CN117050151A - 滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用 - Google Patents

滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用，所述rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质。本发明提供的试剂盒明显优于其他蛋白或MS全菌包被后的检测效果，可用于MS抗体水平的准确监测、感染状况的准确检测，特别地可用于活疫苗免疫与临床感染菌株的鉴别检验，利于种鸡场MS净化；也可用于其他靶动物如鸽子血清MS抗体的检测和健康评估，能有效避免假阴性及漏检。

Description

滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用。
背景技术
滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)是禽类致病性支原体之一，主要感染鸡、火鸡、鸽子等。家禽感染MS后主要表现鸡足垫肿胀，关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎，还可引起呼吸道症状及气囊炎，MS感染可使鸡群淘汰率增加、肉鸡胴体品质差、蛋鸡产蛋率下降等。MS对各个年龄的鸡、火鸡均能感染，但雏鸡感染性最高，一旦感染大多终身带菌。MS临床上常与NDV、IBV、大肠杆菌等病原混合感染。MS感染已成为危害养鸡业发展的重要疫病。
目前，MS抗体的检测方法包括平板凝集试验(RSA)、血凝抑制试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。RSA操作简便，但其同鸡毒支原体抗体存在交叉反应；IHA特异性良好，也可用于鸡毒支原体(MG)和MS的鉴别诊断，但其需要新鲜的鸡红细胞且现用现配，操作比较繁琐。目前，还无商品化MS ELISA抗体检测试剂盒获批，国外IDEXX公司有MS ELISA抗体检测试剂盒在国内销售，但该试剂盒所包被的MS抗原与国内MS流行菌株有显著差异，在国内不同种禽场MS临床检测、净化应用中效果欠佳。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，以及含该重组蛋白的MS间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，所述rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
如上所述的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的制备方法，其包括先采用引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的序列对SEQ ID NO.1所述序列扩增或滑液囊支原体的基因组为模板进行扩增并回收，采用同源臂上游引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13对回收的模板添加同源臂，将同源臂回收产物与pET-28a载体进行同源重组获得连接产物，将连接产物加入感受态细胞，转染后培养，鉴定后获得含阳性的重组pET-28a-mspb的质粒，将质粒转入感受态细胞，获的阳性菌落，将阳性菌落培养诱导后获得滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白。
一种滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒，其包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，还包括酶标记物以及用于滑液囊支原体抗原抗体的检测试剂、样品稀释液、阴性对照、阳性对照、显色液和终止液，所述酶标记物为含针对所检抗体的酶标记抗体溶液。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被浓度为0.0016～5μg/ml，优选为0.2～5μg/ml，更优选为0.2μg/ml；每孔100～200μl；支持介质为微量滴定板。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被抗原浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5μg/ml。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，酶标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖甘酶标记兔抗鸡抗体的溶液，酶标记物所用的酶标稀释液为每升双蒸水中含6.06g Tris、8～12gBSA、0.1ml Tween-20、0.5ml ProClin300；进一步地，BSA最优选为10g；酶标记物与酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释，进一步优选为1∶20000～1∶40000稀释，更优选为1∶40000稀释。