CN102120761A - 一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法。所述的多糖-蛋白质偶联物由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂作用下与蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。其制备方法采用改进的ADH间桥法或EDAC零距离交联法制备。无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备将为预防金黄色葡萄球菌疫苗的研制提供了强有力的技术支撑。

Description

一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是奶牛乳房炎和医源性感染的主要病原之一。目前的研究表明，金黄色葡萄球菌有11个血清型，临床病例分离的金黄色葡萄球菌多为荚膜多糖5型（type 5 capsular polysaccharide，CP5）、荚膜多糖8型（type 8 capsular polysaccharide，CP8）和无荚膜的336型（type 336 polysaccharides，336PS），且不同国家和地区主要流行血清型不同。Verdier I（2007年）对195株医源性金黄色葡萄球菌的分型结果表明，CP5型占42%，CP8型占45%，336型占13%。Melles D C（2008年）等对丹麦分离的162株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的分型结果表明，CP5型占28.4%，CP8型占53.7%，336型占17.9%。韩国学者Han H R等（2000年）对该国奶牛乳房炎分离的107株金黄色葡萄球菌进行血清型分型发现，无荚膜的336PS型占46.7%，CP5和CP8均阳性的菌株为12.1%，CP5/336均阳性菌株为17.8%，CP5/336均阳性菌株为6.5%，未能分型的菌株为4.7%。王登峰等（2010年）对新疆不同地区5个大型奶牛场分离的117株金黄色葡萄球菌分型表明，CP5型占10.36%，CP8型占13.68%，无荚膜的336型占64.96%，未能分型菌株占11.11%。

目前对金黄色葡萄球菌的感染主要使用抗生素进行治疗，但由于该菌容易对抗生素产生抗性，导致其耐药性增强，治疗效率下降。通过免疫预防进行该病防制已成为研究的热点。但是，由于金黄色葡萄球菌荚膜多糖（CP5、CP8）和胞外多糖(336PS)无免疫原性，直接使用相应的提取物作抗原不能够刺激机体产生免疫保护。将其分离、纯化并与合适的蛋白偶联，可作为抗原制备疫苗，刺激机体产生免疫保护。

荚膜多糖CP5、CP8的纯化和偶联研究较多，但无荚膜型的金黄色葡萄球菌胞外多糖的化学结构与荚膜多糖CP5、CP8完全不同，其纯化和偶联方法也有所差异。建立一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化和偶联技术方法，将为预防该型金黄色葡萄球菌疫苗的研制提供技术支撑。

胞外多糖是金黄色葡萄球菌的主要抗原成分和毒力因子，它具有抗吞噬活性，能阻止中性粒细胞对细菌的吞噬和与相关抗体的结合。有关研究表明，金黄色葡萄球菌胞外多糖的结构为聚磷酸化核糖醇-N-乙酰葡萄糖胺，与革兰氏阳性球菌细胞的主要成分壁磷壁酸类似。该多糖分子量小，免疫原较差，经过纯化并与合适的载体蛋白偶联能够提高荚膜多糖免疫原性。目前国外已公开的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖纯化和偶联方法主要采用是Ali Ibrahim Fattom（专利文献号US005770208A，US002194151B1；论文：INFECTION AND IMMUNITY，Vol.60，No.2，p.584-589）的方法。具体方法为：培养无荚膜型金黄色葡萄球菌至吸光度值20.0（650nm），然后用苯酚-乙醇溶液（体积比1:1）低温处理2小时灭活菌体，离心收集沉淀-70℃冻存。悬浮菌体至0.5g/mL，加入溶葡萄球菌酶至终浓度100～150μg/mL，37℃处理3小时，在加入DNA酶、RNA酶至终浓度50μg/mL，培养4小时，然后用25%～75%梯度乙醇浓度沉淀多糖。75%乙醇离心收集沉淀，透析冻干。选择Q Sepharose柱离子交换层析后，将收集的多糖再经溶菌酶的消化残余的糖肽，再经凝胶过滤层析即得到纯化多糖。偶联试剂选择的是ADH和EDAC，但反应介质是在水。用该方法进行纯化和偶联时，纯化过程较为繁杂，偶联反应体系不稳定，不易批量化制备。

