CN104483409A - 一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，采用高效液相色谱法对34株金黄色葡萄球菌和20株非金黄色葡萄球菌建立菌体细胞萃取物色谱图，通过比较确定了金黄色葡萄球菌的特征峰。以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为内标物(特征峰)，将特征峰与标准峰的相对保留时间作为数据基础建立金黄色葡萄球菌指纹图谱，将两类指纹图谱的相关系数分布进行分析比较确定限值，构建出指纹图谱的计算方法，从而用于菌种鉴定；该方法在对金黄色葡萄球菌的识别具有一定的可行性、该方法操作简单、耗时短、特异性好，为快速识别检测金黄色葡萄球菌构建了一个新的稳定的技术平台，同时为微生物的识别检测开拓全新的鉴定方法。

Description

一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法

技术领域

本发明涉及菌种鉴别领域，具体涉及一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus SA)是世界上公认的一种重要的食源性病原菌。其广泛存在于在自然界中，作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物暴露的鼻腔、咽喉、毛发上。一方面金黄葡萄球菌可引起局部化脓性炎症，另一方面它可在污染的食品中生长繁殖，可产生肠毒素，引起食物中毒。加强对食品中金黄色葡萄球菌的检测力度是解决该菌污染食品导致食品安全问题的最有效的途径。目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌主要采用传统的分离、培养、生化鉴定的方法，其操作繁琐，检测周期长，已经不能满足食品中致病菌快速检测的需要。而PCR、LAPM技术等分子方法的技术含量比较高，对人员操作、仪器条件及检样环境均有较高的要求，并且容易出现假阳性的检测结果，仍不能满足实际检测的需求。虽然市场上出现了商业产品化的金黄色葡萄球菌快速测试片，但因时有出现判读错误而造成误差的情况，导致不能进行广泛的普及。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，以金黄色葡萄球菌标准菌株和筛选菌株中为研究对象，建立金黄色葡萄球菌指纹图谱，并利用该菌指纹图谱检测食品中金黄色葡萄球菌的污染情况。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，包括如下步骤：

S1、未知菌培养：将未知菌取适量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，得菌悬液；

S2、菌体富集：将步骤S1所得的菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，得到富集的菌体；

S3、菌体清洗：将灭菌的0.9％的生理盐水加入步骤S2所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，达到清洗菌体的目的；

S4、菌体破碎：将10mL的色谱甲醇加入到步骤S3所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，制成菌悬液，将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，取上清备用。

S5、样品制备：用旋转蒸发仪将步骤S4所得的混合液浓缩至1-2mL，经0.45μm有机相微孔滤膜过滤；

S6、流动相确定：将待测样品注入高效液相色谱仪，分别以不同比例溶剂系统和不同梯度洗脱进行实验，记录色谱图，选择所得色谱图分离度较好，色谱峰数目也较多的流动相条件，确定流动相为：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度程序(min/B％)为：0-15min为90％-80％；15-20min为80％-65％；20-35min为65％-5％；35-40min为5％-0％；

S7、检测波长确定：由于蛋白质(标准品SPA)对紫外的最大吸收波长为280nm，而本实验从金黄色葡萄球菌菌体细胞所提取萃取物较为复杂，所以选定分别在210nm、240nm和280nm检测波长下将待测样品注入高效液相色谱仪测定色谱图，同时进行全波长扫描，对不同波长下图谱进行叠加、比较分，确定紫外检测器的检测波长为：280nm；

S8、流动相流速和色谱柱温度确定：改变流动相的流速，分别为0.5ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min，记录色谱图，观察色谱方法中流速对色谱峰保留时间和峰形的影响，确定流速为：0.8mL/min；改变色谱柱的温度，由于柱温过低容易造成色谱柱堵塞，故不可设定过低温度，遂将柱温分别为25℃、30℃、35℃，40℃，并记录色谱图，确定柱温为：30℃；

S9、进样量确定：改变进样量大小，分别为10μl、20μl，并记录色谱图，观察进样量过小时会导致色谱图峰响应值过小或者没有响应值，进样量过大是否会则导致峰形变化，有没有峰面积误差以及潜在柱过载现象出现，柱分离能力在何种进样量下更高，依据以上标准选择适宜的进样量，确定进样量为：20μL；

S10、在上述确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别调节34株金黄色葡萄球菌数量级10³cfu/mL(与接种的金黄色葡萄球菌保持一致的OD值)，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，并分别精密吸取各待测样品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，初步建立金黄色葡萄球菌指纹图谱色谱图；

