した。
市販の S E不活化ヮクチン Aを 2 6 日齢の S P F鶏 5羽に 0. 5 m 1 Z羽接種、 Bを 3 1 日齢の S P F鶏 1 0羽に 0. 5 m l /羽接種、 Cを 3 3 0齢の3 ? 鶏5 羽に 0. 5 m 1 Z羽接種、 Dを 3 3 日齢の S P F鶏 5羽に 0. 2 5 m 1 Z羽接種、 Eを 3 3 日齢の S P F鶏 4羽に 0. 2 5 m lノ羽接種し、 夫々れ接種 4週後に得ら れた血清を用いて、 C AF— S Eェリ一ザ及び本発明の E L I S Aプレートによる E L I S A反応及ぴ 5 3 k D aポリぺプチド並びに G S T 9 k D aポリぺプチド を抗原とした Western Blotting (WB) 反応'を行い、 夫々れ抗原に対する抗体産 生性を確認した。 WB法では 2種類のポリぺプチドを用いて 1 0 %ポリアタリルァ ミ ドゲルを用いた S D S— P AG Eを行った後、それを二トロセルロース膜に転写 し、各試験血清 1 μ 1 と室温で 9 0分間反応させた後に 2次血清として抗ニヮ トリ I g Gゥサギ血清を 2 0 0 0倍希釈したものを用いて室温で 9 0分間反応させた。 最後に基質として 4一クロ口 1一ナフ トールを使用した。 結果を表 1 3に示す。
(表 1 3 ) 各種 SE不活化ワクチン接種鶏由来血清を用いた抗体反応の成績
Figure imgf000024_0001
A及び Bは用法用量通りに接種を行った力 、
とされているところを 1回のみとした。 * I ：市販の SEエリーザを用いた ELISA反応における m-OD値 (0.2以上を陽性、 0.2未満を陰性とする）
* n-9:GST-9kDaポリぺプチドをコ一ティングしたプレートを用いた ELISA 反応における m-OD値 （0.1以上を陽性、 0.1未満を陰性とする）
·成績と考察
E L I S A法では、 S E不活化ワクチン C、 D、 Eは用法用量で規定されている 量の半量を接種したため、 低い抗体価を示す鶏群もあったが、 WB法に於いては 5 3 k D aポリぺプチド及び G ST 9 k D aポリぺプチドを抗原とした両方の場合 で全ての検体でバン.ドが認められたため （図 3〜 5参照） 、 市販の S E不活化ワク チンは 5 3 k D aポリぺプチド及び 9 k D aポリぺプチドに対する抗体産生を誘 導するものと考えられる。
以上より、 S E不活化ワクチン接種鶏について、 5 3 k D a或いは 9 k D aポリ ペプチドをコーティングした E L I SAプレー.トを用いた検出法 （E L I S A法） 、 及びこれら抗原を用いた WB法により S E感染鶏と区別することができた。
(実施例 4)
- G S T 9 k D aポリぺプチドの細胞への接着性確認試験
S E fliCの一部である 9 k D aポリぺプチドが S Eのコロニー形成の最初のス テップとなる上皮細胞への接着作用を持つかどうかの確認を行った。
G S T 9 k D aポリぺプチドをコ一ティングしたプレート、対照抗原として市販 の S Eエリーザプレート （CAF— S Eエリーザ） 、 N Dエリーザプレート及び 1 %牛アルブミン P B S液を 0. 1 m 1 /ゥエルずつ分注し、 1時間室温に置いた後、 液を捨てた状態のプレートに夫々れ 1. 9 X 1 04個/ゥエルとなるよう MEMで 調整した H e L a細胞を分注して、 3 7°Cで 1時間反応後、 液を捨て MEMでゥェ ルを洗浄し細胞の接着状態を観察した。
·成績と考察
H e L a細胞と各プレートとの反応は、牛アルブミンのみを分注したプレートで は接着 （一） 、 市販の S Eエリーザプレート （CAF— S Eエリーザ） では （+ ) 、 G S T 9 k D aポリぺプチドをコーティングしたプレートでは （++) 、 市販の N Dエリーザプレートでは （ + + + ) となり、 G S T 9 k D aポリペプチドは H e L a細胞に接着する抗原であることがわかった。
