TWI686473B - 一種促進魚類生長與免疫調節之魯梅利桿菌及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種魯梅利桿菌株BST-01(Rummeliibacillus stabekisii)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國107年12月7日，寄存編號為BCRC 910864。藉由本發明之魯梅利桿菌株BST-01，可發揮提升吳郭魚之生長表現、增重率、飼料效益、飼料轉換率、免疫力、抗病性以及存活率等功效。

Description

一種促進魚類生長與免疫調節之魯梅利桿菌及其應用

本發明係關於一種魯梅利桿菌及其應用，特別係一種可有效降低生產成本、促進吳郭魚成長、提高增重率、增強抗病性，使未來之吳郭魚可朝向營養、經濟、環保之方向發展之魯梅利桿菌及其應用。

台灣養殖腹地小，多以高密度養殖方式以提高產量，然而，此方式易因廢棄物堆積與養殖環境惡化而導致疾病的發生。Streptococcus iniae已被證實會對水產養殖魚類造成疾病，如全眼球炎、腦膜炎等，吳郭魚為其主要感染對象之一。

水產養殖業者經常會事先使用抗菌藥物以預防疾病的發生，但過度使用時往往會形成嚴重的負面效應，細菌可能因此產生抗藥性，導致抗菌藥物對病原菌失去抑制的功效，或殘留在水產動物體內無法排除，對生態環境造成重大影響，從而引發水產養殖品的質量安全問題。當人們進食的同時亦有可能把抗菌藥物攝入並累積在體內，如此便會對人類造成危害之風險。因此必須找出能夠取代抗菌藥物使用之方法，已成為當下最重要的議題，而使用益生菌係一項值得關注的方法。

益生菌的種類多不勝數，當中又以乳酸桿菌、芽孢桿菌以及 酵母菌的應用面最為廣泛。益生菌可在動物消化道內增殖，促進維生素和營養的吸收，可抑制有害細菌在腸胃道的附著與繁殖，維護腸道微生物菌群平衡。但水產方面之益生菌的使用必須考慮幾項與陸生動物不同的重要因素，陸生動物的腸胃道為密閉式的環境，不會因為外在環境改變而使腸胃道內的益生菌產生大規模的變化；而水生動物的腸胃道與益生菌卻明顯會因為外在環境而產生變化。因此，若為水生動物使用之益生菌，則必須能夠於養殖水環境下存活，且能聚落(colonization)於腸道表皮增殖，若能由水生動物腸道中篩選出，則可確保能夠於養殖水環境下存活與聚落(colonization)於腸道表皮增殖之能力。

【先前技術文獻】 【非專利文獻】

【先前技術文獻1】Bromage and Owens, 2002

【先前技術文獻2】Cheng et al., 2014

本發明鑑於上述問題，目的在於提供一種魯梅利桿菌及其應用，其具有提升吳郭魚之生長表現、增重率、飼料效益、飼料轉換率、免疫力、抗病性以及存活率等功效。

此外，本發明之魯梅利桿菌作為飼料補充物時，可有效地 使吳郭魚抵抗病原菌的入侵及感染。

本發明經發明人深入研究，發現由吳郭魚腸道中分離出之魯梅利桿菌株(Rummeliibacillus stabekisii)(以下亦簡稱為BST-01)，其具有分泌蛋白酶及木聚糖酶能力，係具潛力做為水產養殖應用之益生菌。

將本發明之魯梅利桿菌株BST-01添加至飼料中餵食吳郭魚，不僅可促進吳郭魚成長，同時可提升吳郭魚之免疫力，強化對鏈球菌S.iniae感染之抵抗能力。

因此，本發明提供以下技術手段。

〔1〕本發明係提供一種魯梅利桿菌株BST-01(Rummeliibacillus stabekisii)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國107年12月7日，寄存編號為BCRC 910864。

〔2〕如前項1之魯梅利桿菌株BST-01，其中，前述菌株係分離自吳郭魚腸道所得。

〔3〕如前項1之魯梅利桿菌株BST-01，其中，前述菌株係具有分泌蛋白酶及木聚糖酶之能力。

〔4〕如前項1之魯梅利桿菌株BST-01，其中，前述菌株係可黏附於吳郭魚之腸道並增生。

〔5〕如前項1之魯梅利桿菌株BST-01，其中，將前述菌株添加至飼料後餵食吳郭魚，可促進吳郭魚腸道中有益菌芽孢桿菌屬增加。

〔6〕如前項5之魯梅利桿菌株BST-01，其中，前述添加有 魯梅利桿菌株BST-01之飼料中，係含有1 x 10⁶CFU之魯梅利桿菌株BST-01。

〔7〕如前項1之魯梅利桿菌株BST-01，其中，前述菌株可促進吳郭魚成長，並提升吳郭魚之免疫力，強化吳郭魚對鏈球菌S.iniaee感染之抵抗能力。

〔8〕一種吳郭魚飼料，其特徵係含有申請專利第1~7項中任一項之魯梅利桿菌株BST-01。

〔9〕如申請專利範圍第8項之吳郭魚飼料，其中，魯梅利桿菌株BST-01係之含量為1 x 10⁶CFU/g。

〔10〕一種生物製劑，其特徵係含有前項1~7中任一項之魯梅利桿菌株BST-01。

本發明之魯梅利桿菌株BST-01，添加至飼料中後餵食吳郭魚，不僅可促進吳郭魚成長，同時可提升吳郭魚之免疫力，強化對鏈球菌S.iniaee感染之抵抗能力。

此外，本發明之生物製劑，由於含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01，故可發揮提升吳郭魚之生長表現、增重率、飼料效益、飼料轉換率、免疫力、抗病性以及存活率等功效。

【圖1】將本發明之魯梅利桿菌株BST-01、正控制組及負控制組進行培養，24小時及48小時後之菌株特性分析之圖。其中，(A)為蛋白水解酶測試；(B)為木聚醣酶測試。左上菌落為正控制組(positive control；PC)：(Bacillus amyloliquefaciens R8)；右上菌落為負控制組(Negative control；NC)(Escherichia coli)；下方菌落為本發明之魯梅利桿菌株BST-01。

【圖2】將含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料餵食吳郭魚兩個月後，吳郭魚之免疫活性分析結果圖。其中，(A)為吞噬活性分析；(B)為呼吸爆活性分析；(C)為超氧歧化酶活性分析；(D)為溶菌酶活性分析。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(P<0.05)。

【圖3】將含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料餵食吳郭魚兩個月後，吳郭魚頭腎組織中之免疫基因表現量結果圖。其中，各發炎基因分別係(A)IL-1β；(B)TNF-α；(C)TGF-β；(D)HSP-70。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(P<0.05)。

【圖4】攝食兩個月之含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料之吳郭魚，其腸道菌株偵測結果圖。M：Maker；Lane 1~4：控制組之腸道DNA；Lane 5~8：餵食兩個月後之1 x 10⁶CFU/g實驗組之腸道DNA；Lane 9~12：餵食了兩個月後之1 x 10⁷CFU/g實驗組之腸道DNA。