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述样品稀释液配方为每升双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29g Na2HPO4·12H2O、2g KCl、2～8g BSA、0.5ml ProClin300和5mlTween-20；进一步地，所述BSA优选为2g、3g、4g、5g、6g、7g或8g；进一步地，所述BSA更优选为5g。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，使用时，待检样品用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释倍数为1∶50～1∶400，进一步优选为1∶400。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述显色液的配制方法：先取0.3g TMB溶于40ml N-甲基甲基吡咯烷酮中，再取0.05g二乙烯三胺五乙酸、10.0gβ-环糊精、14.0g无水柠檬酸、10.0g二水柠檬酸三钠、1.0g核糖、0.08g氯化钙、0.3g过氧化脲溶于850ml双蒸水中，搅拌至完全溶解后，加入TMB混匀，加双蒸水定容至1L。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述阳性对照为滑液囊支原体免疫SPF鸡血清，所述阴性对照为未感染滑液囊支原体的SPF鸡血清。
如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H2SO4溶液，所述洗涤液为含0.05％v/v的Tween-20和0.005％v/v的Proclin300的磷酸盐缓冲液。
如上所述滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，优选地，其包括如下步骤：
1)用基因工程手段制备序列表中编码的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，用包被缓冲液稀释至包被浓度0.0016～5μg/ml，100μl/孔包被于微量滴定板，2～8℃包被16～24小时或37℃包被2小时后洗涤、封闭、干燥；
2)酶标记兔抗鸡抗体用酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释作为酶标记物；
3)分别制备样品稀释液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液；
4)将步骤1)包被的微量滴定板、所述步骤2)的酶标记物及所述步骤3)制备的样品稀释液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液组装成试剂盒。
如上所述的制备方法，优选地，包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，其制备方法为将碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.94g，完全溶解后，加纯化水定容至1000ml，pH值为9.6；
所述封闭用封闭液封闭，所述封闭液为每升双蒸水中含6.06g Tris、5g酪蛋白、1ml ProClin300，pH8.5，pH值为8.5；所述封闭的条件为2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时；
所述干燥的条件为在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时。
如上所述试剂盒在非诊断目的的检测方面的应用，所述非诊断目的的检测方面的应用包括动物感染滑液囊支原体的排查、离体血清的流行病学调查、动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，其具有较好的抗原特性，可用于作为检测滑液囊支原体抗体的包被蛋白，用于免疫试剂盒的制备或用作滑液囊支原体的疫苗。
本发明制备的试剂盒所用的包被抗原优选的rMSPB亚单位蛋白，与MS全菌抗原相比，避免了与其它禽支原体特别是与鸡毒支原体血清的交叉反应，特异性更好；同时，用大肠杆菌制备重组蛋白避免了全菌抗原制备时存在的生物安全风险，制备成本也比较低。本发明技术人员还意外发现rMSPB截短蛋白包被的试剂盒检测MS血清的效果明显优于其他蛋白包被，可用于MS感染状况的准确检测及疫苗免疫抗体水平的准确监测；适用于确定鸡血清中抗MS抗体的含量，特别是用于减毒活疫苗免疫与临床感染菌株的鉴别检验，适用于鸡场MS感染净化；还可用于MS其他靶动物如鸽子血清的检测。
本发明提供了一种滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒，是用MS国内流行株rMSPB截短蛋白作为包被原，检测血清的效果明显优于其他包被蛋白；可准确检测疫苗免疫后抗体消长，特别用于减毒活疫苗免疫与临床感染菌株的鉴别检验，适用于鸡场MS感染净化；也可用于其他靶动物如鸽子血清的检测，能有效避免假阴性及漏检。
具体实施方式
