CN104940920B - 一种防龋齿蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防龋齿蛋白疫苗及其规模化制备方法。本发明提供的防龋齿蛋白疫苗，其活性成分为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。其制备方法包括如下步骤：1）通过PCR方法，从变形链球菌UA159基因组扩增水不溶性葡萄糖基转移酶葡萄糖结合区Glu基因片段；2）将所述GLU基因片段构建到含有6‑His组氨酸标签的表达载体上，得到重组质粒，转化至表达菌，酶切鉴定；3）诱导表达可溶性的重组蛋白；4）纯化重组蛋白。该方法适用于大规模制备人用防龋蛋白疫苗，具有可溶性表达，安全高效，具有良好的开发和应用前景。

Description

一种防龋齿蛋白疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种预防龋齿的蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

龋齿和心血管疾病、癌症并称为人类三大疾病。在中国，80％的儿童、50％的成人、98％的老年人都不同程度受其困扰。要达到龋齿的有效预防，除了降低碳水化合物摄入、利用氟化物增强牙齿对酸的抵抗力和采用密封剂减少致病菌在齿沟的定植之外，使用抗菌物质减少或者消灭致龋微生物是科学家数十年来研究的重点，龋齿疫苗的研发更是重中之重，但到目前为止，仍然没有一种疫苗能够在临床应用。

龋齿疫苗的研发是随着对致龋微生物的逐渐认识而进行的，变形链球菌(Streptococcus mutans,S.Mutans)是主要的致龋微生物，其致龋性主要表现在对牙面的黏附、产酸、耐酸以及产生多糖和细菌素等方面，针对变形链球菌的疫苗种类较多。早期，科学家们尝试将完整的变形链球菌灭活，作为经口途径的疫苗使用，但是因为变形链球菌有能与心肌特别是心脂质和肌纤维膜鞘交叉反应的抗原，导致接种者死亡的潜在危险而不被接受；随后，DNA重组技术被用来将致龋微生物的抗原成分重组到非致龋、无交叉反应的良性细菌(如乳酸杆菌等)中，但是没有足够证据能够保证所谓的良性细菌足够安全；20世纪90年代初出现DNA疫苗，其基本原理是将外源性基因直接导入宿主细胞内，诱导宿主免疫系统对目的基因所表达的蛋白发生免疫反应，达到预防疾病的目的。DNA疫苗具有免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答、可制备成多价疫苗、制备简单等优点。但是，目前为止DNA免疫所得到的结果还很不均一，有的DNA疫苗能起到很好的保护作用，有的却保护不明显，甚至还有免疫自然宿主反而加重了病毒感染的报道。因此，DNA免疫尚处于探索时期，所有的动物、表达载体、基因片段等均不相同，结果差别甚大。

近来，多种以S.Mutans抗原为基础的防龋疫苗可显著降低动物龋齿发生率，抗原主要有：表面蛋白抗原I/II(Ag I/II)、葡糖基转移酶(GTF)和葡聚糖结合蛋白(GBP)等抗原分子(Hajishengallis G.Infect Immun,1998,66(4):1740-1743；Katz J.Infect Immun,1993,61(5):1964-1971；Childers NK.Oral Microbiol Immunol,2006,21(5):309-313；Childers NK.J DentRes,2002,81(1):48-52.；Peacock ZS.Oral Microbiol Immunol,2005,20(1):60-64；Smith D J.Infect Immun,2005,73(5):2797-2804)。葡糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)是变形链球菌合成的重要致龋因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在内的多种胞外多糖。GTF结构包括催化区(Catalytie，Cat)和葡聚糖结合区(Glucanbinding，Glu)两个功能区段。催化活性区具有催化蔗糖水解的活性，能够催化蔗糖产生葡聚糖；葡聚糖结合区与葡聚糖结合，这种结合是特异性，不可逆的，且结合力非常强，由此介导了变形链球菌之间、菌体与葡聚糖、菌体与牙面之间的相互作用，从而使变形链球菌粘附、聚集在牙齿的表面并产酸，酸引起牙齿表面脱矿，最终导致龋病的发生，是龋病发生的主要因素。Glu具有良好的免疫原性和免疫保护性，其可高效诱导抗GTF抗体，从而抑制GTF合成葡聚糖的能力，减少菌斑形成(Xu QA,Vaccine.2007Jan26；25(7):1191-5；Jespersgaard C,Infect Immun.1999Feb；67(2):810-6；Taubman MA,InfectImmun.2001Jul；69(7):4210-6.)。因此，抑制GTF催化合成葡聚糖有可能预防龋病的发生。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种防龋齿蛋白疫苗，其活性成分为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供以上防龋齿蛋白疫苗的制备方法，其主要包含步骤：

