CN104672333A - 一种人源ctla4融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人源CTLA4融合蛋白及其制备方法和应用。本发明的人源CTLA4融合蛋白包含人源CTLA4融合蛋白的胞外区部分，大小为22～28KD，是全长CTLA4蛋白大小一半；本发明构建了pPICZaA-CTLA4重组表达载体，并采用真核表达系统毕赤酵母GS115菌株表达人源CTLA4融合蛋白，该人源CTLA4融合蛋白的C末端含有1个c-Myc标签和1个6His组氨酸标签，可使得表达的人源CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式释放到胞外，便于进行蛋白纯化和分析。

Description

一种人源CTLA4融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人源CTLA4融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）是T淋巴细胞表面的受体，是抑制T细胞活化的共刺激分子，当T细胞表面受体CTLA4与APC上的B7分子结合后，会抑制T细胞的活化，从而抑制T细胞的过度活化。很多过度免疫反应引发的疾病均与CTLA4蛋白的低表达有着极为密切的关系，如同种异体移植引发的免疫排斥反应、慢性支气管哮喘、风湿性关节炎（RA）、艾滋病、系统性红斑狼疮、银屑病、内毒素性休克病等疾病，因此CTLA4蛋白或融合蛋白在这些疾病的特异性治疗方面有着十分广阔的应用前景。此外，CTLA4蛋白在机体内的过度表达与很多疾病特别是肿瘤有着密切的关系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和食道癌、利什曼病等。CTLA4的单克隆抗体CTLA4mAb可广泛用于抗肿瘤的免疫治疗，是目前肿瘤基因治疗的研究热点及方向。获得具有生物学功能、接近人类天然CTLA4蛋白的重组蛋白是CTLA4特异性治疗疾病的关键。

因此，有必要提供一种人源CTLA4融合蛋白。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白。本发明第二方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白的制备方法。本发明第三方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白的应用。

第一方面，本发明提供了一种人源CTLA4融合蛋白，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白由如SEQ ID NO：2所示的基因编码。

本发明提供的如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列包括Kex2蛋白酶酶切位点的编码序列和CTLA4胞外区的编码序列（Gene Bank克隆号：NM-005214.3）。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码His标签的氨基酸序列。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码c-myc标签的氨基酸序列。

优选地，本发明的人源CTLA4融合蛋白的C末端含有1个c-Myc标签和1个6His组氨酸标签，便于筛选。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白由含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因的pPICZaA重组载体表达获得。

优选地，本发明提供的人源CTLA4融合蛋白是在真核表达系统毕赤酵母GS115菌株中分泌表达的可溶性蛋白。

本发明提供的人源CTLA4融合蛋白包含人源CTLA4融合蛋白的胞外区部分，大小为22～28KD，是全长CTLA4蛋白大小一半。

第二方面，本发明提供了一种人源CTLA4融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）、提供或制备pPICZaA重组载体，所述pPICZaA重组载体含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因；

（2）、将步骤（1）所得pPICZaA重组载体采用Sal I限制性内切酶进行线性化，再采用电击法将线性化后的pPICZaA重组载体转化到酵母GS115感受态细胞中；

（3）、采用Zeocin抗性筛选阳性酵母菌株；

（4）、采用甲醇诱导人源CTLA4融合蛋白的表达，得到所述人源CTLA4融合蛋白。

优选地，所述步骤（1）中，构建pPICZaA重组载体的过程中，所述编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因插入所述pPICZaA质粒的Xho I和XbaI位点。

优选地，所述步骤（1）中，提供或制备pPICZaA重组载体的方法，包括如下步骤：

1）、设计CTLA4基因胞外区片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

2）、提供或制备CTLA4基因模板，并以步骤（1）所得上游引物和下游引物为PCR引物，扩增CTLA4基因胞外区片段；

3）、取pPICZaA质粒，将步骤（2）扩增得到的CTLA4基因胞外区片段和所述pPICZaA质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组载体。

优选地，所述步骤2）中，所述CTLA4基因模板为含有CTLA4基因的重组载体pGEM-T-CTLA4。

本发明采用的pGEM-T-CTLA4质粒含有人CTLA4基因全长ORF（GeneBank克隆号为NM-005214.3）

优选地，所述步骤3）中，所述双酶切反应所采用的内切酶为XhoⅠ内切酶和XbaⅠ内切酶。

所述如SEQ ID NO:3所示的上游引物具体为：

5’-CCGCTCGAGAAAAGAAAAGCAATGCACGTGGCC-3’