よって、 G S T 9 k D aポリペプチドは S E fliCの中でも上皮細胞に接着する ことによりコロニー形成に重要な役割を果たす抗原であると考えられる。 産業上の利用可能性
以上の如く構成した本発明により、 S E不活化ワクチン接種鶏と S E感染鶏との 間に血清学的なマーカーとなり うる違いを確認、できることが明らかとなった。これ により、 FliC9 k D aのポリぺプチド又はその複合物を用いて、 S E不活化ワクチ ン接種鶏と S E感染鶏とを容易に識別することができるものとなる。 また、 FliC 9 k D aのポリぺプチド又はその複合物が S E不活化ワクチンの抗原の中で免疫 組織学的に重要な役割を担つていることから、この抗原をサブュニッ トワクチンと して多価ワクチンを製造することができる。 更に、 この抗原処方物は FliC 9 k D a ポリぺプチドからなるべん毛抗原を持つサルモネラ菌属全ての不顕性感染にとつ て有効であること力ゝら、 S Eに限らず他のサルモネラ菌属の検出にも適用できるも. のとなる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 .野外型サルモネラ感染動物とワクチン接種感染動物とを識別するマーカ一抗原 であって、サルモネラ種のべん毛抗原中に於けるフラジェリ ン 5 3 k D a中の発現 プロダク ト 9 k D aポリぺプチド又はその複合物からなる抗原を含有することを 特徴としたサルモネラ抗原処方物。
2 . サルモネラ種がサルモネラ .ェンテリテイデイスであることを特徴とした請求 の範囲 1記載のサルモネラ抗原処方物。
3 . 9 k D aポリペプチドの複合物からなる抗原は、 9 k D aポリペプチドをダル タチオン一 S— トランスフエラーゼと融合させた融合蛋白質であることを特徴と した請求の範囲 1又は 2記載のサルモネラ抗原処方物。
4 . 酵素抗体法により、 血清試料、 卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動 体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキッ トであり、該抗体と免疫 反応する抗原を支持体上に担持させた抗体検出用キットに於いて、種々のコント口 ール血清、 血清希釈液、 コンジュゲート希釈液及びオルトフヱ二レンジァミン希釈 液を含み、支持体は請求の範囲 1記載のサルモネラ抗原処方物が配されていること を特徴としたサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検查キッ ト。
5 . 支持体は、 サルモネラ ·ェンテリテイデイスのべん毛抗原中に於ける 9 k D a ポリぺプチド又はその複合物からなる抗原を含有するサルモネラ抗原処方物を配 し、 サルモネラ ·ェンテリティディス感染鶏とサルモネラ ·ェンテリティディス不 活化ワクチン接種鶏とを血清学的に検査することを特徴とした 請求の範囲 4記 載のサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キッ ト。
6 . 支持体は、 フラジェリン 5 3 k D a中の発現プロダク ト 9 k D aポリぺプチド をグルタチオン一 S— トランスフェラーゼと融合させた融合蛋白質を含有するサ ルモネラ抗原処方物が配されていることを特徴とした請求の範囲 4又は 5記載の サルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キッ ト。
7 . 請求の範囲 1記載の抗原を含んでなる、 サルモネラ菌属の感染に対して動物を 防御することを特徴としたサルモネラサブュニッ トワクチン。
8 . 請求の範囲 2記載の抗原を含んでなる、 サルモネラ ■ェンテリティディス感染 に対して鶏を防御することを特徴としたサルモネラ ·ェンテリティディスサブュニ ッ トワクチン。
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