CN115466693A - 一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌cy2菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株及其应用。本发明所述斯塔贝基斯鲁梅利杆菌(Rummeliibacillusstabekisii)CY2菌株于2022年7月8日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62612。所述CY2菌株具有较好的DPPH自由基清除能力，可提高秀丽隐杆线虫的抗氧化能力，延缓机体衰老，延长寿命，可用于制备延长动物寿命的产品。此外，本发明还发现将CY2菌株添加至胡须鸡基础日粮中可以显著提高胡须鸡的生长性能，提高其平均日采食量、平均日增重，降低平均耗料增重比，具有促进雏鸡开口，加速胡须鸡雏鸡快速生长的功能，可缩短出栏期。

Description

一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和微生物技术领域。更具体地，涉及一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌(Rummeliibacillusstabekisii)CY2菌株及其应用。
背景技术
益生菌是指当摄入足够数量时，对宿主健康产生益处的活性微生物，其益生作用包括调节宿主肠道菌群结构、增强免疫力、延长寿命等。虽然当下益生菌的研究取得了可喜进展，但益生菌在实际应用和工业化生产方面仍存在一定的技术壁垒。一些外界条件，如地域、饮食差异等，会使一种益生菌在不同人群肠道中发挥的作用大相径庭。因此，不断发掘新的优良益生菌菌株对益生菌产业的发展具有重要意义。
除对宿主健康产生益处外，益生菌还可用于促进动物生长，用于制备相应的饲料添加剂等。胡须鸡因具有种群大、脂丰肉满、肉质上佳等优点成为我国比较突出的地方优质鸡品种，但胡须鸡还有生长缓慢，出栏时间长，饲养经济成本高等问题存在。若能提供一种能提高胡须鸡生长性能的产品或方法，对胡须鸡的养殖具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株。
本发明的第二个目的是提供所述CY2菌株在提高动物生长性能或制备用于提高动物生长性能的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述CY2菌株在制备动物开口饲料或开口饲料添加剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种提高动物生长性能的产品。
本发明的第五个目的是提供所述CY2菌株在延长动物寿命或制备用于延长动物寿命的产品中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌(Rummeliibacillusstabekisii)CY2菌株，所述菌株于2022年7月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62612。本发明所述CY2菌株具有较好的DPPH自由基清除能力，可延长秀丽隐杆线虫的寿命。此外，本发明还发现，将CY2菌株添加至胡须鸡基础日粮中可以显著提高胡须鸡的生长性能，提高其平均日采食量、平均日增重，降低平均耗料增重比。因此，本发明还申请保护以下应用。
本发明申请保护所述CY2菌株在提高动物生长性能或制备用于提高动物生长性能的产品中的应用。
具体地，所述应用为CY2菌株在提高动物日采食量或制备用于提高动物日采食量的产品中的应用。
具体地，所述应用为CY2菌株在提高动物日增重量或制备用于提高动物日增重量的产品中的应用。
具体地，所述应用为CY2菌株在降低动物耗料增重比或制备用于降低动物耗料增重比的产品中的应用。
本发明还申请保护所述CY2菌株在制备动物开口饲料或开口饲料添加剂中的应用。
具体地，所述动物为胡须鸡。
本发明还提供了一种提高动物生长性能的产品，所述产品中含有所述斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株。
具体地，所述斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株的添加量为100～10000mg/Kg。
具体地，所述CY2菌株的活菌数为1×107～1×1010CFU/g。
本发明还申请保护所述CY2菌株在延长动物寿命或制备用于延长动物寿命的产品中的应用。
具体地，所述动物为秀丽隐杆线虫。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的斯塔贝基斯鲁梅利杆菌(Rummeliibacillusstabekisii)CY2菌株具有较好的DPPH自由基清除能力，可提高秀丽隐杆线虫的抗氧化能力，延缓机体衰老，延长寿命，可用于制备延长动物寿命的产品。此外，本发明还发现将CY2菌株添加至胡须鸡基础日粮中可以显著提高胡须鸡的生长性能，提高其平均日采食量、平均日增重，降低平均耗料增重比，具有促进雏鸡开口，加速胡须鸡雏鸡快速生长的功能，可缩短出栏期。
