CN102586371B

CN102586371B - 利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基

Info

Publication number: CN102586371B
Application number: CN201210037467.4A
Authority: CN
Inventors: 刘文军; 贾晓娟; 陈才伟
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: CN102586371A

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基。本发明提供的发酵培养基，由如下配比的7种物质组成：酵母膏∶蛋白胨∶biotin∶CaSO₄∶MgSO₄∶NH₄CL∶甲醇为(0.3-1.0)g∶(0.6-1.5)g、4x10^-5g、(0.04-0.08)g∶(0.7-1.4)g∶(0.2-0.5)g∶(0.2-1.5)ml。本发明的实验证明，本发明提供的发酵培养基，降低了碳氮源的百分含量，降低了发酵成本；培养基中添加了常用的无机离子，不仅强化了工程菌对目的蛋白的表达途径，提高了表达量，而且便于工业化大规模发酵生产。

Description

利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用毕赤酵母生产猪Gp96蛋白的方法及专用培养基。

背景技术

Gp96蛋白是内质网热休克蛋白(Heat shork protein，HPS)HPS90家族的代表，是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。Gp96具有高度寡聚结构，其同源寡聚化有利于结合肽段和发挥分子伴侣的功能：参与蛋白质的折叠、转运、合成等过程、并可与细胞内的其它蛋白质结合；参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程；加工提呈肿瘤抗原及维持细胞内环境稳定等作用；对细胞的生长、发育、分化及死亡具有一定的调节作用。在Gp96N末端1-355片段之间有一段重要的氨基酸序列，能与抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)结合，增加抗原肽的提呈，诱导抗原特异性的细胞毒性T细胞淋巴反应(cytotoxic lympHocyte，CTL)，因此这段序列具有充分的免疫活性，能够激活免疫应答，被认为在疫苗制备及抗肿瘤免疫中具有很大的应用前景。有研究表明，Gp96在天然和获得性免疫中均具有重要的作用。在获得性免疫中，Gp96能与APCs的受体结合，通过抗原的交叉呈递作用诱发机体产生特异性的CTL免疫应答，增强CD8+T细胞清除病毒的能力；能通过刺激抗原呈递细胞(DC)和T细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。在天然免疫中，Gp96可与Toll样受体(Toll like receptors，TLR)结合，并且能非特异地激活抗原提成细胞，表达TNF-α、IL-12等细胞因子和上调CD86、CD80共刺激分子及MHC类分子，给CTL提供一个促炎性细胞因子环境和共刺激分子，激发免疫应答；另外，Gp96还可特异结合并激活中性粒细胞(PMNs)和单核细胞，增强其吞噬作用，Gp96刺激的PMNs，特别是单核细胞，使之释放大量的IL-8，IL-8作为一种强力PMNs趋化因子，能诱发PMNs的聚集。因此，Gp96在肿瘤发病学、治疗、预防学以及疫苗研发中的意义已引起广泛关注，成为近年来最活跃的研究领域。

Thomas等用泡状口炎病毒(VSV)模型在体外证实了Gp96-肽复合物对CD8+T淋巴细胞的激活作用。随后，研究显示在体外成功地构建了Gp96-肽复合物，Gp96是TLRs非常重要的伴侣分子，在巨噬细胞的正常功能发挥中扮演重要的角色。Heikema等把含流感病毒核蛋白(NP)编码序列的质粒转染仓鼠细胞，以Gp96制备物作为疫苗免疫小鼠，产生了针对NP的细胞免疫应答，提示对于已知抗原，这是一个生产以Gp96为基础的疫苗的很好方式。

已经有专利申请号：201010140598.6，发明名称为“猪用抗原呈递蛋白及编码基因与应用”，虽然涉及了利用毕赤酵母发酵表达，但是未对发酵培养基及发酵条件进行优化，培养基中蛋白胨和酵母膏含量高，且需添加YNB，发酵成本较高；另外，因p.pastoris-x33属于MUT+型酵母，甲醇的添加量对于诱导外源蛋白的表达至关重要，而且甲醇过多，会导致发酵液溶氧量急剧下降，使菌体生长受到抑制，甚至造成菌体死亡；同时，因目的蛋白Gp96属于糖蛋白，其生物活性和糖基化息息相关，而发酵液的pH对糖基化程度有着重要影响。

因此，对发酵培养基和发酵工艺进行合理优化，成为至关重要的研究方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种发酵培养基。

本发明提供的发酵培养基，由如下配比的7种物质组成：酵母膏∶蛋白胨∶生物素∶CaSO₄∶MgSO₄∶NH₄CL∶甲醇的配比为(0.3-1.0)g∶(0.6-1.5)g∶4x10^-5g∶(0.04-0.08)g∶(0.7-1.4)g∶(0.2-0.5)g∶(0.2-1.5)ml。