【圖5】主成分分析(PCA)對細菌對實驗組內與組間相對差異性之三維分佈之圖。紅色：控制組；藍色：餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料兩個月後之1 x 10⁶CFU/g實驗組；黃色：餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料兩個月後之1 x 10⁷CFU/g實驗組。

【圖6】將含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料餵食吳郭魚兩個月 後，吳郭魚腸道內菌相變化之柱狀圖。不同顏色區塊分別表示不同菌屬。

【圖7】將含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料餵食吳郭魚兩個月後，吳郭魚感染Streptococcus iniae 89353一週後之存活率之圖。圖中各線狀圖之右方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(P<0.05)。

以下揭示本發明實施方式，其並非限制本發明必須以下述方式實施，而係為了闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。

〔本發明之魯梅利桿菌株BST-01〕

(菌株之來源)

本發明之魯梅利桿菌株菌株Rummeliibacillus stabekisii係分離自吳郭魚之腸道內。

〔菌株之鑑定〕

首先，實驗人員取出吳郭魚體內之一段腸道，將其剪碎放置於15mL離心管中，加入5mL的無菌水並震盪5秒，進行序列稀釋後，從各管中取100μL的腸道液塗盤至各個Lactobacilli MRS(de Man,Rogosa and Sharpe,1960,BD^TM,Difco^TM)培養基上，並利用三角形玻璃棒將腸道液均勻地塗開，於28℃培養箱培養48小時，觀察培養基上顯現之單一菌落後，利用接種環將菌落轉移至3mL之MRS培養液中，於28℃培養箱培養24小時後，利用接種環使用四區劃線法確認是否為單一菌株(以下稱為分離株BST-01)，待後續進行菌種鑑定。

(分離株BST-01之16S rDNA序列鑑定)

生物間核醣體rDNA屬於高度保留序列，在演化過程中16S rDNA之序列不容易產生變化，而不同物種間亦僅有些許的差異，本鑑定利用此特性分析16S rDNA序列之差異，從而了解分離株BST-01與菌種之間之親緣關係。

(分離株BST-01之genomic DNA之萃取)

本實驗委託明欣生物科技有限公司(Taipei,Taiwan)進行genomic DNA的萃取，步驟參考自DNeasy Plant Kit(Qiagen)，先加入400μL AP1 Buffer，將菌液加入震盪均勻，加入4μL RNase A後，於65℃水浴槽中反應15分鐘，約8分鐘時再震盪一次，可使細胞裂解，接著加入130μL P3 Buffer，輕輕混合均勻，並放置於冰上5分鐘，沉澱雜蛋白和多醣類，以14000rpm在室溫下離心5分鐘，此步驟中，可能會產生非常粘稠的裂解物和大量的沉澱物，此會影響下一步驟DNA之剪切，此情況下，若以14000rpm離心5分鐘去除大部分之沉澱物，則可獲得最佳結果。

取出上清液，加入裝有2mL collection tube的紫色spin column中，以14000rpm在室溫下離心1分鐘，取出下層液體置於新的1.7mL微量離心管中，加入相較先前回收之下層液體1.5倍體積的AW1 Buffer並立即混合均勻，並加入裝有2mL collection tube的白色spin column中，以8000rpm在室溫下離心1分鐘，去除下層液體，再以8000rpm在室溫下離心1分鐘後，加入500μL AW2 Buffer，以14000rpm在室溫下離心1分鐘，此步驟需重複進行2次，去除下層液體，再以14000rpm在室溫下離心1分鐘，確保酒精能完全去除。完成後將白色spin column放入新的1.7mL微量離心管中，加入50μL的40℃溫水至白色spin column中央的濾膜中回溶，待靜置10分鐘充分 吸收後，以14000rpm在室溫下離心1分鐘後，將分離株BST-01之genomic DNA給沖堤下來。

(16S rDNA聚合酶連鎖反應擴增(PCR))

本實驗使用之引子序列亦為明欣生物科技有限公司代為合成，引子名稱分別為16sF1與16sR1。首先將分離株BST-01之genomic DNA進行適當稀釋，將適當稀釋後之genomic DNA添加至預先備妥之0.2mL PCR離心管中，與其他PCR反應試劑混合均勻，總體積為30μL，接著進行聚合酶連鎖反應擴增16S rDNA之基因片段，反應條件設定如下：先以94℃加熱反應5分鐘，利用高溫將雙股螺旋DNA解離成單股DNA，再以單股DNA作為複製之模板，接著以94℃變性30秒；55℃黏合30秒；72℃延長2分20秒為1個循環，總共進行40個循環，最後再以72℃反應5分鐘進行最終延長反應，使所有DNA完成複製的動作，當PCR完成後即可取適量之PCR產物利用DNA膠體電泳分析確認基因片段，而PCR產物可保存於-20℃冰箱備用。

(16S rDNA定序與序列分析)

確認PCR產物為分離株BST-01之genomic DNA後，進行DNA定序分析(明欣生物科技有限公司)，所選用之引子分別為16sF1與16sF-1F，使用之試劑為ABI Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kits，而使用之定序儀機器為ABI 3730XL DNA Analyzer，待定序結果報告出來後整理定序資料，再送至National Center for Biotechnology Information(NCBI)資料庫中使用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)系統進行序列的比對，搜索與分離株最為接近之菌種。

經上述鑑定後，確認分離株BST-01為魯梅利桿菌株，從而 得到本發明之魯梅利桿菌株BST-01。

〔菌株之活化與保種〕

菌種鑑定確定後進行保存菌種之動作，先利用接種環將單一菌落轉移至3mL之TSB培養液，在28℃下培養至菌種混濁後，吸取0.5mL之菌液至50mL之TSB培養液，在28℃下活化至菌種混濁後，吸取0.5mL之菌液分裝至1.7mL微量離心管中，並添加0.5mL之50%甘油作為抗凍劑，混合均勻後，分別保存於-80℃與-20℃冷凍櫃中完成菌種保存與備用。

〔菌株之生長曲線〕

將保存之菌種由-20℃冷凍櫃中拿出，吸取0.5mL之菌液至50mL之TSB培養液中，在28℃下培養12小時後，吸取1mL之菌液至100mL之TSB培養液中，在28℃下活化。每隔1小時吸取1mL之菌液以測定吸光值OD_600nm，吸光值OD_600nm若大於0.8則需進行稀釋，實驗持續進行28小時以得出菌株之生長曲線。

〔菌株之標準曲線〕

將保存之菌種由-20℃冷凍櫃中拿出，吸取0.5mL之菌液至50mL之TSB培養液中，在28℃下培養12小時後，吸取1mL之菌液至100mL之TSB培養液中，在28℃下活化12小時。將菌種取出後，將菌液對半稀釋以測定吸光值OD_600nm，將每一組測完OD_600nm後之稀釋菌液保留，再進行序列稀釋，分別取不同稀釋濃度50μL，並以三重複的方式塗佈於TSB平板培養基上，培養16-24小時。觀察並計算其菌數，再回乘20倍以推算得知該菌種之濃度(CFU/mL)。最後製作標準曲線，橫軸為吸光值OD_600nm；縱軸為菌種濃度(CFU/mL)。

〔菌株特性分析測試〕

(蛋白酶試驗(Protease))