发明内容

本发明的目的是：制备一种可为人类或其它动物无荚膜型金黄色葡萄球菌感染疫苗研制提供保护性抗原的技术方法，利用化学手段制备无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖与蛋白质的偶联物。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：所述无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂作用下与蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

所述偶联试剂是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

所述蛋白质为牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。

所述的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，包括以下步骤：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为4.7的100mmol/L MES缓冲液将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL液体与400μL EDAC(10mg/mL)和88μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液混合反应4～6小时后，将反应物在pH值为7.5的1mmol/L EDTA的0.1mol/L PBS缓冲液中4℃条件下透析18小时，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)和44μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液进行反应12小时，形成多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物进行纯化并收集波峰部分溶液。

所述的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，还可以按照以下步骤制备：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为5.6的100mmol/L MES缓冲液中将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL溶液，加入ADH和EDAC至0.36mol/L、0.015mol/L，反应4～6小时用透析袋（分子截留量为15KDa）4℃透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)溶液进行反应18小时，收集多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物溶液进行层析并收集波峰部分溶液。

以上制备方法中，所述的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化包括以下步骤：

（1）将无荚膜型金黄色葡萄球菌菌株接种在含有2%氯化钠的哥伦比亚液体培养基中，37℃ 170转/分钟在振荡培养箱中培养22～24小时，5000转/分钟离心收集菌体沉淀；

（2）菌体沉淀用pH值为7.5含2mmol/L硫酸镁的50mmol/LTris缓冲液悬浮至0.25g/mL。加入溶葡萄球菌素至浓度200μg/mL，37℃孵育4小时，12000转/分钟离心30分钟收集上清液；

（3）将上清液用聚乙二醇浓缩至体积的1/5，收集多糖浓缩液；

（4）在多糖浓缩液中加入无水乙醇至总体积的25%～30%，混匀后静置30分钟，12000转/分钟离心30分钟后收集上清液；

（5）向上清液中再次加入无水乙醇至总体积的75%，混匀静置30分钟后离心12000转/分钟收集沉淀，室温下放置挥发多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；

（6）将粗多糖沉淀物以10mg/mL溶解于缓冲液中，加入DNA酶和RNA酶至浓度0.1mg/mL，37℃振荡培养箱温育6小时，再加入蛋白酶ⅩⅣ消化，再次用无水乙醇浸提，获得粗多糖；

（7）将粗多糖用去离子水溶解，在去离子水中透析48小时；

（8）采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化，用可见-紫外分光光度计检测吸光度值（206nm），并绘制曲线，收集波峰部分的液体组分，冻干后获得纯化的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖。

本发明的有益效果：（1）简化了多糖的纯化过程，易于操作，且多糖质量稳定。主要步骤简括为：培养菌体细胞→溶葡萄球菌酶处理→乙醇浸提→除核酸和蛋白→凝胶层析；（2）梯度乙醇处理，去除核酸和蛋白，核酸酶和蛋白酶处理，凝胶层析，收集波峰部分的多糖；（3）本发明采用的偶联方法有两种：①改进的ADH间桥法：选择合适的缓冲液以稳定偶联反应的pH值，采用ADH偶联试剂在EDAC作用下与多糖形成ADH活化的多糖，再将活化的多糖与牛血清白蛋白通过共价键偶联，形成多糖-蛋白偶联物，该法能使反应条件更加稳定，有利于提高偶联率；②EDAC零距离交联法：所制备的多糖通过EDAC和Sulfo-NHS作用下与多糖共价形成Sulfo-NHS活化的多糖中间体，再将活化的多糖与蛋白质通过共价键偶联，形成多糖-蛋白偶联物；（4）选择了合适的缓冲液，适当增加了偶联试剂的浓度，能够使偶联反应条件更加稳定，提高最终的偶联率；（5）EDAC零距离交联法制备的偶联抗原，其反应分两步操作，针对不同的反应特性选择了不同的反应缓冲液，可以提高的偶联率；（6）能显著地改善多糖的抗原性；（7）增加免疫对象的体液免疫水平，提高机体对该菌的免疫保护能力；（8）上述方法是将金黄色葡萄球菌重要的毒力因子胞外多糖在适应的缓冲体系中与蛋白质通过偶联试剂共价连接得到的多糖-蛋白质偶联物。该方法较现有的偶联方法更加稳定。用该方法制备无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物可用于预防该类型金黄色葡萄球菌感染所致的奶牛乳房炎、子宫内膜炎以及医源性金黄色葡萄球菌引起的各种感染性疾病。