在上述发酵培养基中，所述酵母膏∶蛋白胨∶生物素(biotin)∶CaSO₄∶MgSO₄∶NH₄CL∶甲醇的配比为(0.3或0.5)g∶(0.6或1.0)g∶4x10^-5g∶(0.04、0.06或0.08)g∶(0.7、1.0或1.4)g∶(0.2或0.4)g∶(0.2、1.0或1.5)ml；

上述发酵培养基的pH值为5.5-6.5。

本发明的另一个目的是提供一种发酵培养基。

本发明提供的发酵培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的7种物质组成：

所述酵母膏在所述发酵培养基中的终浓度为0.3％-1.0％(质量百分含量)；

所述蛋白胨在所述发酵培养基中的终浓度为0.6％-1.5％(质量百分含量)；

所述生物素在所述发酵培养基中的终浓度为4x10^-5％(质量百分含量)；

所述CaSO₄在所述发酵培养基中的终浓度为0.04％-0.08％(质量百分含量)；

所述MgSO₄在所述发酵培养基中的终浓度为0.7％-1.4％(质量百分含量)；

所述NH₄CL在所述发酵培养基中的终浓度为0.2％-0.5％(质量百分含量)；

所述甲醇在所述发酵培养基中的终浓度为0.2％-1.5％(体积百分含量)；

所述溶剂为水。

上述发酵培养基中，所述酵母膏在所述发酵培养基中的终浓度为0.3％或0.5％(质量百分含量)；

所述蛋白胨在所述发酵培养基中的终浓度为0.6％或1.0％(质量百分含量)；

所述CaSO₄在所述发酵培养基中的终浓度为0.04％、0.06％或0.08％(质量百分含量)；

所述MgSO₄在所述发酵培养基中的终浓度为0.7％、1.0％或1.4％(质量百分含量)；

所述NH₄CL在所述发酵培养基中的终浓度为0.2％或0.4％(质量百分含量)；

所述甲醇在所述发酵培养基中的终浓度为0.2％、1.0％或1.5％(体积百分含量)。

上述发酵培养基的pH值为5.5-6.5。

本发明的第三个目的是提供上述第一个目的中发酵培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述7种物质按照上述配比混合，得到上述第一个目的的发酵培养基。

本发明的第四个目的是提供上述第二个目的的发酵培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述溶质中的7种物质均溶于水达到上述终浓度，得到上述第二个目的的发酵培养基。

本发明的第五个目的是提供一种制备Gp96N蛋白的方法。

本发明提供的方法，为在上述的发酵培养基中发酵工程菌p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96N/12，收集发酵产物，即得到Gp96N蛋白；

上述工程菌p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12为将Gp96N蛋白的编码基因通过重组载体导入p.pastoris-X33中得到的重组菌；

上述重组载体为pPICZαA/Gp96N，具体为将Gp96蛋白的编码基因插入pPICZαA载体中Xho I和Xba I位点间得到的重组载体；

上述Gp96N蛋白为猪Gp96N蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

在上述方法中，上述猪Gp96N蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

在上述方法中，上述发酵的温度为28℃，所述发酵的时间为72h-80h；所述发酵的pH为6.5。

在上述方法中，在所述发酵中，还包括向所述发酵的体系中补加无水甲醇的步骤；发酵的体系为发酵容器中的所有物质。

上述补加无水甲醇的方法依次包括如下步骤：

1)在自所述发酵开始第10h-14h，补加无水甲醇；

2)在步骤1)后每12h-18h，再次补加无水甲醇至发酵结束。

在上述方法中，步骤1)中，所述补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的0.5％-1.5％(体积百分含量)。

步骤2)中，所述再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系的总体积的0.2％-1.0％(体积百分含量)。

本发明的实验证明，一方面，本发明提供的发酵培养基，降低了碳氮源的百分含量，降低了发酵成本；培养基中添加了常用的无机离子，不仅强化了工程菌对目的蛋白的表达途径，提高了表达量，而且便于工业化大规模发酵生产；另一方面，本发明提供的发酵方法对在p.pastoris-X33表达外源蛋白中起至关重要作用的甲醇添加量、添加时间进行了优化，极大的降低了甲醇添加量，避免了发酵后期因甲醇累积对菌体造成的毒害，降低了发酵成本，使整个发酵工艺更温和环保，而且对发酵需要的pH进行了优化，控制整个发酵周期的pH为6.5，有利于猪Gp96N蛋白的糖基化和保持其生物活性，发酵周期为72-90h，缩短了发酵时间，提高了原料和设备的利用率。

