NO333242B1 - Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus - Google Patents

Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus Download PDF

Info

Publication number
NO333242B1
NO333242B1 NO20090290A NO20090290A NO333242B1 NO 333242 B1 NO333242 B1 NO 333242B1 NO 20090290 A NO20090290 A NO 20090290A NO 20090290 A NO20090290 A NO 20090290A NO 333242 B1 NO333242 B1 NO 333242B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
inactivated
virus
cells
salmonid
spp
Prior art date
Application number
NO20090290A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20090290L (no
Inventor
Trygve Meum Eliassen
Inge Tom Solbakk
Svein Alexandersen
Marit Rode
Anne Aas-Eng
Bernt Martinsen
Original Assignee
Pharmaq As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40469649&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO333242(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pharmaq As filed Critical Pharmaq As
Priority to NO20090290A priority Critical patent/NO333242B1/no
Priority to CA2653300A priority patent/CA2653300C/en
Priority to GB0901913.4A priority patent/GB2457158B/en
Priority to CL2009000287A priority patent/CL2009000287A1/es
Priority to GB1219654.9A priority patent/GB2493662B/en
Priority to CA3090088A priority patent/CA3090088C/en
Publication of NO20090290L publication Critical patent/NO20090290L/no
Publication of NO333242B1 publication Critical patent/NO333242B1/no
Priority to NO2015019C priority patent/NO2015019I1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0233—Rickettsiales, e.g. Anaplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/107—Vibrio
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • C07K14/1808—Alphaviruses or Group A arboviruses, e.g. sindbis, VEE, EEE, WEE, semliki forest virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36161—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører en sammensetning omfattende salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav, kombinert med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: en levende, svekket eller drept bakterie, et virus som ikke er salmonid alfavirus, hvor nevnte virus fortrinnsvis er svekket eller inaktivert, en sopp, en parasitt og et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra enhver av disse komponentene. Oppfinnelsen vedrører enn videre en doseringsform og en vaksine omfattende sammensetningen, og oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av sammensetningen i medisin. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning eller en vaksine som beskrevet over, og en fremgangsmåte for å forbedre en polyvalent vaksine, omfattende å inkludere i den polyvalente vaksinen et svekket eller inaktivert salmonid alfavirus.