本发明所用无荚膜型金黄色葡萄球菌菌株购买于美国标准生物品收藏中心（ATCC），其货物描述为Staphylococcus aureus subsp.aureus，ATCC编号为55804，2007年9月委托北京中原合聚经贸有限公司代理进口，合同号为QC07090068，合同书以其他证明文件的形式已经附在电子申请文件中。

本发明还可应用于其它无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖偶联物的制备，这里给出的菌株仅仅是为了例示性说明本发明。

本发明中涉及的术语有：MES为2-（N-吗啉代）乙烷磺酸；PBS为磷酸盐缓冲液；ADH为乙二酸二酰肼；EDAC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺；Sulfo-NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺；Tris为三羟甲基氨基甲烷；DNA为脱氧核糖核酸；RNA为核糖核酸；KDa为千道尔顿；EDTA为乙二胺四乙酸二钠；无水乙醇为质量分数大于或等于99.7%的乙醇。

附图说明

附图为无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖凝胶过滤层析波峰图

图中是用0.2mol/L氯化钠溶液洗脱层析柱并收集洗脱液，以1.4mL/管，共收集120管，分别测定各管溶液的吸光度值（206nm），用Excel 2007绘制曲线，收集第14管～第44管波峰部分样品。

具体实施方式

下面通过具体的实施例是对本发明作进一步的描述：

实施例1 一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物，由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂EDAC和Sulfo-NHS作用下与牛血清蛋白共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-牛血清蛋白偶联物。

用EDAC零距离缩合法制备无荚膜型金黄色葡萄球菌多糖-牛血清蛋白偶联物的制备方法，具体如下：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的分离与纯化

①将金黄色葡萄球菌菌株接种于哥伦比亚液体培养基（含2%氯化钠），37℃ 170转/分钟振荡培养22～24小时，5000转/分钟离心30分钟收集菌体沉淀，称重后-75℃冻存。

②将收集的菌体沉淀pH值为7.5的含2mmol/L硫酸镁的50mmol/L Tris悬浮至0.25g/mL，加入溶葡萄球菌素至终浓度200μg/mL，37℃孵育4小时，12000转/分钟离心30分钟收集上清

③将上清液装入透析袋(分子截留量为12～14KDa)中，用聚乙二醇20000浓缩至原体积的1/5。

④在多糖浓缩液中加入无水乙醇至总体积25%～30%，混匀后静置30分钟，12000转/分钟离心30分钟收集上清。

⑤向上清液中再次加入无水乙醇至总体积的75%，混匀后静置30分钟，12000转/分钟离心30分钟收集沉淀，室温下放置挥发多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；

⑥将多糖沉淀物以10mg/mL溶解于pH值为7.5的2mmol/L硫酸镁的50mmol/L Tris缓冲液中，分别加入DNA酶和RNA酶至浓度0.1mg/mL，37℃振荡温育6小时，再加入蛋白酶ⅩⅣ，浓度为1mg/mL，37℃振荡温育18小时，再次乙醇浸提，方法同上。

⑦将多糖用缓冲液溶解，装入透析袋中，用去离子水透析48小时后冻干。

⑧采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化，凝胶过滤层析柱规格为2.5厘米×50厘米，填料为Sephacryl S-300 HR。填装好后的柱用0.2mol/L氯化钠溶液平衡。将冻干的胞外多糖用上述平衡溶液溶解并上样。0.2mol/L氯化钠溶液洗脱层析柱并收集洗脱液，以1.4mL/管，共收集120管，分别测定各管溶液的吸光度值（206nm），用Excel 2007绘制曲线，收集第14管～第44管波峰部分样品，如图所示。用去离子水4℃透析48小时后冻干，即为纯化的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖。同时对多糖进行化学检定，多糖含量测定采用硫酸-苯酚法，蛋白质含量的测定采用改良型BCA蛋白质定量检测试剂盒，核酸含量的测定采用紫外分光光度法。如表1所示：