本发明中术语“滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)及其感染”，主要临床症状包括鸡足垫肿胀，腱鞘、关节等滑膜增厚等症状，部分鸡表现出气囊炎，MS感染可使鸡群淘汰率增加、肉鸡胴体品质差、蛋鸡产蛋率下降等。
术语“禽滑液囊支原体流行株”，2015年至今，主要养鸡省区大量鸡群中出现行动障碍、腿部关节肿大、生长发育不良病鸡，且鸡群的总体发病率、群内发病率均较高，剖检病鸡可见跗关节腔渗出物增加，自此分离出的菌株均为禽滑液囊支原体流行株。
术语“滑液囊支原体rMSPB截短蛋白”是MS的vlhA蛋白功能区之一。vlhA蛋白为MS结构蛋白之一，为膜表面的脂蛋白，具有黏附细胞的作用。术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖甘酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-NPP)；β-D-半乳糖甘酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷(4MUG)。
术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液(简称PBS)为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g，用超纯水定容至1L，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、现有产品检测临床情况分析：
从全国各地收集到170份临床鸡血清、40份鸽子血清，依据世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)推荐的平板凝集试验方法，使用中海生物商品化的鸡滑液支原体平板凝集试验抗原检测，结果鸡血清125份阳性、45份阴性，鸽子血清6份阳性、34份阴性。用IDEXX商品化MS ELISA试剂盒按其说明书进行检测，可检出鸡血清119份阳性、51份阴性，但无法对鸽子血清进行检测。由此可见，对于鸡血清，IDEXX商品化MS ELISA试剂盒不仅与平板凝集试验符合率低，还存在严重的漏检现象，而漏检、假阴性的鸡极易成为传染源，导致群发感染；对于鸽子血清，则不能进行检测。
种鸡MS的净化是减少商品鸡MS感染发病，提高生产效益的重要措施。在某种鸡场，用商品化MS ELISA试剂盒对种鸡MS感染进行持续抗体监测净化，虽然逐步降低了MS的感染率，但种鸡群大规模抽检发现，仍有部分鸡MS抗体阳性。表明商品化MS ELISA试剂盒可能存在漏检现象。
基于此，本发明人根据国内分离的MS流行株研制出MS重组蛋白及其相关检测技术产品，用于检测MS抗体。
2、滑液囊支原体流行株的分离、鉴定
2.1MS流行株的分离鉴定
先后从陕西省、山西省、宁夏自治区等省份患足垫或关节肿胀、气囊炎等疑似MS感染的鸡场，采集发病鸡的关节、气管、肺脏等病料。将病料组织用核酸提取试剂盒提取核酸，PCR方法进行MS检测，将MS阳性的50份病料用于MS的分离。具体为：将各病料剪碎，加入生理盐水振荡，5000转/分钟离心10分钟，将上清用0.22μm滤膜过滤，滤液按10％v/v接种于含氨苄青霉素(1000U/ml)的改良Frey培养基，置于37℃培养，待培养液颜色变黄后进行传代，连续传3代后收集培养液PCR方法进行鉴定，详情如下：
将分离的菌株分别用MS和鸡毒支原体(MG)的特异性引物进行特异性鉴定，同时设商品化疫苗株(购自澳大利亚生物资源公司)为阳性对照，未添加模板为阴性对照。PCR反应体积为25μl，其中Primer mix 12.5μl，dd H2O9.5μl，上、下游引物(10pmol/μl)各1.0μl，模板2μl。PCR扩增程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
参照SNT 1224-2012禽支原体病检疫技术规范，MS鉴定引物序列为：
上游引物F(SEQ ID NO.2)：GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC；
下游引物R(SEQ ID NO.3)：CAG TCG TCT CCG AAG TTA ACA A。
MG鉴定引物序列为：
上游引物F(SEQ ID NO.4)：GAG CTA ATC TGT AAA GTT GGT C；
下游引物R(SEQ ID NO.5)：GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC。
结果判定：MG的扩增产物为186bp，MS的扩增产物为211bp，在阳性对照出现相应大小片段，阴性对照未出现相应片段，试验成立，待检样品出现186bp条带为MG阳性，出现211bp条带为MS阳性。
分离时由于滑液囊支原体生长缓慢，易于被其他菌污染，从阳性病料中分离鉴定出8株MS，依次命名为YL、YL-A、Q9、M6、W-1、XP-1、XP-2、XP-4。
2.2进化分析