Description

Oppfinnelsens tekniske område
Foreliggende oppfinnelse vedrører veterinærimmunologi og spesielt måter for å forebygge eller kontrollere infeksjoner av salmonid alfavirus og utbrudd av fiskepankreatisk sykdom (fish pancreatic disease) eller sovesyke (sleeping disease) ved anvendelse av en polyvalent vaksine, slik som en polyvalent vaksine som inneholder både virale og bakterielle antigener.
Oppfinnelsens bakgrunn
Pankreassykdom (pancreas disease) har blitt en alvorlig sykdom i lakseoppdrett i flere geografiske områder. Sykdommen ble først rapportert fra Skottland og har senere blitt rapportert fra Irland, Norge og Nord-Amerika. Siden 2007 har pankreassykdommen blitt endemisk i de fleste oppdrettsanlegg i Irland og det har blitt rapportert om isolerte utbrudd av pankreassykdom i Nord-Amerika. En annen diagnose, sovesyke, er endemisk i deler av Frankrike og har også blitt rapportert i Italia og Spania (McLoughlin & Graham, 2007). Nylig har det kommet uoffisielle rapporter om at pankreassykdom også er observert i Chile.
I Norge har sykdommen spredt seg i løpet av de siste 10 årene med 58 bekreftede infiserte områder i 2006 og 98 bekreftede infiserte områder i 2007. I 2006 spredte sykdommen seg også til Møre og Romsdal, som ligger nord for det tidligere definerte geografiske området som var berørt av salmonid pankreassykdom. Pankreassykdom er nå det største helseproblemet for akvakultur-industrien i den vestlige delen av Norge. Pankreassykdom (PD) og den beslektede sovesyken forårsakes begge av alfavirus og kan ikke behandles med noen terapeutika.
Det første alfaviruset ble isolert fra fisk i 1995 (Nelson m.fl. 1995). I dag har alfavirus blitt isolert fra både atlantisk laks som lider av pankreassykdom og regnbueørret som lider av sovesyke (McLoughlin og Graham 2007).
Salmonis alfavirusene (SAV) er sfæriske (omtrent 65 nm i diameter) innhyllede RNA-virus. De inneholder et enkelttrådet positiv-sense-RNA-genom på 11-12 kB (McLoughlin og Graham 2007). I europeisk patent EP 712 926 er det beskrevet å være sensitivt for kloroform, raskt inaktivert ved pH=3 og ved 50 °C og med en flytende tetthet på 1,20 g/ml. Nukleotidsekvenseringsstudier tilordner salmonide alfavirus i tre genetisk forskjellige undertyper (Powers m.fl. 2001, Hodneland m.fl. 2005, Weston m.fl. 2005). Salmonid alfavirus 2 (SAV2) forårsaker sovesyke hos regnbueørret, salmonid alfavirus 1 (SAVI) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks i Irland og Skottland, mens salmonid alfavirus 3 (SAV3) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks og sjøoppdrettet regnbueørret i Norge. Nylig har SAV4, SAV5 og SAV6 blitt identifisert som undertyper beslektet med SAVI.
I Norge er all oppdrettet atlantisk laks vaksinert mot de vanligste bakterielle sykdommene og svært ofte mot pancreatic necrosis virus (IPNV) før de forflyttes til sjøen. Selv om omfattende vaksinasjonsprogrammer absolutt er ønsket for å unngå økonomiske tap og ytterligere spredning av smittsomme sykdommer er slike program også forbundet med tekniske utfordringer. Administrasjon av vaksiner krever omfattende behandling av fisken, noe som forårsaker stress og dødelighet fordi fisken må pumpes inn i oppbevaringstanker, overføres til en tank med anestesi, injiseres med vaksine og pumpes tilbake til oppbevaringstanker. På grunn av den store målestokken i moderne akvakultur er slike vaksinasjonsprogrammer dyre og arbeidskrevende og forårsaker stress hos fisken. Av disse grunnene av dette administreres vaksiner mot de forskjellige smittsomme sykdommene fortrinnsvis i kombinerte, polyvalente vaksiner som inneholder flere antigener.
Teoretisk skal kombinasjon av vaksiner være ukomplisert. I praksis fører imidlertid kombinasjon av flere vaksineantigener ofte til redusert virkning av hvert enkelt antigen. Slike problemer forbundet med polyvalente vaksiner, diskuteres for eksempel i André, E.F. (1999), som gir en oversikt over strategier for humane pediatriske vaksinasjonsprogrammer. Lignende problemer vekker bekymring i vaksinasjonsprogrammer for dyr, for eksempel når det gjelder vaksiner mot klovsyke hos sau, som gjennomgått av 0'Meara m.fl. (1993).
Tross det faktum at salmonid alfavirus ble isolert ogkarakterisertfor mer enn et tiår siden er vaksinering mot pankreassykdom fremdeles en utfordring. I europeisk patent EP 712 926 fremviser eksempel 11 data som viser at en sammensetning ment for vaksinasjonsformål basert på pankreassykdomsvirus SAVI, inaktivert ved tilsetting av beta-propiolakton og NaOH, er ineffektiv for beskyttelse mot etterfølgende infeksjon. I det samme eksperimentet synes en sammensetning basert på PDV behandlet med 0,1 % formalin (35-38 %) å fremkalle en beskyttende immunrespons i eksperimentelle omgivelser. Siden behandling med 0,1 % formalin er utilstrekkelig for å inaktivere PDV må man imidlertid konkludere med at den sistnevnte sammensetningen er en med levende virus. Begge sammensetningene inneholdt PD-virus av SAVl-undertypen med en titer på lO^CIDso<m>T<1>.
Per februar 2008 var kun én PD-vaksine, solgt under navnet Norvac compact PD, kommersielt tilgjengelig. Vaksinen er basert på inaktivert PD-virus av SAVl-undertypen: Et førstegenerasjonsprodukt inneholdt antigen i mengder på 10<7,2>TCID50/dose med et doseringsvolum på 100 ul. Et andregenerasjonsprodukt har blitt utviklet som inneholder 10<7>'<5>TCID50/dose. Rodger & Mitchell (2005) undersøkte effekten av denne vaksinen: I 2003 fant de at vaksinering ikke reduserte risikoen for utbrudd av pankreassykdom; i 2004 virket det som om vaksinerte fisk hadde en noe mindre risiko for infeksjon, men resultatet var imidlertid ikke statistisk signifikant. Videre var det i blandede populasjoner med vaksinerte og ikke-vaksinerte fisk en tendens til lavere dødelighet hos vaksinerte fisk.
I sammendraget over produktkjennetegn beskrives Norvac compact PD som inkompatibel med andre vaksiner og immunologiske produkter. Følgelig anbefales denne monovalente PD-vaksinen kun for injeksjon minst 210 graddager før injeksjon av andre multivalente vaksiner som beskytter mot vanlige bakterielle sykdommer og IPNV i oppdrettsfisk (graddager beregnes som produktet av dager og temperatur: 10 dager med en temperatur på 10 °C er det samme som 100 graddager). Under normale forhold må Norvac compact PD administreres 2-3 uker før administrasjon av en polyvalent vaksine.
Ifølge sammendraget over produktkjennetegn er ingen informasjon tilgjengelig om sikkerhet og virkning for den samtidige anvendelsen av denne vaksinen sammen med noen andre immunologiske produkter. Den angitte mangelen på kompatibilitet med andre vaksiner er imidlertid konsistent med tidligere rapporter om multivalente PD-vaksiner som ikke lykkes i å fremkalle god beskyttelse mot pankreassykdom (Christie m.fl. 1999 A, Intervet newsletter 2002, Christie m.fl. 1999 B). Christie rapporterte induksjon av nøytraliserende antistoffer i 60 % av individene vaksinert med en monovalent PD-vaksine. Den beskjedne virkningen ble kraftig kompromittert da vaksinen ble kombinert med andre immunologiske produkter siden den resulterende polyvalente vaksinen induserte nøytraliserende antistoffer i kun 20 % av de vaksinerte individene.
I EP 1 075 523 er oppfinnerne også bekymret over problemet med at PD-vaksiner er inkompatible med andre vaksiner. I avsnitt [0004] heter det: "En ulempe i produksjonen av inaktiverte vaksiner fra PD-viruset beskrevet i EP-A-712 926, er den langsomme veksten av viruset, spesielt i cellekulturer, noe som gjør fremstillingen av vaksinene til en relativ ineffektiv prosess. En ytterligere ulempe med de inaktiverte vaksinene er ustabiliteten til det inaktiverte viruset i nærvær av andre inaktiverte patogener hvilket fører til potenstap. Fiskevaksiner fremstilles generelt som multivalente vaksiner, og det kreves betydelig høyere mengder inaktiverte virus i de multivalente vaksinene enn det som ville være nødvendig i en monovalent vaksine for å kompensere for potenstapet." Oppfinnerne viser til rekombinante proteinvaksiner som en løsning, men slike rekombinante vaksiner har aldri blitt implementert i behandlingen av pankreassykdom.
Brun m.fl., Norsk Fiskeoppdrett, 2006.07.20, nr. 7, side 50-53, omhandler en epidemiologisk studie av PD i Norge, gjennomført 2002-03. Studiet avdekket at fisk som var vaksinert mot andre patogener (IPNV og Moritella viscosa) hadde en lavere risiko for PD-utbrudd enn fisk som ikke var vaksinert.
Lopez doriga m.fl, Fish and Shellfish Immunology (2001) 11, s 505-22, omhandler isolasjon av et skotsk PD virus og dets evne til å beskytte mot sykdom. Lopez doriga m.fl. tilveiebringer en monovalent vaksine basert på inaktivert virus og viser at det oppnås en bedre beskyttelse ved injisering av større mengder virus (IO<7>TCID50 pr fisk versus IO<5>TCID pr fisk).
WO 2007/031572 omhandler en fiskevaksine mot PD basert på en immunogen epitop av SAV3. Det er beskrevet en kombinasjonsvaksine som omfatter både SAV-epitop og andre inaktiverte patogener som ulike virus, bakterier, sopp og parasitter, eller immunogent materiale fra noen av disse patogenene. Fordelen ved bruk av en kombinasjonsvaksine er nevnt, men patentsøknaden inneholder ikke eksempler som viser en teknisk effekt av en slik vaksine.
WO 2008/002152 omhandler en prosess for kultivering av bakterier av Piscirickettsia familien, og vaksiner som inneholder slike bakterier. Det blir tilveiebragt vaksineformuleringer som i tillegg består av flere patogener mot salmonider, deriblant salmonid pankreassykdom virus (SPDV). WO 2003/101482 omhandler vaksineformuleringer for finnefisk, og beskriver blant annet en polyvalent vaksine for salmonider som består av svekkede eller inaktiverte bakterier og virus. Ulike antigener som kan inngå i en slik vaksine er beskrevet, deriblant antigener fra fiske pankreassykdom virus (FPDV).
WO 2008/002152 og WO 2003/101482 foreslår kun polyvalente vaksiner som omfatter SAV virus; det finnes ingen dokumentasjon som viser at slike vaksiner vil ha effekt når de blir administrert samtidig eller i kombinasjon med andre fiskevaksiner.
Djupvik foreslår en handlingsplan mot pankreassykdom (PD), utarbeidet av Nasjonalt senter for fisk og sjømat i 2007. Forslaget er basert på norske publikasjoner og epidemiologiske undersøkelser av PD, og omhandler således
både historikk, kartlegging av sykdomsutvikling, betydningen av PD og tiltak mot PD. Avsnitt 5.5, side 23 omtaler vaksinering mot PD: "Vaksinering har til no ikkje gjeve tilstrekkeleg beskyttelse. Ifølgje produsenten (Intervet Norbio) er det truleg at dette i hovudsak skuldast feil vaksineringsregime. (PD-vaksine må vere monovalent, og må administreras 3 veker før multivalent vaksine). Ny vaksine med forbetra eigenskapar, (større antigen-konsentrasjon) er under utprøvning i år." Djupvik viser her til det ovenfor nevnte førstegenerasjonsprodukt som inneholdt antigen i mengder på 10<7>'<2>TCID50/dose. Den "ny vaksine med forbetra eigenskaber" er Intervet Norbios andregenerasjonsprodukt som inneholder 10<7>'<5>TCID50/dose.
Fringuelli, E m.fl. J. Fish Dis. 2008 Nov;31(ll):811-23 omhandleren fylogenetisk analyse og molekylær epidemiologi av europeisk SAV. Analysene er basert pg E2 og nsP3 gen nukleotidsekvenser.
Hoel, E m.fl. "Pancreas Disease (PD) — en utredning for Fiskeri- og Kystdepartementet", VESO og Veterinaerinstituttet, 2007.08.23, ISBN 82-91743-77-0, side 1-36 er en utredning om PD for Fiskeri- og kystdepartementet i Norge, utført av Veterinærinstituttet og VESO i 2007. Rapporten inneholder en gjennomgang av kunnskapsstatus for PD. Hoel bekrefter at det har vært vanskelig å få kontroll på SAV-infeksjon i norske oppdrettsanlegg.
I Dom fra Borgarting Lagmannsrett, saksnummer 10-103765ASD-BORG/03, side 1-47, har det blit påpekt at det er vesentlige forskjeller mellom isolatene F93-125 (SAVI) og ALV 405 (SAV3). De to subtypene er svært forskjellige med hensyn til virulens og forårsaker sykdomstegn hos fisken i veldig forskjellig grad. I dommen fremgår det dessuten at søker har presentert forsøk som viser en betydelig bedre vaksineeffekt når man vaksinerer mot SAV3-infeksjoner med en vaksine basert på et SAV3 isolat (ALV 405) enn når man anvender en vaksine basert på et SAVI isolat (F93-125). Dette betyr imidlertid ikke at en vaksine basert på SAVI nødvendigvis er uten effekt på SAV3-infeksjoner: Lagmannsretten bemerker at det er sannsynlig at en vaksine basert på SAV3 virke r bedre mot SAV3-infeksjon enn en SAVl-vaksine fordi den har samme proteinstruktur som infeksjonsstammen.
Graden av kryssimmunitet mellom SAVI og SAV2 er også tidligere undersøkt av Christie m.fl., Poster, Aqua Merck-Animal Health, 2003.06.12. I denne studien fant man nøytraliserende antistoffer mot PDV (SAVI) i serum fra laks og regnbueørret, både etter injeksjon av PDV og SDV (SAV2). Tilsvarende fant man nøytraliserende antistoffer mot SVD i ørretserum, både etter injeksjon av PDV og SDV. Forfatterne konkluderte med at vaksinasjon med SAVI og SAV2 hver især forventes å gi beskyttelse mot begge subtyper av virus.
At det er noen grad av serologisk kryssreaksjon mellom alle seks subtyper av SAV og SAVI fremgår også av en senere studie av Graham m.fl., Journal of Fish Diseases, 34,4 s. 273-86, 2011. Forfatterne anvender seks marine SAV-isolater som representerer alle seks subtyper, og konkluderer: "Using a virus neutralization (VN) test neutralizing salmonid alphavirus (SAV) subtype 1 strain F93-125, VN antibodies were detected in all challenge groups, consistent with serological cross-reactivity between the subtypes."
Som en konklusjon er eksisterende vaksinasjonsprogrammer mot fiskepankreatisk sykdom fremdeles ineffektive og har ikke vært i stand til å stoppe spredning av sykdommen. I tillegg er, ifølge den generelle oppfatningen på området, PD-vaksiner basert på inaktiverte virus kun tilgjengelig til høy produksjonskostnader og de er inkompatible med vaksiner mot andre smittsomme sykdommer som er utbredt i oppdrettsfisk.
Det er derfor fremdeles et akutt behov for effektive tiltak som kan kontrollere fiskepankreatisk sykdom, både av etiske og økonomiske grunner.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et formål ved foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetninger og vaksiner som tillater kombinert og samtidig vaksinasjon mot pankreatisk sykdom og én eller flere andre smittsomme sykdommer.
Spesielt vedrører ett aspekt av oppfinnelsen en sammensetning omfattende inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på 5xl0<8>- 5xl0<10>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler og én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en drept eller inaktivert bakterie,
b. et inaktivert virus som ikke er salmonid alfavirus,
c. et atigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a)
eller fra nevnte virus i b).
Et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en doseringsform av en sammensetning omfattende inaktivert salmonid alfavirus (SAV) kombinert med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a) en drept/inaktivert bakterie,
b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus,
c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b);
hvori doseringsformen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer
på minst 3,75xl07 TCID50/dosis, bestemt ved titrering på CHH celler.
Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus (SAV) i fremstillingen av en vaksine for forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus, hvori nevnte vaksine er en doseringsform som inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde tilsvarende minst 3,75xl0<7>TCID50/dose bestemt ved titrering på CHH celler, og administreres samtidig eller i kombinasjon med en eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a) en drept bakterie,
b) et inaktivert virus som ikke er salmonid alfavirus, og
c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i
a), eller fra nevnte virus i b).
Enda et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en
fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning eller en doseringsform som beskrevet over, nevnt fremgangsmåte omfatter å kombinere et inaktivert salmonid alfavirus med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
i) drept bakterie,
ii) et inaktivert virus som ikke er salmonid alfavirus,
iii) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a) eller fra nevnte virus i b).
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra CHH-l-cellekulturer inokulert med forskjellige SAV3-isolater eller passasjer av isolater. Figur 2 er en fremstilling av SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra SAV3-infiserte CHSE-214-cellekulturer. Figur 3 A og B viser % akkumulert dødelighet etter smitte av atlantisk laksesmolt med salmonid alfavirus type 3 (SAV3). Figuren viser enn videre effekten av å vaksinere fisk i parrstadiet mot salmonid pankreassykdom ved anvendelse av en polyvalent vaksine ifølge oppfinnelsen. To parallelle eksperimenter ble utført i separate smittetanker (A og B).
Foreliggende oppfinnelse vil i det følgende bli beskrevet mer detaljert.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen at til tross for tidligere rapporter om det motsatte, er utvikling av polyvalente vaksiner som kombinerer inaktivert salmonid alfavirus med vaksiner mot andre fiskepatogener faktisk den mest effektive måten for å beskytte oppdrettslaks mot pankreassykdom. Oppfinnerne gjorde spesielt følgende observasjoner: i) Til tross for testing av forskjellige vaksineformuleringer var det ikke mulig å etablere noen ugunstig effekt av andre vaksinekomponenter på stabiliteten av pankreassykdomsantigenet. Med andre ord: PD-vaksiner basert på inaktiverte virus er høyst kompatible med vaksiner mot for tiden utbredte fiksepatogener;