表1 无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖化学检定结果

指标	多糖	蛋白质	核酸
				含量（%）	68.51	0.05	1.02

（2）将纯化后的多糖用pH值为4.7的100mmol/L MES缓冲液配成10mg/mL溶液，取1.0mL与400μL EDAC（10mg/mL）和88μL Sulfo-NHS（6.25mg/mL）混匀，温和震荡反应4～6小时后将反应物用pH值为7.5的1mmol/L EDTA的0.1mol/L PBS缓冲液4℃透析18小时，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入牛血清白蛋白10mg，同时加入200μL EDAC（10mg/mL）和44μL Sulfo-NHS（6.25mg/mL）继续反应12小时，形成多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）用凝胶过滤层析收集波峰部分组分，获得无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

实施例2 一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物，由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂EDAC和ADH作用下与牛血清蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-牛血清蛋白质偶联物。

改进的ADH间桥法制备无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-牛血清蛋白偶联物的制备方法，具体如下：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的分离与纯化，方法同上。

（2）将纯化后的多糖用pH值为5.6的100mmol/L MES缓冲液配成10mg/mL的溶液，取溶液1.0mL，加入ADH和EDAC分别至终浓度0.36mol/L、0.015mol/L，混匀，置室温反应以形成衍生多糖，4～6小时后将反应物用透析袋4℃透析18小时，以除去ADH和EDAC，收集衍生化的多糖中间体溶液。

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入10mg牛血清白蛋白和200μL EDAC（10mg/mL）加入到衍生多糖中，温和震摇反应18小时，收集多糖-蛋白质偶联物溶液。

（4）用凝胶过滤层析收集波峰部分组分，获得无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

Claims (6)

1.一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物，其特征在于：所述的多糖-蛋白质偶联物由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂作用下与蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

2.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌-蛋白质偶联物，其特征在于：所述偶联试剂是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

3.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌-蛋白质偶联物，其特征在于：所述蛋白质为牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。

4.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为4.7的100mmol/L MES缓冲液将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL液体与400μL EDAC(10mg/mL)和88μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液混合反应4～6小时后，将反应物在pH值为7.5的1mmol/L EDTA的0.1mol/L PBS缓冲液中4℃条件下透析18小时，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)和44μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液进行反应12小时，形成多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物进行纯化并收集波峰部分溶液。

5.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为5.6的100mmol/L MES缓冲液中将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL溶液，加入ADH和EDAC至0.36mol/L、0.015mol/L，反应4～6小时用透析袋（分子截留量为15KDa）4℃透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)溶液进行反应18小时，收集多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物溶液进行层析并收集波峰部分溶液。

6.根据权利要求4或5所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：所述的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化包括以下步骤：

（1）将无荚膜型金黄色葡萄球菌菌株接种在含有2%氯化钠的哥伦比亚液体培养基中，37℃ 170转/分钟在振荡培养箱中培养22～24小时，5000转/分钟离心收集菌体沉淀；

（2）菌体沉淀用pH值为7.5含2mmol/L硫酸镁的50mmol/LTris缓冲液悬浮至0.25g/mL加入溶葡萄球菌素至浓度200μg/mL，37℃孵育4小时，12000转/分钟离心30分钟收集上清液；

（3）将上清液用聚乙二醇浓缩至体积的1/5，收集多糖浓缩液；

（4）在多糖浓缩液中加入无水乙醇至总体积的25%～30%，混匀后静置30分钟，12000转/分钟离心30分钟后收集上清液；

（5）向上清液中再次加入无水乙醇至总体积的75%，混匀静置30分钟后离心12000转/分钟收集沉淀，室温下放置挥发多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；

（6）将粗多糖沉淀物以10mg/mL溶解于缓冲液中，加入DNA酶和RNA酶至浓度0.1mg/mL，37℃振荡培养箱温育6小时，再加入蛋白酶ⅩⅣ消化，再次用无水乙醇浸提，获得粗多糖；

（7）将粗多糖用去离子水溶解，在去离子水中透析48小时；

（8）采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化，用可见-紫外分光光度计检测吸光度值（206nm），并绘制曲线，收集波峰部分的液体组分，冻干后获得纯化的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖。