CN112877399B - 一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法，属于养殖鱼类致病菌检测技术领域。为解决现有致病菌药敏检测方法耗时长、工作量大、特异性和灵敏度低的问题，本发明提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒，包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、载药试片、结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。利用本发明提供的试剂盒进行致病菌药敏检测，能够快速指导药敏检测过程中试验药物的选择，克服了常规药敏检测盲目用药，试敏工作量大的缺点。本发明试剂盒及检测方法操作简便、耗时短、实验结果直观精确，适合规模化养殖场进行细菌性疫病的快速药敏检测。

Description

一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于养殖鱼类致病菌检测技术领域，尤其涉及一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法。
背景技术
鲑科鱼类，习惯上有的被称作鲑，有的称为鳟，统称为鲑鳟。鲑鳟鱼类是世界性的主要养殖冷水鱼类，一般均采用较密集的集约化养殖方式养殖，因而各种传染性疾病容易流行。
致病菌引起的疾病是养殖鱼类最为常见且危害最大的一类疾病，其流行广、发病率高，常导致养殖和野生鱼类的大量死亡，给水产业造成了严重的经济损失，因此一直是水产养殖行业研究关注的重点。
由于养殖者缺乏科学的防病治病知识，常常盲目选择抗生素，甚至过量使用抗生素，导致水产致病菌的耐药性、水产品药残、环境污染及生态破坏等问题日益加剧。要从源头上解决抗生素滥用问题，关键是在施药前进行致病菌药敏检测，从而在正确诊断的基础上对症下药，合理调整用药量。
致病菌引起的疾病发病急、传染快，而传统细菌检测需要先依据细胞的形态特征、培养特征、染色反应和生理生化特性等细菌学性状进行致病菌分离鉴定，再根据药敏实验结果指导用药，检测过程一般需要2～3天。传统药敏检测方法耗时长、工作量大、特异性和灵敏度低，无法满足快速获得致病菌药敏检测结果的需要。
发明内容
为解决现有致病菌药敏检测方法耗时长、工作量大、特异性和灵敏度低的问题，本发明提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测方法、药敏检测试剂盒及制备方法。
本发明的技术方案：
一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒，包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、载药试片、结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
进一步的，所述致病菌特异性抗体为嗜水气单胞菌多克隆抗体、杀鲑气单胞菌多克隆抗体、杀鲑弧菌多克隆抗体、鲁氏耶尔森菌多克隆抗体、荧光单胞菌多克隆抗体、嗜冷黄杆菌多克隆抗体、鲑肾杆菌多克隆抗体、哈维弧菌多克隆抗体、金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体、副溶血性弧菌多克隆抗体或沙门氏菌多克隆抗体；所述致病菌药敏检测试剂盒中含有结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子或结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子中的一种或几种。
进一步的，所述载药试片所载药物为复方磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明、盐酸多西环素、氨基糖苷、红霉素、青霉素钠、硫酸链霉素、甲砜霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸环丙沙星、盐酸小襞碱、恶喹酸、氟甲喹、维生素C磷酸酯镁或利福平；所述致病菌药敏检测试剂盒中含有复方磺胺二甲嘧啶载药试片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片、复方新诺明载药试片、盐酸多西环素载药试片、氨基糖苷载药试片、红霉素载药试片、青霉素钠载药试片、硫酸链霉素载药试片、甲砜霉素载药试片、恩诺沙星载药试片、诺氟沙星载药试片、乳酸诺氟沙星载药试片、盐酸环丙沙星载药试片、盐酸小襞碱载药试片、恶喹酸载药试片、氟甲喹载药试片、维生素C磷酸酯镁载药试片或利福平载药试片中的一种或几种。
进一步的，所述载药试片所含药物含量分别为：复方磺胺二甲嘧啶20μg/片、磺胺间甲氧嘧啶20μg/片、复方新诺明30μg/片、盐酸多西环素30μg/片、氨基糖苷50μg/片、红霉素30μg/片、青霉素钠30μg/片、硫酸链霉素30μg/片、甲砜霉素10μg/片、恩诺沙星10μg/片、诺氟沙星10μg/片、乳酸诺氟沙星10μg/片、盐酸环丙沙星10μg/片、盐酸小襞碱20μg/片、恶喹酸20μg/片、氟甲喹20μg/片、维生素C磷酸酯镁50μg/片、利福平30μg/片。
进一步的，每种药物均配制四种不同药物含量的载药试片，所述药物含量为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片。
一种本发明所述鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、配制液体增菌培养基分装于离心管中，高温灭菌后真空包装备用；配制固体培养基，高压灭菌后分装于平皿中，室温凝固后真空包装备用；
步骤二、试敏药物配制成相应浓度的药物溶液，过滤除菌后滴加到装有空白药敏纸片的抗生素瓶中，空白药敏试片经药物溶液浸泡、冻干后真空包装备用；