有不少研究已證實大多數的微生物都會生產分解蛋白質的蛋白質分解酵素，簡稱蛋白酶，可於水解蛋白質的過程中，生成多肽，但水解的最終產物皆為氨基酸，以方便腸道內進行消化吸收。本實驗以NA作為基礎培養基，加入0.5%脫脂奶粉作為基質，經高溫滅菌後製作成平板培養基，首先利用TSB培養液於28℃下活化單一菌落24小時，再以牙籤沾取活化後之菌液，將菌液點至含0.5%脫脂奶粉的NA平板培養基上，靜置於28℃無光照定溫培養箱中培養24小時後，觀察培養基上之菌株外圍是否具有明顯的透明環，有出現透明環者即表示具有分泌蛋白酶的能力，最後測量透明環的直徑，並與正負對照組進行比較。

(木聚醣酶試驗(Xylanase))

木聚醣為多聚五碳糖，屬半纖維素類物質，係飼料原料中非澱粉多醣的最主要成分，木聚醣酶可將木聚醣降解為低聚木糖和少量木糖，亦可解決木聚醣在動物消化道內不能被消化吸收，並阻礙了其他營養成分的消化作用的問題。如此一來，木聚醣酶便能促進動物對飼料的消化吸收與生長，從而提高飼料轉換率，並減少糞便中多餘的殘留物，降低環境污染。本實驗以NA作為基礎培養基，加入0.5%木聚醣(xylan from beechwood)作為基質，經高溫滅菌後製作成平板培養基，首先利用TSB培養液於28℃下活化單一菌落24小時，再以牙籤沾取活化後之菌液，將菌液點至含0.5%木聚醣的NA平板培養基上，靜置於28℃無光照定溫培養箱中培養24小時後，取20mL的0.4%剛果紅溶液作為染劑，浸潤測試平板染色30 分鐘後再倒掉，過後以1M的NaCl潤洗測試平板，靜置15分鐘後再倒掉，再靜置30分鐘左右後再進行觀察，由於剛果紅亦能與木聚醣結合形成紅色複合物，當木聚醣被分解後，其代謝產物不會與剛果紅結合，而NaCl則可使結合不牢的剛果紅洗去，但木聚醣為半纖維素類物質，因此如果培養基上之菌株外圍具有稍明顯的透明環，即可表示它具有分泌木聚醣的能力，最後測量透明環的直徑，並與正負對照組進行比較。

〔本發明之魯梅利桿菌株BST-01作為飼料補充物對吳郭魚益生效果之評估〕

(餵食之自製飼料)

飼料共有3組，各別為：控制組、添加含量1 x 10⁶CFU/g之本發明之魯梅利桿菌株BST-01之實驗組(亦稱為1 x 10⁶CFU/g飼料實驗組)及添加含量1 x 10⁷CFU/g之本發明之魯梅利桿菌株BST-01之實驗組(亦稱為1 x 10⁷CFU/g飼料實驗組)。每公斤之飼料製作方式如下：首先秤取100克的白魚粉、470克的豆粕、180克的麵筋、54克的玉米澱粉、10克的羧甲基纖維素、100克的α澱粉，將以上原料加入攪拌器混合，同時緩緩加入由10克的維生素、19克的礦物質與57克的植物食用油混合而成的糊狀物質，攪拌中需不時加入RO水使其黏稠但切忌過濕，控制組織飼料製作於此時即可利用絞肉器將其塑造成顆粒狀；而1 x 10⁶CFU/g飼料實驗組及1 x 10⁷CFU/g飼料實驗組則需在此時於飼料中添加菌株，添加之菌株分別為每克飼料中含有1 x 10⁶與1 x 10⁷的活菌數(CFU)作為飼料補充物，待攪拌均勻後再利用絞肉器將其塑造成顆粒狀(參照表1)。

(實驗動物飼養)

吳郭魚(Nile tilapia)魚苗購買自屏東地區養殖漁場，為尼羅吳郭魚，飼養於26℃-28℃的2噸流通式養殖魚池中適應兩週，由於為戶外飼養，故光照週期為12小時光照，12小時黑暗，每日固定於早上11點與下午5點各餵食飼料一次，為期2個月。飼料皆依照魚隻口徑大小自製成適口性粉末狀或顆粒狀高蛋白魚隻飼料並混合菌株進行餵食，而餵食劑量則依照魚池內魚體總重之5%進行餵食。

(實驗動物分組)

使用已適應兩週後之野生型吳郭魚(Nile tilapia)魚苗，共分為三組，每一組含有60隻。分組方式如下：

1)吳郭魚控制組：自製飼料

2)吳郭魚實驗組I：本發明之菌株BST-01(1 x 10⁶CFU/g)+自製飼料

3)吳郭魚實驗組II：本發明之菌株BST-01(1 x 10⁷CFU/g)+自製飼料

(吳郭魚體重之變化)

吳郭魚魚苗開始餵食自製飼料補充物期間，每14天記錄其體重，並調整餵食劑量，實驗結束後比較各組間於第0天與第56天之成長差異，最後利用one-way ANOVA與Tukey's test進行統計分析。

〔吳郭魚之免疫活性分析〕

(樣品製備)

首先將餵食兩個月後的吳郭魚之頭腎取出，以pH 7.6的1 x PBS沖洗後置於2mL微量離心管中再加入1mL pH 7.6的1 x PBS混合，再以均質機均質並過濾後放置於冰上備用。

(分離巨噬細胞)

此實驗經由不同濃度的Percoll經過離心將巨噬細胞分離。而本實驗選用之濃度為32%/51%(V/V)，一開始先將32%以及51%的Percoll分別配置，之後先加入2mL 32%的Percoll至15mL離心管中，再利用注射針頭將2mL的51%Percoll伸入至15mL離心管的底部緩慢注入，由於藉此可使32%之Percoll完整地壓在51%的Percoll上方，從而發生層次現象。之後再從上方緩慢滴入200-500μL的頭腎樣品，最後再以1mL微量吸管吸取1mL pH 7.6的1 x PBS緩慢滴入，壓於頭腎樣品之上方，從而保持不同濃度的Percoll、頭腎樣品以及1 x PBS的層次分明，之後將離心管放置於離心機中，以400 x g在4℃的環境下離心30分鐘。離心結束後若發現有混濁狀物質夾在兩種濃度的Percoll之間即表示巨噬細胞已被成功分離出來，將中間這層巨噬細胞以微量吸管吸出置於1.7mL微量離心管中，並放置於冰上以保持低溫狀態，最後分別由各樣品中取10μL於血球計數板上進行計數，並將不同實驗樣本的巨噬細胞稀釋成相同的次方數，以利於後續實驗。

〔免疫分析之超氧化物歧化酶(SOD)〕

(SOD活性測定)