1)通过PCR方法，从变形链球菌UA159基因组扩增水不溶性葡萄糖基转移酶葡萄糖结合区Glu基因片段，扩增引物序列如下：

上游引物

5′-CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3′

下游引物

5′-CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3′

2)将所述Glu基因片段构建到含有6-His组氨酸标签的表达载体上，得到重组质粒，转化至表达菌，酶切鉴定；

3)诱导表达可溶性的重组蛋白；

4)纯化步骤3获得的重组蛋白，冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。

所述步骤(2)中的含6-His组氨酸标签的表达载体为pET28a质粒，表达菌为E.coliDH5α。

优选的，步骤(3)具体为：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜，增菌，待A600OD值为0.4-0.6时，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，15℃-37℃继续培养4-16小时。

优选的，步骤(3)具体为：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜，增菌，待A600OD值为0.4-0.6时，加入IPTG终浓度为0.3mmol/L，15℃继续培养16小时。

优选的，步骤(4)具体为：4℃，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用binding buffer洗涤一次，根据菌体的量，选择适量的binding buffer重悬菌体；冰浴环境下，超声破碎，收集蛋白粗液；10000rpm，30min，4℃离心破碎液，收集上清，并经0.45μm过滤器过滤，冰浴备用；使用1ml HisTrap FF镍柱以及AKTApurifier 10仪器进行纯化，SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度；冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。

本发明通过对新型防龋重组蛋白疫苗的构建，同时对可溶性蛋白疫苗的表达和纯化步骤进行优化，建立了一种新型防龋蛋白疫苗的规模化制备方法，该方法适用于大规模制备人用防龋蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。本发明所构建和纯化得到的重组蛋白疫苗，将为后续研究蛋白疫苗的免疫效应提供充足的物质基础。

附图说明

图1为Glu基因PCR扩增结果图，图中M为DNA marker，1为Glu基因目的片段；

图2为XholI和BamHI双酶切质粒、Glu基因PCR扩增片段结果，图中M为DNA marker，1为载体pET28a经XholI和BamHI双酶切，2为Glu经BamHI和XholI双酶切；

图3为不同温度下诱导表达蛋白的SDS-PAGE图，M为蛋白分子量，1、3、5分别代表未经IPTG诱导，30℃，37℃，15℃下含pET28a-Glu的大肠杆菌的蛋白带；2、4、6分别代表30℃，37℃，15℃下用1mM IPTG诱导含pET28a-Glu的大肠杆菌的蛋白带；

图4为Glu在15℃时经不同IPTG浓度诱导表达重组蛋白的SDS-PAGE图，M为蛋白分子量，1为诱导前的细菌裂解液，2为经IPTG＝0.1mM诱导的细菌裂解液上清，3为经IPTG＝0.1mM诱导的细菌裂解沉淀，4为经IPTG＝0.3mM诱导的细菌裂解液上清，5为经IPTG＝0.3mM诱导的细菌裂解液沉淀；

图5为Glu金属螯合层析SDS-page结果，图中M为蛋白Marker，1为Glu诱导前，2为Glu超声上清，3为Glu超声沉淀，4为Glu流穿峰，5为Glu洗涤峰，6为Glu洗脱峰；