步骤三、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g干燥的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液清洗，加入50mL体积分数为5％的戊二醛溶液中，室温振荡交联2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲溶液清洗所得沉淀，收集沉淀并取20mg分散于60mL PBS缓冲溶液中，加入40mg EDC·HCl和25mg NHS，室温反应30min，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，去离子水清洗磁分离所得沉淀并将其分散于50mL PBS缓冲溶液中，加入200μL致病菌特异性抗体，室温振荡结合2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲液和去离子水洗涤所得沉淀，得到结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子。
进一步的，所述氨基化磁性纳米粒子的制备方法为：FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶解于2M HCl溶液中，按FeCl3与FeSO4摩尔比2:1将氯化铁溶液和硫酸铁溶液混合搅拌，碱性条件下产生Fe3O4磁性纳米粒子沉淀，以磁性分离器进行磁分离并收集、清洗沉淀，取0.1g干燥的Fe3O4磁性纳米粒子分散于50mL无水乙醇中，超声振荡30min，碱性条件下加入0.1mL四乙氧基硅烷搅拌12h，以磁性分离器进行磁分离并收集、清洗沉淀，得到氨基化Fe3O4磁性纳米粒子。
进一步的，所述致病菌特异性抗体的制备方法为：将含有致病菌多克隆抗体的血清与50mmol/L醋酸缓冲液按体积比1：2混合，将所得混合液pH值调至酸性，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心收集上清，加入0.1倍体积PBS缓冲液混匀后将pH值调至中性，加入饱和NH4(SO4)2溶液至其终浓度为45％，4℃反应30min后，离心弃上清，PBS重悬沉淀，所得悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000rpm离心30min，取含有致病菌特异性抗体的上清液于-20℃保存备用。
一种本发明所述鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒进行药敏检测的方法，包括如下步骤：
步骤1、取样增菌：
选取病症典型的濒死鱼体，无菌器械剪取2～3块米粒大小典型病灶直接放入装有增菌液体培养基的离心管中，室温培养至离心管中的液体培养基浑浊；
步骤2、致病菌菌种初步鉴定：
取步骤1增菌离心管，离心收集菌体沉淀并用PBS缓冲溶液清洗菌体，将菌体重新分散于4mL PBS缓冲溶液中，取2mL菌悬液测定其在600nm处吸光度，向剩余2mL菌悬液中加入3mg结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子，振荡吸附5min后磁分离，测定所得磁分离上清液在600nm处吸光度，比较磁分离上清液与菌悬液吸光度，根据吸光度数值是否发生明显变化判断增菌所得致病菌是否与结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子发生了特异性结合，由此初步鉴定致病菌菌种；
步骤3、药敏试验：
取步骤1增菌获得的致病菌菌悬液200μL均匀涂布在固体培养基上，参考步骤2菌种鉴定初步结果，选取该致病菌常用药物的载药试片，将载药试片贴在已接种致病菌的固体培养基表面，轻压使药敏试片与培养基紧密接触，正置培养基15～30min后将培养基倒置放置于37℃培养箱中培养12～24h，观察测量抑菌圈直径，并根据抑菌圈直径大小判断致病菌对载药试片所含药物及其浓度的敏感程度。
进一步的，所述敏感程度的判断标准为：抑菌圈直径＞15mm，判断为高度敏感；抑菌圈直径为10～15mm，判断为中度敏感；抑菌圈直径＜10mm，判断为低度敏感；无抑菌圈则判断为耐药。
本发明的有益效果：
本发明提供的鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒中结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子成本低廉、制作简便、特异性高、稳定性好，具有大比表面积和易于磁性分离的特点，能够快速、准确捕捉菌悬液中的特异性致病菌。本发明试剂盒中配套了能与多种鲑鳟鱼养殖领域常见的致病细菌特异性结合的Fe3O4磁性纳米粒子，只需替换致病菌特异性抗体就可以实现对任意致病菌的特异性菌种鉴定。
本发明在试剂盒中配套了多种水产养殖领域常用和最新的兽用药物，依据规模化养殖场的用药特征，在常用药物浓度的基础上设置了不同药物含量的载药试片，能够进一步指导用药量，从而实现精准用药，降低治疗成本，克服盲目用药造成的致病菌耐药性、水产品药残、环境污染及生态破坏等问题。
