CN109946367A - 一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。该方法包括：采用MALDI‑TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；采用mascot搜索引擎将MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1进行比对，如果MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。该方法操作简便，可快速准确地鉴别耐药菌和敏感菌，整个流程不超过10分钟，具有耗时短、灵敏度高、特异性高的优点，可为临床治疗由该类细菌引起的严重感染争取宝贵的时间。

Description

一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，特别涉及一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。

背景技术

自1928年英国科学家亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，抗菌药物的应用使得全球每年有数千万人受益。随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌不断涌现，“超级细菌”的产生和快速传播使得细菌耐药已成为国内、外高度关注的重大公共卫生问题之一。高效、便捷、实用性强的耐药细菌检测方法对于大规模监测细菌耐药、探究耐药机制、防控耐药细菌流行传播十分重要。

细菌药物敏感性试验是目前国内、外临床和实验室最常用的细菌耐药性检测方法，有纸片法、琼脂稀释法、肉汤稀释法、浓度梯度法等，其中除纸片法外，其余方法均可以获得相对精确的药物最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。近十几年来，借助工业技术的创新，已出现商品化自动药敏检测及分析系统，由于其操作流程的自动化和标准化，目前广泛应用于临床抗感染诊断和治疗以及基层实验室细菌耐药性的日常检测。上述这些方法经典稳定，但都有各自的局限性。一方面上述几种方法操作繁琐、时间长、灵敏度低、特异性差、整个过程影响因素较多；另一方面药物选择的灵活性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。

本发明所提供的鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，具体可包括如下步骤：

(a)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；

(b)采用mascot搜索引擎，将步骤(a)获得的所述MALDI指纹图谱与79AA特征序列进行比对，所述79AA特征序列如SEQ ID No.1所示，根据比对结果按照如下确定所述待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株(即为或候选为药物敏感菌株)。其中，采用mascot搜索引擎将所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列进行比对后，若所得菌株鉴定分值大于等于50分，视为所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配；若所得菌株鉴定分值小于50分，视为所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配。

在步骤(a)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上培养成单菌落(35℃培养24h)；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。

进一步地，所述基质可为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。

其中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。

更大范围地，本发明所提供的鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，可包括如下步骤：鉴定所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中是否含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中不含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株(即为或候选为药物敏感菌株)。

本发明还保护氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽。

当然，所述多肽在作为标记用于鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药中的应用也属于本发明的保护范围。

另外，本发明还要求保护一种将待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否进行分组的方法。

本发明所提供的将待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否进行分组的方法，具体可包括如下步骤：

(A)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测，获得各自的MALDI指纹图谱；

(B)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述MALDI指纹图谱分别与Biotyper3.0软件中的数据库进行比对，确定种属并获得匹配分值；

(C)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述匹配分值基于PearsonCorrelation做分值的分层聚类统计分析，从而将所述待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否分为两组。

在步骤(A)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体分别接种到固体培养基上培养成单菌落(35℃培养24h)；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。

进一步地，所述基质可为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。

其中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。

在本发明中，以上所述的耐药均具体可为耐甲氧西林。

在本发明中，应用MALDI-TOF/TOF质谱技术检测金黄色葡萄球菌耐药菌和敏感菌，通过对10例耐药菌和10例敏感菌的谱图比对，找出特征的氨基酸序列(SEQ IDNo.1)作为耐药性的新判定标准。该方法操作简便、在严格控制实验条件的情况下，可快速准确地鉴别耐药菌和敏感菌，整个流程不超过10分钟，具有耗时短、灵敏度高、特异性高的优点，可为临床治疗由该类细菌引起的严重感染争取宝贵的时间。

附图说明

图1为根据匹配分值聚类分析MRSA组和MSSA组，能明显看到两组区别(四次重复，**p<0.01)。图中，OQ、OE、OS、OT表示四次重复。

图2为指纹图谱峰值统计后，ClinProTools 3.0软件将两组图谱计算的二维分析图(注：×代表MRSA，△代表MSSA，圈代表两组聚集的倾向)。

图3为通过分别比对MRSA组和MSSA组的指纹比图，发现指示其变化的特征耐药氨基酸序列，并与Biotyper打分系统相互对应。

图4为从样本中随机挑选菌株验证本方法的准确性。图中，OQ、OE、OS、OT表示四次重复，R1和R2是MRSA(耐药菌株)合集，R3和R4是MSSA(敏感菌株)合集。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的新方法