首先吸取200μL巨噬細胞樣品放置於1.7mL微量離心管中，加入500μL的HBSS混合均勻，放置於離心機中以400 x g在4℃的環境下離心20分鐘，之後去除上清液並重複加入500μL的HBSS清洗血球以及離心，此步驟需重複進行3次，用以清洗巨噬細胞。清洗完後加入150μL pH 7.8 的1 x PBS讓巨噬細胞懸浮，以超音波細胞粉碎機將血球震破，再置於離心機中以1500 x g在4℃的環境下離心10分鐘，將上清液去除，吸取100μL至1.7mL微量離心管中，再依序加入250μL 0.15M Phosphate Buffer(pH 7.8)、75μL 0.13M Methionine、75μL 1mM Na₂EDTA、75μL 0.63mM NBT、以及150μL 7.5μM Riboflavin。之後放置於25℃培養箱中用4000 Lux以上的光照反應10分鐘，反應結束後吸取200μL至96孔盤以分光光度計測定吸光值OD_560nm。在此條件下，超氧化物歧化酶活性的單位被定義為：以抑制硝基四氮唑藍(Nitrotetrazolium Blue Chloride,NBT)光化還原50%時所需酶量為1個SOD活性單位(U)。樣品蛋白質濃度定量後，依下方公式計算出每毫克的樣品蛋白中含有的SOD活性。

SOD活性公式：(Blank-Sample)/(Blank/2)x 6/mg protein

(樣品蛋白質濃度定量)

本實驗之蛋白質定量方法參照Bradford(Bradford,1976)方式進行，利用1mg/mL的牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)，將其濃度稀釋成0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL，各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL原液稀釋5倍後的Bio-Rad Protein Assay Kit(Bio-Rad)混合，避光並靜置反應10分鐘後以分光光度計測定吸光值OD_595nm，製作標準曲線。將待測樣品各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL原液稀釋5倍後的Bio-Rad混合，避光並靜置反應10分鐘後以分光光度計測定吸光值OD_595nm，最後將各樣品之吸光值OD_595nm代入標準曲線計算，即可得到樣品蛋白質濃度(y=1.1277x+0.3748，R²=0.9902)。

(免疫分析之呼吸爆(O₂ ^-))

此實驗分為對照組和實驗組。先吸取100μL的0.2%Poly-L-Lysine於96孔盤中放置30分鐘，之後再加入100μL的巨噬細胞樣品，放置於離心機中以300 x g離心20分鐘，將上清液去除後，對照組加入100μL的MCHBSS，實驗組加入100μL的Zymosan A，靜置30分鐘，反應結束後去除上清液，以100μL的MCHBSS重複清洗3次，之後加入100μL的0.3%NBT染色30分鐘，之後再加入100μL的100%甲醇終止反應，輕微搖晃後將上清液去除，再以100μL的70%甲醇重複清洗3次，清洗過後將上清液去除，放置於桌面風乾約20~30分鐘，等待風乾後再加入120μL的2M KOH以及140μL的Dimethyl Sulfoxide(DMSO)溶解cytoplasmic formazan，靜置2分鐘後以分光光度計測定吸光值OD_630nm。在本實驗中，以添加非免疫刺激物MCHBSS處理者為basal activity(BA)，而添加免疫刺激物Zymosam A處理者為stimulated activity(SA)，兩者間之差值為respiratory burst activity(RBA)(Pick and Mizel，1981)，用以表示巨噬細胞產生超氧陰離子產量之增減。

(免疫分析之吞噬細胞活性(PA))

此實驗需要在無菌操作台內進行，在操作螢光乳珠的時候需要全程避光。而在實驗開始前要先配置螢光乳珠以及碘化物(PI)，先取15mL的L-15培養液於15mL離心管中，之後加入0.4μL的螢光乳珠，而碘化物係以滅菌過的無菌水配置，其濃度為1mg/mL。前置作業完成後，先取300μL的巨噬細胞樣品加入至12孔細胞培養盤中，靜置1小時讓吞噬細胞吸附在孔洞中，之後將上清液倒除再加入300μL的L-15培養液重複清洗3次，清洗完後加入300μL配置好的螢光乳珠，隨後以鋁箔紙將12孔細胞培養盤包起來靜置2小時，等待反應結束後，加入300μL的PBS清洗一次，將大部分未攝取 的螢光乳珠清除，再加入300μL的1%甲醛用以固定巨噬細胞，反應30分鐘過後以300μL的PBS清洗2至3次後將殘留的1%甲醛洗掉，再加入300μL的碘化物染色10分鐘，染色過後以300μL的PBS清洗2次，靜置待風乾後，最後於Olympus IX50螢光顯微鏡下觀察吞噬細胞之吞噬情形。吞噬活性(phagocytosis activity)為計算200個巨噬細胞中具有吞噬熒光乳珠能力之數量，用以表示頭腎巨噬細胞的吞噬能力。

吞噬活性(%)=[100 x(吞噬熒光乳珠之巨噬細胞量)x(巨噬細胞總量)^-1]

PA(%)=[100 x(phagocytic leukocytes)x(total leukocytes)^-1]

〔免疫分析之溶菌酶活性〕

(採血及血清製備)

首先需先利用濃度0.17mg/mL的抗凝血劑潤過注射針頭以及離心管。以25G注射針頭自吳郭魚的尾柄採取血液樣品，將抽取出來的血液放置於1.7mL微量離心管中，最後將離心管以斜躺的方式放置於4℃冰箱中24小時，等待血清與血球分離。

(血清中溶菌酶之含量測定)

此實驗開始前需先行配置pH 6.2的0.05M Sodium Phosphate Buffer。以pH 6.2的0.05M Sodium Phosphate Buffer配置0.16mg/mL溶菌酶(Lysozyme,from chicken egg white,Sigma)以及0.2mg/mL的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus,ATCC No.4698,Sigma)，先將溶菌酶作為標準品進行實驗測試，稀釋成0.08、0.04、0.02、0.01、0mg/mL，將標準品各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL的M.lysodeikticus混合，以每孔添加完 菌液即刻測定的方式，利用分光光度計測定吸光值OD_530nm於第0分鐘及第5分鐘之反應數值，依據0至5分鐘內吸光值OD_530nm的差異來判斷溶菌酶的活性，並將此差異數值製作成標準曲線，利用直線迴歸方法計算血清樣品中溶菌酶的含量。待標準曲線完成後即可開始測定血液樣品，將放置於4℃冰箱中24小時後的血液樣品取出，放置於離心機中以3000 x g在4℃的環境下離心5分鐘，之後吸取上層的血清放置於新的1.7mL微量離心管中，置於冰上以接著進行溶菌酶活性分析的實驗，或保存於-80℃冰箱中備用，將取出後的血清樣品各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL的M.lysodeikticus混合，以每孔添加完菌液即刻測定的方式，利用分光光度計測定吸光值OD_530nm於第0分鐘及第5分鐘之反應數值，依據0至5分鐘內吸光值OD_530nm的差異來判斷血清中溶菌酶的活性，最後將各樣品之吸光值OD_530nm代入標準曲線計算，即可得到血清中溶菌酶的含量。在此條件下，溶菌酶活性的單位被定義為：於室溫下，每分鐘能使吸光值OD_530nm降低0.001即為1個酶活力單位(U)。根據溶菌酶破壞細菌細胞壁，從而降低細菌懸浮液的濁度的原理，用分光光度法測定。待血清樣品蛋白質濃度定量後，即可計算出每毫克的血清樣品蛋白中含有的溶菌酶活性。

(血清樣品蛋白質濃度定量)