根据MS WVU1853株序列(NCBI登录号：CP011096.1)设计引物，扩增vlhA基因氮端序列即rMSPB。根据8株MS分离株脯氨酸富集重复区数量对其进行基因分型。以WVU1853株为参考基因，用DNAstar软件对分离株MSPB基因进行比对分析。将MS分离株与国内外其它地区报道的MS MSPB序列用Mega6.0进行进化分析。结果表明，8株分离株同我国河南、安徽、江苏等地分离株亲缘关系均较近，均为流行株。
2.3血凝和血凝抑制试验
用1％鸡红细胞测定8株MS分离株培养物的红细胞吸附凝集效价，具体操作按中国兽药典附录进行。结果：8株MS分离株中有7株能凝集鸡红细胞，血凝效价为1∶32～1∶128，其中YL株血凝效价最高(1∶128)，表明YL株的血凝活性最强。
用MS阳性血清(购自中国兽医样品监察所)对分离株的血凝活性进行抑制，操作步骤如下：根据各菌株血凝效价测定结果，将各菌液稀释为8HAU，取50μl加入96孔V型微量血凝反应板，然后加入滑液囊支原体阳性血清和阴性血清，同时设置未加血清对照。结果，各菌株的血凝活性均可被MS阳性血清所抑制，说明所分离的菌株为滑液囊支原体。
实施例2滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的制备及鉴定
(1)vlhA基因的PCR扩增
参考MS WVU1853株基因序列(NCBI登录号：CP011096.1)，设计引物扩增MS YL株vlhA基因全长，其中上游引物F(SEQ ID NO.6)：GATG CGTAAAATAAAAGGATTT；下游引物R(SEQID NO.7)：TACCGTAATT ATAAAACAAAAAAGCC。将MS YL株用细菌基因组提取试剂盒提取基因作为模板。PCR反应体积为50μl，其中Primer mix 25μl，dd H2O 20μl，上、下引物(10pmol/μl)各1μl，模板3μl。PCR扩增程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。结果，PCR产物电泳后于约2500bp出现条带，为阳性。将该条带用凝胶回收试剂盒回收。
(2)MSPB基因的PCR扩增及点突变
根据大肠杆菌密码子偏爱性优化MS的MSPB基因，设计点突变引物见表1，以上述步骤(1)扩增的片段为模板分别扩增扩增体系和程序同步骤(1)中，获得约878bp和约108bp片段，经胶回收作为模板，以V1F/V2R为引物进行重叠PCR，重叠PCR的扩增反应体系和程序同步骤(1)中，获得约960bp片段，再将该片段进行胶回收。
表1 MSPB基因重叠PCR点突变引物
(3)重组pET-28a-mspb载体的构建
将上述步骤(2)回收的MSPB基因添加同源臂，然后与pET-28a载体进行同源重组连接。MSPB基因添加同源臂引物，同源臂上游引物F(SEQ ID NO.12)：CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAAACTCCAGCACCTG；同源臂下游引物R(SEQ ID NO.13)：GTGGTGGTGCTCGAGGTTTGAATTCTGATTTTTCT。
以步骤(2)回收的MSPB基因(960bp)为模板，用同源臂引物进行扩增，扩增产物进行胶回收。将胶回收产物测定浓度后与pET-28a载体进行同源重组。反应体系如下：pET-28a载体1μl，MSPB基因4μl，重组酶5μl。反应条件为50℃反应30分钟。将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰水浴反应30分钟，42℃热激90秒，然后加入LB液体培养基，37℃、220转/分钟振荡培养1小时，然后接种于含有Kan+(50μg/ml)的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR(以V1F和V2R为引物)，将鉴定为阳性的菌落接种含有Kan+(50μg/ml)的LB液体培养基，37℃、220转/分钟振荡培养6小时。将培养的菌液用质粒提取试剂盒提取质粒，然后送基因公司测序，结果见序列表SEQ ID NO.1所示。将测序正确的质粒命名为pE T-28a-mspb。
(4)含重组pET-28a-mspb质粒的Bal21菌的构建和鉴定
4.1重组pET-28a-mspb质粒转化Bal21菌及可溶性分析
将pET-28a-mspb质粒按上述方法转入Bal21感受态细胞。将鉴定为阳性的菌落接种含有Kan+(50μg/ml)的LB液体培养基，37℃、220转/分钟振荡培养6小时，然后加入终浓度为1mmol/L的IPTG，20℃诱导12小时。将菌液按10000转/分钟离心10分钟，菌体用Tris-Cl洗涤3次，按每g菌体用10ml A液(Tris-Cl 10mmol/L，pH9.2)重悬后用超声破碎仪破碎，工作1.2秒，间隔2秒，破碎10分钟。将菌体破碎液以12000转/分钟离心10分钟，取上清，沉淀用等体积A液重悬。将重组菌诱导前后，菌液破碎后离心的上清和沉淀进行SDS-PAGE。将待检样品与4×SDS-PAGE上样缓冲液按3∶1混合，沸水煮10分钟，冷却后上样，10μl/孔。电泳后将凝胶于考马斯亮蓝染液中染色，脱色后拍照。结果：相较于诱导前，诱导后菌液于40KDa左右处出现目的条带，且主要存在于上清中。
4.2重组rMSPB截短蛋白的纯化及含量测定