所述如SEQ ID NO:4所示的下游引物具体为：

5’-GCTCTAGAGCGTCAGAATCTGGGCACGGTT-3’

该上游引物（CTLA4up）和下游引物（CTLA4down）的组成如下：

其中，引入碱基“GC”的设计目的是为了纠正目的基因插入表达载体pPICZaA时在载体插入位点间引入的编码错位。

Kex2蛋白酶位于酵母细胞膜中，是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys-Arg，通过对酶切位点之前的信号肽的切割而得到天然N端的CTLA4蛋白（由于本发明提供的Kex2酶切位点的上游紧邻质粒的XhoⅠ位点，下游紧邻CTLA4蛋白胞外区序列，因此，切割后能得到天然的N端CTLA4蛋白胞外区；该天然N端是指在CTLA4蛋白胞外区的N端不含有其它任何多余系列）。

本发明提供的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在酵母中表达后，能得到含有Kex2蛋白酶酶切位点的CTLA4胞外区融合蛋白，该Kex2蛋白酶酶切位点经酵母细胞膜的Kex2蛋白酶切割，促使CTLA4胞外区融合蛋白分泌到胞外。

本发明第三方面提供了一种人源CTLA4融合蛋白的在制备免疫或肿瘤疾病药物中的应用。

优选地，所述人源CTLA4融合蛋白用于制备免疫抑制剂。

优选地，由于CTLA4与B7分子的亲和力比CD28与B7的亲和力高10～20倍，只需少量的CTLA4蛋白即可阻断CD28与B7的结合，本发明提供的人源CTLA4融合蛋白可作为拮抗剂，竞争性地结合CD28分子，降低CD28分子与B7分子相互作用。

本发明所制备的CTLA4蛋白可用于单克隆抗体药物的制备。

优选地，本发明所制备的CTLA4蛋白可用于免疫小鼠并制备抗CTLA4的单克隆抗体。

本发明构建的重组载体可用于表达人源CTLA4融合蛋白胞外区，该蛋白为人源CTLA4融合蛋白胞外区全长基因序列所编码，本发明所构建的pPICZaA-CTLA4重组载体及酵母菌株GS115/pPICZaA-CTLA4可广泛应用于生物制药、抗体药物、蛋白生产等领域。

本发明提供了的重组载体及其制备方法和应用具有如下有益效果：

（1）本发明的人源CTLA4融合蛋白包含人源CTLA4融合蛋白的胞外区部分，大小为22～28KD，是全长CTLA4蛋白大小一半；

（2）本发明的人源CTLA4融合蛋白可在真核表达系统毕赤酵母GS115菌株中分泌表达，其C末端含有1个c-Myc标签和1个6His组氨酸标签，便于筛选；

（3）本发明提供的人源CTLA4融合蛋白的制备方法简便，易于工业化生产；

（4）本发明提供的人源CTLA4融合蛋白可作为拮抗剂，降低CD28分子与B7分子相互作用。

附图说明

图1为本发明提供的pPICZaA-CTLA4重组载体构建流程图；

图2为本发明实施例制得的Kex2-CTLA4基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例制得的重组载体的质粒图谱；

图4为本发明实施例制得的人源CTLA4融合蛋白的免疫印迹图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例所使用的质粒载体pGEM-T-CTLA4、pPICZaA质粒、以及所使用的酵母菌株GS115购自？公司，所使用的试剂均为市售商品。

结合图1所示的pPICZaA-CTLA4重组载体构建流程图，本发明实施例提供了一种重组载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）Kex2-CTLA4融合基因的克隆

a）提供上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的碱基序列如SEQ IDNO:3所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:4所示；

b）提供pGEM-T-CTLA4质粒作为DNA模板，采用PCR扩增CTLA4胞外区基因序列，配置扩增体系如下，体系中的引物采用步骤（1）所述的上游引物和下游引物：

