CN103898128B - 香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种香菇C91-3菌株的<i>Latcripin-16</i>基因片段、编码蛋白及制备方法，<i>Latcripin-16</i>基因片段，具有如SEQ？ID？NO：1？所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列。<i>Latcripin-16</i>基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。

Description

香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

背景技术

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌，为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321-327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-160]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡和调节细胞周期的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ 和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'- GC GAATTC ACCAACAATGCATCCGGTG -3'

下游引物XhoⅠ：

5'- G CTCGAG ATTACAAGAGCGCTCAGTA -3'

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bp Marker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

所述c步骤的PCR反应体系50 µl： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg^{2 ＋}plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃冷却10min。

本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-16基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET-32a原核表达体系中进行高效的表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1是本发明实施例 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例pET-32a（＋）重组Latcripin-16基因片段的表达质粒测序结果图。

图3是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图4是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。

图5是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率示意图。

香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入0.2ml氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000rpm离心，15min；吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止15min，再次4˚C,12000rpm离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇1ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

进行1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。

b. 将菌丝体总RNA反转录合成CDNA；

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

反应体系：香菇菌丝体总RNA (1 µg/µl) 1 µl、3’ RACE Adaptor (5 µM) 1 µl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 µl、RNase Free dH₂O 4.5 µl；

反应条件：70℃，10 min 立即冰上放置2分钟；

然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2 µl、 RNase Inhibitor (40 U/µl) 0.25 µl、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNase) (200 U/ µl) 0.25 µl，体系总体积达到10 µl。

反应条件：42℃，60 min 70℃，15 min 得到反转录产物（cDNA）。

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'- GC GAATTC ACCAACAATGCATCCGGTG -3'

下游引物XhoⅠ：

5'- G CTCGAG ATTACAAGAGCGCTCAGTA -3'

引物委托宝生物（大连）公司合成。

PCR反应体系50 µl： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg^{2 ＋}plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃冷却10min。

PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M ： DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-16目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bp Marker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，名命为Latcripin-16基因片段。

实验：

1. Latcripin-16基因片段序列测定：

测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-16基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-16的基因片段序列长为231bp的cDNA，其含有77个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。

2. Latcripin-16基因片段的克隆表达

2.1 载体构建

2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切；

反应体系 （37℃过夜）：

pET32a（＋）（100 ng/µl） 10 µl

10×K Buffer 5 µl

EcoRⅠ（10 U/µl） 1 µl

XhoⅠ（10 U/µl） 1 µl

dH₂O Up to 50 µl

2.1.2 载体回收

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9 kbp 的DNA 片段。

2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-16基因片段进行重组

使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-16基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：

Latcripin-16基因片段（100 ng/µl） 2 µl

酶切后回收载体（50 ng/µl） 1 µl

5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 µl

dH₂O Up to 10 µl

50℃ 15 min

取上述In-Fusion 产物2.5 µl 热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ℃ 过夜培养。

同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ℃ 培养14小时，采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提质粒进行测序鉴定，结果如图2所示，且与SEQ ID NO.1相同。

2.2Latcripin-16蛋白的诱导表达及鉴定

2.2.1Latcripin-16蛋白的自诱导表达

挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml 含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37 ℃ 下，180 rpm 振荡培养5小时，再接种于10ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37 ℃ 下，180 rpm 振荡培养3、4、6小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4℃）离心5000 rpm，5min，取上清，加入50μl PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS-PAGE电泳图如图3所示，图3中M：Premixed Protein Marker (low)，KB：空载体pET32a在E.coli Rosetta-gami中诱导表达产物，3h：Rosetta-gami中诱导表达3小时后表达重组蛋白，4h：Rosetta-gami中诱导表达4小时后表达重组蛋白，6h：Rosetta-gami中诱导表达6小时后表达重组蛋白。表明：重组蛋白表达成功。

2.2.2目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭100分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4℃孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图4所示，表明：表达蛋白即为目的蛋白。

2.3 Latcripin-16蛋白的纯化及活性鉴定

2.3.1. Latcripin-16蛋白的纯化

将上述条件诱导的菌体低温5000rpm，10 min~20 min离心，每50~100 mg菌体（湿重）加入1~2 ml细菌裂解液。10000×g，4℃离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图5所示。图5中，M : PageRuler Prestained Protein Ladder ；1: 纯化后的单一目的蛋白条带。表明：重组蛋白纯化效果良好。

采用现有方法纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。此新型特异蛋白序列（Latcripin-16蛋白，简称Lp-16），经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析，结果表明Latcripin-16蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，该结构域具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。