ii) I vaksiner basert på inaktivert virus synes en minste antigentiter i området 3,75 x IO<7>TCID50/dose å være ønskelig for å effektivt indusere beskyttende immunitet, noe som indikerer at tidligere vaksinasjonsprogrammer har vært basert på vaksiner som inneholdt utilstrekkelige mengder antigen;
iii) Titre av salmonid alfavirus som er tilstrekkelige for fremstilling i stor skala av vaksiner med god virkning, kan visselig oppnås ved å anvende konvensjonell teknologi for viruspropagering og til en rimelig pris.
Mikrobiologisk materiale
I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har isolater av salmonide alfavirus blitt deponert under Budapestkonvensjonen hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 OJG UK 12. desember 2007 under følgende aksesjonsnumre: 07121201, som svarer til isolat ALV 405 i eksemplene; 07121202, som svarer til isolat ALV 407 i eksemplene; og 07121203 som svarer til isolat ALV 409 i eksemplene.
Foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetninger som i tillegg til salmonide alfavirus eller deler derav omfatter andre antigene komponenter. Polyvalente vaksiner som inneholder antigener fra typiske fiskepatogener bortsett fra salmonide alfavirus, er velkjente i faget og er allerede kommersielt tilgjengelige. Identifikasjonen og isoleringen av passende antigener som skal anvendes i slike vaksiner er beskrevet i litteraturen og gir således fagmannen mulighet til å generere og fremstille slike polyvalente vaksiner. I tillegg er representative isolater av relevante fiskepatogener tilgjengelige uten restriksjoner fra forskjellige kilder. Foreksempel er følgende bakteriearter tilgjengelige fra LGCPromochem/American Type Culture Collection ATCC oppbevarings- og distribusjonssenter (ATCC): A. salmonicida (ATCC 33658™ opphavsland: ikke oppgitt), Aeromonas hydrophila, V. salmonicida (ATCC 43839™, opphavsland: Norge), V. anguillarum serotype 01(ATCC 43305™, opphavsland: Danmark) og 02(ATCC 19264)™, opphavsland: ikke oppgitt) og Moritella viscosa (ATCC BAA-105™, opphavsland: Norge). Flavobacterium columnaris (deponert som Cytophaga columnaris) er tilgjengelig under ATCC-nummer 23463™
(Opphavsland: USA).
Når det gjelder Piscirickettsia salmonis, har nåværende søker deponert flere nyttige isolater under Budapesttraktaten hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 OJG UK: tre isolater ble deponert 9. juni 2006 under aksesjonsnumrene 06050901, 06050902 og 06050903 (isolat AL10005, AL10007 og AL10008). Et enkelt isolat ble deponert 21. mars 2007 under aksesjonsnummer 07032110 (opphavsland: Chile). På en lignende måte er representative isolater av relevante virusarter tilgjengelige inklusive infectious pancreatic necrosis virus (IPNV, ATCC VR-1318, opprinnelsesland: ikke oppgitt), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV, ATCC VR_1389, opprinnelsesland: Danmark); Infectious Hematopoietic Nerosis Virus (IHNV, ATCC VR-1392, opprinnelsesland: USA)); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC, ATCC VR-1390, opprinnelsesland: Danmark); Channel Catfish Virus (CCV) (ATCC VR-665, opprinnelsesland: USA); Infectious Salmon Anaemia (ISA) virus (ATCC VR-1554, opprinnelsesland: Canada).
Patentdeponeringer har tidligere blitt gjort av nåværende søker av følgende virusarter: Heart and Skeletal Muscle Infection Virus (HSMIV, patentdeponeringsnr. ECACC 04050401, opprinnelsesland: Norge); Cardiomyopathic syndrome virus (CMSV, patentdeponeringsnr. ECACC 07032902, opprinnelsesland: Norge).
Definisjoner
Før foreliggende oppfinnelse diskuteres i videre detaljer vil de følgende uttrykkene og konvensjonene bli definert: "Et antigent og/eller immunogent materiale" i foreliggende kontekst refererer til et materiale som inneholder én eller flere beskyttende epitoper. En epitop er beskyttende hvis den kan indusere en immunrespons som er i stand til å effektivt interferere med omfanget eller utviklingen av infeksjon med salmonid alfavirus, inklusive SAVI, SAV2 og spesielt SAV3. Uttrykket innbefatter polypeptider, inklusive polypeptider som er fremstilt ved bruk av rekombinante teknikker og deler av slike polypeptider.
Uttrykket "genotypiske karakteristika" viser i store trekk til sammensetningen av én eller flere deler av et individs genom som bidrar til å bestemme en spesifikk egenskap.
Med hensyn til viruset ifølge oppfinnelsen brukes uttrykket "relaterte genotypiske karakteristika" i relasjon til virus som innehar nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med kjente nukleinsyresekvenser fra tidligere isolerte salmonide alfavirus. Sammenligning kan gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for en enkelt av de nsPl, nsP2, nsP3 og nsP4 ikke-strukturelle proteinene. Sammenligning kan videre gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for kapsid, glykoprotein E2, glykoprotein E3 eller 6K- og gpEl-proteiner. Uttrykket anvendes spesielt for å definere virus som har nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med alle slike kjente aminosyresekvenser av deponerte isolater ALV 405, ALV 407 og/eller ALV 409. Med sikte på å definere de virale isolatene anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse vises det spesielt til nukleinsyresekvenser av glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1-6. Det skal derfor forstås at viruset ifølge oppfinnelsen innehar nukleinsyresekvenser som er minst 80 % identiske, slik som minst 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % eller 99,9 % identiske med nukleinsyresekvensene i glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1-6. Uttrykket "sekvensidentitet" indikerer et kvantitativt mål på graden av homologi mellom to aminosyresekvenser eller mellom to nukleinsyresekvenser med lik lengde. Hvis de to sekvensene som skal sammenlignes ikke har lik lengde, må de justeres for å gi best mulig tilpassing, som tillater innsettingen av hull (gaps) eller alternativt trunkering ved endene av polypeptidsekvensene eller
nukleotidsekvensene. Sekvensidentiteten kan beregnes som<Nnf>, der Ndif er det totale antall ikke-identiske rester i de to sekvensene når de er justert, og hvori Nref er antall rester i én av sekvensene. Derfor vil DNA-sekvensen AGTCAGTC ha en sekvensidentitet på 75 % med sekvensen AATCAATC (Ndif=2 og Nref=8). Et hull regnes som ikke-identitet av de(n) spesifikke resten(e), dvs.
DNA-sekvensen AGTGTC vil ha en sekvensidentitet på 75 % med DNA-sekvensen AGTCAGTC (Ndif=2 og Nref=8).
Med hensyn til alle oppfinnelsens utførelsesformer som vedrører nukleotidsekvenser, kan også prosenten av sekvensidentitet mellom én eller flere sekvenser være basert på tilpasning ved bruk av clustalW software (http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html) med standardinnstillinger. For nukleotidsekvenstilpasninger er disse innstillingene: Tilpasning=3Dfull, Gap Open 10,00, Gap Ext. 0,20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB).
Alternativt kan nukleotidsekvenser analyseres ved å bruke programmet DNASIS Max, og sammenligningen av sekvensene kan gjøres ved
http:// www. paraliqn. org/. Denne servicen er basert på de to sammenlignings-algoritmene kalt Smith-Waterman (SW) og ParAlign. Den første algoritmen ble publisert av Smith og Waterman (1981) og er en veletablert metode som finner den optimale lokale tilpasningen for to sekvenser. Den andre algoritmen, ParAlign, er en heuristisk metode for sekvenstilpasning; detaljer om metoden er publisert i Rognes (2001). Standardinnstillinger for score matrix og Gap-handikap samt E-verdier ble brukt.
Uttrykket "fenotypiske karakteristika" viser like generelt til én eller flere observerbare egenskaper hos en organisme som frembringes ved interaksjon av den arvede genotypen til individet med overførte epigenetiske faktorer og/eller ikke-nedarvet miljømessig variasjon. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse inkluderer uttrykket "relaterte fenotypiske karakteristika" enhver av de følgende karakteristika: størrelse, fasong, pH-stabilitet, temperaturstabilitet, kloroformsensitivitet og hemagglutinasjon.
"Fenotypiske karakteristika" inkluderer videre evnen til å fremkalle ethvert av de kliniske tegnene på pankreatisk sykdom og sovesyke, inklusive store patologiske tegn og histopatologiske tegn som beskrevet i foreliggende søknad. "Fenotypiske karakteristika" inkluderer også virusets evne til å introdusere slike kliniske tegn i et laboratoriesmitteeksperiment som beskrevet heri. Enn videre refererer uttrykket til virusets opptreden når det vokser på cellekulturer, inklusive vekstkinetikk og evnen til å fremkalle en cytopatogen effekt.
Uttrykkene SAVI, SAV2 og SAV3 definerer undertyper av salmonide alfavirus: SAVl-undertypen er definert ogkarakteriserti Nelson m.fl. Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995 og et representativt isolat har blitt deponert ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. SAV2-undertypen er på den annen side utløsende for "sovesyke" og ble først isolert ogkarakterisertav Castric m.fl. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997. SAV3-undertypen ble først isolert ogkarakterisertav Hodneland m.fl. som beskrevet i Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5; 66(2): 113-20 (Erratum i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2): 181). Uttrykkene SAV4, SAV5 og SAV6 definerer nye undertyper av salmonide alfavirus funnet nær Skottland og Irland.
Som fagmannen vil forstå, viser "cytopatogen effekt" til synlige morfologiske endringer i celler infisert med virus. Den kan spesielt inkludere avstenging av cellulært RNA og proteinsyntese, cellefusjon, frigjøring av lysosomale enzymer, endringer i cellemembranpermeabilitet, diffuse endringer i intracellulære strukturer, tilstedeværelse av virale inklusjonslegemer og kromosomale aberrasjoner.
Uttrykket "komponent eller del av nevnte virus" viser til en komponent eller del av nukleinsyrekjernen til viruset eller den omliggende proteinkappen.
"Cellekultur" viser til kulturer av celler slik som omdannede celler etablert in vitro. Spesielt, som anvendt heri, viser "cellelinje" til en populasjon av celler som er i stand til kontinuerlig eller langvarig vekst og deling in vitro. Ofte er cellelinjer klonale populasjoner avledet fra en enkelt stamcelle. Det er videre kjent i faget at spontane eller induserte endringer kan forekomme i karyotyp under lagring eller overføring av slike klonale populasjoner. Celler avledet fra cellelinjen det vises til kan derfor ikke være helt identiske med stamcellene eller -kulturene, og cellelinjen det vises til inkluderer slike varianter. Uttrykket "cellelinjer" inkluderer også immortaliserte celler.
Uttrykket "adjuvans" brukes i sin normale betydning og definerer et middel som kan stimulere immunsystemet og øke responsen på en vaksine uten å ha noen spesifikk antigen effekt i seg selv.
På samme måte brukes uttrykket "emulgator" vanligvis for å definere en substans som stabiliserer en emulsjon, ofte en surfaktant.
Uttrykket "detergent" definerer en annen surfaktantklasse som vil interagere kjemisk med både olje og vann og dermed stabilisere grenseflaten mellom olje-eller vanndråper i en suspensjon.
Emulsjoner omfattende vann og olje omtales generelt enten som vann-i-olje emulsjoner, olje-i-vann emulsjoner eller vann-i-olje-i vann emulsjoner. Hvorvidt en emulsjon blir en vann-i-olje emulsjon eller en olje-i-vann emulsjon avhenger av volumfraksjonen av begge faser og av emulgatortypen. Generelt tenderer emulgatorer og emulgerende partikler til å fremme dispersjon av fasen de ikke løses særlig godt i. Proteiner løses f.eks. bedre i vann enn i olje og tenderer dermed til å danne olje-i-vann emulsjoner (dvs., de fremmer spredningen av oljedråper gjennom en kontinuerlig vannfase).
I den foreliggende sammenhengen er en "surfaktant", også kjent som "et tensid", et fuktemiddel som senker overflatespenningen i en væske, tillater lettere spredning og senker grenseflatespenningen mellom to væsker.
Til sist, i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, anvendes en " polyvalent vaksine" (også kjent som multivalent vaksine) for å definere en kombinasjon av flere antigener i én vaksine. Derfor kan en polyvalent vaksine beskytte mot mer enn én sykdom. I motsetning til en polyvalent vaksine er en "monovalent vaksine" en vaksine som inneholder vaksinekomponenter rettet mot bare ett patogen. Spesielt kan en monovalent vaksine inneholde bare ett antigen som beskytter mot én spesiell sykdom.
Sammensetning
Ifølge et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning som omfatter et inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på 5xl0<8>- 5xl0<10>TCID50/1T1I bestemt ved titrering på CHH celler og én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en drept eller inaktivert bakterie,
b. et inaktivert virus som ikke er salmonid alfavirus, og c. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b).
Selv om sammensetninger basert på underenheter av viruset, for eksempel sammensetninger omfattende rekombinante antigener, kan overveies, foretrekkes det at sammensetningen ifølge oppfinnelsen fremstilles på grunnlag av kulturer av viruset. For den foreliggende oppfinnelsens formål er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5xl0<8>TCID50/ml. Selv om naturlig forekommende ikke-virulente stammer av salmonide alfavirus og stammer av viruset som har blitt svekket i laboratoriet kan overveies, inneholder sammensetningen ifølge oppfinnelsen et salmonid alfavirus som er inaktivert.
På lignende vis er bakterie-komponentene i vaksinen drept eller på annen måte gjort ute av stand til å infisere/angripe fisken.
Inaktivering av viruset kan oppnås med kjemiske eller fysiske metoder.
Kjemisk inaktivering kan utføres ved behandling av virusene med foreksempel, men ikke begrenset til, behandling med enzymer, med formaldehyd, p-propiolakton eller etylenimin eller et derivat derav, med organisk løsningsmiddel (f.eks. 30 halogenert hydrokarbon) og/eller detergent, f.eks. Triton<®>eller Tween<®>. Fysiologisk inaktivering kan fordelaktig utføres ved å underkaste virusene energirik stråling slik som UV-lys, gammabestråling eller røntgenstråler. Om nødvendig kan inaktiveringsmidlet nøytraliseres med tiosulfat. Om nødvendig returneres pH deretter til ca pH 7.
Mens inaktivering med formaldehyd tidligere har blitt ansett suboptimalt som en metode for inaktivering av salmonid alfavirus, har nåværende oppfinnere erfart at formaldehydinaktivering virkelig er en nyttig tilnærming. I en fortrukket utførelsesform inaktiveres viruset ved tilsetting av 1,5-2,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 12-96 timer, ved en temperatur fra 13-17 °C.
Oppfinnerne har funnet at når det brukes 2,0 g/kg formaldehyd, er en 48-timers inkubasjon vanligvis tilstrekkelig for å sikre tilfredsstillende inaktivering av viruset. For å tilfredsstille spesifikke regulatoriske krav kan imidlertid lengre inkubasjonsperioder være foretrukket, slik som en inkubasjonsperiode på minst 72 timer.
Når det gjelder sammensetningens bakterielle komponenter, skal det likeledes forstås at flere anvendelige metoder for inaktivering er tilgjengelige for fagmannen. I de for øyeblikket foretrukne utførelsesformene har bakterien blitt inaktivert ved å anvende en prosedyre som omfatter tilsetting av 3,5 - 4,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1-2 timer ved en temperatur på 20 °C.
Selv om hver av de virale, bakterielle, fungale og parasittiske komponentene i vaksinen kan drepes eller inaktiveres før de kombineres med de andre komponentene, kan de også inaktiveres eller drepes etter at de har blitt satt til vaksinen.
I ytterligere utførelsesformer er nevnte levende svekkede, drepte eller inaktiverte bakterie av en art som er et anerkjent fiskepatogen. Følgelig velges bakterien fortrinnsvis fra gruppen bestående av bakterier av artene Piscirickettsias spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Listonella spp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium spp., Yersinia spp., Renibacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobactehum spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Edwarsiella spp., Francisella spp., Pseudomonas spp., Cytophaga spp., Nocardia spp., Haphnia spp. og Mycobacerium spp.
Ifølge mer spesifikke utførelsesformer velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas spp., Vibrio spp., Flavobacterium spp., Haphnia spp., Piscirickettsia spp. og Moritella viscosa. Enda mer spesielt velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum, Vibrio ordali, Flavobacterium columnaris, Haphnia sp., Piscirickettsia salmonis og Moritella viscosa.
I visse foretrukne utførelsesformer omfatter sammensetningen ifølge oppfinnelsen drepte eller inaktiverte bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av A salmonicida, V. salmonicida, V. anguillarum og M. viscosa.
Ifølge like foretrukne utførelsesformer omfatter sammensetningen nevnte bakterier av artene Vibrio ordali og/eller Piscirickettsia salmonis.
Ifølge andre utførelsesformer omfatter sammensetningen bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnaris og Haphnia sp.
På en lignende måte er nevnte virus som ikke er salmonid alfavirus et anerkjente fiskepatogen. Følgelig velges det fortrinnsvis fra gruppen bestående av: infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Infectious Hematopoetic Necrosis virus (IHNV); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC); Channel Catfish Virus (CCV); Infectious Salmon Anaemia (ISA)-virus; nodavirus; iridovirus, koi herpes-virus; Heart and Skeletal Muscle Inflammation Virus (HSMV) og Cardiomyopathy Syndrome Virus.