附图说明

图1为猪Gp96N SDS电泳图

图2为猪Gp96N Western-blot检测

图3为BCA蛋白定量标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的培养基中组分浓度如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的发酵

1、p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的制备

1)pPICZαA/Gp96N的获得

Gp96N的氨基酸序列为序列表中的序列1，其编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。

制备序列2，以下列引物进行PCR扩增：

F1：5’CATCTCGAGATGGAGGATGAAGTGGATGTGG，其中CTCGAG为XhoI酶切位点；

F2：5’CATTCTAGATTAGTATTCATCATCTTCTACTTCCTTTG，其中TCTAGA为XbaI酶切位点。

PCR条件为：94℃4min；94℃50s，55℃50s，72℃1min；30个循环；72℃10min。

得到1000bp的PCR扩增产物。

将上述PCR产物经XhoI和XbaI双酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的载体pPICZαA(购自美国Invitrogen公司，目录号：V195-20)连接，得到重组质粒pPICZαA/Gp96N，经过测序，该载体为将序列表中的序列2插入pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点之间得到的载体，命名为pPICZαA/Gp96N。

2)重组工程菌的构建

先用限制性内切酶SacI单酶切重组质粒pPICZαA/Gp96N，得到线性化的质粒，再将得到的线性化质粒电转入p.pastoris-X33感受态细胞(购自美国Invitrogen公司，货号：C1800-00)(电转参数为1.5kv、25μF、200Ω)，得到重组菌。

提取重组菌的基因组DNA作为模板，引物为F1和F2，进行PCR扩增，得到大小为1000bp左右的目标片段，PCR鉴定结果表明，序列表的序列2所示的猪Gp96N基因已整合到p.pastoris-X33的基因组中，将该重组菌命名为p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12。

2、发酵

1)活化

以p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12为出发菌株，经斜面活化和种子培养后，接种于BMGY培养基中，pH6.0，经200rpm、28℃摇床培养至OD₆₀₀＝2.0时，室温(25℃)下3000rpm离心5min收集湿菌体；

2)发酵

发酵培养基1的组分如下：酵母膏(购自OXOID公司，货号：LP0021)0.3％、蛋白胨(购自OXOID公司，货号：LP0042)0.6％、biotin(生物素)(购自Sigma公司，货号G-4501)4x10^-5、CaSO₄0.04％、MgSO₄0.7％、NH₄CL0.2％、甲醇0.2％(体积百分含量)和水，初始pH为6.0；

以invitrogen公司提供的BMMY培养基配方(1％酵母膏、2％蛋白胨、100mM磷酸钾，1.34％YNB、4x10^-5生物素、1％甘油或0.5％甲醇，除甲醇是体积百分含量外，其他组分均为质量百分含量)为对照发酵培养基甲，组分如下：酵母膏2％、蛋白胨1％、100mM磷酸钾、YNB1.34％，biotin(生物素)4x10^-5、甲醇0.5％(体积百分含量)和水。

分别用上述两种培养基重悬湿菌体，相同条件下进行甲醇诱导发酵。

用发酵培养基1重悬湿菌体后的发酵液命名为发酵液1。

用对照发酵培养基甲重悬湿菌体后的发酵液命名为发酵液甲。

相同条件如下：用100ml的培养基在体积为500ml的三角瓶中重悬湿菌体，使得初始发酵体系中菌体OD₆₀₀＝1.0，六层纱布封口摇瓶，200rpm、28℃摇床培养10h后，向发酵体系中第一次补加0.5ml的无水甲醇(补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的0.5％)，200rpm、28℃继续培养，每隔16h后，向发酵体系中补加0.5ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的0.4％)，共发酵72h后，收集发酵液5000rpm离心10min，收集上清。在发酵过程中，持续用氨水调节使pH值保持为6.5。

分别收集在第12h、28h、44h、60h、72h的发酵液1，离心后的上清液，经过SDS电泳图，结果如图1所示，其中，泳道1-7分别为在12h、28h、44h、60h、72h的上清液，可以看出，均得到约为55KD的目的产物，与预期的猪Gp96N的蛋白发生糖基化的大小一致，说明发酵产物的上清中得到猪Gp96N的蛋白。

再进行Western-blot检测(抗体为用猪Gp96N的蛋白为抗原免疫得到的多克隆抗体)，结果如图2所示，其中，1-4分别为在12h、28h、44h、60h的上清液，可以看出，得到约55KD的目的产物猪Gp96N的蛋白，进一步证明发酵产物的上清液中有猪Gp96N蛋白。