图6蛋白疫苗Glu纯化后SDS-PAGE图；

图7为蛋白疫苗免疫小鼠后血清中特异性抗体产生水平，A为PCIA-P DNA疫苗免疫组，B为rPAc蛋白免疫，C为Glu蛋白免疫，D为PBS空白对照；

图8为蛋白刺激免疫后小鼠脾细胞IFN-γ及IL-4细胞因子产生水平，A为PBS空白对照，B为PCIA-P DNA疫苗免疫组，C为Glu蛋白免疫，D为rPAc蛋白免疫；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

【实施例1】Glu重组防龋蛋白疫苗的构建

1、引物的设计合成

从NCBI:BLAST中的变形链球菌UA159(Streptococcus mutans UA159)基因组序列中水不溶性葡萄糖基转移酶葡萄糖结合区Glu基因片段编码序列(Sequence ID:AE014133.2)，设计合成一对特异性引物，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；引物的序列和编号如下:

GLU基因PCR扩增引物

上游引物

5′-CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3′

下游引物

5′-CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3′

(扩增产物5′端含有BamHI位点，3′端含有XholI位点)

2、变形链球菌UA159全基因组DNA的提取

培养变形链球菌UA159(美国模式培养物集存库ATCC购买)(使用BHI液体培养基)，37℃，220rpm置于摇床震荡过夜。取4ml菌液集菌，10000rpm离心1分钟，弃上清。加入500μlTE洗涤，震荡重悬，14000rpm离心3分钟，弃上清。加入300μl组织细胞裂解液，超声5秒钟。加入10μl溶菌酶、10μl蛋白酶K、2μl变溶菌素后37℃温育1小时，每隔15分钟上下颠倒混匀5-10次。65℃温育1小时，每隔15分钟涡旋震荡混匀5-10次后放置至室温。加入2.5μl胰蛋白酶37℃温育30分钟。加入400μl MPC裂解液，充分混匀，14000rpm离心10分钟，转移上清至无菌离心管。加入600μl酚/氯仿/异戊醇(24:25:1)，混匀，14000rpm离心10分钟，转移上清至无菌离心管。加入250μl氯仿，混匀，14000rpm离心10分钟，转移上清至无菌离心管。加入350μl异丙醇，混匀，放置沉淀2小时，4℃14000rpm离心10分钟，弃上清。70％乙醇洗涤沉淀，4℃14000rpm离心10分钟，弃上清。真空干燥DNA沉淀后加入50μlTE，室温2小时充分溶解DNA。检测DNA浓度和纯度，-20℃保存。

3.PCR(聚合酶链反应)扩增目的片段

1)建立PCR反应体系

用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应：98℃变性5min,98℃10Sec，59℃20Sec，72℃1min,进行33个循环，72℃10min。

使用5μl PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，以2kdDNA ladder为分子量参照标准，凝胶成像系统扫描，分析结果(图1)。

2)PCR产物回收纯化

PCR产物使用OMEGA Cycle-Pure Kit纯化试剂盒(货号D64922-01)纯化，具体步骤如下：

a PCR产物加入4-5倍体积缓冲液CP，震荡混匀。

b加入离心柱离心(室温，10000g，离心1分钟)。

c加入DNA wash buffer 700μl(室温，10000g，离心1分钟)。

d重复上一步。

e空管离心(室温，13000g，离心2分钟)

f加入无菌水20-30μl,静置1-2分钟。

g离心收集(室温，13000g，离心1分钟)

h测回收产物的浓度和纯度。

3)酶切初步鉴定(图2)

PCR纯化进行初步酶切鉴定，酶切条件如下：

备注：37℃恒温酶切3-5小时。对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳

4、构建原核表达载体

1)载体pET28a质粒提取

将pET28a甘油菌(卡那霉素抗性)的LB固体培养基中，37℃培养12-16小时，挑单菌落接种于含相应抗生素(卡那霉素抗性)的5-10ml LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜培养(12小时)，按照OMEGA试剂盒说明提取质粒。