Av disse virusene er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) særlig relevant i forbindelse med norsk oppdrett av laks. Det er derfor foretrukket i visse utførelsesformer at nevnte virus, bortsett fra salmonid alfavirus, er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).
Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det ofte at tilnærminger for å kontrollere infeksjoner i fiskepopulasjoner rettes mot alle eller i det minste de fleste av de potensielt relevante patogenene. Det kan derfor være foretrukket at sammensetningen ifølge oppfinnelsen omfatter to eller flere virus- og/eller bakteriekomponenter som definert ovenfor
Det vil bli forstått at sammensetningen ifølge oppfinnelsen bør inneholde antigener i mengder som er tilstrekkelige til å fremkalle en immunrespons, fortrinnsvis en beskyttende respons, etter injeksjon av sammensetningen i en fisk. Generelt er det foretrukket at sammensetningen ifølge oppfinnelsen har et relativt høyt innhold av salmonid alfavirus siden dette antas å forbedre den beskyttende immunresponsen når sammensetningen anvendes til vaksinasjonsformål. De nåværende oppfinnerne har observert at det generelt er mulig å dyrke salmonid alfavirus for å oppnå en tilfredsstillende titer i cellekultur, og at produksjons-kostnadene ikke hindrer utviklingen av multivalente vaksiner. Tilgjengeligheten av isolater med en spesiell SAV3-undertype som foreviser utmerket vekstkinetikk når de dyrkes på cellekulturer, har videre tillatt de nåværende oppfinnerne å utvikle en ekstremt kostnadseffektiv virusvaksinekomponent for pankreatisk sykdom.
Vaksinen kan spesielt omfatte en mengde salmonid alfavirusantigen, slik som en mengde av SAV3-antigen, som tilsvarer 7,5xl0<8->lxl0<10>TCID50/ml vaksine.
Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendelige i akvakulturen. Det skal derfor forstås at vaksinen ifølge oppfinnelsen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner av herav.
Når vaksiner skal administreres ved injeksjon, er generelt et relativt lite doseringsvolum nødvendig. Således er det ønskelig å formulere sammensetningen ifølge oppfinnelsen slik at hver dose har et volum på 25-200 ul. Mer foretrukket har hver dose et volum på 40-120 ul, slik som et volum på 90-110 ul eller 45-55 ul. For øyeblikket foretrekkes et doseringsvolum på 50 ul.
Når sammensetningen ifølge oppfinnelsen er formulert for injeksjon, kan den spesielt være formulert for intraperitoneal injeksjon i en teleostei inkludert, men ikke begrenset til laksefisker, havabbor, brasme, torsk, snapper, flyndrefisk, steinbit, gulhale og tilapias. Fortrinnsvis er vaksinen formulert for injeksjon i en laksefisk.
I foretrukne utførelsesformer, når sammensetningen er tiltenkt for injeksjon, kan den formuleres slik at en alikvot på 25-200 ul, fortrinnsvis en alikvot på 40-120 ul, slik som en alikvot på 90-110 ul eller 45-55 ul, og mest foretrukket en alikvot på 50 ul, inneholder salmonid alfavirus i mengder tilsvarende 3,75xl0<7->0,5xl0<9>TCIDsoeller fra 0,5xl0<8->2,5xl0<8>TCID50.
Som nevnt ovenfor er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5xl0<8>TCID50/ml. Dette gir fortrinnsvis en mengde salmonid alfavirus på minst 3,75xl0<7>TCID50/dose.
Det skal forstås at for den foreliggende oppfinnelsens formål bestemmes de
spesifiserte mengdene salmonid alfavirus ved titrering av CHH-celler som illustrert i eksemplene. En alternativ tilnærming er titrering av CHSE-celler. Som fastslått i eksempel 3, er CHH-celler omtrent dobbelt så sensitive for salmonid alfavirus som CHSE-cellene. Når man bestemmer virustitre for CHH-celler, er de oppnådde verdiene derfor omtrent dobbelte så høye som når de bestemmes ved titrering av CHSE-celler.
I europeisk patent EP 712,926 brukes CHSE-celler for titrering. Det er derfor rimelig å anta at virustitrene i PD-vaksinen, som er kommersielt tilgjengelig fra innehaveren av EP 712,926, også bestemmes ved titrering av CHSE-celler. Det angitte antigeninnholdet på 10<7>'<2>TCID50/dose i den første generasjonen monovalent vaksine fra patentinnehaveren ville derfor tilsvare 3,2xl0<7>TCID50/dose hvis bestemt ved anvendelse av CHH-celler for titrering. Likeledes ville det angitte antigeninnholdet på 10<7>'<5>TCID50/dose i den andre generasjonen vaksine tilsvart 6,4xl0<7>TCID50/dose ved titrering med CHH-celler.
Videre er det foretrukket at det bakterielle antigenet tilsettes i mengder som fremkaller en beskyttelse som resulterer i en relativ overlevelsesprosent (RPS) over 70 for den relevante sykdommen ved bruk av en smittemodell for sykdommen ved anvendelse av intraperitoneal injeksjon som smittevej.
Ifølge mer spesifikke utførelsesformer er den drepte eller inaktiverte bakterien til stede i mengder som tilsvarer Ixl0<8->8xl0<9>celler/ml. Ved et doseringsvolum på 50 ul tilsvarer dette 5xl0<6>- 4xl0<8>celler/dose. Fortrinnsvis er bakterien til stede i mengder tilsvarende 0,9 - 5 xlO<9>celler/ml, tilsvarende 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul.
I en spesiell utførelsesform som hovedsakelig er rettet mot det norske markedet, er den levende svekkede eller drepte bakterien til stede i mengder tilsvarende
>2,9xl08 celler/ml (>l,45xl0<7>celler/dose) Aeromonas salmonicida,
>7,4xl0<7>celler/ml (>3,7xl0<6>celler/dose) Vibrio salmonicida, > 4,3xl0<8>celler/ml (> 1.65xl0<7>celler/dose) V. anguillarum serovar 02a, >3,2xl0<8>celler/ml (>l,6xl0<7>celler/dose) V. anguillarum serovar 01 og > 2,7xIO<7>celler/ml (> 1.35xl0<6>celler/dose) Moritella viscosa. I ytterligere foretrukne utførelsesformer tiltenkt for samme formål omfatter sammensetningen inaktivert Aeromonas salmonicida, inaktivert Vibrio. Salmonicida, inaktivert Vibrio anguillarum og inaktivert Moritella viscosa, og hvert bakterielle antigene er til stede i en mengde som tilsvarer 0,9 -5xl0<9>celler/ml.
I en foretrukket utfore I sesform som for øyeblikket er tiltenkt for det chilenske markedet, omfatter sammensetningen: inaktivert Vibrio ordali og inaktivert Piscirickettsia salmonis, begge i en mengde som tilsvarer 0,9 -5xl0<9>celler/ml.
I en foretrukket utførelsesform som for øyeblikket er tiltenkt for Øst-Asia omfatter sammensetningen inakrivert Aeromonas hydrophila, inaktivert Flavobacterium columnaris og inaktivert Haphnia sp., hver i en mengde som tilsvarer 0,9 -5xl0<9>celler/ml.
Ifølge spesifikke utførelsesformer er viruset som ikke er salmonid alfavirus til stede i mengder som tilsvarer 1,0 - 5xl0<9>PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml i tilfeller med infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Ved doseringsstørrelser på 50 ul tilsvarer dette henholdsvis 0,5 - 2,5xl0<8>PFU/dose og 0,2-0,8 antigenenheter/dose.
Som fagmannen vil innse, er det mulig å inkludere én eller flere rekombinant fremstilte antigener i vaksinene ifølge oppfinnelsen. Spesielt kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra det salmonide alfaviruset være et materiale som fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker. I tillegg kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra nevnt bakterie i punkt a) eller fra nevnte virus i punkt b) som definert over fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker.
Slike teknikker, inkludert teknikker for kloning, ekspresjon, syntese og rensing av peptider og polypeptider, er selvfølgelig tilgjengelige og velkjente for fagmannen.
Egnede rekombinante antigener kan være polypeptider klonet fra fiskepatogener eller immunogene deler av slike polypeptider. En immunogen del av et polypeptid kan omfatte en T-celle- og/eller en B-celle-epitop. T-celle-epitoper, som er lineære, kan identifiseres ved å undersøke effekten av deletion-mutasjoner systematisk introdusert i polypeptidsekvensen. B-celle-epitoper kan identifiseres ved å analysere B-celleresponsene på overlappende peptider som dekker polypeptidsekvensen av interesse. Fagmannen vil være klar over at immunogene aminosyresekvenser generelt vil ha en minimumslengde på 6 aminosyrer i en etterfølgende sekvens. Lengre aminosyresekvenser kan naturligvis være foretrukket, inklusive aminosyresekvenser på minst 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 100, 150 eller 200 aminosyrer i en etterfølgende sekvens.
Når påtenkt for formålet å fremkalle en beskyttende immunrespons, vil fagmannen erkjenne at sammensetningen ifølge oppfinnelsen videre kan omfatte et organisk adjuvans og/eller et uorganisk adjuvans.
Det organiske adjuvanset velges fortrinnsvis fra gruppen som består av: mineralolje, squalen 2,6,10,15,19,23-heksametyl-2,6,10,14,18,22-tetracosa-heksan), virosomer, Montanid og CpG-oligodeoksynukleotider. Andre eksempler på hyppig benyttede adjuvantia i fisk- og skalldyroppdrett er muramyldipeptider, lipopolysakkarider, flere glukaner og glykaner, mineralolje og Carbopol<®.>Også adjuvantia som interleukin og glykoproteiner kan anvendes. En omfattende oversikt over adjuvantia egnet for fisk- og skalldyrvaksiner er gitt i oversikts-artikkelen av Jan Raa (1996), hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet.
Nyttige uorganiske adjuvantia vil være kjent for den erfarne utøver og er beskrevet av JC Aguilar og EG Rodriguez, 2007, Vaccine 25, 3752 - 3762, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet.
Spesielt velges det uorganiske adjuvanset som eventuelt er inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen fra gruppen som består av AI(OH)3(aluminiumhydroksid), Ca3(P04)2(kalsiumfosfat) og vannuløselige salter av aluminium, kalsium, jern eller zirkonium.
Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en passende farmasøytisk bærer. I en for tiden foretrukket utførelsesform er vaksinen formulert som en emulsjon av vann i olje. Vaksinen kan også omfatte et såkalt "vehikkel". Et vehikkel er et middel som antigenet fester seg til uten å være kovalent bundet til det. Slike vehikler er bl.a. biodegraderbare nano-/mikropartikler eller -kapsler av PLGA (polylaktid-co-glykolsyre), alginat eller kitosan, liposomer, niosomer, miceller, multiple emulsjoner og makrosoler, alle kjent i faget. En spesiell form for et slikt vehikkel der antigenet er delvis kapslet inn i vehikkelet, er det såkalte ISCOM (europeiske patenter EP 109.942, EP 180.564 og EP 242.380, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet).
I tillegg kan sammensetningen omfatte én eller flere passende overflateaktive forbindelser, detergenter og/eller emulgatorer.
Spesielt velges detergenten fra gruppen som består av ikke-ioniske detergenter, kationiske detergenter og anioniske detergenter.
Fagmannen vil innse at estere av ikke-PEG-ylert eller PEG-ylert sorbitan med fettsyrer er eksempler på nyttige emulgatorer. Som det fremgår i eksemplene kan emulgatoren spesielt være polysorbat eller sorbitanoleat. Mer spesielt kan nevnte detergent og/eller emulgator velges fra gruppen som består av polyoksyetylen (20) sorbitanmonooleat (Tween<®>80), sorbitanmonooleat (Span<®>80), kremofor, Tween® og Span®.
I visse utførelsesformer velges sammensetningen ifølge oppfinnelsen fra gruppen som består av en vann-i-olje-emulsjon, en vann-i-olje-i-vann-emulsjon og en olje-i-vann-emulsjon. For øyeblikket er den foretrukne sammensetningen ifølge oppfinnelsen en vann-i-olje-emulsjon.
I spesifikke utførelsesformer omfatter sammensetningen en mineralolje.
Det skal forstås at salmonid alfavirus i sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være et virus av enhver av de for øyeblikket kjente SAV-undertyper, SAVI, SAV 2, SAV 3, SAV4, SAV5 og SAV6 som definert over. De nåværende oppfinnerne har observert at tidligere beskrevne stammer av salmonide alfavirus er effektive når de blir anvendes som en antigen komponent i polyvalente vaksiner og gir god beskyttelse mot senere infeksjon.
Representative isolater av SAVI- og SAV 2-undertyper er beskrevet i faget: En patentdeponering av SAVI har tidligere blitt gjort under Budapestkonvensjonen ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. Det deponerte SAVl-isolatet tilsvarer isolatet beskrevet i Nelson m.fl. 1995 og isolatet tilveiebrakt i EP 712,926.
Det salmonide alfaviruset i sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være et salmonid alfavirus undertype 3 (SAV3)-virus og kan velges det salmonide alfaviruset i sammensetningen fra gruppen bestående av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 OJG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201, 07121202 og 07121203.
Relaterte genotypiske karakteristika:
Viruset kan være en stamme eller isolat med genotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene angitt over, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene.
Selv om de genome organiseringene av alle karakteriserte SAVer er like, er nukleotidsekvenslikheten mellom SAV3 og SAVI bare 91,6 %, og mellom SAV3 og SAV2 92,9 % (Hodneland m.fl. 2005). Dersom sammenligningen begrenses til bestemte gener, for eksempel det ikke-strukturelle proteinet nsP3, er likheten mellom undertyperså lav som 81,5 % (Weston m.fl. 2005).
Det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte en nukleinsyresekvens som er minst 90 %, slik som 95 %, 97 % eller 99 % identisk med en enkelt av sekvensene angitt i SEQ ID NO: 1-3.
I ytterligere utførelsesformer omfatter det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyresekvens som er minst 80 %, slik som 85 %, 90 %, 95 %, 98 % eller 99 % identisk med sekvensen angitt i en enkelt av SEQ ID NO: 4-6.
Virus av SAV3-varianten kan omfatte en nukleinsyresekvens som er minst 98 %, 99 % eller 99,5 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.
For den foreliggende oppfinnelsens formål er en passende test for å avgjøre om et virusisolat har genotypiske karakteristikker som er beslektet med eller ligner på de deponerte stammene ovenfor, gitt i eksempel 2: fagmannen vil innse at i foretrukne utførelsesformer er salmonid alfavirus ifølge oppfinnelsen et virus, hvilket er positivt i den SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR (RT-QPCR)-identitetstesten som beskrevet i eksempel 2, spesielt når det anvendes et sett primere som er utviklet for å amplifisere del av en salmonid alfavirus glykoprotein E2 nukleotidsekvens, slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8.
Relaterte fenotypiske karakteristika:
Viruset kan dessuten være en stamme eller isolat med fenotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene.
Fenotypiske forskjeller eksisterer mellom isolater innenfor de tre SAV-gruppene, samt mellom grupper (Christie m.fl. Dis. Aquat. Org. 75: 13-22, 2007, Hodneland m.fl. 2005, Taksdal m.fl.): I en studie avTaksdal m.fl. hadde alle atlantiske laks og 76 % av regnbueørretene infisert med virus av SAV3-undertypen alvorlige pankreatiske lesjoner i sen/regenerativ fase. Dette var i motsetning til rapporter fra irske og skotske tilfeller der fisk infisert med SAVI vanligvis hadde normalt, sannsynligvis legede, eksokrine pankreatiske vev. Et ytterligere karakteristisk trekk ved pankreatisk sykdom forårsaket av SAV3-undertypen er nærvær av tallrike celler i nyren som inneholder cytoplasmiske eosinofile granuler (EG). I Taksdals studier ble EG-inneholdende celler funnet i 40 % av regnbueørreten og i 64 % av atlantisk ørret. I tillegg er det karakteristisk at regnbueørreten og atlantisk laks er like følsomme for infeksjoner med SAV3, selv om regnbueørret synes å være litt resistent mot infeksjon med SAVI. Til slutt synes hjertet å friskne til tidligere etter infeksjoner med SAV3 sammenlignet med infeksjoner med SAVI.
Viruset som er inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, kan være i stand til å fremkalle dødelighet på minst 25 %, slik som minst 30 %, minst 35 %, minst 40 %, minst 45 %, minst 50 %, minst 55 % eller fortrinnsvis minst 60 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og smitte av postsmolt ved intraperitoneal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID5o, minst 10<10>TCID5oeller fortrinnsvis minst 3,5 x IO<8>TCID5opr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann (25 %o) på 12 °C.
Den nye varianten av salmonid alfavirus undertype SAV3 er kjennetegnet ved evnen til å vokse til høye titre in vitro i kulturer av vertsceller. Således kan dette viruset være i stand til å vokse til en titer i supernantanten/vekstmediet på minst lxlO<8>, 5xl0<8>, lxlO<9>, 5xl0<9>, lxlO<10>og 5xl0<10>eller slik som minst lxlO<11>TCID50/ml når de dyrkes ved å anvende vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-l-celler eller CHSE-214-celler.
Spesielt kan slike høye virustitre oppnås når:
i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet
på 0,1-lxlO<5>celler cm"<2>;
ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon;
iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 xlO<6>celler cm'<2>på
infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat;
iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10
% føtalt bovint serum (FBS) + 2 mM L-glutamin + 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) + 0,1 % gentamicin og
v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 °C i en periode på
10-14 dager.
Det vil videre bli forstått at SAVI, SAV3, SAV4, SAV5 eller SAV6-viruset som er inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, er et virus som hvis ikke det er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med fiskepankreatisk sykdom. Generelle symptomer på fiskepankreatisk sykdom har blitt gjennomgått i McLoughlin og Graham, Journal of Fish Disease 2007, 30, 511-531, hvis innhold er innlemmet her i sin helhet. Symptomene inkluderer:
i) Død/dødelighet
ii) Mangel på appetitt
iii) Nedsatt svømmeferdighet
iv) Letargi
v) Pankreatisk nekrose
vi) Kardiomyopati og skjeletal myopati, inklusive øsofageale
muskellesjoner
vii) Nyrelesjoner, angrepne nyrer som inneholder tallrike interstitielle
celler fylt med eosinofilt materiale
viii) Fokal gliose i hjernen.
Generelt kan sykdomsforløpet som følge av infeksjoner med fiskepankreatisk sykdomsvirus karakteriseres som å omfatte en akutt fase og en sen/kronisk fase, der hver fase er forbundet med forskjellige histopatologiske symptomer. Viruset tilveiebrakt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan særlig være i stand til å forårsake minst ett av følgende histopatologiske symptomer i akuttfasen: i) ødeleggelse av hoveddelen av pankreatisk acinærvev og en variabel inflammatorisk respons som varierer fra ingen inflammasjon til moderat inflammasjon;
ii) fibrose i periacinært vev.
Viruset tilveiebrakt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også være i stand til å forårsake minst ett av de følgende histopatologiske symptomene i den sene/kroniske fasen.
i) signifikant tap av pankreatisk acinærvev med eller uten fibroplasi av
periacinært vev;
ii) multifokal kardiomyocytisk nekrose, angrepne celler har et innskrumpet, dypt eosinofilt cytoplasma og pyknotiske kjerner.
I motsetning til infeksjoner med SAVI og -3 er infeksjoner med SAV2 i regnbueørret rapportert å forårsake lavere dødelighet, men en dødelighet på opptil 22 % har blitt rapportert (Boucher og Baudin 1994). Sovesyke kan imidlertid forårsake at fisken ligger på siden på bunnen av tanker eller vannrenner. Dersom den forstyrres, svømmer fisken litt og returnerer deretter til bunnen. Dette tegnet skyldes primært omfattende nekrose i røde skjelettmuskler.
Makroskopiske lesjoner forekommer ikke, men av og til sekundære sår på skinnet eller petekkier på det pyloriske organ. Nekroser av røde skjelettmuskler kan forefinnes, og histopatologisk undersøkelse kan avsløre inflammasjon i eksokrin pankreas og hjerte. I den enkelte fisk kan disse lesjonene foreligge med eller uten noen atferdsendringer.
Det vil bli forstått at SAV2-viruset, som kan være inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, er et virus som hvis det ikke er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med sovesyke hos fisk.
Det skal videre forstås at viruset ifølge oppfinnelsen kan ha en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, slik som under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler. Som nevnt har nåværende oppfinnere identifisert en ny variant av salmonid alfavirus undertype SAV3. Denne varianten av viruset viste synlig cytopatogen effekt under første passasje i cellekultur. Mens tidligere isolater av salmonid alfavirus ikke har hatt synlig cytopatogen effekt før de vente seg til in vitro dyrkingsbetingelsene, kan evnen til å forårsake en cytopatogen effekt uten å ha blitt passert på en cellelinje derfor brukes som enda et kjennetegn på viruset ifølge foreliggende oppfinnelse.
Det skal også forstås at de deponerte virusene kan mutere eller på annen måte endre karakteristika, for eksempel når de passeres på vertsceller in vitro (JD Watson m.fl., 1987). Fagmannen vil innse at replikasjon av RNA-virusgenomer ledsages av svært høye mutasjonsrater (Watson et al., 1987). Dette skyldes mangel på korrekturlesingsaktivitet hos RNA-viruspolymeraser, noe som fører til en konstant generering av nye genetiske varianter for eksempel under viruspropagering (Elena og Sanjuån, 2005). Domingo og Holland (1997) konkluderer dessuten med at forskjellige konstellasjoner av mutasjoner kan assosieres med en lignende biologisk atferd. Salmonid alfavirus anvendt til den foreliggende oppfinnelsens formål kan derfor være en stamme som kan oppnås ved å introdusere én eller flere substitusjoner, utelatelser og/eller tilføyelser av nukleotider i genomet til en enkelt av de deponerte stammene nevnt over. Med andre ord kan salmonid alfavirus som anvendes til den foreliggende oppfinnelsens formål være en genetisk variant av en hvilken som helst av de ovennevnte deponerte stammene.
Oppfinnerne har under screeningen av nye SAV 3-isolater fra utbrudd i norske lakseoppdrettsanlegg oppdaget en variant av viruset med egenskaper som avviker signifikant fra de som tidligere er beskrevet. Funnet av at denne varianten av SAV3-undertypen viste synlig cytopatogen effekt under dens første passasjen i cellekultur, og frembrakte dødelighet da den ble injisert i atlantisk laks, var derfor høyst overraskende. I tillegg er det meget oppmuntrende at vaksiner basert på antigent materiale fra denne varianten av viruset gir en utmerket beskyttelse mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus, også når vaksinen gis som en polyvalent vaksine omfattende ytterligere antigener. I tillegg har denne nylig oppdagede varianten av viruset gode vekstegenskaper ved vekst in vitro på kulturer av vertsceller.
Det vil forstås at kulturene med salmonid alfavirus som anvendes i forbindelse med oppfinnelsen, hovedsakelig er fri for annet viralt eller mikrobielt materiale. Spesielt er kontaminering av virusisolater ifølge oppfinnelsen med IPNV en kilde til bekymring siden fisk infisert med salmonid alfavirus, ofte også er infisert med IPNV. I løpet av isoleringen av viruset ifølge oppfinnelsen kan det derfor være nødvendig å tilsette et antistoff rettet mot IPNV for å eliminere IPNV-viruset fra isolater eller kulturer av viruset ifølge oppfinnelsen. I kulturer av virus på vertsceller vil dette antistoffet hemme infeksjon av vertscellene med IPNV.
I en spesifikk og for tiden foretrukket utførelsesform, som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Nord-Europa, inkludert Norge, omfatter sammensetningen ifølge oppfinnelsen: i) inaktivert Salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 3,75xl0<7>- 2,5xl0<8>TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
ii) inaktivert Aeromonas salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose),
iii) inaktivert Vibrio. salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
iv) inaktivert Vibrio anguillarum i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
v) inaktivert Moritella viscosa i en mengde tilsvarende 0,5 -5xl0<9>celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
vi) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 - 2,5xl0<8>PFU/dose ved et doseringsvolum på 50^1) eller 2-8 antigen-
enheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
vii) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
viii) en detergent og/eller emulgator.
I alternative utførelsesformer som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sør-Amerika, inkludert Chile, omfatter sammensetningen ifølge oppfinnelsen: i) inaktivert salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 3,75xl0<7>- 2,5xl0<8>TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 ul) ,
ii) inaktivert Vibrio ordali i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50Hl),
iii) inaktivert Piscirickettsia salmonis i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
iv) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 - 2,5xl0<8>PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 ul) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
v) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
vi) en detergent og/eller emulgator.
I andre alternative utførelsesformer som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sørøst-Asia, omfatter sammensetningen ifølge oppfinnelsen: i) inaktivert salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID5o/ml (for å fortrinnsvis gi 2,5xl0<7>- 2,5xl0<8>TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 ul) ,
ii) inaktivert Aeromonas hydrophila i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
iii) inaktivert Flavobacterium columnaris i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>
celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
iv) inaktivert Haphnia sp. i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml (for å
fortrinnsvis gi 0,45 - 2,5xl0<8>celler/dose ved et doseringsvolum på 50Hl),
v) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5 - 2,5xl0<8>PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 ul) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 ul),
vi) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
vii) en detergent og/eller emulgator.
Doseringsform
Enda et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en doseringsform av en sammensetning ifølge oppfinnelsen.
Selv om andre doseringsformer kan være overveid, inkludert faste doseringsformer basert på fiskefor, er doseringsformen ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis en flytende doseringsform, mer foretrukket en flytende doseringsform for injeksjon slik som intraperitoneal injeksjon. Når doseringsformen er beregnet for injeksjon, har den fortrinnsvis et volum på 25-200 ul, mer foretrukket et volum på 40-120 ul, slik som et volum på 90-110 ul eller 45-55 ul. For tiden er et doseringsvolum på 50 ul mest foretrukket av praktiske grunner.
I forbindelse med doseringsformen gjelder de samme preferansene med hensyn til doseringsvolum og antigeninnhold som beskrevet i forbindelse med sammensetningen ifølge oppfinnelsen.
Spesielt omfatter doseringsformen ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis salmonid alfavirus i mengder tilsvarende, 3,75 x 10<7->0,5 x IO<9>eller 0,5 x 10<8->2,5 x IO<8>TCID50/dose.
Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendbare i akvakultur. Det skal derfor forstås at sammensetningen eller dosisformen ifølge oppfinnelsen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner herav.
Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det at vaksinen administreres til parr laks, fortrinnsvis parr på 10-60 gram. Som fagmannen vil innse, kan vaksinen ifølge oppfinnelsen imidlertid også administreres til laks i andre stadier, inklusive alle saltvannsstadier.
Som vist i eksemplene tilveiebringer sammensetningene ifølge oppfinnelsene ekstremt effektiv beskyttelse mot infeksjon av salmonid alfavirus ved testing i laboratoriesmitteforsøk hvor de vaksinerte fiskene smittes med høye titre av høyvirulente SAV3-isolater. I området hvor fisken eksponeres for mye lavere titre av viruset forventes det at beskyttende virkning av vaksinene tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen er enda høyere enn det som er vist i foreliggende eksempler.
Medisinsk anvendelse/fremgangsmåte for profylakse
Andre aspekter av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av inaktivert salmonid alfavirus i fremstillingen av en vaksine for forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus, hvori nevnte vaksine er en doseringsform som inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde tilsvarende minst 3,75xl0<7>TCID50/dose bestemt ved titrering på CHH celler, og administreres samtidig eller i kombinasjon med én eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a) en drept bakterie,
b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus,
c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i
a), eller fra nevnte virus i b).
Det skal derfor forstås at ifølge oppfinnelsen inneholder den nevnte doseringsformen inaktiverte salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 3,75 x IO<7>TCIDso/dose. Likeledes foretrekkes det at nevnte vaksine / immunologiske sammensetning inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 7,5 x IO<8>TCID50/ml.
Ytterligere aspekter av oppfinnelsen vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus.
Enda ytterligere aspekter vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av fiskepankreatisk sykdom og/eller sovesyke. I enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å redusere forekomsten av og/eller behandle eller forebygge infeksjon med salmonid alfavirus i en fiskepopulasjon, der fremgangsmåten omfatter å administrere en sammensetning, vaksine eller doseringsform som definert over til fisken.
Fremgangsmåte for å lage en vaksine
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning og/eller doseringsform som definert over. Fremgangmåten omfatter å kombinere et inaktivert salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en levende, svekket, drept eller inaktivert bakterie,
b. et virus som ikke er salmonid alfavirus, nevnte virus er fortrinnsvis
svekket eller inaktivert, og
c. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a) eller fra nevnte virus i b).
Mengden av salmonid alfavirus justeres for å tilveiebringe en sammensetning eller vaksine som omfatter minst 7,5 x IO<8>TCID50/ml inaktivert salmonid alfavirus eller en doseringsform som omfatter minst 2,5 x IO<7>TCID50/dose.
I denne sammenheng er fortrinnsvis de virale og bakterielle antigenkomponentene som spesifisert over, avhengig av fiskepatogenene som er utbredt i området hvor vaksinen skal anvendes.
Siden det salmonide alfaviruset må dyrkes på kulturer av vertsceller kan fremgangsmåten i henhold til dette aspektet av oppfinnelsen videre omfatte
a. etablering av en kultur med vertsceller;
b. infisering av vertscellene med et isolat av et virus av salmonid alfavirus og c. dyrking av infiserte celler under betingelser som tillater nevnte virus å nå
en titer i supernatanten/vekstmediet på minst 7,5 x IO<8>TCID50/ml.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dyrkes vertscellene enten på et fast medium eller som suspensjonskulturer.
For å gi optimale vekstbetingelser kan vertscellene dyrkes ved en pH mellom 6,5 og 8,5, slik som mellom 7,0 og 8,0, mellom 7,2 og 8,0, mellom 7 og 7,5 eller mellom 7,2 og 7,5.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er utviklet for det spesielle formålet å produsere den salmonid alfavirus vaksinekomponenten i store mengder. Derfor kan prosessen tilpasses for å produsere salmonid alfavirusmateriale i batcher på 25-2000 liter, slik som 25-1000 liter, 50-2000 liter, 50-1000 liter eller 50-500 liter.
Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan vertscellene sås med en tetthet på 0,1-1,5 x IO<5>celler cm"<2>, 0,2-1,5 x IO<5>celler cm"<2>,0,2-1,25 x IO<5>celler cm"<2>, 0,2-1 x IO<5>celler cm"<2>eller 0,2-1 x IO<5>celler cm"<2>når de dyrkes på en fast bærer.
Vertscellene kan dyrkes i 3-8 dager før vi rusi nfi sering, slik som fra 4-8 dager, 4-7 dager eller fra 4-6 dager.
Vertsceller kan dessuten dyrkes til en tetthet på 8 x IO<5>celler cm"<2>på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat.
Spesielt kan vertscellene dyrkes til en tetthet på fra 5 x IO<5>celler cm"<2>til 5 x IO<6>celler cm"<2>på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat.
Hva gjelder vekstmediet kan vertscellene dyrkes i et vekstmedium valgt fra gruppen bestående av EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) + 2 mM L-glutamin + 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) + 0,1 % gentamicin.
Etter infisering av cellene kan de infiserte cellene dyrkes ved en temperatur fra 12-16 °C, slik som ved en temperatur på 13-16 °C, 13-15 °C, 14-16° C eller 14-15 °C, og i en periode på 6-20 dager, slik som en periode på 8-20 dager, 8-18 dager, 8-16 dager, 9-20 dager, 9-18 dager, 9-16 dager, 10-20 dager, 10-18 dager, 10-16 dager eller 10-14 dager.
Dessuten kan de infiserte cellene dyrkes inntil 30 % av vertscellene er lysert eller har løsnet, slik som inntil 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % eller 90 % av vertscellene er lysert eller har en cytopatogen effekt bestående av avrundede celler.
Som forklart over kan nevnte salmonide alfavirus være et virus av SAV3-undertypen.
Hva gjelder vertscellene kan disse velges fra gruppen bestående av celler avledet fra hjertevev fra unge chum-laks ( Onchorhynchus keta), celler avledet fra Chinook-laks ( Oncorhynchus tshawytscha)- embryo.
Mer spesielt kan brukes vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-1-celler og CHSE-214-celler, CHH-l-celler er tilgjengelige fra ATCC under deponeringsnummer CRL-1680, CHSE-214-celler er tilgjengelige fra ATCC, deponeringsnummer CRL 1681 og fra ECACC under deponeringsnummer 91041114.
Bakterielle antigener til bruk i polyvalente vaksiner ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å bruke konvensjonelle teknikker, f.eks. ved å dyrke bakteriene i tryptisk soyabuljong med 2 % NaCI ved 12-15 °C, eller i hjerne/hjerte-infusjonsbuljong med 3 % NaCI ved 12-15 °C (Atlas, RM,2004, Handbook of Microbiological Media, tredje utgave, CRC press, side 1820 og 246).
Hva gjelder infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) kan dette viruset propageres i den hensikt å fremstille en vaksine i CHSE-214-celler i henhold til Dobos P og Roberts TE, 1982, Canadian Journal of Microbiology, 29, 377 - 384.
Dyrkingen av disse representative patogenene er også beskrevet på http:// www. lqcpromochem- atcc. com/.
Et eksempel på en polyvalent vaksine som fordelaktig kunne forbedres ved å inkludere et antigenpreparat av salmonid alfavirus, er AJ 6-2 allerede markedsført av den nåværende søkeren.
Det bør bemerkes at utførelsesformer og trekk beskrevet i sammenheng med ett av aspektene av foreliggende oppfinnelse også gjelder for de andre aspektene av oppfinnelsen.
Alle patent- og ikke-patentreferanser sitert i foreliggende søknad innlemmes herved ved referanse i sin helhet.
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i ytterligere detaljer i de følgende ikke-begrensende eksemplene.
Eksempler
Eksempel 1: Isolasjon av PD-virus fra fisk med klinisk PD-infeksjon (ALV-405, ALV 406 og ALV-407)
Materialer
Orqanmateriale
Hjerter ble tatt fra fisk med kliniske symptomer på pankreassykdom i kommersielle fiskeoppdrettsanlegg. Hjertene ble holdt kalde ved 4 °C.