本實驗之蛋白質定量方法參照Bradford(Bradford,1976)方式進行，利用1mg/mL的BSA，將其濃度稀釋成0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL，各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL原液稀釋5倍後的Bio-Rad混合，避光並靜置反應10分鐘後以分光光度計測定吸光值OD_595nm，製作標準曲線。將血清樣品稀釋30倍後各吸取10μL放置於96孔盤中，再加入200μL 原液稀釋5倍後的Bio-Rad混合，避光並靜置反應10分鐘後以分光光度計測定其吸光值OD_595nm，最後將各血清樣品之吸光值OD_595nm代入標準曲線計算，即可得到血清樣品蛋白質濃度(y=1.1277x+0.3748，R²=0.9902)。

〔基因表達之免疫分析〕

(吳郭魚頭腎之RNA抽取)

組織均質化(Homogenization)：首先將餵食兩個月後的吳郭魚之頭腎取出，各置於2mL微量離心管中，加入1mL TRI^® Reagent混合，再以均質機均質後放置於冰上備用。相分離(Phase separation)：加入200μL chloroform，上下輕微搖晃30秒後，置於冰上5分鐘，再置於離心機中以12000rpm在4℃的環境下離心15分鐘。吸取400-500μL上清液至新的1.5mL微量離心管中，再置於冰上。RNA沉澱(RNA precipitation)：加入500μL Isopropanol並混合均勻，靜置於室溫下10分鐘，再置於離心機中以12000rpm在4℃的環境下離心10分鐘後，去除上清液，留下RNA pellet。RNA洗滌(RNA wash)：加入1mL的75%分生級酒精，再置於離心機中以12000rpm在4℃的環境下離心10分鐘後，去除上清液，留下RNA pellet，靜置於室溫下風乾15分鐘。RNA回溶(RNA solubilization)：加入10-20μL的0.1%DEPC water並混合均勻，待測完OD值後，最後保存於-80℃。

(反轉錄酶反應(Reverse transcription,RT))

使用iScript^TM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)將各組吳郭魚頭腎RNA進行反轉錄。分別加入總體積1μg RNA、4μL 5X iScript Reaction Mix、1μL iScript Reverse Transcriptase、再利用Nuclear-free water填補至總反應體積20μL，充分混合均勻後即可進行反轉錄酶作用。作用反應條件設 定如下：25℃下反應5分鐘；42℃下反應30分鐘；85℃下反應5分鐘；再反應於無限期的4℃下，最後將cDNA保存於-20℃冰箱備用。

(Real-time PCR引子設計)

本實驗之Real-time PCR產物大小設計於80~200bp左右，其中引子設計的條件為長度20~25bp、GC比為50~65%、Tm值為50~60℃，且Forward primer和Reverse primer的差距不得超過5℃，避免連續相同鹼基的出現，特別係需避免GGGG或更多G出現，並根據NCBI裡Nucleotide中物種Oreochromis niloticus之CDS設計，使用之引子如表2所示。

(即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time PCR))

利用Real-time PCR來分析吳郭魚各組之間的各種基因表現之倍率。本實驗所使用之試劑為KAPA SYBR^® FAST qPCR Kit，於0.2mL PCR離心管中加入2μL先前反轉錄時已定量好之cDNA(100ng/μL)、10μL 2X KAPA SYBR^® FAST qPCR Master Mix ABI Prism^TM、0.4μL 10μM之Forward primer、0.4μL 10μM之Reverse primer，最後再以ddH₂O定量至20μL。將反應條件設定為：95℃下反應30秒；Step 1，95℃反應3秒；Step 2，60℃反應20秒，Step 1到Step 2總共進行40個循環。最後，待Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system分析數據後，以β-Actin作為管家基因，將樣品之間的表達差異進行歸一化，再通過2^-△△CT的公式計算控制組與實驗組之間的基因表現之倍數變化。

〔腸道菌株偵測〕

(腸道細菌染色體DNA抽取)

吳郭魚餵食兩個月後由每一組犧牲4隻吳郭魚取其腸道抽取染色體DNA，參考自EasyPure Genomic DNA Spin Kit(Bioman,GT-100)中的方法，抽取腸道內細菌染色體DNA作為模板備用。此實驗開始前需先行配置Lysozyme Buffer(20mg/mL Lysozyme；20mM Tris-HCl；2mM EDTA；Triton X-100；pH 8.0)以溶解細菌細胞壁。首先分別自每隻吳郭魚體內剪取固定一段腸道後，再各別放入1.7mL微量離心管內並加入200μL的Lysozyme Buffer，再利用micropestle將各管之腸道充分碾碎後震盪均勻使菌體完全懸浮，置於室溫10分鐘，每2-3分鐘顛覆一次，加入200μL的GB Buffer與20μL的10mg/mL Proteinase K震盪均勻，置於60℃的水浴槽中20分鐘使樣品完全裂解後，再加入200μL的99%ethanol震盪10秒混合均勻，將混合液加入裝有2mL collection tube的GD column中，以13000rpm在室溫下離心5分鐘後，去除下層液體，再加入200μL的W1 Buffer，以13000rpm在室溫下離心30秒，去除下層液體，再加入600μL的Wash Buffer，以13000rpm 在室溫下離心30秒，去除下層液體，再以13000rpm在室溫下離心3分鐘，確保酒精能完全去除，將GD column放入新的1.7mL微量離心管中，緩緩滴入100μL先前預熱好的60℃ Elution Buffer至GD column中央的濾膜中回溶，待靜置5分鐘充分吸收後，以13000rpm在室溫下離心30秒後，將純化後之genomic DNA給沖堤下來。

(聚合酶連鎖反應擴增(PCR))

本實驗使用之引子序列為賾屨有限公司代為合成，引子名稱分別為Bacteria 16S rDNA 8f與Bacteria 16S rDNA 1510r。先後將1μL genomic DNA、1μL Bacteria 16S rDNA 8f primer、1μL Bacteria 16S rDNA 1510r primer、0.5μL 50mM MgCl₂、10μL RBC Taq Mastermix、6μL的無菌水添加至準備好的0.2mL PCR離心管中混合均勻，總體積為20μL，接著進行聚合酶連鎖反應擴增16S rDNA的基因片段，反應條件設定如下：先以94℃加熱反應3分鐘，利用高溫將雙股螺旋DNA解離成單股DNA，再以單股DNA作為複製的模板，接著以94℃變性1分鐘；50℃黏合1分鐘；72℃延長2分鐘為1個循環，總共進行40個循環，最後再以72℃反應10分鐘進行最終延長反應，使所有DNA完成複製的動作，最後反應維持於4℃下，當PCR完成後即可取適量之PCR產物利用DNA膠體電泳分析確認基因片段，而PCR產物可保存於-20℃冰箱備用。

(DNA片段確認)

要製備1%的洋菜膠，首先稱量0.5g的LE agarose與50mL的1 X TAE Buffer(配置方式：4mL 25 X TAE Buffer+96mL RO水)，放入微波爐加熱約1分鐘直到洋菜膠完全溶解後靜置於室溫冷卻至約60℃時，即可倒 入預先裝設好的製膠模型中，待凝固後緩慢地將製膠盤上的齒梳向上拉開，以防止孔洞破裂。

