CN106596822A - 一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其步骤包括：1）根据目标物的分子量找出对应的色谱峰，并结合Mascot在线搜索，明确目标物的氨基酸序列。优化质谱条件建立各个苯酚可溶性调控蛋白的定量分析方法；2）建立不同基质的样品的预处理技术，并用高效液相色谱串联质谱检测样品中目标物含量；3）将合成的高纯度多肽作为标准样品用作定量分析；4）建立不同基质的样品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白随着生长时间的浓度变化曲线。该食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法具有前处理过程简单、检验快速、结果准确、选择性好和灵敏度高的特点。

Description

一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是人体皮肤和鼻腔常见的定植菌，既可引起局部化脓性感染，也可引起全身性感染。它不仅是重要的临床与社区获得性致病菌，也是人类第二大食源性致病菌。

金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白（PSMs）是Wang等人在2007年用热苯酚从高致病性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的培养液中提取的七种新的小肽。PSMs基因定位于细菌核心基因组，是典型的α-helix结构，表现出似于表面活性剂的两亲性质。其表达受到Agr系统的严格调控，通过不依赖于RNAIII的新途径在对数生长后期大量表达，并通过金黄色葡萄球菌表面特有的Pmt通道向胞外分泌。PSMs按照肽段大小和基因组定位可分为α型与β型，其中α型包括定位于PSMα操纵子的PSMα1-4，以及定位于附属基因调控系统关键调控分子RNAIII基因内的δ毒素；β型包括定位于PSMβ操纵子的PSMβ1和PSMβ2。

研究表明，低浓度的PSMs可导致免疫细胞趋化与炎症反应，高浓度的PSMs则能溶解许多人类细胞，可破坏中性粒细胞、树突细胞等免疫细胞、红细胞等血细胞以及白细胞。此外，PSMs能够促进生物被膜的形成，有利于细菌对抗抗生素与宿主的免疫防御机制。同时，PSMs有一定的抑菌活性，它可能是金黄色葡萄球菌获得环境竞争优势的关键分子，帮助其在特定环境如食品、皮肤、鼻腔中定植发挥重要作用。因此，建立食品中金黄色葡萄球菌的新毒力因子PSMs的定性定量分析方法，有利于研究其致病机制，具有重要的实际意义。

目前，国内外关于金黄色葡萄球菌PSMs的检测方法研究较少，仅有质谱成像技术和液相-离子阱/三重四极杆质谱法。前者前处理要求较高，操作较为繁琐，且主要用于定性分析。后者分辨率较低，质荷比仅可精确到1Da，无法将质荷比极为接近的干扰物分离，且两种方法都只做了培养液中金黄色葡萄球菌PSMs，并没有应用到实际样品测定中。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是建立一种食品中金黄色葡萄球菌PSMs的分析方法，从而为PSMs的致病机制研究提供一个新途径。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

1、菌株接种

将保存在甘油中的金黄色葡萄球菌与TSB培养液以1:100（V/V）均匀混合，振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100 µL，加至2 g肉、蔬菜、牛奶或果汁中。