利用本发明提供的试剂盒进行致病菌药敏检测，能够快速获得致病菌菌种的初步鉴定，与传统菌种鉴定方法相比省时省力；根据致病菌菌种初步鉴定结果，能够快速指导药敏检测过程中试验药物的选择，克服了常规药敏检测盲目用药，试敏工作量大的缺点。本发明提供的药敏检测试剂盒操作简便、耗时短、实验结果直观精确，适合规模化养殖场进行细菌性疫病的快速药敏检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、复方磺胺二甲嘧啶载药试片20μg/片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片20μg/片、复方新诺明载药试片30μg/片、盐酸多西环素载药试片30μg/片、氨基糖苷载药试片50μg/片、红霉素载药试片30μg/片、青霉素钠载药试片30μg/片、硫酸链霉素载药试片30μg/片、甲砜霉素载药试片10μg/片、恩诺沙星载药试片10μg/片、诺氟沙星载药试片10μg/片、乳酸诺氟沙星载药试片10μg/片、盐酸环丙沙星载药试片10μg/片、盐酸小襞碱载药试片20μg/片、恶喹酸载药试片20μg/片、氟甲喹载药试片20μg/片、维生素C磷酸酯镁载药试片50μg/片、利福平载药试片30μg/片、结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成药物溶液，其中18种药物溶液的浓度依次为：复方磺胺二甲嘧啶2mg/mL、磺胺间甲氧嘧啶2mg/mL、复方新诺明3mg/mL、盐酸多西环素3mg/mL、氨基糖苷5mg/mL、红霉素3mg/mL、青霉素钠3mg/mL、硫酸链霉素3mg/mL、甲砜霉素1mg/mL、恩诺沙星1mg/mL、诺氟沙星1mg/mL、乳酸诺氟沙星1mg/mL、盐酸环丙沙星1mg/mL、盐酸小襞碱2mg/mL、恶喹酸2mg/mL、氟甲喹2mg/mL、维生素C磷酸酯镁5mg/mL、利福平3mg/mL。配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应的药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种载药试片，真空包装备用。
步骤三、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
(Ⅰ)、制备Fe3O4磁性纳米粒子：
将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶解于2M HCl溶液中，得到FeCl3浓度为1M的氯化铁溶液和FeSO4浓度为1M的硫酸铁溶液，在氮气保护下按FeCl3与FeSO4摩尔比2:1将氯化铁溶液和硫酸铁溶液混合搅拌，滴加氨水使所得混合溶液pH值升至11，室温搅拌30min产生Fe3O4磁性纳米粒子沉淀，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅱ)、制备氨基化Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅰ真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于50mL无水乙醇中得到Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，超声振荡30min，调节溶液的pH值为9，加入0.1mL四乙氧基硅烷，氮气保护下室温搅拌12h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得氨基化Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅲ)、制备致病菌抗体：
将含有嗜水气单胞菌多克隆抗体、杀鲑气单胞菌多克隆抗体、杀鲑弧菌多克隆抗体、鲁氏耶尔森菌多克隆抗体、荧光单胞菌多克隆抗体、嗜冷黄杆菌多克隆抗体、鲑肾杆菌多克隆抗体或哈维弧菌多克隆抗体的血清分别与50mmol/L醋酸缓冲液按体积比1：2混合，将所得混合液pH值调至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心收集上清，加入0.1倍体积PBS缓冲液混匀后将pH值调至7.2，加入饱和NH4(SO4)2溶液至其终浓度为45％，4℃反应30min后，离心弃上清，PBS重悬沉淀，所得悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000rpm离心30min，分别得到含有嗜水气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑弧菌多克隆抗体的上清液、含有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的上清液、含有荧光单胞菌多克隆抗体的上清液、含有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的上清液、含有鲑肾杆菌多克隆抗体的上清液或含有哈维弧菌多克隆抗体的上清液，于-20℃保存备用。
(Ⅳ)、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅱ真空干燥后的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液清洗3次，加入50mL体积分数为5％的戊二醛溶液中，室温振荡交联2h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，用PBS缓冲溶液清洗所得沉淀3次，收集沉淀20mg分散于60mLPBS缓冲溶液中，加入40mgEDC·HCl和25mg NHS，室温反应30min，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，去离子水清洗磁分离所得沉淀并将其分散于50mLPBS缓冲溶液中，加入200μL含有嗜水气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑弧菌多克隆抗体的上清液、含有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的上清液、含有荧光单胞菌多克隆抗体的上清液、含有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的上清液、含有鲑肾杆菌多克隆抗体的上清液或含有哈维弧菌多克隆抗体的上清液，室温振荡固定2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲液和去离子水洗涤所得沉淀，得到结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子或结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子。