2)构建原核表达载体

a)pET28a载体双酶切(所加质粒量根据质粒浓度调整)：

双酶切反应体系如下：

反应条件：37℃，3-5小时

b)载体与插入片段切胶回收

对双酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，对照2kd DNA ladder进行切胶回收，具体步骤按照OMEGA(D2500-01)使用方法，具体操作如下：

1)紫外灯下切下含目的条带的琼脂凝胶。

2)承重，以1mg＝1μl计算胶体积，加入等体积Buffer XP2,混匀后60℃加热至胶完全溶解(大约10分钟)。

3)转移液体至离心柱，室温10000g离心1分钟，弃离心液。

4)加入300μl Buffer XP2，室温10000g，离心1分钟，弃离心液。

5)加入700μl Buffer SPW，室温10000g，离心1分钟，弃离心液。

6)重复上一步骤。

7)室温空管离心13000g离心2分钟。

8)加入Elution Buffer 30-40μl,静置2分钟。

9)室温13000g离心1分钟，收集离心液，测OD。

c)载体与目的片段连接

反应体系如下：

备注：16℃过夜连接(12-16小时)，载体和插入片段摩尔比建议为1：1-1:3得到的克隆质粒命名为pET28a-Glu。

d)化学转化

取连接产物5μl加入50μl E.coli DH5α(天根生化科技有限公司)，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃90秒，再次冰浴150秒，加入500μl预热的LB液体培养基，37℃(150rpm)摇床培养45分钟，取200μl涂布到含卡那霉素的LB固体培养基(100μg/μl),37℃培养过夜(12-16小时)。

e)鉴定阳性克隆

挑取单克隆，37℃卡那霉素阳性LB液体培养基(100μg/ml)摇菌培养增殖12小时，集菌，使用OMEGA试剂盒提取质粒，选择BamH和XholI进行酶切鉴定。

5、目的蛋白诱导表达

1)诱导融合蛋白表达

a)挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入10ml卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃过夜震荡培养。

b)取200μl菌液接种至10ml新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜。

c)A600OD值为0.5-0.6时，加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，继续37℃培养4小时。

d)取诱导组菌液和未诱导菌液各1ml，4℃10000rpm离心1分钟，弃上清，-20℃保存。

e)诱导组和未诱导组各自加入100μl PBS，混匀，超声破菌(超声10次，功率为200W，时间3秒钟，超声间隔时间3秒钟)，4℃14000rpm离心10分钟。分离上清和沉淀，在沉淀中加入100μl PBS，混匀。

f)取上清和沉淀各20μl，加入20μl 2X上样缓冲液，100℃煮沸5分钟。

g)分别取处理后样品10μl-20μl进行SDS-PAGE电泳。

2)诱导条件优化

根据前期实验发现在常规条件下很难得到可溶性的重组蛋白，为提高重组蛋白的产量和增大其溶解性，分别对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等条件进行了优化。

①最适温度优化(图3)

a)挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入10ml卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃培养震荡过夜。

b)取200μl菌液接种至3管10ml新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜。

c)待A600OD值为0.5-0.6时，取未诱导菌液1ml，加入IPTG终浓度为0.2mmol/L，分别按15℃、30℃、37℃继续培养，于诱导后7小时从各管中取诱导菌液1ml。

d)将诱导组菌液和未诱导菌液，4℃10000rpm离心1分钟，弃上清，-20℃保存。

e)诱导组和未诱导组各自加入100ul PBS，混匀，超声破菌(超声10次，功率为200W，时间3秒钟，超声间隔时间3秒钟)，4℃14000rpm离心10分钟。分离上清和沉淀，在沉淀中加入100μl PBS，混匀。

f)取上清和沉淀各20μl，加入20μl 2X上样缓冲液，100℃煮沸5分钟。

g)取处理后样品10μl-20μl进行SDS-PAGE电泳，其余-20℃保存。

结果显示SDS-PAGE电泳在不同温度下用1mM IPTG诱导的含pET28a-Glu的大肠杆菌在约35KD处有一条明显的蛋白带。在低温条件下(15℃时)，目的蛋白占细菌总蛋白的比例较正常诱导条件下高。