將凝固之膠體連同製膠盤一併放入電泳槽內，並將孔洞面朝向電極負極處放置，在電泳槽內倒入適量之1 X TAE Buffer使膠體能夠完全的被覆蓋，先吸取5μL 1kb DNA Ladder注入膠體的第一個孔洞內作為marker，接著分別吸取2μL gel loading dye與8μL PCR產物混合後幫助DNA能夠沉到膠體上的孔洞中，當每個樣品注入孔洞後即可開始進行分析，所設定之電泳條件為100V，30分鐘。待電泳結束後，將膠體浸泡於Ethidium Bromide(EtBr)中染色約8分鐘，最後放入數位照膠系統內觀察於UV下的膠體結果並拍照記錄。

(次世代定序(NGS))

成功確認腸道之genomic DNA片段後委託基龍米克斯生物科技股份有限公司進行NGS分析，以鑑定R.stabekisii在餵食了兩個月後是否有附著於吳郭魚之腸道內，抑或係有協助改善吳郭魚腸道內之菌相，譬如提升好菌於腸道內的繁衍以及降低壞菌於腸道內的黏著。

〔病原菌之毒性測試〕

(病原菌之製備與標準曲線)

將保存之菌種Streptococcus iniae 89353(Gong et al.,2017)由-80℃冷凍櫃中拿出，首先吸取0.5mL之菌液至50mL之TSB培養液中，在28℃下培養12小時後，吸取1mL之菌液至100mL之TSB培養液中，在28℃下活化12小時。將菌種取出後，將菌液對半稀釋以測定吸光值OD_600nm，將每一組測完OD_600nm後之稀釋菌液保留，再進行序列稀釋，分別取不同稀 釋濃度50μL，並以三重複的方式塗佈於TSB平板培養基上，培養16-24小時。觀察並計算其菌數，再回乘20倍以推算得知該菌種之濃度(CFU/mL)。最後製作標準曲線，橫軸為吸光值OD_600nm；縱軸為菌種濃度(CFU/mL)。

(吳郭魚腹腔注射)

將上述已經製備好的菌液Streptococcus iniae 89353活菌數先行調整至1 x 10⁷CFU/mL，再依照各已餵食兩個月後之吳郭魚體重進行注射，使每隻吳郭魚之注射濃度皆為1 x 10⁵CFU/g，再利用1mL之針筒吸取與體重相對應之菌液體積注入控制組、實驗組I與實驗組II的吳郭魚腹腔內，如：體重5g則注射50μL的菌液。而注射當天為第0天，並持續觀察7天且記錄受Streptococcus iniae 89353感染的吳郭魚之狀況，再計算由Streptococcus iniae 89353感染吳郭魚後所造成之存活率，最後進行控制組與餵食飼料補充物的實驗組之間的比較。

(統計分析)

本實驗所分析之數據至少進行三重複，並統一採用SigmaPlot 12.5軟體進行統計分析，將不同處理組之間以單向變異數(one-way analysis of variance,ANOVA)進行分析比較，並以Student-Newman-Keuls測驗(Student-Newman-Keuls’s test)比較各處理組之間之顯著差異程度(P<0.05)，而所得數據皆以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示。

〔結果〕

(菌株之鑑定與特性分析測試)

將整理後的定序資料送至NCBI資料庫中使用BLAST系統 進行序列比對後，判斷分離株BST-01最有可能的菌屬為Rummeliibacillus，再經由食品工業發展研究所進一步以16S rDNA序列分析與微生物脂肪酸鑑定系統加以鑑定後，確認此菌株為Rummeliibacillus stabekisii，從而得到本發明之魯梅利桿菌株BST-01。

R.stabekisii屬於革蘭氏陽性桿菌，具有觸酶及運動性，不具氧化酶，會產生內生孢子，於好氧環境下會生長，厭氧環境下則不會生長(參照表4)。

圖1係表示培養24小時與48小時後之菌株特性分析結果。(A)澱粉酶測試；(B)纖維水解酶測試；(C)蛋白水解酶測試；(D)木聚醣酶測試。左上為正控制組(Bacillus amyloliquefaciens R8)；右上為負控制組(Escherichia coli)；下方為本發明之魯梅利桿菌株BST-01。

在經過測試後，發現本發明之魯梅利桿菌株BST-01會產生蛋白水解酶(參照圖1(A))以及木聚醣酶(參照圖1(B))，此結果表示本發明之魯梅利桿菌株BST-01具有與正控制組Bacillus amyloliquefaciens R8相近之蛋白水解酶能力，可有效提升腸胃道內含蛋白質食物分解之效率；且本發明之魯梅利桿菌株BST-01亦具有與正控制組Bacillus amyloliquefaciens R8相近之木聚醣酶能力，可有效解除木聚醣之抗營養作用，促進動物對飼料的消化吸收與生長，從而提高飼料轉換率，因此，可明顯得知，本發明之魯梅利桿菌株BST-01具有蛋白酶與木聚醣酶兩種酵素特性，預期對實驗動物的生長表現具有良好之功效。

(吳郭魚經餵食飼料補充物後之生長評估)

本實驗進行了體內測試的目的在於觀察餵食益生菌對於水生動物在成長上是否具有明顯的效果，將本發明之魯梅利桿菌株BST-01作為新型飼料補充物使用，於自製飼料當中添加了1 x 10⁶CFU/g與1 x 10⁷CFU/g持續餵食兩個月。

在生長表現之試驗方面，利用one-way ANOVA與Tukey's test統計分析對各組間於第0天與第56天之成長差異進行了比較。

統計結果顯示，餵食無添加本發明之魯梅利桿菌株BST-01之控制組中，吳郭魚控制組體重於兩個月後平均增加13.436g。

餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組中，吳郭魚實驗組I體重於兩個月後分別平均增加18.275g，餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組中，吳郭魚實驗組II體重於兩個月後平均增加14.012g。

由此結果得知，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組飼料，吳郭魚實驗組I兩個月後之生長狀況最好，其飼料效益高於控制組與1 x 10⁷CFU/g實驗組飼料。因此，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組飼料明顯較餵食控制組飼料及1 x 10⁷CFU/g實驗組飼料兩個月後之生長表現明顯較佳(P<0.05)(參照表5)。

〔吳郭魚之免疫活性分析〕

頭腎為吳郭魚體內最主要之免疫器官，含最多的巨噬細胞。為此本實驗在免疫活性分析方面利用了one-way ANOVA與Tukey's test統計分析對各組間進行比較。

由統計分析得知，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)，其等吞噬活性與呼吸爆活性皆明顯高於餵食控制組(P<0.05)，其中，1 x 10⁶CFU/g實驗組之吞噬活性與呼吸爆活性又明顯較1 x 10⁷CFU/g實驗組為佳(P<0.05)(參照圖2(A)及圖2(B))。

此結果表示：

1.餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組 及1 x 10⁷CFU/g實驗組)之吳郭魚，頭腎組織內免疫細胞吞噬活性高於控制組，說明魯梅利桿菌株BST-01具有免疫調節功能。