实施例2
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、复方磺胺二甲嘧啶载药试片20μg/片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片20μg/片、复方新诺明载药试片30μg/片、盐酸多西环素载药试片30μg/片、氨基糖苷载药试片50μg/片、红霉素载药试片30μg/片、青霉素钠载药试片30μg/片、硫酸链霉素载药试片30μg/片、甲砜霉素载药试片10μg/片、恩诺沙星载药试片10μg/片、诺氟沙星载药试片10μg/片、乳酸诺氟沙星载药试片10μg/片、盐酸环丙沙星载药试片10μg/片、盐酸小襞碱载药试片20μg/片、恶喹酸载药试片20μg/片、氟甲喹载药试片20μg/片、维生素C磷酸酯镁载药试片50μg/片、利福平载药试片30μg/片、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成药物溶液，其中18种药物溶液的浓度依次为：复方磺胺二甲嘧啶2mg/mL、磺胺间甲氧嘧啶2mg/mL、复方新诺明3mg/mL、盐酸多西环素3mg/mL、氨基糖苷5mg/mL、红霉素3mg/mL、青霉素钠3mg/mL、硫酸链霉素3mg/mL、甲砜霉素1mg/mL、恩诺沙星1mg/mL、诺氟沙星1mg/mL、乳酸诺氟沙星1mg/mL、盐酸环丙沙星1mg/mL、盐酸小襞碱2mg/mL、恶喹酸2mg/mL、氟甲喹2mg/mL、维生素C磷酸酯镁5mg/mL、利福平3mg/mL。配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应的药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种载药试片，真空包装备用。
步骤三、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
(Ⅰ)、制备Fe3O4磁性纳米粒子：
将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶解于2M HCl溶液中，得到FeCl3浓度为1M的氯化铁溶液和FeSO4浓度为1M的硫酸铁溶液，在氮气保护下按FeCl3与FeSO4摩尔比2:1将氯化铁溶液和硫酸铁溶液混合搅拌，滴加氨水使所得混合溶液pH值升至11，室温搅拌30min产生Fe3O4磁性纳米粒子沉淀，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅱ)、制备氨基化Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅰ真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于50mL无水乙醇中得到Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，超声振荡30min，调节溶液的pH值为9，加入0.1mL四乙氧基硅烷，氮气保护下室温搅拌12h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得氨基化Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅲ)、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅱ真空干燥后的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液清洗3次，加入50mL体积分数为5％的戊二醛溶液中，室温振荡交联2h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，用PBS缓冲溶液清洗所得沉淀3次，收集沉淀20mg分散于60mLPBS缓冲溶液中，加入40mgEDC·HCl和25mg NHS，室温反应30min，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，去离子水清洗磁分离所得沉淀并将其分散于50mLPBS缓冲溶液中，加入200μL含有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的悬浮液、含有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的悬浮液、含有副溶血性弧菌多克隆抗体的悬浮液或含有沙门氏菌多克隆抗体的悬浮液，室温振荡固定2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲液和去离子水洗涤所得沉淀，得到结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子或结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子。
本实施例中金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体、副溶血性弧菌多克隆抗体和沙门氏菌多克隆抗体均购自上海慧耘生物科技有限公司。
实施例3