一、材料

菌株来源：北京中医药大学附属东直门医院临床分离的10株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和10株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株用于建模和验证。

试剂：三氟乙酸、乙腈(Thermofisher,美国)、96孔加样板、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、多肽标准品(MALDI-TOF/TOF质谱仪校正的时候用的多肽标准品，属于Bruker这款仪器自带的校正标品)。

仪器：MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker，德国)、二氧化碳培养箱(Thermo 371，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)。

软件：MALDI Biotyper 3.0软件、ClinProTools 3.0软件(Bruker，德国)。

二、检测方法研究

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院相关性和社区相关性感染的重要致病菌之一，可引起多种疾病，如皮肤感染、肺炎、血流感染等，自1961年首次发现以来，其临床分离率不断增加，2012年CHINET监测显示，临床分离的金黄色葡萄球菌中MRSA比例高达47.9％。医院获得性MRSA常为多重耐药菌，治疗较为困难，MRSA感染已成为现代抗感染治疗中最关注的问题之一。因此，选用MRSA作为研究对象具有代表性，为临床防治提供参考依据。

本实施例中共设两种检测思路。

第一种，基于匹配分值进行聚类统计分析，具体包括如下步骤：

(a1)菌株培养：将上述已保存菌株(MRSA和MSSA各10株)转划于平板培养，35℃孵育24h后，可肉眼观察到单菌落成型。

(a2)质谱鉴定：挑取单菌落，均匀涂布于MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，注意涂布厚度＜1mm(大于0mm)，覆基质CHCA，然后利用MALDI-TOF/TOF MS进行鉴定，设置具体参数如下：Shots＝500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z，获得各菌株的MALDI指纹图谱。

(a3)对比：将以上获得的各菌株的MALDI指纹图谱与Biotyper3.0软件中的数据库进行比对，并用匹配分值首先给鉴定结果定级。分值为1.80～2.00可以鉴定到属(明确是金黄色葡萄菌)，分值为2.00～2.300可以准确鉴定到属，甚至种水平(种带有标号的金黄色葡萄球菌)。

(a4)数据分析：用聚类分析对步骤(a3)获得的各菌株的匹配分值基于PearsonCorrelation做分值的分层聚类统计分析。

第二种，比对谱图找出特征氨基酸序列，具体包括如下步骤：

(b1)菌株培养：将上述已保存菌株(MRSA和MSSA各10株)转划于平板培养，35℃孵育24h后，可肉眼观察到单菌落成型。

(b2)质谱鉴定：挑取单菌落，均匀涂布于MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，注意涂布厚度＜1mm(大于0mm)，覆基质CHCA，然后利用MALDI-TOF/TOF MS进行鉴定，设置具体参数如下：Shots＝500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z，获得各菌株的MALDI指纹图谱。

(b3)ClinProTools3.0软件对以上获得的各菌株的MALDI指纹图谱进行分组分析，具体步骤参照软件自带的Manual进行操作。基本参数维持不变，将所有菌株分成两组(MRSA和MSSA组)，然后分组调入样品数据，选择快速分类算法(QC)对数据进行分析并建立相应的模型。

(b5)谱图比对：将步骤(b2)所得的MRSA组和MSSA组的金黄色葡萄球菌MALDI指纹图谱进行比对，找出差异化特征氨基酸序列，具体是通过对两组实验结果中大量的MALDI指纹图谱，先进行分类分组，之后分别与金黄色葡萄球菌测序得到的理论蛋白序列进行比对，归纳总结得到的。

三、检测方法研究结果

1、微生物鉴定结果

MALDI-TOF/TOF质谱鉴定结果全部为金黄色葡萄球菌。用于模型建立的20株细菌中，10株分值分布在1.80～2.00，10株分值＞2.00，均可以鉴定到属的水平。通过对分值统计聚类分析，和单因素方差统计分析，能够明显区分两组金黄色葡萄球菌，(图1，表1，P＜0.05)。

表1单因素方差统计分析能够明显区分两组金黄色葡萄球菌

注：表中的Rp01-Rp04为四次重复。

2、指纹谱图峰统计

进行指纹谱图峰统计之后，运用快速分类算法，ClinProTools 3.0软件将MRSA组和MSSA组金黄色葡萄球菌清晰的划分两个区域，大部分菌株准确落在相应分组区域内(图2)。

3、指纹谱比对

通过对MRSA组和MSSA组的金黄色葡萄球菌的MALDI指纹图谱进行比对，发现同一个结果序列为79AA，验证搜索结果与Biotyper3.0分值比对，发现随鉴定分值提高，Mascot比对可信度越高(图3)，因此确定金葡菌耐药性和敏感性区别的特征序列为：

MAVAALILGLTGNQMMTMMNKNMDQNMRSAKKMGQKPSQKKTEEMLRMMQMDYLRRNPPINQMMPAKNTKKRGQNMDQA(SEQ ID No.1)。

MRSA(即耐药菌株)不含有SEQ ID No.1所示的特征序列，而MSSA(即药物敏感菌株)含有SEQ ID No.1所示的特征序列。

四、基于核心特征耐药序列(SEQ ID No.1)建立本发明比对方法

基于以上发现的核心特征耐药序列(SEQ ID No.1)建立本发明鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，具体包括如下步骤

(c1)菌株培养：将待测金黄色葡萄球菌转划于平板培养，35℃孵育24h后，可肉眼观察到单菌落成型。

(c2)质谱鉴定：挑取单菌落，均匀涂布于MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，注意涂布厚度＜1mm(大于0mm)，覆基质CHCA，然后利用MALDI-TOF/TOF MS进行鉴定，设置具体参数如下：Shots＝500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。获得待测菌株的MALDI指纹图谱。

(c3)采用mascot搜索引擎，将以上获得的待测菌株的MALDI指纹图谱与SEQIDNo.1所示的核心特征耐药序列进行比对，根据比对结果按照如下确定待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果待测菌株的MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1所示的核心特征耐药序列不匹配，则待测金黄色葡萄球菌为MRSA；如果待测菌株的MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1所示的核心特征耐药序列匹配，则待测金黄色葡萄球菌为MSSA。

发明人进一步从供试的20种甲氧西林的金黄色葡萄菌耐药菌株和敏感菌株中随机挑选，利用以上所建立的核心特征耐药序列(SEQ ID No.1)比对的方法，验证准确性。结果表明，相比于仅仅依靠Biotyper3.0打分系统区分率95％，利用序列比对，在任何条件下，随机挑选，耐药菌和敏感菌的区分度能达到100％(＞50为敏感菌，＜50为耐药菌)(图4)。图4中，R1和R2是MRSA(耐药菌株)合集，R3和R4是MSSA(敏感菌株)合集，随机进行了4次实验，每次分别从R1-R4四个集合中各抽取5个菌株鉴定，20株/次，共计80次实验，结果如图4，纵坐标为鉴定分值，敏感菌株＞50分，耐药菌株＜50分。

综上所述，可见：本发明建立了一种简便易行可靠的通过菌株的指纹图谱及比对特征的耐药氨基酸序列来反映金黄色葡萄球菌的耐药与敏感性，并通过实际临床样本应用充分说明了本方法的快速、灵敏性及可靠性。该方法克服了传统方法的不足，可应用金黄色葡萄球菌耐药性的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。

<110> 中国中医科学院医学实验中心

<120> 一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法

<130> GNCLN172273

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 79

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 1

Met Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Gly Leu Thr Gly Asn Gln Met Met

1 5 10 15

Thr Met Met Asn Lys Asn Met Asp Gln Asn Met Arg Ser Ala Lys Lys

20 25 30

Met Gly Gln Lys Pro Ser Gln Lys Lys Thr Glu Glu Met Leu Arg Met

35 40 45

Met Gln Met Asp Tyr Leu Arg Arg Asn Pro Pro Ile Asn Gln Met Met

50 55 60

Pro Ala Lys Asn Thr Lys Lys Arg Gly Gln Asn Met Asp Gln Ala

65 70 75

Claims (9)

1.一种鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，包括如下步骤：

(a)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；

(b)采用mascot搜索引擎，将步骤(a)获得的所述MALDI指纹图谱与79AA特征序列进行比对，所述79AA特征序列如SEQ ID No.1所示，根据比对结果按照如下确定所述待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上培养成单菌落；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。

5.一种鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，包括如下步骤：鉴定所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中是否含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中不含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。

6.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

7.权利要求6所述多肽在作为标记用于鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药中的应用。

8.一种将待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否进行分组的方法，包括如下步骤：

(A)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测，获得各自的MALDI指纹图谱；

(B)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述MALDI指纹图谱分别与Biotyper3.0软件中的数据库进行比对，确定种属并获得匹配分值；

(C)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述匹配分值基于PearsonCorrelation做分值的分层聚类统计分析，从而将所述待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否分为两组。

9.根据权利要求1-5和7-8中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述耐药为耐甲氧西林。