②最适IPTG浓度优化(图4)

a)挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入10ml卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃培养震荡过夜。

b)取200μl菌液接种至3管10ml新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜。

c)待A600OD值约为0.5-0.6时，取未诱导菌液1ml，分别加入IPTG终浓度为0.1mmol/L、0.3mmol/L，15℃继续培养，于诱导后7小时、20小时从各管中取诱导菌液1ml。

d)将诱导组菌液和未诱导菌液，4℃10000rpm离心1分钟，弃上清，-20℃保存。

e)诱导组和未诱导组各自加入100μl PBS，混匀，超声破菌(超声10次，功率为200W，时间3秒钟，超声间隔时间3秒钟)，4℃14000rpm离心10分钟。分离上清和沉淀，在沉淀中加入100μl PBS，混匀。

f)取上清和沉淀各20μl，加入20μl 2X上样缓冲液，100℃煮沸5分钟。

g)取处理后样品10μl-20μl进行SDS-PAGE电泳，其余-20℃保存。

结果表明0.3mM IPTG诱导的样品上清中以可溶性存在的蛋白表达量最大，蛋白带最浓。0.3mM为最适合的诱导浓度。

3)金属螯合亲和层析获得预期分子量的重组蛋白的过程(图5)

①从-80℃冰箱里取出冻存的阳性克隆，在含有50μg/ml卡娜霉素的固体LB平板上划线；挑取单菌落接种于5ml液体LB培养基(含50μg/ml卡娜霉素)中，160rpm，37℃培养过夜；

②按照1：100的比例转接到500ml LB培养基(含50μg/ml卡娜霉素)，160rpm，37℃培养至OD600达到0.4-0.6，菌液经冰浴冷却10分钟，再加入终浓度0.1-0.2mM的IPTG，120rpm，16℃诱导10-16h。

③收菌：4℃，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用binding buffer洗涤一次，根据菌体的量，选择适量的bingding buffer重悬菌体。

④破碎：冰浴环境下，超声破碎条件为37％功率，破3s、停5s，30min。

⑤收集蛋白粗液：10000rpm，30min，4℃离心破碎液，收集上清，并经0.45μm过滤器过滤，冰浴备用。

⑥上样和纯化：使用1ml HisTrap FF镍柱以及AKTA purifier 10仪器进行纯化。SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度(图6)；

⑦透析。冰浴搅拌透析换液，除去咪唑；

⑧蛋白分装冻存于-80℃备用。

【实施例2】Glu重组蛋白鼻腔免疫小鼠的新型蛋白疫苗免疫效能的检测

为了评价防龋蛋白疫苗，本发明采用BALB/c小鼠为动物模型。

1、动物免疫

1)免疫策略：分组以新型重组防龋蛋白疫苗Glu，重组蛋白PAc(阳性对照)，PBS(空白对照)，PCIA-P DNA疫苗免疫接种小鼠。

2)免疫途径和方法：经鼻腔滴注，在未麻醉情况下间断缓慢、交替滴注于小鼠两侧鼻腔。

3)分组：取6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠48只，每组12只随机分成4组(每组中6只于第8周处死取脾脏，进行脾细胞上清细胞因子的检测)，分组如下：

a)PBS对照组(第0周和第2周均鼻腔接种PBS)

b)rPAc(第0周和第2周均鼻腔接种Glu)(50μg/只)

c)重组蛋白Glu(第0周和第2周均鼻腔接种GLU)(50μg/只)

d)PCIA-P DNA疫苗(第0周和第2周均鼻腔接种GLU)(50μg/只)

2、动物血清和唾液样本的收集

1)分别于免疫接种前(第0周)和初次免疫后第2、4、6、8、10、12、16、20周采集小鼠的血清和唾液样本。

2)血清采集方法：眶后静脉丛取血法，从眼外眦进针穿刺入眶后静脉丛，收集血液约100-200μl，置于室温待血液凝固后4℃静置过夜，次日4℃、4000rpm离心10分钟，小心吸取上层血清，-20℃保存备用。