将上述4.1收获的上清用镍离子柱纯化。将上清用0.22μm滤膜过滤，将滤液加至用平衡液A液(Tris-Cl 20mmol/L，NaCl 150mmol/L，咪唑5mmol/L)平衡的镍柱，上样速度为2ml/min，用A液洗涤5个柱体积后，用洗脱液B液(Tris-Cl 20mmol/L，NaCl 150mmol/L，咪唑500mmol/L)洗脱，收集洗脱峰，然后进行SDS-PAGE分析。将洗脱蛋白于Tris-Cl缓冲液(20mmol/L)透析过夜，即得重组rMSPB截短蛋白。结果：纯化后重组rMSPB截短蛋白于约40KDa处出现明显条带，纯度＞80％。按BCA试剂盒说明书测定其含量，结果：重组rMSPB截短蛋白浓度为400μg/ml。
4.3重组rMSPB截短蛋白反应活性的测定
4.3.1 Western blot鉴定
将纯化的重组rMSPB截短蛋白进行SDS-PAGE，取出凝胶，置于PVDF进行转膜，100V转膜100分钟。将PVDF用PBST洗涤3次后，加入5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时。洗涤后，加入1∶3000稀释的鼠抗His单克隆抗体(购自Proteintech)或1∶1000稀释的鼠抗MS多克隆抗体(免疫商商品化滑液囊支原体灭活疫苗(购自青岛易邦生物工程有限公司)制备)，37℃反应2小时。洗涤后，加入1∶3000稀释的羊抗鼠抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司)，37℃反应1小时，然后加入ECL显色。结果：重组rMSPB截短蛋白与鼠抗His单克隆抗体及鼠抗MS多克隆抗体均可发生反应。
4.3.2 ELISA反应活性鉴定
将纯化的重组rMSPB截短蛋白用碳酸盐缓冲液(0.15mol/L，pH9.6)稀释至5μg/ml作为包被抗原，100μl/孔加至96孔抗原包被板，2～8℃包被过夜。用PBST洗涤3次后，加入含5％M/V脱脂奶粉的PBST进行封闭，37℃封闭2小时。将鸡抗滑液囊支原体阳性血清和阴性血清分别用PBS稀释100倍，然后作2倍梯度稀释至1∶6400，取100μl稀释液分别加至抗原包被板，同时设未见血清孔作为空白对照，37℃反应2小时。用PBST洗涤3次后，每孔加入1∶20000v/v稀释的HRP标记的兔抗鸡抗体，37℃反应1小时。用PBST洗涤3次后，每孔加入50μlTMB底物溶液，37℃避光显色15分钟，然后加入2M H2SO4终止，测定各孔OD450nm/OD600nm值。结果：重组rMSPB截短蛋白与不同稀释度MS阳性血清反应OD450nm/OD600nm值为0.976～1.826，与阴性血清非特异性结合为0.021～0.060，能显著区分MS阳性和阴性血清。
实施例3MS间接ELISA抗体检测试剂盒的制备及检测方法的建立
1)试剂盒的制备
抗原包被板：用碳酸盐缓冲液(碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.94g，完全溶解后，加纯化水定容至1000ml，pH值9.6)将实施例2制备的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白稀释至优选的终浓度(0.2μg/ml)进行包被微量滴定板，100μl/孔，2～8℃包被16～24小时，用洗涤液洗涤后，按200μl/孔加入封闭液(每1L双蒸水中含6.06g Tris、5g酪蛋白、1ml ProClin300，pH8.5)，2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时，弃去封闭液后在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时，密封后于2～8℃储存备用。
样品稀释液：每1L双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29g Na2HPO4·12H2O、2g KCl、5g BSA、0.5ml ProClin300、5ml Tween-20。
酶标记物：取6.06g Tris、8～12gBSA、0.1ml Tween-20、0.5ml ProClin300，补加双蒸水定容至1000mL，作为酶标稀释液。将商品化酶标记兔抗鸡抗体用酶标稀释液按最适浓度稀释后作为酶标记物，过滤后无菌分装。
10×浓缩洗涤液：每1L双蒸水中含80.0g NaCl、2.0g K2HPO4、29.0g Na2HPO4·12H2O、2.0gKCl、5.0ml Tween20、0.5ml Proclin300。用时用双蒸水稀释10倍，简称PBST。
阳性对照：将商品化滑液囊支原体灭活疫苗(购自青岛易邦生物工程有限公司)经腿部肌肉接种SPF鸡，接种后60日，采血并分离血清，收集血清即为阳性血清。取阳性血清2.5ml、0.5ml ProClin-300混匀并补加磷酸盐缓冲液定容为1000mL，过滤后无菌分装。
阴性对照：采集未接种滑液囊支原体灭活疫苗的SPF鸡血并分离血清，收集血清即为阴性血清。取阴性血清2.5ml、0.5ml ProClin-300混匀，并补加磷酸盐缓冲液定容为1000mL，过滤后无菌分装。
显色液：取0.3gTMB溶于40ml N-甲基甲基吡咯烷酮中，再取0.05g二乙烯三胺五乙酸、10.0gβ-环糊精、14.0g无水柠檬酸、10.0g二水柠檬酸三钠、1.0g核糖、0.08g氯化钙、0.3g过氧化脲溶于850ml双蒸水中，搅拌至完全溶解后，加入TMB混匀，加双蒸水定容至1L，置2～8℃保存备用。