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、复方磺胺二甲嘧啶载药试片20μg/片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片20μg/片、复方新诺明载药试片30μg/片、盐酸多西环素载药试片30μg/片、氨基糖苷载药试片50μg/片、红霉素载药试片30μg/片、青霉素钠载药试片30μg/片、硫酸链霉素载药试片30μg/片、甲砜霉素载药试片10μg/片、恩诺沙星载药试片10μg/片、诺氟沙星载药试片10μg/片、乳酸诺氟沙星载药试片10μg/片、盐酸环丙沙星载药试片10μg/片、盐酸小襞碱载药试片20μg/片、恶喹酸载药试片20μg/片、氟甲喹载药试片20μg/片、维生素C磷酸酯镁载药试片50μg/片、利福平载药试片30μg/片、含有结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成药物溶液，其中18种药物溶液的浓度依次为：复方磺胺二甲嘧啶2mg/mL、磺胺间甲氧嘧啶2mg/mL、复方新诺明3mg/mL、盐酸多西环素3mg/mL、氨基糖苷5mg/mL、红霉素3mg/mL、青霉素钠3mg/mL、硫酸链霉素3mg/mL、甲砜霉素1mg/mL、恩诺沙星1mg/mL、诺氟沙星1mg/mL、乳酸诺氟沙星1mg/mL、盐酸环丙沙星1mg/mL、盐酸小襞碱2mg/mL、恶喹酸2mg/mL、氟甲喹2mg/mL、维生素C磷酸酯镁5mg/mL、利福平3mg/mL。配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应的药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种载药试片，真空包装备用。
步骤三、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
(Ⅰ)、制备Fe3O4磁性纳米粒子：
将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶解于2M HCl溶液中，得到FeCl3浓度为1M的氯化铁溶液和FeSO4浓度为1M的硫酸铁溶液，在氮气保护下按FeCl3与FeSO4摩尔比2:1将氯化铁溶液和硫酸铁溶液混合搅拌，滴加氨水使所得混合溶液pH值升至11，室温搅拌30min产生Fe3O4磁性纳米粒子沉淀，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅱ)、制备氨基化Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅰ真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于50mL无水乙醇中得到Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，超声振荡30min，调节溶液的pH值为9，加入0.1mL四乙氧基硅烷，氮气保护下室温搅拌12h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，以去离子水和无水乙醇交替清洗3次磁分离所得氨基化Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于60℃真空干燥过夜；
(Ⅲ)、制备致病菌抗体：
将含有嗜水气单胞菌多克隆抗体、杀鲑气单胞菌多克隆抗体、杀鲑弧菌多克隆抗体、鲁氏耶尔森菌多克隆抗体、荧光单胞菌多克隆抗体、嗜冷黄杆菌多克隆抗体、鲑肾杆菌多克隆抗体或哈维弧菌多克隆抗体的血清分别与50mmol/L醋酸缓冲液按体积比1：2混合，将所得混合液pH值调至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心收集上清，加入0.1倍体积PBS缓冲液混匀后将pH值调至7.2，加入饱和NH4(SO4)2溶液至其终浓度为45％，4℃反应30min后，离心弃上清，PBS重悬沉淀，所得悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000rpm离心30min，分别得到含有嗜水气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑弧菌多克隆抗体的上清液、含有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的上清液、含有荧光单胞菌多克隆抗体的上清液、含有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的上清液、含有鲑肾杆菌多克隆抗体的上清液或含有哈维弧菌多克隆抗体的上清液，于-20℃保存备用。
本实施例中金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体、副溶血性弧菌多克隆抗体和沙门氏菌多克隆抗体均购自上海慧耘生物科技有限公司。
(Ⅳ)、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g步骤Ⅱ真空干燥后的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液清洗3次，加入50mL体积分数为5％的戊二醛溶液中，室温振荡交联2h，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，用PBS缓冲溶液清洗所得沉淀3次，收集沉淀20mg分散于60mLPBS缓冲溶液中，加入40mgEDC·HCl和25mg NHS，室温反应30min，以磁性分离器进行磁分离收集沉淀，去离子水清洗磁分离所得沉淀并将其分散于50mLPBS缓冲溶液中，加入200μL含有嗜水气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的上清液、含有杀鲑弧菌多克隆抗体的上清液、含有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的上清液、含有荧光单胞菌多克隆抗体的上清液、含有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的上清液、含有鲑肾杆菌多克隆抗体的上清液、含有哈维弧菌多克隆抗体的上清液、含有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的悬浮液、含有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的悬浮液、含有副溶血性弧菌多克隆抗体的悬浮液或含有沙门氏菌多克隆抗体的悬浮液，室温振荡固定2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲液和去离子水洗涤所得沉淀，得到含有结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子。
实施例4
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例与实施例1的区别仅在于：
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管，含有固体培养基的平皿，药物含量均为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片的复方磺胺二甲嘧啶载药试片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片、复方新诺明载药试片、盐酸多西环素载药试片、氨基糖苷载药试片、红霉素载药试片、青霉素钠载药试片、硫酸链霉素载药试片、甲砜霉素载药试片、恩诺沙星载药试片、诺氟沙星载药试片、乳酸诺氟沙星载药试片、盐酸环丙沙星载药试片、盐酸小襞碱载药试片、恶喹酸载药试片、氟甲喹载药试片、维生素C磷酸酯镁载药试片、利福平载药试片，结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的药物溶液，配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种抗生素的药敏试片，每种抗生素药敏试片的药物含量分别包括10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片。
本实施例步骤三制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子的步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例与实施例2的区别仅在于：
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管，含有固体培养基的平皿，药物含量均为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片的复方磺胺二甲嘧啶载药试片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片、复方新诺明载药试片、盐酸多西环素载药试片、氨基糖苷载药试片、红霉素载药试片、青霉素钠载药试片、硫酸链霉素载药试片、甲砜霉素载药试片、恩诺沙星载药试片、诺氟沙星载药试片、乳酸诺氟沙星载药试片、盐酸环丙沙星载药试片、盐酸小襞碱载药试片、恶喹酸载药试片、氟甲喹载药试片、维生素C磷酸酯镁载药试片、利福平载药试片，结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的药物溶液，配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种抗生素的药敏试片，每种抗生素药敏试片的药物含量分别包括10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片。
本实施例步骤三制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子的方法与实施例2相同。
实施例6
本实施例提供了一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒及其制备方法。
本实施例与实施例3的区别仅在于：
本实施例药敏检测试剂盒中包括含有液体增菌培养基的离心管，含有固体培养基的平皿，药物含量均为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片的复方磺胺二甲嘧啶载药试片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片、复方新诺明载药试片、盐酸多西环素载药试片、氨基糖苷载药试片、红霉素载药试片、青霉素钠载药试片、硫酸链霉素载药试片、甲砜霉素载药试片、恩诺沙星载药试片、诺氟沙星载药试片、乳酸诺氟沙星载药试片、盐酸环丙沙星载药试片、盐酸小襞碱载药试片、恶喹酸载药试片、氟甲喹载药试片、维生素C磷酸酯镁载药试片、利福平载药试片，结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械。
本实施例鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：
步骤一、制备增菌液体培养基和固体培养基：
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物和10份氯化钠溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，分装至20mL圆底塑料离心管中，高温高压灭菌20min，盖紧离心管管盖，冷却至室温并真空包装备用；