3)检测产量

分别收集发酵液1和发酵液甲离心后的上清液，用PBS缓冲液(每1LPBS缓冲液中含NaCl8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O3.58g、KH₂PO₄0.24g、pH7.2)4℃透析，再浓缩(截留分子量为55KD)至20ml，得到浓缩液1(纯化的猪Gp96N)和对照浓缩液甲(纯化的猪Gp96N)；再通过BCA蛋白定量试剂盒(购自北京博迈德，货号PP0101)检测浓缩液1和对照浓缩液甲中猪Gp96N的蛋白浓度，BCA蛋白定量检测的标准曲线为图3(Y：蛋白浓度(μg/ml)；X：吸光值)所示。

结果如下：浓缩液1中猪Gp96N的蛋白浓度为20mg/ml，经过换算，100mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白400mg，即发酵液1的目的蛋白产量为4.0mg/ml发酵液；

对照浓缩液甲中猪Gp96N的蛋白浓度为10mg/ml，经过换算，100mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白200mg，即对照发酵液甲的目的蛋白产量为2.0mg/ml发酵液。

实施例2、p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的发酵

1)活化

以由实施例1的1得到的p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12为出发菌株，经斜面活化和种子培养后，接种于BMGY培养基中，pH6.0，经200rpm、28℃摇床培养至OD₆₀₀＝4.0时，室温下(25℃)3000rpm离心5min收集湿菌体；

2)发酵

发酵培养基2的组分如下：酵母膏0.5％、蛋白胨1.0％、biotin(生物素)4x10^-5、CaSO₄0.06％、MgSO₄1.0％、NH₄CL0.4％、甲醇1.0％(体积百分含量)，初始pH为5.5；

用150ml发酵培养基2在体积为1L的三角瓶中重悬湿菌体，使得初始发酵体系中菌体OD₆₀₀＝2.0，六层纱布封口摇瓶，200rpm、28℃摇床培养12h后，向发酵体系中第一次补加1.5ml的无水甲醇(补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的1％)，200rpm、28℃继续培养，每隔16h后，向发酵体系中补加1.5ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的0.9％)，共发酵80h后，收集发酵液2在5000rpm离心10min，收集上清。在发酵过程中，持续用氨水调节使pH值保持为6.5。

对照组的发酵培养基(命名为发酵培养基乙)和发酵条件如下：

发酵培养基乙的组分为：酵母膏0.2％、蛋白胨0.4％、biotin(生物素)4x10^-5、CaSO₄0.06％、MgSO₄1.0％、NH₄CL0.4％、甲醇2.0％(体积百分含量)，初始pH为5.5；

对照组发酵条件如下：用150ml发酵培养基乙在体积为500L的三角瓶中重悬湿菌体，使得初始发酵体系中菌体OD₆₀₀＝2.0，六层纱布封口摇瓶，200rpm、28℃摇床培养14h后，向发酵体系中第一次补加2.0ml的无水甲醇(补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的1.3％)，200rpm、28℃继续培养，每隔16h后，向发酵体系中补加2.0ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的1.3％)，共发酵80h后，收集发酵液乙5000rpm离心10min，收集上清。在发酵过程中，持续用氨水调节使pH值保持为6.5。

与实施例一的SDS电泳和Western-blot的方法相同，结果也无显著差异。

3)检测产量

分别收集发酵液2和发酵液乙的离心后上清液，用PBS缓冲液4℃透析，再浓缩(截留分子量为55KD)至30ml，得到浓缩液2和对照浓缩液乙；

再通过BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德)检测浓缩液2和对照浓缩液乙中猪Gp96N的蛋白浓度；

结果如下：浓缩液2中猪Gp96N的蛋白浓度为28mg/ml，经过换算，150mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白840mg，即发酵液2的目的蛋白产量为5.6mg/ml发酵液。

对照浓缩液乙中猪Gp96N的蛋白浓度为10mg/ml，经过换算，150mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白300mg，即对照发酵液乙的目的蛋白产量为2.0mg/ml发酵液。

实施例3、p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的发酵

1)活化

以由实施例1的1得到的p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12为出发菌株，经斜面活化和种子培养后，接种于BMGY培养基中，pH6.0，经200rpm、28℃摇床培养至OD₆₀₀＝6.0时，室温下3000rpm离心5min收集湿菌体；

2)发酵

发酵培养基3的组分如下：酵母膏0.3％、蛋白胨0.6％、biotin(生物素)4x10^-5、CaSO₄0.08％、MgSO₄1.4％、NH₄CL0.4％、甲醇1.5％(体积百分含量)，初始pH为6.0；