2、样品提取

用正丁醇提取PSMs，振荡2 h（37℃，200 rpm），转移有机相至空白管，常温下氮气吹干，超纯水复溶，用孔径为0.22 µm的滤膜过滤。

3、液质分析

（1）色谱条件

色谱柱：Zorbax 300Å SB-C₈ (3.5 µm, 2.1×150 mm, Agilent) ；

流动相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：乙腈；

梯度程序：0-2.5 min，10%B; 2.5-5 min, 50%B;5-20 min, 50%B-90%B；

进样量：5 µL；

柱温：30℃。

（2）质谱条件

离子化模式：Dual AJS ESI （+）；

质量扫描范围：100-3200 m/z；

毛细管出口电压：175 V；

干燥器温度：325℃，干燥器流速：10 L/min；

鞘气温度：350℃，流速：7.5 L/min；

毛细管电压：4000 V；

碰撞电压：PSMα1(60 V)，PSMα2(55 V)，PSMα3(65 V)，PSMα4(65 V)， δ-toxin(65 V)。

4、PSMs的定性定量离子质荷比

PSMs的定性定量离子质荷比如表1所示。其中d表示目标离子电荷数为2，t表示目标离子电荷数为3。

本发明技术效果主要体现在以下方面：飞行时间质谱是高分辨率质谱，质量精度可达到小数点后第四位，一方面，可以得到目标物的精确质量，另一方面，对目标离子进行二级质谱扫描，得到碎片信息及图谱，结合Mascot在线搜索，即可知道目标物的氨基酸序列。同时，在合成多肽的基础上，建立食品中PSMs的定量分析方法，在复杂的食品基质中，飞行时间质谱的高分辨率可以将杂质与目标物完全分离，且样品前处理较为简单。

附图说明

图1是标准菌株TSB培养液中PSMα1-4及δ-toxin色谱图；

图2是PSMα1-4及δ-toxin一级质谱图；

图3 是PSMα1-4及δ-toxin二级质谱图；

图4 是Mascot在线数据库SwissProt中匹配出的PSMα1-4及δ-toxin氨基酸序列；

图5是实施例1得到的色谱图；

图6是不同食品介质中PSMα1随着生长时间的浓度变化曲线。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步详述，以使本发明技术方案更易于理解和掌握。

参阅图1-4所示，一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，将金黄色葡萄球菌加入食品或培养基中，过夜生长，用正丁醇提取，转移正丁醇层，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，0.22 µm微孔滤膜过滤，以甲酸溶液-乙腈体系为流动相，经液相色谱柱分离后，用质谱仪得到的离子信息和图谱，结合Mascot在线搜索进行定性分析，用液质进行定量分析，所述质谱仪为四极杆串联飞行时间质谱，所述食品为肉、奶制品、果汁和蔬菜，所述色谱条件如下：色谱柱：Zorbax 300Å SB-C₈(3.5 µm,2.1×150 mm,Agilent)；流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈；梯度程序：0-2.5 min，10%B; 2.5-5 min, 50%B;5-20 min,50%B-90%B；进样量：5 µL；柱温：30℃；所述质谱条件如下：离子化模式：Dual AJS ESI（+）；质量扫描范围：100-3200 m/z；毛细管出口电压：175 V；干燥器温度：325℃，干燥器流速：10L/min；鞘气温度：350℃，流速：7.5 L/min；毛细管电压：4000 V；碰撞电压：PSMα1(60 V)，PSMα2(55 V)，PSMα3(65 V)，PSMα4(65 V)，δ-toxin(65 V)。

实施例一：美汁源果粒橙中PSMs的液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱检测方法

取保存在甘油中的食源性金黄色葡萄球菌10 µL，加入TSB培养液1 mL，混合均匀，放入恒温培养振荡器中振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100µL，加至2 g美汁源果粒橙中，振荡（37℃，200 rpm）16 h。将果汁培养体系放入高速离心机中，离心5 min，提取上清液1 mL，加入0.5 mL正丁醇，振荡2 h（37℃，200 rpm），转移有机相至空白管，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，孔径为0.22 µm的滤膜过滤。取过滤液进样，按照发明内容中的色谱质谱条件分析样品。图5为实验得到的色谱图。

实施例二：不同食品中PSMα1的变化曲线探究结果

为了探究不同食品中PSM的生长速度，本研究分别在不同介质的培养基TSB培养液、牛奶和猪肉中接种金黄色葡萄球菌。并在接种后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48h分别测定PSMα1的浓度。PSMα1的浓度变化曲线如图6所示。由图可知，PSMα1在液体培养介质TSB培养液和牛奶中的增长速度较快，在灭菌煮肉中的增长速度较慢。

实验具体操作如下：

TSB培养液：取保存在甘油中的食源性金黄色葡萄球菌10 µL，加入TSB培养液1 mL，混合均匀，放入恒温培养振荡器中振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100 µL，加至2 g TSB培养液中，振荡（37℃，200 rpm）。分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8h、16 h、24 h、32 h、48 h后将TSB培养液放入高速离心机中，离心5 min，提取上清液1 mL，加入0.5 mL正丁醇，振荡2 h（37℃，200 rpm），转移有机相至空白管，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，孔径为0.22 µm的滤膜过滤。取过滤液进样，按照发明内容中的色谱质谱条件分析样品。

牛奶：取保存在甘油中的食源性金黄色葡萄球菌10 µL，加入TSB培养液1 mL，混合均匀，放入恒温培养振荡器中振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100 µL，加至2 g 牛奶中，振荡（37℃，200 rpm）。分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16h、24 h、32 h、48 h后加入乙腈除沉淀蛋白，高速冷冻离心除脂肪，提取水层清液1 mL，加入0.5 mL正丁醇，振荡2 h（37℃，200 rpm），转移有机相至空白管，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，孔径为0.22 µm的滤膜过滤。取过滤液进样，按照发明内容中的色谱质谱条件分析样品。

猪肉：取保存在甘油中的食源性金黄色葡萄球菌10 µL，加入TSB培养液1 mL，混合均匀，放入恒温培养振荡器中振荡（37℃，200 rpm），过夜生长。称取2 g新鲜猪肉，在高温灭菌锅中灭菌。取过夜生长的金黄色葡萄球菌菌液100 µL，加至灭菌后的猪肉中，振荡（37℃，200 rpm）。分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h后加入0.5 mL正丁醇，振荡2 h（37℃，200 rpm），加入乙腈沉淀蛋白，冷冻离心除脂肪，提取正丁醇层清液，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，孔径为0.22 µm的滤膜过滤。取过滤液进样，按照发明内容中的色谱质谱条件分析样品。

本发明技术效果主要体现在以下方面：飞行时间质谱是高分辨率质谱，质量精度可达到小数点后第四位，一方面，可以得到目标物的精确质量，另一方面，对目标离子进行二级质谱扫描，得到碎片信息及图谱，结合Mascot在线搜索，即可知道目标物的氨基酸序列。同时，在合成多肽的基础上，建立食品中PSMs的定量分析方法，在复杂的食品基质中，飞行时间质谱的高分辨率可以将杂质与目标物完全分离，且样品前处理较为简单。

当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其特征在于：将金黄色葡萄球菌加入食品或培养基中，过夜生长，用正丁醇提取，转移正丁醇层，常温下氮气吹干，用超纯水复溶，0.22 µm微孔滤膜过滤，以甲酸溶液-乙腈体系为流动相，经液相色谱柱分离后，用质谱仪得到的离子信息和图谱，结合Mascot在线搜索进行定性分析，用液质进行定量分析。

2.如权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其特征在于：所述质谱仪为四极杆串联飞行时间质谱。

3.如权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其特征在于：所述食品为肉、奶制品、果汁和蔬菜。

4.如权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其特征在于：所述色谱条件如下：

色谱柱：Zorbax 300Å SB-C₈(3.5 µm,2.1×150 mm,Agilent)；

流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈；

梯度程序：0-2.5 min，10%B; 2.5-5 min, 50%B;5-20 min, 50%B-90%B；

进样量：5 µL；

柱温：30℃。

5.如权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法，其特征在于：所述质谱条件如下：

离子化模式：Dual AJS ESI（+）；

质量扫描范围：100-3200 m/z；

毛细管出口电压：175 V；

干燥器温度：325℃，干燥器流速：10 L/min；

鞘气温度：350℃，流速：7.5 L/min；

毛细管电压：4000 V；

碰撞电压：PSMα1(60 V)，PSMα2(55 V)，PSMα3(65 V)，PSMα4(65 V)，δ-toxin(65 V)。