按重量份将10份蛋白胨、8份酵母提取物、10份氯化钠和15份琼脂溶于1000份蒸馏水中，调整液体培养基pH值为7.2，121℃高压灭菌后分装到培养皿中，冷却至室温凝固并装入真空包装备用；
步骤二、制备载药试片：
将18种试敏药物分别配制成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的药物溶液，配制药物溶液时，水溶性药物以蒸馏水为溶剂、不溶于水的药物以乙醇为溶剂。药物溶液使用前用0.2μm细菌滤器过滤除菌。
将500μL相应药物溶液均匀滴加到装有50片空白药敏纸片的抗生素瓶中，充分浸泡25～35min，然后将装有药敏纸片的抗生素瓶冻干处理，分别得到18种抗生素的药敏试片，每种抗生素药敏试片的药物含量分别包括10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片。
本实施例步骤三制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子的方法与实施例3相同。
实施例7
本实施例提供了一种利用实施例6提供的检测试剂盒进行鲑鳟鱼致病菌药敏检测的方法，包括如下步骤：
步骤1、取样增菌：
选取病症典型的濒死鱼体，清水洗净解剖部位，无菌器械剪取2～3块米粒大小典型病灶直接放入装有增菌液体培养基的离心管中，共取样分别放入7支离心管中，盖紧管盖，用力振荡离心管数次后置于室温下培养，每隔1h振荡离心管数次，直至离心管中的液体培养基浑浊；
步骤2、致病菌菌种初步鉴定：
取步骤1所得7支增菌离心管，分别离心收集菌体沉淀并用PBS缓冲溶液清洗菌体，将菌体重新分散于4mL PBS缓冲溶液中，每支增菌离心管取2mL菌悬液测定其在600nm处吸光度，向每支增菌离心管剩余2mL菌悬液中分别加入3mg结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子，振荡吸附5min后磁分离，分别测定所得磁分离上清液在600nm处吸光度。
经检测，只有加入结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子的磁分离上清液与同支离心管中未吸附菌悬液的吸光度相比下降了80％，说明增菌离心管中的致病菌与结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子发生了特异性结合，由此可初步鉴定致病菌为嗜水气单胞菌。
步骤3、药敏试验：
取步骤1增菌获得的嗜水气单胞菌菌悬液200μL均匀涂布在固体培养基上，参考步骤2菌种鉴定初步结果，选取嗜水气单胞菌常用抗生素的载药试片，即药物含量分别为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片的诺氟沙星载药试片、硫酸链霉素载药试片、盐酸环丙沙星载药试片，将不同药物浓度的试片贴在已接种嗜水气单胞菌的固体培养基表面，轻压使药敏试片与培养基紧密接触，各药敏试片之间的中心间距不小于24mm，药敏试片距培养基平皿边缘不小于15mm。
本实施例还做了4种浓度的盐酸小襞碱载药试片和恶喹酸载药试片的对比试敏试验。
药敏试片与培养基粘贴完成后正置培养基防治15～30min，然后将培养基倒置放置于37℃培养箱中培养24h，观察测量抑菌圈直径，并根据抑菌圈直径大小判断致病菌对药敏试片所含不同浓度的药物的敏感程度。
敏感性判断标准为：
抑菌圈直径＞15mm，判断为高度敏感；抑菌圈直径为10～15mm，判断为中度敏感；
抑菌圈直径＜10mm，判断为低度敏感；无抑菌圈则判断为耐药。
本实施例药敏检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002907378000000161
表1药敏结果显示，该致病菌对诺氟沙星、硫酸链霉素和盐酸环丙沙星较为敏感，而对盐酸小襞碱和恶喹酸敏感度较低。综合致病菌对不同浓度载药试片呈现的不同敏感程度、药物成本及治疗效果，能够精确指导药物及浓度的选择，从而实现精准用药，降低治疗成本，克服盲目用药造成的致病菌耐药性、水产品药残、环境污染及生态破坏等问题。
通过本实施例可以看出，本发明检测方法能够快速获得致病菌菌种的初步鉴定，与传统菌种鉴定方法相比省时省力；根据致病菌菌种初步鉴定结果，能够快速指导药敏检测过程中试验药物的选择，克服了常规药敏检测盲目用药，试敏工作量大的缺点。本发明提供的药敏检测试剂盒操作简便、耗时短、实验结果直观精确，适合规模化养殖场进行细菌性疫病的快速药敏检测。

Claims (6)

1.一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒，其特征在于，包括含有液体增菌培养基的离心管、含有固体培养基的平皿、载药试片、结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子和无菌试验器械，
所述致病菌特异性抗体为嗜水气单胞菌多克隆抗体、杀鲑气单胞菌多克隆抗体、杀鲑弧菌多克隆抗体、鲁氏耶尔森菌多克隆抗体、荧光单胞菌多克隆抗体、嗜冷黄杆菌多克隆抗体、鲑肾杆菌多克隆抗体、哈维弧菌多克隆抗体、金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体、副溶血性弧菌多克隆抗体或沙门氏菌多克隆抗体；所述致病菌药敏检测试剂盒中含有结合有嗜水气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑气单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有杀鲑弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲁氏耶尔森菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有荧光单胞菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有嗜冷黄杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有鲑肾杆菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有哈维弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有单核细胞增生李斯特菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子、结合有副溶血性弧菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子或结合有沙门氏菌多克隆抗体的Fe3O4磁性纳米粒子中的一种或几种，
所述载药试片所载药物为复方磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明、盐酸多西环素、氨基糖苷、红霉素、青霉素钠、硫酸链霉素、甲砜霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸环丙沙星、盐酸小襞碱、恶喹酸、氟甲喹、维生素C磷酸酯镁或利福平；所述致病菌药敏检测试剂盒中含有复方磺胺二甲嘧啶载药试片、磺胺间甲氧嘧啶载药试片、复方新诺明载药试片、盐酸多西环素载药试片、氨基糖苷载药试片、红霉素载药试片、青霉素钠载药试片、硫酸链霉素载药试片、甲砜霉素载药试片、恩诺沙星载药试片、诺氟沙星载药试片、乳酸诺氟沙星载药试片、盐酸环丙沙星载药试片、盐酸小襞碱载药试片、恶喹酸载药试片、氟甲喹载药试片、维生素C磷酸酯镁载药试片或利福平载药试片中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒，其特征在于，所述载药试片所含药物含量分别为：复方磺胺二甲嘧啶20μg/片、磺胺间甲氧嘧啶20μg/片、复方新诺明30μg/片、盐酸多西环素30μg/片、氨基糖苷50μg/片、红霉素30μg/片、青霉素钠30μg/片、硫酸链霉素30μg/片、甲砜霉素10μg/片、恩诺沙星10μg/片、诺氟沙星10μg/片、乳酸诺氟沙星10μg/片、盐酸环丙沙星10μg/片、盐酸小襞碱20μg/片、恶喹酸20μg/片、氟甲喹20μg/片、维生素C磷酸酯镁50μg/片、利福平30μg/片。
3.根据权利要求1所述一种鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒，其特征在于，每种药物均配制四种不同药物含量的载药试片，所述药物含量为10μg/片、20μg/片、30μg/片和50μg/片。
4.一种如权利要求1-3任一所述鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、配制液体增菌培养基分装于离心管中，高温灭菌后真空包装备用；配制固体培养基，高压灭菌后分装于平皿中，室温凝固后真空包装备用；
步骤二、试敏药物配制成相应浓度的药物溶液，过滤除菌后滴加到装有空白药敏试片的瓶中，空白药敏试片经药物溶液浸泡、冻干后真空包装备用；
步骤三、制备结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子：
取0.1g干燥的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液清洗，加入50mL体积分数为5%的戊二醛溶液中，室温振荡交联2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲溶液清洗所得沉淀，收集沉淀并取20mg分散于60mL PBS缓冲溶液中，加入40mg EDC·HCl和25mgNHS，室温反应30min，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，去离子水清洗磁分离所得沉淀并将其分散于50mL PBS缓冲溶液中，加入200μL致病菌特异性抗体，室温振荡结合2h，以磁性分离器进行磁分离并收集沉淀，用PBS缓冲液和去离子水洗涤所得沉淀，得到结合有致病菌特异性抗体的Fe3O4磁性纳米粒子。
5.根据权利要求4所述鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述氨基化磁性纳米粒子的制备方法为：FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O分别溶解于2M HCl溶液中，按FeCl3与FeSO4摩尔比2:1将氯化铁溶液和硫酸亚铁溶液混合搅拌，碱性条件下产生Fe3O4磁性纳米粒子沉淀，以磁性分离器进行磁分离并收集、清洗沉淀，取0.1g干燥的Fe3O4磁性纳米粒子分散于50mL无水乙醇中，超声振荡30min，碱性条件下加入0.1mL四乙氧基硅烷搅拌12h，以磁性分离器进行磁分离并收集、清洗沉淀，得到氨基化Fe3O4磁性纳米粒子。
6.根据权利要求4或5所述鲑鳟鱼致病菌药敏检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述致病菌特异性抗体的制备方法为：将含有致病菌多克隆抗体的血清与50mmol/L醋酸缓冲液按体积比1：2混合，将所得混合液pH值调至酸性，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心收集上清，加入0.1倍体积PBS缓冲液混匀后将pH值调至中性，加入饱和NH4(SO4)2溶液至其终浓度为45%，4℃反应30min后，离心弃上清，PBS重悬沉淀，所得悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000rpm离心30min，取含有致病菌特异性抗体的上清液于-20℃保存备用。
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