2.根據此結果亦說明了吳郭魚之免疫力不會因本發明之魯梅利桿菌株BST-01於飼料中添加之含量越多會導致其具有更好之免疫能力。

圖2係表示餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料兩個月後，吳郭魚之免疫活性分析結果。(A)吞噬活性；(B)呼吸爆活性；(C)超氧化物酶活性；(D)溶菌酶活性。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(P<0.05)

根據超氧化物酶活性分析之結果，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)之吳郭魚，其超氧化物酶活性皆低於控制組，惟在統計分析方面三組間並沒有顯著差異(P>0.05)(參照圖2(C))，此情況可能係因為組中變異數太大導致統計上沒有顯著性的差異。而餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)之溶菌酶活性亦明顯高於控制組(P<0.05)，此結果說明，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)之吳郭魚體內所產生的抗菌活性高於控制組，惟1 x 10⁶CFU/g實驗組與1 x 10⁷CFU/g實驗組並無顯著差異(P>0.05)(參照圖2(D))，此結果表示餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組與餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組後，兩者具有相近的抗菌能力。

由此得知，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組之免疫活性不僅比控制組要高，亦較餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組之免疫活性為高，以上綜合說明了1 x 10⁶CFU/g實驗組具有最佳之免疫活性。

〔腸道菌株偵測〕

(DNA膠體電泳確認)

為確認餵食各組飼料兩個月後之吳郭魚腸道中是否附著Rummeliibacillus stabekisii，每一組犧牲4隻吳郭魚抽取其腸道細菌染色體DNA後，進行PCR，再經由DNA膠體電泳分析確認片段於1500bp附近無誤(參照圖4)，此結果表示吳郭魚腸道中確實含有微生物，但需將PCR產物進行NGS，分析後方可確認其腸道中菌相之變化。

〔NGS分析〕

(主成份分析(PCA))

主成份分析法(PCA)係一種常用於簡化數據集、觀察樣本或基因群之間相關性的統計技術，同時保留數據對變異數貢獻最大的特徵，藉以觀察樣本或基因群的主要差異。

結果如圖5所示，每一個點代表1個樣本，各組間4個樣本以同一顏色來表示，紅色為控制組、藍色為1 x 10⁶CFU/g實驗組、黃色為1 x 10⁷CFU/g實驗組。一般而言，同組之樣本因來自同一魚缸以及餵食同一飼料，所以理論上相關性應該很高；但由於樣本取得、實驗過程、分析方式以及個體之間的差異都可能造成誤差，所以實際上的結果難免會有變異性。

以主成分分析(Principal components analysis，PCA)分析組別樣本之差異性，因同組之樣本的微生物群落越相似，PCA數據中的樣本點就越接近，實驗結果證實三組實驗樣本微生物明顯區隔為三群，三群中魯梅利桿菌株BST-01實驗組點的分佈集中，足以代表實驗組的組內微生物差異性小，組內結果呈一致性，而三組實驗組間明顯區隔為三群表示三組間 的微生物有顯著差異性(參照圖5)。

(吳郭魚腸道內菌相變化)

數據分析結果顯示，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)兩個月後，於腸道中均有分析到Rummeliibacillus菌屬，而控制組中則無，即表示餵食Rummeliibacillus stabekisii確實可有效附著於吳郭魚腸胃道管壁上，即表示餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01會使得吳郭魚腸胃道中微生物之菌相產生改變。而吳郭魚實驗組I之腸道內微生物群的數量亦明顯比吳郭魚控制組及吳郭魚實驗組II為多(P<0.05)(參照圖6)。

如圖6所示，各組之間吳郭魚腸道內微生物之菌相均不一，圖6中最大差異在於餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料(1 x 10⁶CFU/g實驗組及1 x 10⁷CFU/g實驗組)兩個月後，吳郭魚實驗組I與吳郭魚實驗組II之腸道內存在較控制組腸道內種類與數量多之菌種，譬如Algoriphagus alkaliphilus、其次為Leeia oryzae、Bacillus koreensis以及Perexilibacter aurantiacus等。此結果說明了吳郭魚之餵食不會因為添加過多之本發明之魯梅利桿菌株BST-01而導致其腸道內微生物群多樣性提升，但相較之下，添加1 x 10⁶CFU/g之本發明之魯梅利桿菌株BST-01為最佳餵食劑量。

〔病原菌之毒性測試〕

圖7係表示餵食各組飼料兩個月後之吳郭魚感染Streptococcus iniae 89353一週後之存活率。圖中各線狀圖之右方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(P<0.05)。

毒性測試中，利用Streptococcus iniae 89353感染各組間一週後的病原菌之毒性測試中，結果顯示餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組飼料兩個月後之吳郭魚實驗組II，其於第7天之存活率將近57%，明顯較控制組為高(P<0.05)；另一方面，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組飼料兩個月後之吳郭魚實驗組I，其於第7天存活率約略73%，亦明顯比餵食了兩個月後之吳郭魚實驗組II為高，甚至比控制組高出整整30%(P<0.05)(參照圖7)。

〔結果討論〕

由上述實驗顯示，本發明之魯梅利桿菌株BST-01確實具有產生蛋白酶與木聚醣酶之能力，蛋白酶具有能夠使動物體內的代謝物與營養物質更加容易被消化吸收之特性，而木聚醣酶通常用於家禽和牲畜飼料中以分解阿拉伯木聚醣，可降低原料產品的黏度，改善消化道初始部分營養物質的消化，從而提高動物體內之能量利用率以及其生長表現。然而，木聚醣酶在水產養殖中的應用研究卻很少。

為了更進一步確認具有產生蛋白酶與木聚醣酶的本發明之魯梅利桿菌株BST-01是否真的具有使動物體內的代謝物與營養物質更加容易被消化吸收之特性，進行了體內測試，將本發明之魯梅利桿菌株BST-01作為新型飼料補充物來使用，於自製飼料當中添加了1 x 10⁶CFU/g與1 x 10⁷CFU/g。

在生長表現的試驗方面，利用one-way ANOVA與Tukey's test統計分析對各組間於第0天與第56天之成長差異進行了比較。結果顯示，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組兩個月後之吳郭魚實驗組I，在體重增重率、飼料效益等數值，皆明顯較餵食兩個月後之控制組及吳郭魚實驗組II之生長表現 為好(P<0.05)。

在免疫活性分析方面，亦利用了one-way ANOVA與Tukey's test統計分析對各組間進行比較，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料，吳郭魚之吞噬活性與呼吸爆活性明顯高於控制組(P<0.05)，而吳郭魚實驗組I之吞噬活性與呼吸爆活性明顯又較吳郭魚實驗組II為好(P<0.05)。

此外，根據超氧化物酶活性分析之結果，餵食了本發明之魯梅利桿菌株BST-01之吳郭魚活性皆低於控制組，可能反映了吞噬細胞有較高的殺菌能力。惟在統計分析方面顯示三組間並沒有顯著差異(P>0.05)，此情形可能係因組中變異數太大導致統計上沒有顯著性的差異。