附图说明
图1为候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的产蛋白酶活性测定结果。
图2为候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的自聚集和共聚集实验结果。
图3为候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的表明疏水性实验结果。
图4为候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的菌株上清液和菌体的DPPH自由基清除能力实验结果；图中**代表差异显著，p<0.01，***代表差异极显著，p<0.005。
图5为CY2菌株在光学显微镜下的革兰氏染色结果。
图6为CY2菌株的耐酸能力测定结果；图中不相同字母代表具有显著性差异(p<0.05)。
图7为CY2菌株的耐胆盐能力测定结果；图中不相同字母代表具有显著性差异(p<0.05)。
图8为候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的溶血活性检测结果；其中，图A中1～4依次对应菌株CY1～CY4，图B中的5和6分别对应菌株CY5和CY6，图B中的7和8为阳性对照，图C中的9对应菌株CY+。
图9为CY2菌株的降解LPS能力测定测定结果；图中**代表差异显著，p<0.01。
图10为CY2菌株对线虫寿命的影响结果。
图11为CY2菌株对线虫体内MDA、SOD和GSH活性的影响；图中不相同字母代表具有显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1CY2菌株的分离及益生性能测定
1、CY2菌株的分离
本发明所述CY2菌株分离自醋醅，所述醋醅样品购自上海佳民酿造食品有限公司酿造一厂(前身为上海酿造一厂)。
具体分离方法为：称取1mg醋醅溶解于9mL无菌生理盐水中，涡旋仪振荡混匀，混匀后取1mL依次稀释10-2～10-7倍，各取100μL涂布于0.2％乙醇发酵固体培养基中，平行3次，30℃恒温培养箱培养24～48h；从平板上挑取生长良好的单菌落，单独在新的0.2％乙醇发酵固体培养基上平板划线，30℃恒温培养箱培养48h，得到醋醅源初筛菌株；以同样的方法进行二次筛选，共得到7株候选菌株，依次命名为CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+。
2、产蛋白酶检测
将20g脱脂乳粉加入到100mL水中混匀，115℃高压蒸汽灭菌15min；另称取1.5g琼脂加入到100mL水中混匀，121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌后将二者混合，配置成10％脱脂牛奶琼脂培养基；分别吸取1μL筛选得到的候选菌株点接于培养基中，每株菌设3个平行，置于30℃恒温培养箱培养24h后测量蛋白溶解圈直径，比较菌株产蛋白酶活性。
候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的产蛋白酶活性测定结果如图1所示，由图1可知，CY2、CY4、CY5和CY6菌株在7株候选菌中具有较好的产蛋白酶能力。
3、聚集试验
自聚集实验：4℃，5000r/min条件下离心15min并用无菌0.2M PBS缓冲液清洗2次，重悬，将OD600调节至0.7左右，于30℃静置24h，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h吸取100μL上层菌液，在酶标仪中测量各菌株600nm下的吸光值，将吸光值带入以下公式计算得出自聚集百分率。
Figure BDA0003802762010000041
At为0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h上层菌液吸光值；A0为0h的菌液吸光值。
共聚集实验：以大肠杆菌(E.coil)对菌株的共聚集能力进行评价；分别将OD600＝0.7的待测菌株(CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+)的菌液和大肠杆菌悬液等体积混合，涡旋振荡10s，在37℃下孵育0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h，轻取100μL上层悬液，在酶标仪中测量600nm处的吸光值(A混)，将吸光值带入以下公式计算得出共聚集百分率。
Figure BDA0003802762010000051
式中：A2、A3分别为受试菌与致病菌菌悬液单独处理的吸光值，A混为菌悬液混合后检测的。
候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的自聚集和共聚集实验结果如图2所示，由图2可知，受试的7株候选菌株中，CY2菌株的自聚集能力最强，且其与大肠杆菌之间的共聚集的能力也最强。
4、疏水性试验
本发明利用微生物黏附碳氢化合物法(BATH)测定菌株的表面疏水性。将筛选到的7株候选菌株(CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+)分别培养24h后，3000r/min离心15min，收集菌体沉淀，用无菌0.2M PBS缓冲液洗涤两次后重悬，将菌悬液的OD600调节至0.7，取3mL菌液(以0.2M PBS缓冲液为对照组)分别与1mL氯仿、1mL二甲苯和1mL乙酸乙酯混合振荡并室温静置24h，待分层后分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h吸取100μL水相，在酶标仪中测量各菌株600nm的吸光值，计算菌株细胞表面疏水活性。
候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的细胞疏水性实验结果如图3所示，由图3可知，CY2菌株在7株候选菌株中具有最高的细胞表面疏水活性。
5、DPPH清除能力测定
取1mL上清或OD600＝1.0的菌悬液，置于10mL离心管中，加入3mL现配的0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合摇匀后，在室温下置于暗处静置30min，4000r/min离心10min，取上清，于517nm处测定吸光值；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，对照组以等体积去离子水代替菌液。候选菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的菌株上清液和菌体的DPPH自由基清除能力实验结果如图4所示，由图4可知，CY2菌株的菌液和菌体均具有较好的DPPH清除能力。
实施例2CY2菌株的菌种鉴定
综合实施例1的各项益生性能测定结果，本发明选择对CY2菌株进行进一步鉴定和保藏。
CY2菌株在光学显微镜下的革兰氏染色结果如图5所示，由图5可知，本发明所述CY2菌株为革兰氏阳性菌。
分子生物学鉴定：
提取CY2菌株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为上下游引物扩增细菌的16S rDNA，反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送擎科生物科技有限公司进行测序鉴定，将测序结果用软件拼接后，在NCBI数据库中进行blast比对。菌种鉴定结果表明，本发明所述CY2菌株为斯塔贝基斯鲁梅利杆菌(Rummeliibacillusstabekisii)，所述CY2菌株于2022年7月8日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62612，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
实施例3CY2肠道耐受性测定
1、耐酸能力测定
取40％接种量的活化好的CY2菌液于4000r/min条件下离心10min后弃上清，接入pH＝3.0的TSB液体培养基中，30℃静置培养，以普通TSB培养基为对照，接种后分别在0h、4h、8h用十倍梯度稀释法用无菌生理盐水稀释至合适梯度，在TSA平板点10μL，于30℃培养0h、4h、8h后进行活菌计数计算存活率。CY2菌株的耐酸能力测定结果如图6所示，由图6可知，CY2菌株的耐酸性较好，其8h的存活率在77％以上，且随时间延长有生长繁殖趋势。
2、耐胆盐能力测定
将活化好的CY2菌液以2％接种量接入0.3％(w/v)的猪胆盐TSB液体培养基中，30℃静置培养，以普通TSB培养基为对照，接种后分别在4h、8h用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，取稀释后的菌液在TSA平板涂布，于30℃条件下培养0h、4h、8h后进行活菌计数将活菌数计算耐胆盐存活率。CY2菌株的耐胆盐能力测定结果如图7所示，由图7可知，CY2菌株具有良好的胆盐耐受性，其4h内存活率在94％以上，8h内存活率在62％以上。
实施例4CY2安全性测定
1、溶血活性检测
分别将菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+活化后，用接种环挑取单菌落分别接种于哥伦比亚血琼脂平板上，在封口膜密封条件下30℃培养48h，观察菌落在血平板上有无透明圈，另设阳性对照。
菌株CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6和CY+的溶血活性检测结果如图8所示，图8A中1～4依次对应菌株CY1～CY4，图8B中的5和6分别对应菌株CY5和CY6，图8B中的7和8为阳性对照，图8C中的9对应菌株CY+，由图8可知，除菌株CY+具有溶血活性外，其余菌株均无溶血活性，安全性良好。
2、抗生素敏感性检测
采用标准纸片法分析抗生素敏感性，制作抗生素谱检查菌株对常规抗生素(10种，抗生素种类如表1所示)的敏感性或耐药情况。具体方法为：将CY2菌株接种于TSB液体培养基中，30℃，180rpm/min条件下摇瓶培养至OD600＝0.5，吸取100μL涂布于TSA固体培养基表面，用无菌镊子夹取抗生素圆片置于培养基表面，每种抗生素做3个平行，30℃条件下培养12h，测量抑菌圈直径(mm)。根据CLSI(2015)(Clinical and Laboratory StandardsInstitute(CLSI)(2015)Performance standards for antimicrobial susceptibilitytesting:twenty-second informational supplement.In:CLSI documentM100S22.Clinical Laboratory Standard Institute,Wayne)标准，将抗生素敏感程度分为敏感(S)、中度敏感(I)、耐药(R)和不敏感(NS)。
抗生素敏感性检测结果如表1所示，由表1所示结果可知，CY2菌株对氨苄西林耐药，对林可霉素不敏感，对其余8种抗生素敏感，即对80％抗生素具有敏感性，表明其安全性较好。
表1 CY2对10种不同抗生素产生抑菌圈直径(mm)/敏感程度
Figure BDA0003802762010000071
Figure BDA0003802762010000081
注：S：菌株对抗生素敏感，R：菌株对抗生素具有抗性，NS：菌株对抗生素不敏感；药敏纸片直径为6.00mm。
实施例5CY2降解LPS能力测定
将CY2菌株活化后(30℃条件下培养至浑浊)，取5mL培养液于4000r/min条件下离心10min；分别取1mL上清液和空白培养基加入80EU的LPS中，在30℃条件下分别反应0h、4h，分别取0h反应后溶液的原液、4h反应后溶液以及分别稀释10倍、100倍、1000倍后的稀释液各0.1mL，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测。CY2菌株的降解LPS能力测定测定结果如图9所示，由图9可知，CY2菌株具有显著降解LPS的能力，在4h内能够降解LPS标准品中的46.95％。
实例6CY2对秀丽隐杆线虫的影响
1、寿命试验
将OD600值为0.5的OP50、CY2和50％OP50+50％CY2混合液等量加在NGM琼脂平板上(E.coil OP50为对照组)。将同期化处理生长至L4时期的秀丽隐杆线虫(C.elegans)挑选置于上述用不同菌液处理的NGM固体平板上，每个培养皿中有25条线虫，每个处理组有4板，总共100条线虫，在20℃恒温培养箱中培养；每天同一时间记录线虫死亡数目，统计存活率，并进行换板培养直到线虫全部死亡。
CY2菌株对线虫寿命的影响结果如图10所示，由图10可知，CY2菌株单独饲喂组相比于E.coil OP50饲喂组，平均寿命延长了15.91％，最大寿命延长了1d；CY2菌株与E.coilOP50同时饲喂组，相比于E.coil OP50组，平均寿命延长了17.10％，最大寿命延长了2d；相比于CY2菌株单独饲喂组，与E.coil OP50同时饲喂组平均寿命延长了1.03％，最大寿命延长了1d，表明CY2菌株具有延长线虫寿命的能力。
2、抗氧化能力测定
将OD600值为0.5的OP50、CY2和50％OP50+50％CY2混合液等量加在NGM琼脂平板上(E.coil OP50为对照组)。将同期化处理生长至L4时期的秀丽隐杆线虫(C.elegans)挑选置于上述用不同菌液处理的NGM固体平板上，每个培养皿中有25条线虫，每个处理组有4板，总共100条线虫，在20℃恒温培养箱中培养；培养结束后，用线虫M9缓冲液将NGM平板上的线虫冲洗到离心管中，每管1000条，每组3管，1000r/min离心10min，弃上清液，加入500μL生理盐水，利用液氮反复冻融至虫体破碎；接着，12000r/min离心10min，收集上清液；按照碧云天MDA丙二醛试剂盒、SOD超氧化物歧化酶试剂盒、GSH总谷胱甘肽试剂盒的说明书操作，分别测定线虫中相关抗氧化酶的活性，即丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性。