核糖核酸内切酶L-PSP，又称为鼠肝脏高氯酸可溶性蛋白，它具有抑制蛋白质合成的作用。它在蛋白质合成过程中作用于mRNA，并引起多核糖体崩解，导致蛋白合成起始阶段的阻滞。研究者发现在不同的组织器官内（肝脏、肾脏、脑和肺脏等），L-PSP都与细胞增殖的抑制关系密切。[Kanouchi H, Miyamoto M, Oka T, et al. Perchloric acid-soluble protein is expressed in enterocytes and goblet cells in the intestine and upregulated by dietary lipid. Biochim Biophys Acta, 2006, 1760 (9): 1380–85] 。在大鼠的肾脏肿瘤模型中，核糖核酸内切酶L-PSP表达下调，而正常肾脏细胞L-PSP蛋白是相对高表达的。这提示，肿瘤细胞的增殖与L-PSP活性降低密切相关，指出L-PSP可能与诱导肿瘤细胞的凋亡相关。[Ryo Morishita, Akihito Kawagoshi, Tatsuya Sawasaki, et al. Ribonuclease Activity of Rat Liver Perchloric Acid-soluble Protein, a Potent Inhibitor of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274 (9): 20688–92]。另外，研究者发现，人核糖核酸内切酶L-PSP的同源蛋白具有显著的促进巨噬细胞分化的作用，从而发挥着一定的免疫调节作用。[Schmiedeknecht G, Kerkhoff C, Orsó E, et al. Isolation and characterization of a 14.5-kDa trichloroacetic-acid-soluble translational inhibitor protein from human monocytes that is upregulated upon cellular differentiation. Eur J Biochem, 1996, 242( 2): 339–51]。

2.3.2. Latcripin-16蛋白的除盐和复性

将纯化后的Latcripin-16蛋白进行梯度透析，将Latcripin-16蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5L~2L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24h~72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000rpm，4℃离心，20~30min上清即为复性的重组蛋白。

2.3.3 Latcripin-16蛋白的活性鉴定（MTT法）

将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为18.75 μg/ml 、37.5 μg/ml、75 μg/ml、150 μg/ml，以PBS作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25~1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×10⁴/ml。每孔加入100 µl，边缘孔用无菌PBS填充，5%CO₂，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述18.75 μg/ml 、37.5 μg/ml、75 μg/ml、150 μg/ml浓度梯度的药物每孔100 µl，每个浓度设4个复孔，5%CO₂，37 ℃孵育24小时，48小时，并倒置显微镜下观察。每孔加入20 µl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h 。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 µl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630 nm，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）：IR（inhibited rate）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/对照组平均OD值。目标蛋白在蛋白浓度为18.75 μg/ml 、37.5 μg/ml、75 μg/ml、150 μg/ml时， 24h、48h的抑瘤率如图6所示，说明本发明基因片段表达的Latcripin-16蛋白对人肺癌A549细胞有显著地抑制作用。

序列表

<110> 大连医科大学

<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法

<160> 4

<210> 1

<211> 231

<212> DNA

<24>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）

<400> 1

1 accaacaatgcatccggtgcgattggtccttactctcagg

41 cgatcaaggctggagatttgctctttgtgtctggctgcat

81 ccccatggatcctaacactggtgaaattgtcgaaggtatc

121 gagaagcagacaacgcaaactttgaagaacctgattgctg

161 tcgttaatgctggtggatcagagctcagaaaagtagtgaa

201 aactacagtgcgtactgagcgctcttgtaat 231

<210> 2

<211> 77

<212> PRT

<24>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表达产物

<400> 2

1 T N N A S G A I G P Y S Q A I

16 K A G D L L F V S G C I P M D

31 P N T G E I V E G I E K Q T T

46 Q T L K N L I A V V N A G G S

61 E L R K V V K T T V R T E R S

76 C N 77

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<24>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

GC GAATTC ACCAACAATGCATCCGGTG 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<24>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

G CTCGAG ATTACAAGAGCGCTCAGTA 26

Claims (5)

1.一种香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'- GC GAATTC ACCAACAATGCATCCGGTG -3'

下游引物XhoⅠ：

5'- G CTCGAG ATTACAAGAGCGCTCAGTA -3'

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bpMarker附近的明

显条带，切胶回收DNA片段。

4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，室温放置5min，然后加入氯仿，温和震荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 ul： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP Mixture 4 μl、5×PrimeSTAR Buffer 10 μl、2.5 U/μl 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5 μl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃冷却10min。