用100ml发酵培养基3在体积为1L的三角瓶中重悬菌体，使得初始发酵体系中菌体OD₆₀₀＝3.0，六层纱布封口摇瓶，200rpm、28℃摇床培养14h后，向发酵体系中第一次补加1.5ml的无水甲醇(补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的1.5％)，200rpm、28℃继续培养，每隔18h后，向发酵体系中补加1.0ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的0.9％)，共发酵76h后，收集发酵液3在5000rpm离心10min，收集上清。在发酵过程中，持续用氨水调节使pH值保持为6.5。

对照组的发酵培养基(命名为发酵培养基丙)和发酵条件如下：

发酵培养基丙的组分为：酵母膏0.2％、蛋白胨0.4％、biotin(生物素)4x10^-5、CaSO₄0.06％、KCL0.4％、甲醇2.0％(体积百分含量)，初始pH为5.5；

对照组发酵条件如下：用100ml发酵培养基丙在体积为500L的三角瓶中重悬菌体，使得初始发酵体系中菌体OD₆₀₀＝4.0，六层纱布封口摇瓶，200rpm、28℃摇床培养14h后，向发酵体系中第一次补加2.0ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的2.0％)，200rpm、28℃继续培养，每隔16h后，向发酵体系中补加2.0ml的无水甲醇(再次补加无水甲醇的量为占补加时发酵体系总体积的1.9％)，共发酵80h后，收集发酵液丙5000rpm离心10min，收集上清。在发酵过程中，不人为调节pH，保持发酵液自然pH值。。

3)检测产量

分别收集发酵液3和发酵液丙的离心后上清液，用PBS缓冲液4℃透析，再浓缩(截留分子量为55KD)至20ml，得到浓缩液3和对照浓缩液丙；

再通过BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德)检测浓缩液3和对照浓缩液丙中猪Gp96N的蛋白浓度，

结果如下：浓缩液3中猪Gp96N的蛋白浓度为30mg/ml，经过换算，100mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白600mg，即发酵液3的目的蛋白产量为6.0mg/ml发酵液；

对照浓缩液甲中猪Gp96N的蛋白浓度为15mg/ml，经过换算，100mlp.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12的菌液表达目的蛋白300mg，即发酵液的目的蛋白产量为3.0mg/ml发酵液。

Claims

1.一种毕赤酵母发酵表达外源Gp96N蛋白的发酵培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的7种物质组成：

酵母膏在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.3%-1.0%；

蛋白胨在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.6%-1.5%；

生物素在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为4×10^-5%；

CaSO₄在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.04%-0.08%；

MgSO₄在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.7%-1.4%；

NH₄Cl在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.2%-0.5%；

甲醇在所述发酵培养基中的终体积百分浓度为0.2%-1.5%；所述发酵培养基的pH值为5.5-6.5；所述溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于：所述酵母膏在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.3%或0.5%；

所述蛋白胨在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.6%或1.0%；

所述生物素在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为4×10^-5%；

所述CaSO₄在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.04%、0.06%或0.08%；

所述MgSO₄在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.7%、1.0%或1.4%；

所述NH₄Cl在所述发酵培养基中的终质量百分浓度为0.2%或0.4%；

所述甲醇在所述发酵培养基中的终体积百分浓度为0.2%、1.0%或1.5%。

3.权利要求1或2所述的发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：将所述溶质中的7种物质均溶于水达到所述终浓度，得到所述发酵培养基。

4.一种制备Gp96N蛋白的方法，为在权利要求1或2所述的发酵培养基中发酵工程菌p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12，收集发酵产物，即得到Gp96N蛋白；

所述工程菌p.pastoris-X33/pPICZαA/Gp96/12为将Gp96N蛋白的编码基因通过重组载体导入p.pastoris-X33中得到的重组菌；

所述重组载体为将Gp96N蛋白的编码基因插入pPICZαA载体中得到的重组载体；

所述Gp96N蛋白为猪Gp96N蛋白，所述猪Gp96N蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述猪Gp96N蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述发酵的温度为28℃，所述发酵的时间为72h-80h；所述发酵的pH为6.5。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

在所述发酵中，还包括向所述发酵的体系中补加无水甲醇的步骤；

所述补加无水甲醇的方法依次包括如下步骤：

1）在自所述发酵开始第10h-14h，补加无水甲醇；

2）在步骤1）后每12h-18h，再次补加无水甲醇至发酵结束。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述补加无水甲醇的量为占所述发酵体系的总体积的0.5%-1.5%；

步骤2）中，所述再次补加无水甲醇的量为占补加时所述发酵体系的总体积的0.2%-1.0%。