Cellekulturer
CHH-1, 145. passasje
CHSE-214, 36. passasje
GF-1, 4. passasje
Celler ble sådd to - tre dager før bruk.
Vekstmedia
• CHH-l-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). • CHSE-214-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
• GF-1 vekstmedium: L-15 (Sigma L-5520 lot), 10 % FBS (Sigma F-3885),
1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Filter:
Minisart plus (Sartorius #17829)
Anti-IPNV-antistoffer: Kanin-anti-IPNV-antiserum (CP54/1996)
Hjerter fra atlantisk laks ble homogenisert ved bruk av en porselensmorter og kvartssand med noe tilsatt medium (ca 8-20 ml). Homogenatet ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 °C før filtrering gjennom et sprøytefilter på 0,45 nm. Homogenatene ble fordelt i kryoflasker og frosset ved -80 °C.
Prøver av noen av organhomogenatene ble blandet 1:100 med anti-IPNV-antiserum og inkubert i to timer ved 15 °C. Deretter ble 50-200 ni homogenat med eller uten tilsatt anti-IPNV-antiserum inokulert i de forskjellige cellekulturene (50-90 % konfluent) i 75/175 cm<2>Nunc-celleflasker med 15/50 ml av passende medium i henhold til tabell 1.
Ved passering av viruset i nye cellekulturer ble 1 ml supernatant overført til nye cellekulturflasker.
Konklusjoner
SAV3 ble isolert fra hjerter samlet fra atlantisk laks med pankreassykdom Cytopatogen effekt var synlig i cellekulturene fra passasje 1
Passasje l-SAV3-isolatene hadde en titer på opptil 1,3 x IO<8>TCID50
SAV3 kan isoleres i passasje 1 på flere forskjellige cellelinjer
Eksempel 2: Identitetstest for SAV3, og test for fravær av IPNV i SAV3-isolater
For å bekrefte identiteten til forskjellige isolater av SAV3 og for å teste dem for fravær av infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), ble en revers transkripsjon-kvantitativ PCR (RTQPCR)-prosedyre som bruker primere spesifikke for SAV og IPNV anvendt.
Materialer
Virusisolater: ALV-405 p5 og p6, ALV 407 pl, ALV 408 pl, ALV 409 lpA og lpB (to separate isolasjoner). Positiv kontroll: IPNV ALV 103.
RNA-isolasjon: QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol
Revers transkripsjon og QPCR: Brilliant® II QPCR og QRT-PCR-reagenser fra Stratagene.
RT-PCR-betingelser:
IPNV-test: 50 °C, 30 min - 95 °C, 10 min -(95 °C, 30 sek - 57 °C, 60 sek - 72 °C, 30 sek)<*>40 ;SAV3-test: 50 °C, 30 min - 95 °C, 10 min -(95 °C, 30 sek - 57 °C, 60 sek - ;72 °C,30 sek)<*>40
Resultater: Alle SAV3-isolater var positive i SAV RT-QPCR og negative i IPNV RT-QPCR. Disse testene viser at alle SAV3-isolatene virkelig er SAV og ikke kontaminert med IPNV.
Eksempel 3: Titrering av salmon pancreas disease virus ved bruk av ulike cellelinjer.
SAV3 ble titrert på to ulike cellelinjer; CHH og CHSE som beskrevet i henholdsvis eksempel 4 og 5. TCID50-verdiene oppnådd med de to cellelinjene vises i tabell 3. CHH-cellelinjen er ca. dobbelt så sensitiv for viruset som CHSE-cellelinjen.
Eksempel 4: Dyrking av SAV3 i CHH-l-cellekulturflasker med høy celletetthet.
Intensjon
Hensikten var å evaluere potensielle PD-utbytter for forskjellige virusisolater i CHH-l-cellekulturflasker med høy celletetthet.
Materialer og fremgangsmåter
Cellekulturer og vekstmedier
3 x 175 cm<2>flasker, CHH-1, 160. passasje med 100 x IO<6>celler pr. flaske (5,7 x IO<5>C/cm<2>)
CHH-l-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Virus/ infeksionsmateriale
ALV-405, p6, titer: 5,01 x IO<8>TCID50/ml
ALV-407, pl, titer: 3,41 x IO<7>TCID50/ml
ALV-407, p4, titer: 4,14 x IO<7>TCID50/ml
Rett før infisering ble vekstmediet i flaskene erstattet med 50 ml friskt vekstmedium, og deretter ble de respektive infeksjonsmaterialene tilsatt (tabell 1). Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker.
Prøvetaking, titrering og mikroskopiske observasjoner
Mikroskopiske observasjoner og titrering av prøver ble utført 7, 10, 13 og
18 dager pi på CHH-1.
Resultater/diskusjon
Mikroskopiske observasjoner
Løsning og avrunding av celler viste seg ca. en uke pi i alle flasker. Ved slutten av observasjonsperioden (18 dager pi) hadde flaske 2 mest fremtredende CPE med 80 % av cellene løsnet mens flaske 1 og 3 hadde henholdsvis 20 % og 40 % løsnede celler.
Titreringsresultater
De tre isolatene/passasjene hadde alle titre på IO<9>TCID50/ml eller høyere. Overraskende var utbyttene høyest i flasken infisert med den 1. passasjen av ALV-407 (figur 1, ALV-407 p2), men denne flasken hadde også den mest fremtredende CPE. Resultatene bekrefter at CHH-l-celler frembringer høye SAV3-utbytter også fra virusstammer med få passasjer. Resultater er vist i figur 1.
Konklusjoner
• De høyeste utbyttene var 1,78 x IO<9>TCID50/ml i en prøve oppnådd
13 dager etter inokulasjon med ALV-407 pl ved MOI 0,2.
• Fremstilling av SAV3 med få passasjer i CHH-l-celler gir et godt utbytte av SAV3.
Eksempel 5: Dyrking av SAV3 i CHSE-celler.
Intensjon
Hensikten var å evaluere de potensielle SAV3-utbyttene for forskjellige virusstammer i CHSE-214-cellekulturer.
Materialer og fremgangsmåter
Cellekultur og vekstmedium
CHSE-214: 19. passasje med ca. 80 % konfluens.
CHSE-214 vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Virusstamme
• ALV-404, 8p.
Flaskene ble avkjølt til 15 °C før de ble infisert uten endring av medium. Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker.
Prøver av virussåmaterialene ble titrert på 96-brønns plater.
Mikroskopisk observasjon og titrering av prøver fra alle flasker ble utført 6, 12, 15, 20 og 27 dager pi.
Resultater/diskusjon
Mikroskopiske observasjoner
Infeksjonen (lysering og løsning av celler) utviklet seg raskt i CHSE-kulturene, med mer enn 90 % lysering 12 dager pi. Prøver fra de to flaskene ble samlet og titrert på 96-brønns plater på dag 6, 12, 15, 20 og 27 dager etter infisering. Gjennomsnittsverdiene fra de to parallelle flaskene er vist i figur 2.
Dette eksperimentet viser at CHSE-214 er en passende cellelinje for produksjon av SAV3 siden høye virustitre produseres fra stammer av SAV3 med få passasjer.
Eksempel 6: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom basert på salmonid alfavirus undertype 3-antigent materiale og viser utmerket beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen. Atlantisk unglaks (parr) med en gjennomsnittsvekt på 25,7 gram ble vaksinert med 0,1 ml av en polyvalent vann-i-olje vaksine. Vaksinen inneholdt inaktivert antigen fra følgende patogener:
Alle komponentene ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C.
Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittet ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Smittedosen var 5,36 x IO<8>TCID50pr fisk. I smittetankene nådde dødeligheten 86 % i kontrollgruppen i tank 1 og 66 % i tank 2, mens ingen dødelighet ble registrert i gruppene vaksinert med den polyvalente vaksinen som beskytter mot salmonid pankreassykdom. Resultater vises i figur 3. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 7: Dose/respons - vaksinasjon med monovalent og polyvalent SAV3-vaksine.
Foreliggende eksempel presenterer et dose-responseksperiment med monovalent og multivalent vaksine mot pankreassykdom.
Atlantisk unglaks (parr) med en gjennomsnittsvekt på 25,7 gram ble vaksinert med 0,1 ml av en polyvalent vann-i-olje vaksine. Vaksinen inneholdt inaktivert antigen fra følgende patogener:
Alle komponentene ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C.
Merking og vaksinasjon
For hver gruppe ble 40 fisk merket ved klipping av finnen og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering. Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittetdret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Smittedosen var 6,5 x IO<8>TCIDsopr fisk.
Resultater:
I smitteforsøkenega den polyvalente vaksinen bedre beskyttelse enn den monovalente vaksinen ved de laveste antigendosene. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine med et PD-antigeninnhold på 1 x IO<9>TCID50/ml effektivt kan beskytte mot salmonid pankreassykdom når den gis i doser på 0,5 x IO<8>TCID50/dose. Ettersom vaksinen gir noe beskyttelse mot senere infeksjon, selv når den gis i doser på IO<6>TCID50, er det rimelig å konkludere med at en tilfredsstillende grad av beskyttelse også kan oppnås når vaksinen administreres i doser som inneholder noe mindre enn 0,5 x IO<8>TCID50/dose.
Eksempel 8: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAVI
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAVl-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAVl-antigent materiale fremstilles fra en kultur med dette viruset, dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
SAVl-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittes ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen er 3-6 x
IO<8>TCID50pr fisk. Dette eksperimentet viser at polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom SAV3.
Eksempel 9: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved anvendelse av en vaksine omfattende SAVI
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAVl-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAVl-antigent materiale ble fremstilt fra en kultur av dette viruset i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene ble fremstilt:
SAVl-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etter-følgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C. Vaksinene ble formulert som vann-i-olje-emulsjoner ved å anvende standardmetoder. 60 fisk ble merket ved finneklipping og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering ble fisken fordelt i en tank inneholdende sjøvann (25 %o) og smittet ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen var 3,01 x IO<8>TCIDsopr fisk.
Dødeligheten i kontrollgruppen nådde 70 %, mens dødeligheten i gruppen vaksinert med en polyvalent vaksine omfattende 2 x IO<9>TCID50/ml inaktivert SAVI, nådde 3,3 %, noe som gir en relativ overlevelsesprosent på 95,2. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. I dette eksperimentet er SAVl-antigendosen doblet sammenlignet med den monovalente SAVI vaksine C, og det er en økning i observert RPS. Dette antyder at den samme antigendosen kan anvendes i polyvalente PD-vaksiner som fremkaller den samme beskyttelsen som monovalente PD-vaksiner. Dette er i motsetning til konvensjonell kunnskap på området for fiskevaksinologi.
Eksempel 10: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV2
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV2-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 2 isoleres fra utbrudd av sovesyke hos regnbueørret oppdrettet i ferskvann i Frankrike. SAV2-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
SAV2-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittes ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen er 3-6 x IO<8>TCID50pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 2-antigent materiale virkelig kan beskytte mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus SAV3.
Eksempel 11: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
SAV3-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etter-følgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 °C.
En vann-i-olje-emulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittes ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen er 3-6 x IO<8>TCID50pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og flere bakterielle antigener virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 12: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponenter fremstilles:
SAV3-virus ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 °C.
En vann i oljeemulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittes ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen er 3-6 x IO<8>TCID50pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og flere bakterielle antigener virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 13: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell smittemodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
SAV3-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 °C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 °C.
En vann-i-olje-emulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 %o) og smittes ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Smittedosen er 3-6 x IO<8>TCID50pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og Montanid ISA 736 B virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Referanser
Aguilar JC og Rodriguez EG (2007), Vaccine adjuvants revisited, Vaccine 2007, 25, 3752 - 3762, 2007.
Alderborn G og Aulton M (2002) Pharmaceutics; The Science of Dosage Form Design, 2002, Elsevier Science
Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, jeffroy J, Le Ven A og Bearzotti M
(1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997.
Boucher P og Baudin Laurencin F (1994) Sleeping disease (SD) of salmonids, Bull of the European Association of Fish Pathologists, 14, 179-180
Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, jeffroy J, Le Ven A og Bearzotti M
(1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997.
Christie KE, Koumans JTM, Fyrand K, Goovaerts D og Rødseth OM (1999A) Vaccination against pancreas disease in Atlantic salmon (Salmo salar L). IXth International Conference of the European Association of Fish Pathologists, Rohdes, September 1999, muntlig presentasjon med sammendrag
Christie KE, Fyrand K og Rødseth OM (1999B) Vaksine mot pancreas disease hos laks og ørret, møte Frisk Fisk, Tromsø januar 1999, muntlig presentasjon med sammendrag.
Hodneland K, Bratland A, Christie KE, Endresen C, Nylund A. (2005), New subtype of salmonid alphavirus (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway, Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5;66(2): 113-20 (Rettelser i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2): 181).
Intervet Newsletter, March 2002.
Lopez- Doriqa MV, Smail DA, Smith R], Doménech A, Castric J, Smith PD, Ellis AE. Isolation of salmon pancreas disease virus (SPDV) in cell culture and its ability to protect against infection by the 'wild-type' agent. Fish Shellfish Immunol. 2001 Aug;ll(6):505-22.
McLoughlin MF og Graham DA (2007), Alphavirus infections in salmonids - a review, Journal of Fish Diseases 2007, 30, 511-531.
Nelson RT, McLoughlin MF, Rowley HM, Platten MA og McCormick JI (1995) Isolation of a toga-like virus from Atlantic salmon Salmo salar with pancreas disease (1995) Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995.
Powers AM, Brault AC, Shirako Y, Strauss EG, kang W, Strauss JH og Weaver SC
(2001) Evolutionary relationships and systematics of the alphaviruses, Virology 75, 10118-10131 2001.
Raa J (1996), Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-228 1996.
Rognes T ( 2001), ParAlign: a parallel sequence alignment algorithm for rapid and sensitive database searches, Nucleic Acids Research, 29, 1647-1652 2001.
Smith TF og Waterman MS (1981) Identification of common molecular sub-sequences. Journal of Molecular Biology, 147, 195-197.
Taksdal T, Olsen, A B, Bjerkas I, Hjortaas M J, Dannevig B H, Graham D A, McLoughlin M F (2007), Pancreas disease in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss ( Walbaum), in Norway, Journal of Fish Disease 2007, 30, 545-558.
Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987)
Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses (898-961)
Rodger, H & Mitchell, S. Pancreas disease in Ireland: Epidemiological survey results for 2003 and 2004 in Ruane N, Rodger H, Graham D, Foyle L, Norris A, Ratcliff J, Murphy K, Mitchell S, Staples C, Jewherst H, Todd D, Geoghegan F og Cinneide MO: Marine Environment and health service No 22 2005 Research on Pancreas disease in Irish farmed Salmon 2004/2005 - Current and Future in initiatives. 2005.
André, E F: Development and clinical application of new polyvalent combined paediatric vaccines, Vaccine 17(1999), 1620-1627
0,Meara m.fl.: Recombinant vaccines against ovine footrot, Immunology and Cell Biology (1993) 71, 473-488.
Elena, SF og Sanjuån, R m.fl.: Adaptive Value of High Mutation Rates of RNA viruses: Separating Causes from Consequences (2005), Journal of Virology, 79, 11555-11558.
Domingo, E og Holland, JJ m.fl.: RNA virus mutations and fitness for survival
(1997), Annu. Rev. Microbiol., 51, 151-78.
Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987), Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses
(898-961)
Djupvik m.fl. "Handlingsplan - forslag til tiltak mot Pancreas Disease". Nasjonalt senter for fisk og sjomat (NaS), Rapport April 2007 (1-40).
Brun m.fl., Norsk Fiskeoppdrett, 2006.07.20, nr. 7 (50-53).
WO 2007/031572 (Intervet International B.V.)
WO 2008/002152 (PHARMAQ)
WO 2003/101482 (Genesis Group)
Fringuelli, E m.fl. "Phylogenetic analyses and molecular epidemiology of European salmonid alphaviruses (SAV) based on partial E2 and nsP3 gene nucleotide sequences". J. Fish Dis. 2008 Nov;31(ll) (811-23).
Hoel, E m.fl. "Pancreas Disease (PD) — en utredning for Fiskeri- og Kystdepartementet", VESO og Veterinaerinstituttet, 2007.08.23, ISBN 82-91743-77-0 (1-36).
Dom fra Borgarting Lagmannsrett, saksnummer 10-103765ASD-BORG/03, (1-47).
Christie K.E. m.fl. "Cross injection of salmon and trout with pancreas disease virus (PDV) and sleeping disease virus (SDV)". Poster, Aqua Merck-Animal Health, 2003.06.12.
David Graham, "Salmonid alfavirus-en komparativ studie av ulike subtyper isolert fra atlantisk laks" Norsk fiskeoppdrett, 2011, 4 (56-58).
Graham m.fl. "A comparative study og marine salmonid alphavirus subtypes 1-6 using an experimental cohabitation challenge modell". Journal of fish disease, 2011, 34, (273-286).

Claims (47)

1. Sammensetning omfattende inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på 5xl0<8>- 5xl0<10>TCID50/1T1I bestemt ved titrering på CHH celler og én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: a) en drept/inaktivert bakterie, b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus, c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b).
2. Sammensetning ifølge krav 1, hvor sammensetningen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på minst 7,5xl0<8>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler.
3. Sammensetning ifølge krav 1, hvor sammensetningen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på 7,5xl0<8>- lxlO<10>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler.
4. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det inaktiverte salmonide alfaviruset er av SAVI-, SAV2-, SAV3-, SAV4-, SAV5- eller SAV6-undertypen, eller er en kombinasjon av disse.
5. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det salmonide alfaviruset er valgt fra gruppen bestående av a. virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved ECACC under deponeringsnummer V94090731 og med European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 OJG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201, 07121202 og 07121203 og b. en virusstamme som er en mutant av en enkelt av stammene i a), hvor virus er positive i en SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR-identitetstest ved anvendelse et sett primere slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8 og betingelsene 50 °C, 30 min - 95 °C, 10 min -(95 °C, 30 sek - 57 °C, 60 sek - 72°C,30 sek)<*>40.
6. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori det salmonide alfaviruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 95 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 og/eller SEQ ID NO: 3 og/eller minst 98 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 og/eller SEQ ID NO: 6.
7. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 1,5-2,5 g/kg, formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 16-96 timer ved en temperatur fra 13-17 °C.
8. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den inaktiverte bakterien har blitt inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 3,5-4,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1-2 timer ved en temperatur på 20 °C.
9. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor sammensetningen er en vann-i-olje-emulsjon, en vann-i-olje-i-vann-emulsjon eller en olje-i-vann-emulsjon.
10. Sammensetning ifølge krav 9, hvori sammensetningen er en vann-i-olje-emulsjon.
11. Sammensetning ifølge krav 9 eller 10, hvori sammensetningen omfatter en mineralolje.
12. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav som videre omfatter en detergent og/eller emulgator.
13. Sammensetning ifølge krav 12, hvori emulgatoren er en ester av ikke-PEG-ylert eller PEG-ylert sorbitan med fettsyrer.
14. Sammensetning ifølge krav 12, hvori emulgatoren er polysorbat eller sorbitanoleat.
15. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte/inaktiverte bakterien er valgt fra gruppen bestående av bakterier av artene Piscirickettsias spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Listonella spp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium spp., Yersinia spp., Renibacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Edwarsiella spp., Francisella spp., Pseudomonas spp., Cytophaga spp., Nocardia spp., Haphnia spp. og Mycobacerium spp.
16. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte/inaktiverte bakterien velges fra gruppen bestående av Aeromonas spp., Vibrio spp., Flavobacterium spp., Haphnia spp., Piscirickettsia spp. og Moritella viscosa.
17. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte/inaktiverte bakterien velges fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum, Vibrio ordali, Flavobacterium columnaris, Haphnia sp., Piscirickettsia salmonis og Moritella viscosa.
18. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte eller inaktiverte bakterien er av en eller flere arter, valgt fra gruppen bestående av A. salmonicida, V. salmonicida, V. anguillarum og M. viscosa.
19. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte eller inaktiverte bakterien er Vibrio ordali og/ eller Piscirickettsia salmonis.
20. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte eller inaktiverte bakterien er av én eller flere arter, valgt fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnaris og Haphnia sp.
21. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori viruset som ikke er salmonid alfavirus velges fra gruppen bestående av: infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHNV); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC); Channel Catfish Virus (CCV); Infectious Salmon Anaemia (ISA) virus; nodavirus; iridovirus, koi herpesvirus; Heart and Skeletal Muscle Inflammation Virus (HSMV) og Cardiomyopathy Syndrome Virus.
22. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori viruset som ikke er salmonid alfavirus er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).
23. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, sammensetningen omfatter to eller flere komponenter som definert i et hvilket som helst av kravene 15-22.
24. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den drepte eller inaktiverte bakterien er til stede i mengder tilsvarende 1 x 10<8->8 x IO<9>celler/ml, fortrinnsvis i mengder tilsvarende 0,9 - 5 xlO<9>celler/ml.
25. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori viruset som ikke er salmonid alfavirus er til stede i mengder tilsvarende 1,0-5xl0<9>PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml når det er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).
26. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori sammensetningen omfatter: i) inaktivert salmonid alfavirus undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler, ii) inaktivert Aeromonas salmonicida i en mengde tilsvarende 0,2 -5xl0<9>celler/ml, iii) inaktivert Vibrio salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 - 5xl0<9>celler/ml, iv) inaktivert Vibrio anguillarum i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, v) inaktivert Moritella viscosa i en mengde tilsvarende 0,5 -5xl0<9>celler/ml, vi) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml, vii) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje og viii) en detergent og/eller emulgator.
27. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori sammensetningen omfatter: i) inaktivert Salmonid alfavirus undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler, ii) inaktivert Vibrio ordali i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, iii) inaktivert Piscirickettsia salmonis i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, iv) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml levende virus eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml, v) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje og vi) en detergent og/eller emulgator.
28. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori sammensetningen omfatter: i) inaktivert salmonid alfavirus undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5xl0<8>- 5xl0<9>TCID50/ml bestemt ved titrering på CHH celler, ii) inaktivert Aeromonas hydrophila i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, iii) inaktivert Flavobacterium columnaris i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, iv) inaktivert Haphnia sp. i en mengde tilsvarende 0,9 -5xl0<9>celler/ml, v) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende l,0-5,0xl0<9>PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml, vi) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje og vii) en detergent og/eller emulgator.
29. Doseringsform av en sammensetning omfattende inaktivert salmonid alfavirus (SAV) kombinert med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: a) en drept/inaktivert bakterie, b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus, c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b); hvori doseringsformen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) med en titer på minst 3,75xl0<7>TCID50/dosis, bestemt ved titrering på CHH celler.
30. Doseringsform ifølge krav 29, hvor nevnte doseringsform er flytende doseringsform.
31. Doseringsform ifølge krav 30, hvori sammensætningen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) i en mengde tilsvarende 3,75xl0<7>- 0,5 xlO<9>TCID50/dosis, bestemt ved titrering på CHH celler.
32. Doseringsform ifølge krav 30, hvori sammensætningen omfatter inaktivert salmonid alfavirus (SAV) i en mengde tilsvarende 0,5xl0<8>- 2,5 xlO<8>TCID50/dosis på, bestemt ved titrering på CHH celler.
33. Doseringsform ifølge et hvilket som helst av kravene 29-32 hvori sammensetningen er ifølge et hvilket som helst av kravene 1-28.
34. Doseringsform ifølge et hvilket som helst av kravene 29 - 33 med et volum på 0,05-0,2 ml.
35. Doseringsform ifølge et hvilket som helst av kravene 29-33 med et volum på 45-55 fil.
36. Doseringsform ifølge hvilket som helst av kravene 29-33 med et volum på 90-110 fil.
37. Anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus (SAV) i fremstillingen av en vaksine for forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus, hvori nevnte vaksine er en doseringsform som inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde tilsvarende minst 3,75xl0<7>TCID50/dose bestemt ved titrering på CHH celler, og administreres samtidig eller i kombinasjon med en eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av: a) en drept bakterie, b) et inaktivert virus som ikke er salmonid alfavirus, og c) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b).
38. Anvendelse ifølge krav 37, hvori vaksinen inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde tilsvarende minst 7,5xl0<8>TCID50/ml , bestemt ved titrering på CHH celler.
39. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-38, hvori vaksinen anvendes i et behandlingsregime hvor der samtidigt vaksineres mot pankretisk sykdom og én eller flere andre sykdomme forårsaket av virale eller bakterielle fiskepatogener.
40. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-39, hvori doseringsformen er beregnet for injektion og har et volum på 90-110 ul,
41. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-40, hvori doseringsformen er beregnet for injektion og har et volum på 45-55 ul,
42. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-41, hvori doseringsformen er beregnet for injektion og har et volum på 50 ul.
43. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-42, hvori vaksinen administreres ved intraperitoneal injeksjon.
44. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 37-43, hvori vaksinen administreres til parr laks.
45. Anvendelse ifølge krav 44, hvori vaksinen administreres til parr på 10-60 gram.
46. Fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning som definert i hvilke som helst av kravene 1-28 eller en doseringsform som definert i hvilke som helst av kravene 29-36, hvor fremgangsmåten omfatter å kombinere inaktivert salmonid alfavirus med én eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av: a. en drept bakterie, b. et inaktivt virus som ikke er salmonid alfavirus c. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), eller fra nevnte virus i b); for å tilveiebringe en sammensetning som omfatter minst 7,5 x IO<8>TCID50/ml inaktivert salmonid alfavirus bestemt ved titrering på CHH celler.
47. Fremgangsmåten ifølge krav 46, hvor fremgangsmåten videre omfatter trinnene: i) etablering av en kultur med vertsceller; ii) infisering av vertscellene med et isolat av et virus av salmonid alfavirus og iii) dyrking av de infiserte cellene under betingelser som tillater nevnte virus å nå en titer på minst 7,5 x IO<8>TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet bestemt ved titrering på CHH celler.
NO20090290A 2008-02-08 2009-01-20 Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus NO333242B1 (no)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20090290A NO333242B1 (no) 2008-02-08 2009-01-20 Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus
CA2653300A CA2653300C (en) 2008-02-08 2009-02-06 Polyvalent vaccine against salmonid alphavirus infections
GB0901913.4A GB2457158B (en) 2008-02-08 2009-02-06 Polyvalent vaccine against salmonid alphavirus infections
CL2009000287A CL2009000287A1 (es) 2008-02-08 2009-02-06 Composicion que comprende un alfavirus salmonideo (sav) inactivado y al menos un componente seleccionado de una bacteria muerta/inactivada, otro virus inactivado, un hongo, un parasito y un material antigenico derivado de la bacteria, virus, hongo o parasito anterior; metodo para elaborar la composicion y uso del sav.
GB1219654.9A GB2493662B (en) 2008-02-08 2009-02-06 Salmonid alphavirus vaccine
CA3090088A CA3090088C (en) 2008-02-08 2009-02-06 Polyvalent vaccine against salmonid alphavirus infections
NO2015019C NO2015019I1 (no) 2008-02-08 2015-08-03 Aeromonas salmonicida subspesie salmonicida,inaktivert/ Vibrio salmonicida,inaktivert/ Vibrio anguillarum serotype O1, inaktivert/Vibrio anguillarum serovar O2a, inaktivert/ Moritella viscosa, inaktivert/ Infeksiøs pankreasnekrosevirus (IPVN) serotype Sp/Laksespankreas sykdomsvirus (SPDV) stamme F93-125, inaktivert