3)唾液样本采集方法：腹腔注射0.2％的毛果芸香碱(0.7mg/100g体重)，用微量加样器吸取唾液，收集约250μl，4℃，4000rpm离心10分钟，收集上清并分装，-20℃保存备用。

3、ELISA检测唾液及血清中特异性抗体的水平

1)包被抗原：10μg/ml的PAc或GLU重组蛋白溶于0.05M碳酸盐缓冲液中，将10ug/ml(W/V)抗原溶液加入96孔聚苯乙烯微量酶标板(Corning公司产品，下同)，每孔100μl，4℃冰箱过夜。

2)次日弃包被液，每孔加入200ulPBS-T(PBS含0.1％Tween-20，pH 7.5，下同)洗涤5次，每次3min。

3)封闭：每孔加入200μl封闭液(含2％BSA的PBST)，37℃湿盒中封闭90min；

4)弃封闭液，每孔加入200μl PBST洗涤5次后，每次3min。

5)加待检样本：将待测血清1：50，唾液1：1用PBS稀释，混匀，每孔加入100μl，每个样本均设置复孔，37℃孵育120min。

6)弃去孔内样本溶液，每孔加入200μl PBST洗涤5次，每次3min。

7)二抗孵育：：用含3％BSA的PBST稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(H+L),辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG1,辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG2a(终浓度均为1：10000)，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgA(终浓度均为1：1000)，每孔加入100μl，置于37℃湿盒内孵育120min。

8)弃去孔内溶液，每孔加入200μl PBST洗涤5次后，每次3min。

9)底物反应：向酶标板各孔中加入显色底溶液(含0.045％H₂O₂，0.4mg/ml o-phenylenediamine dihydrochloride(OPD)的磷酸-柠檬酸盐缓冲液)，每孔100μl，37℃避光显色25min。

10)终止反应：每孔加入2M H₂SO₄50μl终止反应即刻测量波长为490nm处样本OD值，并保存读数结果。

11)标准曲线设置：

①包被抗体采用未标记羊抗小鼠IgG或者IgA抗体，溶于0.1M碳酸盐缓冲液中，每孔加入100μl，4℃冰箱过夜。

②加入待测样本操作时，设置标准曲线孔内加入用PBST缓冲液倍比稀释的标准小鼠血清，每孔加样100μl，每个样本一式两份，37℃湿盒内孵育120min。

③其他操作步骤及所用试剂均与检测样本相同，每96孔板均设置标准曲线，并与待测样本的检测同时进行。

ELISA实验根据标准曲线计算样本中的特异性抗体或细胞因子的含量，取复孔平均值，使用SPSS13.0进行统计学分析并绘制结果图，P<0.05或P<0.01为统计差异显著性检验水平。

结果表明，Glu蛋白疫苗免疫小鼠后能明显提高特异性抗体的产生水平。(图7)

4、小鼠脾细胞培养上清细胞因子水平的检测(图8)

1)小鼠脾细胞培养上清的制备

①末次免疫后6周，脱颈处死小鼠，75％乙醇中浸泡3分钟，取出小鼠放置于一次性无菌培养皿(10cm)，无菌操作下剖开腹部小心取出脾脏并去除脂肪和外膜；

②用3ml的注射器芯在尼龙网上挤压研磨脾脏，研磨过程中保证脾脏组织和尼龙网浸于预冷的RPMI-1640培养基中浸润；研磨完全后，使细胞悬液从尼龙网漏下，收集于50ml离心管中，并用RPMI-1640培养基洗涤尼龙网和研磨平皿，洗涤的细胞悬液也收集到离心管中；