CY2菌株对线虫体内MDA、SOD和GSH活性的影响结果如图11所示，由图11可知，单独用CY2菌株饲喂相比于E.coil OP50饲喂组，线虫体内MDA含量降低了33.65％，SOD含量增加了15.87％，GSH含量增加了49.72％；CY2菌株与E.coil OP50同时饲喂，相比于E.coil OP50单独饲喂组，MDA含量降低了58.48％，SOD含量增加了34.83％，GSH含量增加了55.30％；相比于CY2菌株单独饲喂组，CY2菌株与E.coil OP50同时饲喂组线虫体内MDA含量降低了37.31％，SOD含量增加了16.37％，GSH含量增加了3.72％，表明CY2菌株可以提高线虫的抗氧化能力。
实例7CY2对胡须鸡雏鸡生长性能影响
将CY2菌株添加入基础日粮中，混合均匀，自由采食。饲喂胡须鸡雏鸡试验阶段为7～21日龄以及21～42日龄，CY2菌株的日添加量分别为0mg/Kg(0)、100mg/Kg(CY2L)和100000mg/Kg(CY2H)。将若干只(30只)仔鸡随机分为(3)组，每组(10)个重复，总实验时间为42天。
在试验开始时，统计每栏鸡平均体重(g/只)，经统计软件SPSS17.0统计分析以确保各试验组间的初体重差异不显著(P>0.05)(如组间初体重差异显著则应调整各栏鸡只，直至组间体重无显著差异)。在试验过程中，每日记录各栏投料量和余料量，记录各栏鸡存活数，并计算出每日每栏鸡的平均耗料量(g/只)；在每阶段的试验结束前12h就撤料以使鸡只饥饿排空，之后称各栏鸡重，计算出各栏鸡平均体重(g/只)。最后计算出每个生长阶段各栏鸡的平均日增重(g/只/日)(ADG)、平均日采食量(g/只/日)(ADFI)、耗料增重比(F/G)和死亡率。
CY2对胡须鸡雏鸡(7～21日龄)生长性能的影响结果如表2所示，由表2所示结果可知，CY2L组相比于0组，平均日采食量增加了31.57％，平均日增重增加了15.65％；CY2H组相比于0组，平均日采食量增加了33.22％，平均日增重增加了21.18％，CY2H组相比于CY2L组，平均日采食量增加了1.25％，平均日增重增加了4.78％。
表2 CY2对胡须鸡雏鸡(7～21日龄)生长性能的影响
Figure BDA0003802762010000101
注：表中3组饲粮含CY2活菌数分别为0CFU/g、1×107CFU/g(100mg/Kg)和1×1010CFU/g(10000mg/Kg)；不相同字母代表组间具有显著性差异(p<0.05)。
CY2对胡须鸡雏鸡(21～42日龄)生长性能的影响结果如表3所示，由表3所示结果可知，CY2L组相比于0组，平均日采食量增加了27.48％，平均日增重增加了11.54％；CY2H组相比于0组，平均日采食量增加了30.04％，平均日增重增加了17.81％；CY2H组相比于CY2L组，平均日采食量增加了2.01％，平均日增重增加了5.41％。
表3 CY2对胡须鸡雏鸡(21～42日龄)生长性能的影响
Figure BDA0003802762010000102
Figure BDA0003802762010000111
注：表中3组饲粮含CY2活菌数分别为0CFU/g、1×107CFU/g(100mg/Kg)和1×1010CFU/g(10000mg/Kg)；不相同字母代表组间具有显著性差异(p<0.05)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株，其特征在于，所述菌株于2022年7月8日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62612。
2.权利要求1所述CY2菌株在提高动物生长性能或制备用于提高动物生长性能的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为权利要求1所述CY2菌株在提高动物日采食量或制备用于提高动物日采食量的产品中的应用。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为权利要求1所述CY2菌株在提高动物日增重量或制备用于提高动物日增重量的产品中的应用。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为权利要求1所述CY2菌株在降低动物耗料增重比或制备用于降低动物耗料增重比的产品中的应用。
6.权利要求1所述CY2菌株在制备动物开口饲料或开口饲料添加剂中的应用。
7.一种提高动物生长性能的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株。
8.根据权利要求7所述产品，其特征在于，所述斯塔贝基斯鲁梅利杆菌CY2菌株的添加量为100～10000mg/Kg。
9.根据权利要求8所述产品，其特征在于，所述CY2菌株的活菌数为1×107～1×1010CFU/g。
10.权利要求1所述CY2菌株在延长动物寿命或制备用于延长动物寿命的产品中的应用。
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