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20080711 2008-02-08
NO20080885 2008-02-20
NO20090290A NO333242B1 (no) 2008-02-08 2009-01-20 Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20090290L NO20090290L (no) 2009-08-10
NO333242B1 true NO333242B1 (no) 2013-04-15

Family

ID=40469649

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20090290A NO333242B1 (no) 2008-02-08 2009-01-20 Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus
NO2015019C NO2015019I1 (no) 2008-02-08 2015-08-03 Aeromonas salmonicida subspesie salmonicida,inaktivert/ Vibrio salmonicida,inaktivert/ Vibrio anguillarum serotype O1, inaktivert/Vibrio anguillarum serovar O2a, inaktivert/ Moritella viscosa, inaktivert/ Infeksiøs pankreasnekrosevirus (IPVN) serotype Sp/Laksespankreas sykdomsvirus (SPDV) stamme F93-125, inaktivert

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2015019C NO2015019I1 (no) 2008-02-08 2015-08-03 Aeromonas salmonicida subspesie salmonicida,inaktivert/ Vibrio salmonicida,inaktivert/ Vibrio anguillarum serotype O1, inaktivert/Vibrio anguillarum serovar O2a, inaktivert/ Moritella viscosa, inaktivert/ Infeksiøs pankreasnekrosevirus (IPVN) serotype Sp/Laksespankreas sykdomsvirus (SPDV) stamme F93-125, inaktivert

Country Status (4)

Country Link
CA (2) CA3090088C (no)
CL (1) CL2009000287A1 (no)
GB (2) GB2457158B (no)
NO (2) NO333242B1 (no)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2688587B2 (en) 2011-03-25 2023-08-16 Intervet International B.V. Salmonid alphavirus vaccine
CA2884918C (en) * 2012-09-17 2019-01-08 Novartis Tiergesundheit Ag Salmonid alphavirus and uses thereof
NO344938B1 (en) * 2018-12-13 2020-07-20 Patogen As Pancreas Disease Virus Markers
BE1028701B1 (nl) * 2020-10-13 2022-05-16 Poulpharm Bvba Werkwijze voor autovaccin productie en verkregen autovaccin
CN112877399B (zh) * 2021-01-20 2023-05-16 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法
CA3230802A1 (en) * 2021-08-31 2023-03-09 Zoetis Services Llc Attenuated alphavirus

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0712926B1 (en) * 1994-10-18 2003-10-08 Akzo Nobel N.V. Fish pancreatic disease virus
EP1075523B1 (en) * 1998-05-08 2007-08-08 Intervet International BV Structural proteins of fish pancreatic disease virus and uses thereof
AU2003229199A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-19 Alpharma As Liposome vaccine formulations for fin-fish
DK179025B1 (da) * 2005-09-16 2017-08-28 Intervet Int Bv Fiskevaccine
GB2452892B (en) * 2006-06-29 2011-10-12 Pharmaq As Process for culturing bacteria of the piscirickettsia genus

Also Published As

Publication number Publication date
CA3090088A1 (en) 2009-08-08
GB2457158B (en) 2013-04-03
NO20090290L (no) 2009-08-10
CA2653300A1 (en) 2009-08-08
CA3090088C (en) 2023-01-31
GB201219654D0 (en) 2012-12-12
GB2457158A (en) 2009-08-12
CL2009000287A1 (es) 2010-08-27
GB2493662A (en) 2013-02-13
CA2653300C (en) 2020-11-17
NO2015019I1 (no) 2015-08-10
GB2493662B (en) 2013-04-17
GB0901913D0 (en) 2009-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10537631B2 (en) Tilapia lake virus vaccines
NO333242B1 (no) Sammensetning, medisinsk anvendelse og fremgangsmate som omfatter salmonid alfavirus
Korsnes et al. Horizontal transmission of nervous necrosis virus between turbot Scophthalmus maximus and Atlantic cod Gadus morhua using cohabitation challenge
US20160122728A1 (en) Ipn vaccine
US20210269488A1 (en) Recombinant rotavirus expression system and recombinant rotaviruses
CN110438090B (zh) 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物
Falcone et al. Experimental infection of calves with bovine viral diarrhoea virus type-2 (BVDV-2) isolated from a contaminated vaccine
TW201812005A (zh) 新穎之魚類病原病毒
Falchieri et al. Avian metapneumoviruses expressing Infectious Bronchitis virus genes are stable and induce protection
Naylor et al. Charged amino acids in the AMPV fusion protein have more influence on induced protection than deletion of the SH or G genes
CN106794242B (zh) 针对禽类呼肠孤病毒的广谱疫苗
NO20191081A1 (no) Polyvalent vaksine mot salmonid alfavirusinfeksjoner
Falk Vaccination against infectious Salmon anemia
NO20130080L (no) Polyvalent vaksine mot salmonid alfavirusinfeksjoner
Rimstad Vaccination against infectious pancreatic necrosis
CN104328090B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
US20050169939A1 (en) Chicken anemia virus vaccine from cell line
AU2014201189B2 (en) Method for producing vaccinal viral strain of a virus of the Reoviridae family
Sharma Development and Evaluation of Vaccine Candidates for Senecavirus A
WO2024003035A1 (en) Vaccines for piscirickettsiosis (salmonid rickettsial septicaemia)
Ennaji et al. and Moulay Mustapha Ennaji
Massi et al. Protection of chickens vaccinated with different schemes including the 4/91 IBV vaccine strain against field IBV strain Italy 02: preliminary results
Shaw The role of non-structural proteins in bluetongue virus replication
AU2002332925A1 (en) Chicken anemia virus vaccine from cell line
NO347865B1 (no) Fremgangsmåte for dyrking av bakterie av Piscirickettsia-genuset

Legal Events

Date Code Title Description
FC2A Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application
ERR Erratum

Free format text: I PATENTTIDENDE NR. 32/12 BLE PATENTSOKNAD NR. 20090290 FEILAKTIG KUNNGJORT ENDELIG HENLAGT. SOKNADENS STATUS ER UNDER BEHANDLING.

PDF Filing an opposition

Opponent name: INTERVET INTERNATIONAL BV, WIM DE KOERVERSTRAAT 35

Effective date: 20140114

BDEC Board of appeal decision

Free format text: KLAGEN FORKASTES. PATENT NUMMER 333242 OPPHEVES

Filing date: 20160318

Effective date: 20171031

SPCW Withdrawal, rejection or dismissal of supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: 2015019