③4℃，1200rpm离心8分钟，弃上清；

④沉淀中加入1ml红细胞裂解液重悬细胞，室温静置1分钟；

⑤加入预冷的RPMI-1640培养基至总体积10ml，静置1分钟使组织团块沉降；转移细胞悬液至新的15ml离心管中，沉降于50ml管底的团块不转移；

⑥4℃，1200rpm离心8分钟，弃上清；

⑦5ml的R10培养基重悬细胞沉淀；

⑧细胞计数并根据计数结果调整至细胞浓度为5×10⁶/ml，加入12孔板中，每孔500μl，每个样本均设置复孔，37℃，5％CO₂培养箱静置过夜；

⑨每孔加入500μl含Glu或PAc重组蛋白的R10培养基(rPAc终浓度为20μg/ml)；

⑩37℃，5％CO₂培养箱培养48小时，收集细胞，2000rpm离心10分钟，吸取细胞培养上清并分装，-20℃保存备用；

2)脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ、IL-4的检测(图8)：

①提前20分钟将检测小鼠IFN-γ、IL-4的ELISA试剂盒内板条从4℃冰箱取出，放置至室温；

②未稀释的细胞培养上清加入孔内(100ug/孔)，同时加入梯度稀释的不同浓度的标准品(浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/ml),同样每孔100μl，空白孔加入100μl标本通用稀释液。每个样本设三个复孔。用封板胶将孔板封住后，置37℃孵育90分钟；

③每孔加入300μl洗涤液，洗板5次，每次约30秒，甩尽洗涤液，并在吸水纸上拍干；

④每孔加入100μl生物素化抗体工作液，空白孔加入生物素化抗体稀释液，再用封板胶纸封住板孔，置37℃孵育60分钟；

⑤每孔加入300μl洗涤液，再洗板5次，每次约30秒，甩尽洗涤液，并在吸水纸上拍干；

⑥每孔加入100μl酶结合物工作液，空白孔加入酶结合物稀释液，再用封板胶纸封住板孔，置37℃避光孵育30分钟；

⑦再按上述洗涤方法洗板5次；

⑧每孔加100μl显色底物(TMB),37℃避光孵育15分钟,并预热酶标仪，设置好检测程序；

⑨每孔加100μl终止液并于3分钟内即可测量OD450值，保存读数结果以备统计学分析。

在各实验组中脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平和阴性对照组比较虽未有显著的统计学差异，但从趋势上看，DNA疫苗免疫组，所分泌的IFN-γ相对较低而IL-4水平相对较高，提示该组免疫方式可能诱导Th2型免疫反应。而当使用GLU或rPAc蛋白疫苗免疫后，出现了IFN-γ的分泌在此基础上相对升高而IL-4水平相对降低的现象，可推测，GLU蛋白疫苗在此免疫过程中介导了Th1型为主的免疫应答。由此可见，新型的防龋蛋白疫苗GLU可有效的诱导Th1型免疫反应，增强防龋疫苗的免疫效能。

Claims (1)

1.一种防龋齿蛋白疫苗的制备方法，该疫苗的活性成分为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，其特征在于：主要包含如下步骤：

1)通过PCR方法，从变形链球菌UA159基因组扩增水不溶性葡萄糖基转移酶葡萄糖结合区Glu基因片段，扩增引物序列如下：

上游引物

5′-CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3′

下游引物

5′-CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3′

2)将所述Glu基因片段构建到含有6-His组氨酸标签的表达载体上，得到重组质粒，转化至表达菌，酶切鉴定；

3)诱导表达可溶性的重组蛋白：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜，增菌，待A600OD值约为0.4-0.6时，加入IPTG终浓度为0.3mmol/L，15℃继续培养16小时；

4)纯化步骤3获得的重组蛋白：4℃，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用binding buffer洗涤一次，根据菌体的量，选择适量的binding buffer重悬菌体；冰浴环境下，超声破碎，收集蛋白粗液；10000rpm，30min，4℃离心破碎液，收集上清，并经0.45um过滤器过滤，冰浴备用；使用1ml HisTrap FF镍柱以及AKTA purifier 10仪器进行纯化，SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度。