终止液：2M H2SO4溶液。
将以上各组分组装成试剂盒。
2)检测方法的建立
检测方法如下：
(1)试剂盒组分回温平衡：实验前将试剂盒组分取出置室温30分钟，颠倒摇动混合均匀。
(2)样品稀释：将待检样品用样品稀释液作400倍稀释。
(3)加样：分别在相应孔中加入稀释后的待检样品100μl，设置阳性对照、阴性对照各2孔(均为100μl)，封板后置37℃温育30分钟。
(4)洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液洗涤3遍，最后一次扣干。
(5)加酶标记物：每孔加入酶标记物100μl，封板后置37℃温育30分钟。
(6)洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液洗涤3遍，最后一次扣干。
(7)显色：每孔加入显色液100μl，混匀，37℃避光反应10分钟。
(8)终止并检测：每孔加终止液50μl，10分钟内用酶标仪测定各孔OD450nm/600nm值(即OD450nm－OD600nm，简称OD值)，根据以下结果判定标准进行判定。
当阳性对照孔OD值≥0.6、阴性对照孔OD值＜0.1时试验成立，否则无效。试验成立时，样品中抗体存在与否，或样品中抗体的相对水平的高低由S/P值决定，S/P值的计算方式：
S/P＝(样品OD值－NCx)/(PCx－NCx)，其中NCx表示阴性对照平均OD值(若小于0.05，则按照0.05计算)，PCx表示阳性对照平均OD值；当S/P≥0.50时，样品判为阳性，当S/P值＜0.50时，样品判为阴性。
3)包被原的选择
根据NCBI登录号：NZ_CP011096的重组蛋白DnaK、Ef-tu、LP78、MSPB，分别按分子生物学方法制备并按本实施例中步骤1)方法将各蛋白用碳酸盐缓冲液(pH值9.6，0.05mol/L)分别稀释至终浓度1μg/ml制备试剂盒，分别标为试剂盒1、2、3、4。并将YL株用碳酸盐缓冲液(碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.94g，完全溶解后，加纯化水定容至1000ml，pH值9.6)稀释至1μg/ml包被以制成试剂盒5。
将鸡抗滑液支原体阳性血清和阴性血清各5份用PBS稀释400倍，然后分别加至上述包被有不同包被原的抗原包被板，按本实施例2)方法进行检测，根据检测的阳性血清和阴性血清OD值，选择阳性血清OD值较高、阴性血清OD值较低的抗原用于作为试剂盒包被原。检测结果见表2，明显发现rMSPB截短蛋白作为包被原制备的试剂盒检测MS阳性血清反应OD值较高，反应原性比较好，同时与MS阴性血清反应OD值较低，非特异性结合低，明显优于MS其他蛋白或YL株菌液作为包被原制备试剂盒的检测效果。
表2不同包被原的结果对比
4)重组rMSPB截短蛋白最适包被浓度与待检血清稀释度的确定
按本实施例步骤1)将实施例2制备的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白稀释至终浓度0.0016、0.008、0.04、0.2、1、5μg/ml分别进行抗原包被板的制定，每个稀释度各包被1列。将鸡抗滑液囊支原体阳性血清和阴性血清分别用样品稀释液稀释50、100、200、400倍，然后取100μl各稀释液分别加至抗原包被板，按实施例步骤2)进行检测，测定各孔OD450nm/OD600nm值。计算各稀释度阳性血清和阴性血清的比值即P/N值。结果(见表3)：当包被浓度为0.2μg/ml、阳性血清(P)及阴性血清(N)稀释均为400倍时，P/N值最高，可有效分辨阴性样品和阳性样品。表明重组rMSPB截短蛋白的终浓度为0.2μg/ml为优选的终浓度，后续将按此浓度制备试剂盒用于后续实验。
表3不同抗原包被浓度与血清稀释度反应的P/N值
5)酶标记物使用浓度的确定
将鸡抗MS阳性血清和阴性血清分别用样品稀释液稀释400倍，再取100μl各稀释液分别加至抗原包被板，37℃反应2小时，同时设空白对照。将HRP标记的兔抗鸡抗体用酶标稀释液作1∶20000、1∶40000、1∶60000、1∶80000、1∶100000稀释(作为酶标记物)，100μl/孔，按实施例2)进行检测，计算各稀释度酶标记物所对应MS阳性血清(P)和阴性血清(N)OD450nm/OD600nm值的平均值，然后计算P/N值，选择P/N值最大所对应的酶标兔抗鸡抗体稀释度作为试剂盒最适稀释浓度。结果见表4：当酶标记物1∶40000稀释时，P/N值最高，能有效区分阳性、阴性样品，选择此稀释度作为酶标记物的最适稀释度。
表4酶标兔抗鸡抗体最适稀释度的确定
6)样品稀释液的优化
按表5制备样品稀释液以对其进行优化，将MS阳性血清(编号为1#～3#)和阴性血清(编号为4#～6#)各3份用表5所述样品稀释液稀释后，按本实施例步骤2)进行检测，结果见表6：A6对应的样品稀释液制备成试剂盒后检测样品OD值均较高，阴性血清OD值均较低，差异明显，因此优选A6对应的样品稀释液。
表5样品稀释液配方
表6不同样品稀释液配方的检测结果比较
在按A6其他组分不变，仅将BSA含量调整为1g、2g、8g、10g的情况下连同试剂盒A6进行对比试验，结果见表7：当组分中BSA为1g、10g时检测效果均不理想，BSA为2g、5g、8g时检测结果较优，以5g效果最优。
表7不同样品稀释液配方的检测结果比较
7)酶标稀释液的优化
按表8制备酶标稀释液以对其进行优化，将MS阳性血清1#～3#和阴性血清4#～6#用样品稀释液A6进行稀释，按本实施例2)方法进行检测，加入不同配方酶标稀释液稀释的酶标记兔抗鸡抗体对样品进行检测，结果见表9：B6对应的酶标稀释液制备成试剂盒后检测MS阳性血清的OD值最高，检测阴性血清OD值较低，阳性血清和阴性血清差异明显，能有效区分阴性样品、阳性样品。
表8酶标稀释液配方
表9不同酶标稀释液配方的检测结果比较
在其他组分不变，仅将B6中BSA的含量调整为5g、8g、12g、15g的情况下连同试剂盒B6进行对比试验，结果见表10：当组分中BSA为5g、15g时检测效果均不理想，BSA为8g、10g、12g时检测结果较优，以10g效果最优。
表10不同酶标稀释液配方的检测结果比较
由此可见，将重组rMSPB截短蛋白作为包被原，包被终浓度为0.2μg/ml，100μl/孔，2～8℃包被16～24小时，用洗涤液洗涤后，按200μl/孔加入封闭液(每1L双蒸水中含6.06gTris、5g酪蛋白、1ml ProClin300，pH8.5)，2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时，弃去封闭液后在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时，获得抗原包被板。
样品稀释液配方为A6：每1L双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29gNa2HPO4·12H2O、2g KCl、5g BSA、0.5ml ProClin300、5ml Tween-20；
酶标稀释液配方为B6：每1L双蒸水中含6.06g Tris、10gBSA、0.1ml Tween-20、0.5ml ProClin300，使用时，酶标记物(HRP标记的兔抗鸡抗体)的最适稀释度按1∶40000稀释，其他组分按实施例1)制备，制备出的试剂盒为最优试剂盒，标记为试剂盒A，用于后续实验。
8)试剂盒的评价
8.1敏感性
取已知血凝抑制效价(HI)的鸡血清(1∶128)，用PBS稀释100倍，然后作2倍梯度稀释并稀释至1024倍。用试剂盒A根据本实施例2)中方法分别检测上述各稀释度血清，确定试剂盒的灵敏度。结果：用试剂盒A检测的最低检测限为血清稀释25600倍，商品化IDEXX MSELISA试剂盒检测最低检测限为血清稀释12800倍。
8.2特异性
用试剂盒A分别检测新城疫病毒阳性血清、H5亚型禽流感病毒阳性血清、H7亚型禽流感病毒阳性血清、H9亚型禽流感病毒阳性血清、传染性支气管炎病毒阳性血清、传染性法氏囊病毒阳性血清、禽腺病毒阳性血清、副鸡嗜血杆菌阳性血清、鸡毒支原体阳性血清。结果均为阴性，表明试剂盒A特异性良好。
8.3保存期
制备3批试剂盒A均保存于2～8℃，分别于3、6、9、12、15个月取样。参照本实施例7)进行敏感性、特异性检测。结果：在不同保存时间，试剂盒A测定阴性样品的结果为阴性，测定阳性样品的结果均为阳性。发明人意外地发现试剂盒A在2～8℃保存15个月仍具有良好的敏感性、特异性。
实施例4试剂盒的应用
1、MS抗体消长规律测定
1.1 MS感染抗体的检测
将MS YL株(107CCU/ml)经足垫途径接种21日龄SPF鸡10只，0.5ml/只，分别于接种后3、7、10、14、21、28、42、60日采血，分离血清，均用实施例3中的试剂盒A和IDEXX商品化试剂盒进行检测。结果：试剂盒A与IDEXX试剂盒均于MS感染鸡后第7日检出阳性，其中试剂盒A检测7/10为阳性，而IDEXX试剂盒检测4/10为阳性，试剂盒A较IDEXX试剂盒敏感。
1.2 MS灭活疫苗免疫抗体的检测
将青岛易邦生物工程有限公司的商品化MS灭活疫苗(YBF-MS1株)经腿部肌肉接种5只21日龄SPF鸡，0.5ml/只，分别于接种后3、7、10、14、21、28、42、60日采血，分离血清作为待检样品，用试剂盒A和IDEXX试剂盒分别检测上述血清，检测方法采用实施例3中2)所述的检测方法。结果：试剂盒A与IDEXX试剂盒均于MS灭活疫苗免疫后第10日检出阳性，其中试剂盒A检测4/5为阳性，而IDEXX试剂盒检测3/5为阳性。
1.3 MS活疫苗免疫抗体的检测
将澳大利亚生物资源公司的商品化MS减毒活疫苗(MS-H株)经滴鼻、点眼途径接种21日龄SPF鸡，2滴/只，分别于接种后3、7、10、14、21、28、42、60日采血，分离血清，用试剂盒A试剂盒检测上述血清。
结果：试剂盒A检测均为阴性，表明用本试剂盒检测接种活疫苗场，可用于鉴别疫苗免疫和自然感染MS鸡，可用于后续该病的净化。
2临床应用
用试剂盒A检测实施例1中170份临床鸡血清，结果检出122份阳性、48份阴性，试剂盒A与平板凝集试验的总符合率达98％，阳性符合率为97％；优于IDEXX商品化MS ELISA试剂盒的检测结果(119份阳性、51份阴性与平板凝集试验的总符合率为96％，阳性符合率为95％)。
3检测其他靶动物
用试剂盒A检测实施例1中40份临床鸽子血清，结果：检出5份阳性、35份阴性，而IDEXX商品化MS ELISA试剂盒其检测说明书未提及能检测其他靶动物样品。
综上所述，本发明制备的MS抗体检测试剂盒所用包被原及其包被量，及样品稀释液、酶标稀释液的组分及含量等均经一系列优化而得，其检测效果明显优于其他蛋白或全菌包被后的检测效果，可用于MS抗体水平的准确监测、感染状况的准确检测，特别地可用于活疫苗免疫与临床感染菌株的鉴别检验，利于鸡场净化；也可用于其他靶动物如鸽子血清的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，其特征在于，所述rMSPB截短蛋白为SEQ IDNO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
2.一种滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，其包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
3.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标记物以及用于滑液囊支原体抗原抗体的检测试剂、样品稀释液、阴性对照、阳性对照、显色液和终止液，所述酶标记物为含针对所检抗体的酶标记抗体溶液。
4.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被浓度为0.0016～5μg/ml，每孔100～200μl；所述支持介质为微量滴定板。
5.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖甘酶标记兔抗鸡抗体的溶液，所述酶标记物所用的酶标稀释液为每升双蒸水中含6.06g Tris、8～12gBSA、0.1ml Tween-20、0.5ml ProClin300；
所述酶标记物与所述酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释。
6.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液配方为每升双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29g Na2HPO4·12H2O、2g KCl、2～8g BSA、0.5mlProClin300和5ml Tween-20。
7.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述显色液的配制方法：先取0.3g TMB溶于40ml N-甲基甲基吡咯烷酮中，再取0.05g二乙烯三胺五乙酸、10.0gβ-环糊精、14.0g无水柠檬酸、10.0g二水柠檬酸三钠、1.0g核糖、0.08g氯化钙、0.3g过氧化脲溶于850ml双蒸水中，搅拌至完全溶解后，加入TMB混匀，加双蒸水定容至1L；
所述阳性对照为滑液囊支原体免疫SPF鸡血清，所述阴性对照为未感染滑液囊支原体的SPF鸡血清；
所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H2SO4溶液，所述洗涤液为含0.05％v/v的Tween-20和0.005％v/v的Proclin300的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求2-7中任一项所述ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其包括用基因工程手段制备序列表中编码的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，用包被缓冲液稀释至包被浓度0.0016～5μg/ml，100μl/孔包被于微量滴定板，2～8℃包被16～24小时或37℃包被2小时后洗涤、封闭、干燥。
9.根据权利要求8所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，其制备方法为将碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.94g，完全溶解后，加纯化水定容至1000ml，pH值为9.6；
所述封闭用封闭液封闭，所述封闭液为每升双蒸水中含6.06g Tris、5g酪蛋白、1mlProClin300，pH8.5，pH值为8.5；所述封闭的条件为2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时；
所述干燥的条件为在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时。
10.根据权利要求2-7任一项所述ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测方面的应用，所述非诊断目的的检测方面的应用包括动物感染滑液囊支原体的排查、离体血清的流行病学调查、动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价中的应用。
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