PCR反应体系

PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物。

（2）含Kex2-CTLA4融合基因的重组载体pPICZaA-CTLA4的构建

1.含Kex2-CTLA4融合基因和pPICZaA质粒的双酶切；

取pPICZaA质粒，将步骤（1）所扩增得到的基因片段与pPICZaA质粒利用相同的酶分别进行酶切反应，酶切体系分别如下：

2.Kex2-CTLA4融合基因和pPICZaA的连接；

将步骤1所得双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，将Kex2-CTLA4融合基因同pPICZaA进行连接，22℃连接5h，连接反应体系如下：

3.酶切以及测序鉴定

将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，在图2中，泳道M为DNA分子量marker（1Kb Plus DNA Ladder，invitrogen），泳道1为构建的重组载体pPICZaA-CTLA4进行双酶切（XhoⅠ和XbaⅠ）结果，其中，泳道1在400bp左右具有明显条带，该条带大小与Kex2-CTLA4融合基因的大小（约400bp）一致，表明Kex2-CTLA4融合基因成功构建到载体上；

将鉴定的阳性克隆进行测序，将插入核苷酸片段和NCBI人源CTLA4片段比对后，将碱基序列完全一致的载体进行保存，本发明提供的重组载体pPICZaA-CTLA4（3898bp）的质粒图谱如图3所示。

4.人源CTLA4融合蛋白的表达

用限制性内切酶Sal I（Takara）单酶切步骤3构建得到的重组载体pPICZaA-CTLA4，使其线性化；后将线性化的pPICZaA-CTLA4用Gene Pulsersystem（Bio-Rad）电穿孔(条件：1.5k V，200Ω，and25μF)，使其进入感受态毕赤酵母GS115菌株；电转混合物在YPD固体培养基上培养，（培养基中含1M山梨醇，和100-500ug/ml的Zeocin抗生素）培养基上培养，筛选阳性酵母菌株。

挑取阳性酵母菌株，参照invitrogen毕赤酵母表达手册，采用1%甲醇诱导人源CTLA4融合蛋白表达，然后采用12%的SDS-PAGE和Western Blot（免疫印迹）实验筛选并验证目的蛋白的表达。本发明所表达的目的蛋白的大小为22～28KD。Western Blot实验结果如图4所示，在图4中，M表示Marker（分别为15、25、35、45KD），1～6泳道中，1～2为阴性对照，3～6为本实施例得到的人源CTLA4融合蛋白，箭头所指处即为该蛋白的表达条带。由图4可知，阳性酵母菌株成功表达了人源CTLA4融合蛋白，且该人源CTLA4融合蛋白的胞外区糖基化位点有不同程度的糖基化，形成22～28KD的表达条带。

5.人源CTLA4融合蛋白的纯化

参照invitrogen毕赤酵母表达手册培养阳性酵母菌株，得到发酵产物；取发酵液；10000rpm离心，取上清；随后采用80%饱和硫酸铵沉淀目的蛋白；透析后，蛋白样品经Ni²⁺柱纯化，再经过透析超滤浓缩，获得高纯度的人CTLA4胞外区蛋白。

Claims (8)

1.一种人源CTLA4融合蛋白，其特征在于，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的人源CTLA4融合蛋白，其特征在于，所述人源CTLA4融合蛋白由如SEQ ID NO：2所示的基因编码。

3.如权利要求1所述的人源CTLA4融合蛋白，其特征在于，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码His标签的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的人源CTLA4融合蛋白，其特征在于，所述人源CTLA4融合蛋白的氨基酸序列还包括编码c-myc标签的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的人源CTLA4融合蛋白，其特征在于，所述人源CTLA4融合蛋白由含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因的pPICZaA重组载体表达获得。

6.一种人源CTLA4融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）、提供或制备pPICZaA重组载体，所述pPICZaA重组载体含有编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基因；

（2）、将步骤（1）所得pPICZaA重组载体采用Sal I限制性内切酶进行线性化，再采用电击法将线性化后的pPICZaA重组载体转化到酵母GS115感受态细胞中；

（3）、采用Zeocin抗性筛选阳性酵母菌株；

（4）、采用甲醇诱导人源CTLA4融合蛋白的表达，得到所述人源CTLA4融合蛋白。

7.如权利要求6所述的人源CTLA4融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建pPICZaA重组载体的过程中，所述编码如SEQID NO：1所示氨基酸序列的基因插入所述pPICZaA质粒的Xho I和Xba I位点。

8.如权利要求1所述的人源CTLA4融合蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。