S11、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出菌株RS05，RS08，RS30三株屎肠球菌，同样以10³cfu/mL数量级，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行对比；

S12、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出17株非金黄色葡萄球菌的细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行比对，找出金黄色葡萄球菌特有的色谱峰；

S13、指纹图谱匹配和相似度计算：

首先，在确定共有色谱峰和SPA内标物标准峰的前提下，对34株金黄色葡萄球菌的共有峰的保留时间计算平均值，计算出每个峰的可信度φ；其次，在确定每个所选出的共有峰及标准峰具有可用性的条件下，计算34株金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r；最后，对19株非金黄色葡萄球菌菌株色谱图计算相似度。

其中，所述每个峰的可信度φ的计算公式为：

$\mathrm{\φ}=\frac{\frac{\mathrm{\Σ}|x_i-\stackrel{\‾}{x_i}|}{n}}{\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x_i-\stackrel{\‾}{x_i})}^2}{n-1}}}$

式中，x_i代表第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间；则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值；n为样本数。

其中，所述金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r的计算公式为：

$r=\frac{\frac{\mathrm{\Σ}|x_j-s|}{n}}{\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x_j-s)}^2}{n-1}}}$

式中，x_j依依旧代表第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间；s则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值；n为一个样本中峰的个数。

本发明具有以下有益效果：

采用高效液相色谱法对34株金黄色葡萄球菌和20株非金黄色葡萄球菌建立菌体细胞萃取物色谱图，通过比较确定了金黄色葡萄球菌的特征峰。以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为内标物(特征峰)，将特征峰与标准峰的相对保留时间作为数据基础建立金黄色葡萄球菌指纹图谱，将两类指纹图谱的相关系数分布进行分析比较确定限值，构建出指纹图谱的计算方法，从而用于菌种鉴定。在指纹图谱构建过程中，分别对金黄色葡萄球菌菌体细胞萃取物的累积、提取以及其液相色谱条件进行优化，并对金黄色葡萄球菌鉴定方法进行了评价和应用。优化确定了菌体细胞萃取物的提取条件；该方法在对金黄色葡萄球菌的识别具有一定的可行性、该方法操作简单、耗时短、特异性好，为快速识别检测金黄色葡萄球菌构建了一个新的稳定的技术平台，同时为微生物的识别检测开拓全新的鉴定方法。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的菌株详见表1所示。

表1 试验用菌株

本实施例中采用的试剂为“

培养基为：

营养琼脂(Nutrient Agar，NA)

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，按上述成分混合调pH至7.2±0.2，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。

营养肉汤(Nutrient Broth，NB)

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，按上述成分混合调pH至7.4±0.2，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。

7.5％氯化钠肉汤培养基(7.5％Nutrient Broth)

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠75g，蒸馏水1000mL，按上述成分混合调pH至7.4±0.2，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。

加富培养基(0.1％酵母浸膏入营养肉汤)

酵母浸膏1g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，按上述成分混合调pH至7.2±0.2，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。

菌株鉴定中所用到的各种生理生化试剂，如灭菌0.9％生理盐水、血平板、Baird-Parker琼脂平板、革兰氏染色液等。

本具体实施所使用的仪器与设备为：

(1)高效液相色谱仪：Agilent 1200型(安捷伦公司，美国加州帕罗阿托市)，配备载物台、在线脱气机、四元输液泵、自动进样器、柱温箱、光电二极管阵列检测器以及Agilent Chemstation色谱工作站，色谱柱分别使用Agilent C18(4.6mm×25mm，5μm)、氨基柱XB-NH(4.6mm×25mm，5μm)。

(2)反压高温灭菌锅：广州来邦机电科技有限公司；DL-CJ医用型洁净工作台：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；LRH-250A生化培养箱：广东省医疗器械厂；LG-100B理化干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；恒温振荡摇床；XSZ-G型电子显微镜：重庆光学仪器厂；3K15离心机：德国SIGMR公司；WH-861漩涡震荡器：华丽达；JY 96-IIN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KQ-200DB型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；SHD-III型循环水多用真空泵：保定高新区阳光科教仪器厂；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

实施例

先用金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC26073和CMCC26003对各项条件进行摸索。

①菌体富集：将150-200mL菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，得到富集的菌体。

②菌体清洗：将灭菌的0.9％的生理盐水加入沉淀的菌体，漩涡震荡以再次使菌体悬浮，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，达到清洗菌体的目的。

③菌体破碎：将10mL的色谱甲醇加入到沉淀物的菌体中，漩涡震荡以再次使菌体悬浮，制成菌悬液，将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，取上清备用。将三四合并，

④样品制备：用旋转蒸发仪浓缩至1-2mL，进样前经0.45μm有机相微孔滤膜过滤。

色谱分析方法确定

(1)流动相确定：将待测样品注入高效液相色谱仪，分别以甲醇-水，乙腈-水，乙腈-水-甲酸(0.05％)，乙腈-水-磷酸(0.05％)，等不同比例溶剂系统和不同梯度洗脱进行实验，记录色谱图。选择所得色谱图分离度较好，色谱峰数目也较多的流动相条件。

(2)检测波长确定：由于蛋白质(标准品SPA)对紫外的最大吸收波长为280nm，而本实验从金黄色葡萄球菌菌体细胞所提取萃取物较为复杂，所以选定分别在210nm、240nm和280nm检测波长下将待测样品注入高效液相色谱仪测定色谱图，同时进行全波长扫描。并对不同波长下图谱进行叠加、比较分析。结果最终确定检测波长为色谱图中色谱峰数目较多，各峰响应值较大，且分离度较好(R≥1.5)的波长。

(3)色谱柱优化

C₁₈柱的色谱条件

流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈。

表2 C₁₈柱流动相梯度

氨基柱的色谱条件

流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈。

表3 氨基柱流动相梯度

梯度洗脱程序的确定：在实验过程中不断调整梯度洗脱程序，最终确定分离度较良好的梯度条件。

(4)流动相流速和色谱柱温度确定：在实验过程中改变流动相的流速，0.5ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min，记录色谱图，观察色谱方法中流速对色谱峰保留时间和峰形的影响。在实验过程中改变色谱柱的温度，由于柱温过低容易造成色谱柱堵塞，故不可设定过低温度，遂将柱温分别为25℃、30℃、35℃，40℃，并记录色谱图。

(5)进样量确定：在实验过程中改变进样量大小，10μl、20μl，并记录色谱图。观察进样量过小时会导致色谱图峰响应值过小或者没有响应值，进样量过大是否会则导致峰形变化，有没有峰面积误差以及潜在柱过载现象出现，柱分离能力在何种进样量下更高，依据以上标准选择适宜的进样量。

样品前处理条件优化

(1)培养基优化

将金黄色葡萄球菌的标准菌株CMCC26073和CMCC26003接种于营养琼脂斜面上，37℃培养过夜；然后从营养琼脂斜面上挑取一环已活化好的金黄色葡萄球菌，将其平行接种于营养肉汤、7.5％氯化钠肉汤培养基和0.1％酵母浸膏入营养肉汤三种新鲜无菌的培养基中(200mL)，以此方法，分别37℃过夜摇床培养24h备用。对三种培养基培养出的菌体共萃物进行液相色谱分析进行比较，最终根据图谱效果确定最好培养方法。

(2)培养基时间优化

取培养过夜的菌液调节菌数数量级为10⁵cfu/mL，确定按2％的接种量接种于5mL上一步优化出来的新鲜无菌的培养基中混匀，置于37℃培养，从接种开始至24h之间，每隔2h取一次样，测量吸光值(OD值)，用未接种的营养肉汤培养基溶液作空白对比。从而做出金黄色葡萄球菌生长曲线。选择处于生长旺盛时期的金黄色葡萄球菌，进行色谱分析。

(3)菌体洗涤溶液优化

将摇床培养了10至12小时的菌悬液离心去上清后，可以的到大量富集的菌体，分别使用无菌0.9％氯化钠水溶液和无菌水对富集的金黄色葡萄球菌菌体进行洗涤。以去除菌体表面及菌体间仍存有培养基液体等一些含有丰富营养物质及代谢产物的液体，避免这些非金黄色葡萄球菌胞内物质在后续处理中混入细胞萃取物，减少无关组分的存在对实验结果的影响，本实验对富集的菌体进行洗涤处理。

(4)浸提溶液和离心条件的优化

提取方法优化

①将150-200mL菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下分别以离心力6654g，离心6min；离心力3742g，离心8min；离心力1664g，离心10min弃去上清，得到富集的菌体。

②将灭菌的0.9％的生理盐水加入沉淀的菌体，漩涡震荡以再次使菌体悬浮，在4℃下以离心力6654g，离心6min，弃去上清，操作两次以达到清洗菌体的目的。

③分别将10mL的色谱甲醇、色谱乙醇、50％甲醇、50％乙醇和纯水加入到沉淀物的菌体中，漩涡震荡以再次使菌体悬浮，制成菌悬液备用。

④将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下分别以离心力6654g，离心6min；离心力3743g，离心8min；离心力1664g，离心10min取上清备用。

⑤用旋转蒸发仪浓缩至1-2mL，进样前经0.45μm微孔滤膜过滤。

(5)破碎方法及时间的优化

通过比较各种破碎方法及时间的液相色谱图，得到最好的破碎方法和提取时间。

①反复冻融法收集菌悬液，在4℃下低温离心(离心力3743g，离心5min)，弃去上清液，加一定量(200μL)PBS，轻轻吹打混匀。在-20℃下冷冻30min或利用液氮冷冻，然后再在常温37℃、50℃、65℃、100℃下解冻，溶解后震荡，再次冷冻，冻融三至四次。进样，记录色谱图

②菌体研磨破碎收集菌悬液，在4℃下低温离心(离心力3743g，离心5min)，弃去上清液，75℃烘干12h，得干菌体备用。准确称取0.1g干菌体放入研钵，加入0.5g石英砂研磨10分钟。进样，记录色谱图

③超声清洗仪破碎收集沉淀的菌体，加入10mL甲醇，漩涡震荡制成菌悬液，使用超声波清洗仪，以90％功率，30min完成破碎浸提过程。进样，记录色谱图

④超声波细胞破碎仪破碎法收集沉淀的菌体，加入10mL甲醇，漩涡震荡制成菌悬液，使用细胞破碎仪，以50％功率，分设2.5min、5min、7.5min和10min破碎，完成破碎浸提过程。分别进样，记录色谱图

金黄色葡萄球菌谱特征峰的建立

根据上述最终确定的条件分析表4中的菌株，记录液相色谱图，将非标准菌株与用于条件摸索的菌株CMCC26073，CMCC26003的色谱图进行重叠比较，最终确立金黄色葡萄球菌的共有色谱峰(特征峰)及SPA标准峰，并计算出各峰的平均保留时间。

金黄色葡萄球菌指纹图谱对比分析

在上述确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别调节34株金黄色葡萄球菌(如下表)数量级10³cfu/mL(与接种的金黄色葡萄球菌保持一致的OD值)，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤。并分别精密吸取各待测样品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，初步建立金黄色葡萄球菌指纹图谱色谱图。

表4 试验用金黄色葡萄球菌菌株

球菌属指纹图谱对比分析

在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出菌株RS05，RS08，RS30三株屎肠球菌，同样以10³cfu/mL数量级，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA。并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行对比。

非球菌属指纹图谱对比分析

在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出17株非金黄色葡萄球菌的细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA。并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行比对，找出金黄色葡萄球菌特有的色谱峰。

表5 试验用非金黄色葡萄球菌菌株

指纹图谱匹配和相似度计算

首先，在确定共有色谱峰和SPA内标物标准峰的前提下，对34株金黄色葡萄球菌的共有峰的保留时间计算平均值，根据公式1计算出每个峰的可信度φ。其次，在确定每个所选出的共有峰及标准峰具有可用性的条件下，利用公式2计算34株金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r。最后，对19株非金黄色葡萄球菌菌株色谱图计算相似度。根据金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的相似度差别，判定金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的相似度界限，从而运用菌株共萃物的色谱图，即菌株指纹图谱鉴，鉴定金黄色葡萄球菌的存在与否。

公式1中φ为各个峰在34峰金黄色葡萄球菌指纹图谱中的相关系数，可认为是各个峰的可信度。x_i代表第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间，则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值。n为样本数，在本实验中为34

公式2中r为各个金黄色葡萄球菌指纹图谱在34金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中的相关系数，可认为是各个样本的可信度。x_j依旧代表第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间，s则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值。n为一个样本中峰的个数，在本实验中为15.

实施例1

食品中常见细菌图谱与金黄色葡萄球菌谱比较以及混菌鉴定

金黄色葡萄球菌经常容易侵染的食品主要是肉、蛋、奶等高蛋白的食物。而这些食物中同时容易被大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌以及阪崎肠杆菌等致病微生物感染。在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取筛选出以上提及的菌株的和金黄色葡萄球菌分别与以上各种混合培养的菌体细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤。并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图与保留时间，与金黄色葡萄球菌图谱进行比对，进一步得出金黄色葡萄球菌指纹图谱用于鉴定的可行性。

实施例2

双盲试验验证指纹图谱准确性

为了排除无意识地暗示(unintentional physical cues)或观察者偏爱(observer bias)对研究结果的影响。本实验在验证金黄色葡萄球菌指纹图谱在鉴定检验金黄色葡萄球菌存在与否的准确性时，选择采取双盲制试验。在实验者不知情的情况下将金黄色葡萄球菌随机人工污染牛奶样品，并做好记录，当实验结束球所有数据记录并分析完毕后，实验者方可知道哪些牛奶样品是污染的，哪些牛奶样品是未被污染的。

从市场上买来巴氏消毒的鲜牛奶。均按国家标准GBT 4789.10-2010《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》检测证实不含有金黄色葡萄球菌。对于需要人工污染的牛奶样品称取1.0g数量级为8.1×10⁵cfu/mL的菌落，加入100ml巴氏消毒的鲜牛奶中，37℃摇床过夜培养14h。对于不需要人工污染的牛奶样品，直接将买来巴氏消毒的鲜牛奶放置4℃保存，备用。在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取培养14h获得的杂菌细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤。并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，与金黄色葡萄球菌色谱图进行对比。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、未知菌培养：将未知菌取适量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，得菌悬液；

S2、菌体富集：将步骤S1所得的菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，得到富集的菌体；

S3、菌体清洗：将灭菌的0.9％的生理盐水加入步骤S2所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，达到清洗菌体的目的；

S4、菌体破碎：将10mL的色谱甲醇加入到步骤S3所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，制成菌悬液，将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，取上清备用。

S5、样品制备：用旋转蒸发仪将步骤S4所得的混合液浓缩至1-2mL，经0.45μm有机相微孔滤膜过滤；

S6、流动相确定：将待测样品注入高效液相色谱仪，分别以不同比例溶剂系统和不同梯度洗脱进行实验，记录色谱图，选择所得色谱图分离度较好，色谱峰数目也较多的流动相条件，流动相为：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度程序(min/B％)为：0-15min为90％-80％；15-20min为80％-65％；20-35min为65％-5％；35-40min为5％-0％；

S7、检测波长确定：分别在210nm、240nm和280nm检测波长下将待测样品注入高效液相色谱仪测定色谱图，同时进行全波长扫描，对不同波长下图谱进行叠加、比较分，确定紫外检测器的检测波长为：280nm；

S8、流动相流速和色谱柱温度确定：改变流动相的流速，分别为0.5ml/min、0.8ml/min、1.0mi/min，记录色谱图，观察色谱方法中流速对色谱峰保留时间和峰形的影响，确定流速为：0.8mL/min；改变色谱柱的温度，分别为25℃、30℃、35℃，40℃，并记录色谱图，确定柱温为：30℃；

S9、进样量确定：改变进样量大小，分别为10μl、20μl，并记录色谱图，观察进样量过小时会导致色谱图峰响应值过小或者没有响应值，进样量过大是否会则导致峰形变化，有没有峰面积误差以及潜在柱过载现象出现，柱分离能力在何种进样量下更高，依据以上标准选择适宜的进样量，确定进样量为：20μL；

S10、在上述确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别调节34株金黄色葡萄球菌数量级10³cfu/mL，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，并分别精密吸取各待测样品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，初步建立金黄色葡萄球菌指纹图谱色谱图；

S11、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出菌株RS05，RS08，RS30三株屎肠球菌，同样以10³cfu/mL数量级，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行对比；

S12、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出17株非金黄色葡萄球菌的细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行比对，找出金黄色葡萄球菌特有的色谱峰；

S13、指纹图谱匹配和相似度计算：

首先，在确定共有色谱峰和SPA内标物标准峰的前提下，对34株金黄色葡萄球菌的共有峰的保留时间计算平均值，计算出每个峰的可信度φ；其次，在确定每个所选出的共有峰及标准峰具有可用性的条件下，计算34株金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r；最后，对19株非金黄色葡萄球菌菌株色谱图计算相似度。

2.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，其特征在于，所述每个峰的可信度φ的计算公式为：

$\mathrm{\φ}=\frac{\frac{\mathrm{\Σ}|x_i-\stackrel{\‾}{x_i}|}{n}}{\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x_i-\stackrel{\‾}{x_i})}^2}{n-1}}}$

式中，x_i代表第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间；则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第i个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值；n为样本数。

3.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r的计算公式为：

$r=\frac{\frac{\mathrm{\Σ}|x_j-s|}{n}}{\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x_j-s)}^2}{n-1}}}$

式中，x_j依依旧代表第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间；s则代表34个金黄色葡萄球菌指纹图谱样本中第j个峰对于标准峰SPA峰的相对保留时间的平均值；n为一个样本中峰的个数。