上述實驗證明，吳郭魚實驗組I及吳郭魚實驗組II之溶菌酶活性亦明顯高於控制組(P<0.05)，但是實驗組1 x 10⁶CFU/g與1 x 10⁷CFU/g並沒有顯著差異(P>0.05)，表示餵食了1 x 10⁶CFU/g實驗組與1 x 10⁷CFU/g實驗組後，吳郭魚具有相近的抗菌能力。此結果說明，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料，吳郭魚體內所產生之抗菌活性遠高於控制組，即本發明之魯梅利桿菌株BST-01在吳郭魚體內具有免疫刺激功能，而本發明之魯梅利桿菌株BST-01所含之木聚醣酶可能係藉由飼料中植物成分消化之寡糖作用而發生。

除了免疫活性之分析外，上述實驗亦對餵食兩個月後之吳郭魚做了基因表達之探討。將各組之頭腎樣品利用Real-time PCR分析實驗數據後進行比較，發現吳郭魚實驗組I及吳郭魚實驗組II對於IL-1β、TNF-α的mRNA表現量明顯高於吳郭魚控制組(P<0.05)，而在TGF-β的mRNA表現 量上，餵食了1 x 10⁶CFU/g實驗組之吳郭魚實驗組I亦明顯高於控制組(P<0.05)，但餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組之吳郭魚實驗組II在此時並沒有顯著差異(P>0.05)。

此結果皆表明餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01之吳郭魚體內具有較高的促發炎細胞激素表現，促發炎因子細胞激素IL-1β、TNF-α、TGF-β被許多研究中廣泛應用，在調節免疫反應中起著非常關鍵的作用，尤其IL-1β更扮演著舉足輕重的角色，在魚類研究中為應用最多的細胞因子，其表現量高表示餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01具有免疫調節功效，可以提升宿主免疫力。

而餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料之吳郭魚對於HSP-70的mRNA表現量明顯低於控制組(P<0.05)，而吳郭魚實驗組II又明顯較吳郭魚實驗組I為低(P<0.05)。HSP-70為生物體面對緊迫(stress)誘導表現之基因，HSP-70基因表現量低表示餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料有助降低吳郭魚之緊迫。

PCA測試說明餵食吳郭魚含1 x 10⁶CFU/g之本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料兩個月後，其腸胃道中之微生物呈現高的豐富度，並且可以明顯地提升腸胃道微生物群的數量。如圖6所示，雖然1 x 10⁷CFU/g實驗組並沒有明顯地提升腸胃道微生物群的表現量，但與1 x 10⁶CFU/g實驗組仍然有相同之處，與控制組相比，腸道內的菌相確實已經有所改變，存在著多種比控制組數量多之菌種。文獻指出芽孢桿菌屬(Bacillus)廣泛用用於水產養殖作為益生菌使用，具有促進成長與免疫等功效，餵食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料之吳郭魚，腸道中芽孢桿菌屬增加，表示餵 食含本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料之吳郭魚有助改善腸道菌相，增加腸道中有益菌。

在利用Streptococcus iniae 89353感染各組間一週後的病原菌之毒性測試中，結果顯示餵食1 x 10⁷CFU/g實驗組兩個月後之吳郭魚實驗組II，其於第7天之存活率明顯比控制組的要來得高(P<0.05)；另一方面，餵食1 x 10⁶CFU/g實驗組兩個月後之吳郭魚實驗組I，其於第7天存活率亦明顯較吳郭魚實驗組II為高，甚至比控制組高出將近30%(P<0.05)。這結果無疑說明了餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01確實可以通過刺激先天免疫過程，如吞噬細胞、呼吸爆與溶菌酶活性，增強吳郭魚的免疫能力與抗病能力。

綜上所述，餵食本發明之魯梅利桿菌株BST-01之飼料補充物兩個月後的吳郭魚確實提升了其生長表現、增重率、飼料效益免疫活性、感染病原菌後之存活率、腸道內菌相變化等方面，尤其是餵食了1 x 10⁶CFU/g實驗組，於各項測試分析上更是具有明顯的優勢，此結果亦說明了餵食適量含有本發明之魯梅利桿菌株BST-01之新型飼料補充物不僅可提升吳郭魚的免疫力，亦能夠促進其生長表現，進而提升存活率。若將本發明之魯梅利桿菌株BST-01作為新型飼料補充物來開發，未來對水產養殖業的市場將具有一定程度的幫助。

【產業利用可能性】

本發明之魯梅利桿菌株BST-01，具有提升吳郭魚之生長表現、增重率、飼料效益、飼料轉換率、免疫力、抗病性以及存活率等無法 預期之功效。

本發明之魯梅利桿菌株BST-01提供了一種創新策略，藉由餵食含有蛋白酶與木聚醣酶之本發明之魯梅利桿菌株BST-01提高水產動物體內之飼料效益以及其生長表現，可應用於水產動物飼料行業，能作為未來水產養殖業上之新型飼料補充物來使用與生長發育良好的首要憧憬。

此外，將本發明作為水產養殖業上之新型飼料補充物，可有效地抵抗病原菌的入侵與感染，係永續經營強而有力的後盾。再者，本發明之魯梅利桿菌株BST-01可有效降低生產成本、縮短吳郭魚成長時間、提高增重率、增強抗病性，使未來的吳郭魚能朝著營養的、經濟的、環保的方向發展。

上述所使用的用語及說明，係用以說明本發明的實施形態，但本發明並非限定於此。只要係不脫離本發明申請專利範圍，具備本發明之技術特徵而有修飾變化者，亦包含在本專利所保護範圍內。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】：台灣新竹食品工業發產研究所、民國107年12月7日、BCRC 910864

<110> 國立屏東科技大學

<120> 一種促進魚類生長與免疫調節之魯梅利桿菌及其應用

<160> 1

<210> 1

<211> 1499

<212> DNA

<213> 魯梅利桿菌(Rummeliibacillus stabekisii)

<220>

<223> 魯梅利桿菌之16S rDNA序列

<400> 1

Claims (9)

1. 一種魯梅利桿菌株BCRC 910864(Rummeliibacillus stabekisii)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國107年12月7日，寄存編號為BCRC 910864。
2. 如申請專利範圍第1項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，前述菌株係分離自吳郭魚腸道所得。
3. 如申請專利範圍第1項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，前述菌株係具有分泌蛋白酶及木聚醣之能力。
4. 如申請專利範圍第1項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，前述菌株係可黏附於吳郭魚之腸道並增生。
5. 如申請專利範圍第1項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，將前述菌株添加至飼料後餵食吳郭魚，可促進吳郭魚腸道之益菌芽孢桿菌屬增加。
6. 如申請專利範圍第5項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，前述添加有魯梅利桿菌株BST-01之飼料中，係含有1 x 10⁶CFU之魯梅利桿菌株BCRC 910864。
7. 如申請專利範圍第1項之魯梅利桿菌株BCRC 910864，其中，前述菌株可促進吳郭魚成長，並提升吳郭魚之免疫力，強化吳郭魚對鏈球菌S.iniaee感染之抵抗能力。
8. 一種吳郭魚飼料，其特徵係含有申請專利第1~7項中任一項之魯梅利桿菌株BCRC 910864。
9. 如申請專利範圍第8項之吳郭魚飼料，其中，魯梅利桿菌株BCRC 910864 係含量為1 x 10⁶CFU/g。

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