CN104039975A - 通过质谱法直接检测金黄色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及采用特定质谱技术研究含有金黄色葡萄球菌菌群的样品的方法，该方法能够特异性地检测在获得的质谱上存在或不存在m/z值为3005±5Th或3035±5Th的峰，并依据该结果作出相应的决定。

Description

通过质谱法直接检测金黄色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法
本发明涉及分析金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的技术领域。金黄色葡萄球菌是造成定殖和感染的细菌(Wertheim,Melles等人,2005)，由占人口的20至30％的带菌者携带。感染可以被分为两大类型：涉及粘着因子“识别粘着基质分子的微生物表面组分”或MSCRAMM(血纤蛋白原的结合蛋白(FnBP)、蛋白A、凝固酶等)的化脓性感染；和需要分泌外毒素的毒素性感染，其中最出名的外菌素是溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)、葡萄球菌肠毒素和剥脱性毒素(Otto2010)。所有的金黄色葡萄球菌菌株都不具有全部的毒力因子，并且这些因子在细菌生长期间不会被同时表达。在指数生长期，存在粘着因子的表达，这是定殖和侵入宿主所需要的。相反，在指数生长期结束时且在稳定期过程中，大多数细菌表达破坏宿主细胞(其生长所必需的营养物质的来源)所需的毒素。金黄色葡萄球菌具有许多控制这些进程的调节因子(Dufour,Jarraud等人,2002)。其中，“附属基因调节子”(agr)系统是最重要的系统之一。
金黄色葡萄球菌的agr系统调节大量毒力基因和细菌的新陈代谢。其由基因座中分配在两种趋异转录物RNA II和RNA III中的5个基因(agrBDCA和hld)组成。RNA II是操纵子P2的信使，其含有agrBDCA基因；RNA III含有hld，其为溶血素δ的基因。agrC编码组氨酸激酶，agrA是双组分系统的受体。agrD编码通过agrB加工成熟并分泌的肽。所产生的肽是一种自诱导肽，其激活刺激agrA的agrC。一旦其被激活，agrA受体通过各自的启动子P2和P3诱导RNA II和RNA III的转录。RNA III含有hld(一种编码溶血素δ的基因)，但首先是一种RNA调节子，该agr系统的真正的效应子。因此，这种RNA III在转录和翻译水平上都调节大量基因(Verdon,Girardin等人,2009；Felden,Vandenesch等人,2011)。诱导该agr系统功能失常的突变导致自溶素和溶血素的表达改变；以及对细菌表型的作用，尤其是在致病潜力中所涉及到的细菌表型(Schweizer,Furuno等人,2011)。
金黄色葡萄球菌的溶血素δ，也称为δ-毒素或δ-溶素，由属于agr系统的hld基因编码。其定位在RNA III(agr系统的效应子)内。RNA III翻译成溶血素δ被延迟(≈1小时)，并在指数生长期结束时发生(Balaban和Novick1995；Somerville,Cockayne等人,2003)。溶血素δ由此反映了RNA III的转录，因此反映了agr系统的功能性(Felden,Vandenesch等人,2011)。其属于金黄色葡萄球菌的溶血毒素家族，并在细胞膜中产生孔。尤其是，其通过破坏细胞膜的磷脂造成人、兔、羊、马、猫、鸡的红细胞等等的细胞裂解(Kreger,Kim等人,1971)。其还参与阻止生物膜的形成并参与在人嗜中性粒细胞中引发氧化应激(Somerville,Cockayne等人,2003)。其由图1中显示的26种氨基酸组成并具有2.9kDa的质量(Fitton,Dell等人,1980)。其表现为两种形式：i)在蛋氨酸残基上的N-末端甲酰化形式，其为天然的并且为主要形式，在本文件中被命名为溶血素δ；和ii)脱甲酰化形式(Verdon,Girardin等人,2009)。通过酶铁依赖性脱甲酰基酶肽确保脱甲酰化。在指数期和后指数期早期过程中，溶血素δ被脱甲酰化以获得弱趋化实体(chemoattracting entity)(Somerville,Cockayne等人,2003)。在细菌生长过程中，铁浓度逐渐降低，导致脱甲酰基酶活性逐渐降低。从而存在溶血素δ的累积，提供嗜中性粒细胞的趋化性；并诱发炎症反应，其为将来细菌生长的营养物来源(Somerville,Cockayne等人,2003)。最后，已经描述了多态性：在犬来源的菌株中发现了一种变体。其存在氨基酸的变化；在胰蛋白酶作用下消化降低；对羊红血细胞的溶血潜力降低以及在低于25℃的温度下溶血活性降低(Turner1978)。在人来源的菌株中，在GenebankTM(Figueiredo,Jarraud等人，2000)中描述了将位置10处的甘氨酸替换为丝氨酸(G10S)的多态性类型，但是该突变的流行率是未知的。
根据研究，金黄色葡萄球菌的agr系统缺陷型菌株的出现频率估计为15％至22％(Traber,Lee等人,2008；Schweizer,Furuno等人,2011；Tsuji,Maclean等人,2011)。与社区MRSA相比，这些菌株在耐甲氧西林的医院金黄色葡萄球菌(MRSA)中是更常见的(Tsuji,Maclean等人,2011)。但是，已经在所有的agr基因池I、II、III和IV中发现了agr缺陷型菌株，不支持克隆假设(Rose,Rybak等人,2007)。
这些菌株具有实际临床相关性，因为它们是在已对其施以最少操作的生物样品中分离出来的，并且不是由于连续再植过程中发生的突变的结果(Traber,Lee等人,2008)。在agr系统功能异常与不存在溶血素δ之间已经建立了不同的临床联系。
例如，在2011年，在2003年至2007年间进行的处理814例金黄色葡萄球菌菌血症的回顾性研究再次发现22％的菌株具有agr系统的功能异常。在18％的病例中，感染这些菌株的患者在30天内死亡，而对于agr系统是功能性的菌株为12％(p＝0.03)。因此，对agr缺陷型金黄色葡萄球菌菌株感染能够预测死亡率，灵敏度为30％、特异性为79％、阳性预测值为18％和阴性预测值为88％(Schweizer,Furuno等人,2011)。
此外，处理MRSA持续性菌血症(BP)的回顾性临床研究(即在超过7天的合适的抗生素疗法下带有MRSA的阳性血培养物的存在率)表明，与消散型菌血症(RB)相比，在持续性菌血症(BP)的过程中更频繁地发现agr系统功能异常的MRSA菌株(通过在琼脂糖上寻找溶血素δ来体现)(BP组中菌株为71.4％，RB组中菌株为38.9％；p＝0.057)。因此，不产生溶血素δ(表明agr系统功能异常)可能是持续性菌血症的标志，需要加强管理(即最佳抗生素疗法)(Fowler,Sakoulas等人,2004)。
还建立了与细菌自溶的联系。agr系统控制许多基因尤其是lytS与lytR的表达。因此，agr系统的功能异常与在液体介质中聚集体的形成；细胞表面的改变，变得粗糙和扩散；以及自溶的倾向性有关(Brunskill和Bayles1996)。
Vuong等人，依他们的看法，已经表明在对聚苯乙烯的粘附模型中，78％的agr-缺陷型菌株形成生物膜，而仅有6％的菌株表达agr。这一现象还通过加入agr抑制剂得以证实并似乎是由于溶血素δ的表面活性剂性能引起的(Vuong,Saenz等人,2000)。但是，由于生成生物膜要求agr系统功能异常，而生物膜的扩散似乎依赖于agr系统，强调agr系统缺陷型菌株与功能型菌株在慢性感染过程中可能共存(Boles和Horswill2008)。累积的这些结果支持在慢性感染过程中或在血管内设备上寻找agr-缺陷型菌株。
还建立了与囊肿性纤维化的联系。在2000年，Goerke等人研究了RNA III在从患有囊肿性纤维化的患者呼吸道样品中分离的金黄色葡萄球菌菌株中的表达。显示了agr-缺陷型菌株的优势。因此在囊肿性纤维化过程中agr系统的功能性对于定殖与感染而言不是必需的(Sakoulas,Eliopoulos等人,2005)。
最后，还已经报道了与糖肽耐药表型(即糖肽中间型金黄葡萄糖球菌(Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus)，GISA)的联系。被具有功能性agr系统的MRSA菌株感染的患者长期服用(即超过9个月)万古霉素诱导溶血素δ表达减少，但后者不是被完全消除。在停止治疗后，测量到溶血素δ的表达的显著增加(Sakoulas,Gold等人,2006)。此外，agr系统功能异常的菌株表现出降低的万古霉素敏感性，尽管后者的药效动力学并未发生改变(Tsuji,Maclean等人,2011)。在2002年，Sakoulas等人证明了包括在他们实验室的GISA收集物中包括的所有菌株具有功能异常的agr系统(Sakoulas,Eliopoulos等人,2002)。在2005年，证实了异质GISA表型的出现与agr系统缺陷型菌株长期暴露于万古霉素之间的联系。对万古霉素的敏感性的这种降低也与细菌裂解减少和对血小板抗微生物肽的敏感性较低相关(Sakoulas,Eliopoulos等人,2005)。这种关系也得到了Rose等人的研究的证实，Rose等人的研究表明agr-缺陷型菌株提高其对万古霉素的最低抑制浓度(MCI)的能力提高，并由此成为GISA。相反，用属于另一类抗生素的另一种抗金黄色葡萄球菌抗生素达托霉素(daptomycin)并未发现这种现象(Rose,Rybak等人,2007)。由此证明溶血素δ的产生的缺乏可能是检测趋向GISA表型或异质性GISA表型的时间依赖性变化的早期标志，特别是在用万古霉素治疗期间(Fowler,Sakoulas等人,2004)。
同样，考虑到检测溶血素δ的临床益处，已经描述了用于测量金黄色葡萄球菌的溶血素δ的不同方法。可以提及溶血试验、在动物模型上的生物测试、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹(Northern blot)、测序和高效色谱法(HPLC)。
在溶血试验中，可以通过在抗溶血素α和β抗体的存在下测量在琼脂糖上培养的金黄色葡萄球菌菌株诱导的对血液的溶血作用，检测溶血素δ。还可以通过寻找溶血素δ与溶血素β之间的溶血协同作用来检测溶血素δ(Verdon,Girardin等人,2009)。描述了不同的方法学：Sakoulas等人使用由溶血素β诱导产生大面积溶血的RN4420金黄色葡萄球菌菌株来检测溶血素δ。Schweitzer等人也已经描述了一种派生方法学。这些方法容易进行，但是需要进行“专用”测试并具有主观读数：寻找溶血协同作用，这有时难以观察到。最后，与RNA印迹和与agr基因测序相比，这些测试可能受假阴性的影响(Traber,Lee等人,2008)。
以往，已经使用了在动物模型上的生物测试。在这种情况下，可以通过测量对小鼠或豚鼠的最小致死剂量(MLD)来检测溶血素δ的活性。但是这需要大剂量(小鼠MLD＝110mg/kg，豚鼠MLD＝30mg/kg)。另一方法学包括研究溶血素δ诱导兔皮肤坏死的能力。大约1mg溶血素δ在24小时后诱导大的红斑(直径>28mm)和硬结，在第3天(D+3)时形成坏死区。在较小剂量下还可以观察到脱皮(Kreger,Kim等人,1971)。
还可以通过靶向RNA III的RT-PCR评估溶血素δ的表达。从菌株中提取总RNA，并进行竞争性RT-PCR。为了使结果标准化，Goerke等人使用编码促旋酶(gyr)的管家基因，其表达是恒定的，与生长阶段无关。RNA IIIRT-PCR代表一种灵敏、特异性和定量的技术。但是，由于高污染风险，其应用仅限于专业实验室(Goerke,Campana等人,2000)。
通过使用靶向RNA III的RNA印迹可以间接检测溶血素δ的表达(Kornblum,Projan等人,1988；Goerke,Campana等人,2000；Traber和Novick2006)。
某些作者还使用了agr基因座的完整测序以便鉴定可以解释其功能异常的点状突变(Traber和Novick2006)。
还已经使用了几种HPLC技术。在2000年，Otto和Gotz描述了一种通过高效液相色谱法(HPLC)测量溶血素δ的定性和定量方法。将在胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤中制作的细菌培养物的上清液以19000g离心5分钟。随后在1mL的PHE(“苯基衍生化的”)柱上通过HPLC分析上清液，并随后用10至90％的溶剂B梯度洗脱，溶剂A是0.1％的三氟乙酸(TFA)/水混合物，溶剂B是0.1％的TFA/乙腈混合物。用具有214或280nm二极管线阵列的UV光谱仪实现检测(Otto和Gotz2000)。在2002年，Somerville等人，依他们的看法，描述了一种与Otto和Gotz的方法类似的方法学，使用HPLC检测和测量溶血素δ但是与具有电喷雾源的质谱法检测联用。他们由此获得了溶血素δ的天然与脱甲酰化形式的m/z为3007Th(Thomson)和2972Th(Somerville,Cockayne等人,2003)。
在这种背景下，发明人着眼于一种研究金黄色葡萄球菌菌落的新方法，其有可能根据是否存在溶血素δ作出诊断和/或与是否存在溶血素δ建立关联。这种方法应当快速和容易使用，并且尤其不需要任何提取蛋白质的繁琐步骤。
本发明涉及采用质谱技术研究含有金黄色葡萄球菌菌群的样品的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与介质接触，以通过激光束的作用使样品中存在的分子离子化，
b)用激光束离子化样品中存在的分子，
c)通过电势差加速获得的离子化的分子，
d)使加速的离子化分子在至少一个减压管中自由运动，
e)检测至少一部分已自由运动的加速的离子化分子，以便测量它们穿过至少一个减压管所花费的时间并获得对应于给定时刻下检测到的离子化分子的数量的信号，
f)计算所检测的分子的质荷比(m/z)，以便根据所检测的分子的m/z比获得对应于具有相同质荷比(m/z)的离子化分子的数量的信号，
g)直接或间接地确定在步骤b)中获得的离子化分子中是否存在质荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的离子化分子，
h)根据步骤g)中获得的结果作出相应的判断。
根据第一替代实施方案，步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与分析的金黄色葡萄球菌菌群不存在溶血素δ及其变体G10S关联在一起的步骤。
具有序列SEQ ID NO.1的溶血素δ：XaaAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK，其中Xaa＝在N-末端位置甲酰化的蛋氨酸，具有3005,6Th的质子化单一同位素质量(MH+)。
其具有序列SEQ ID NO.2的变体：XaaAQDIISTISDLVKWIIDTVNKFTKK，其中Xaa＝在N-末端位置甲基化的蛋氨酸，具有3035,6Th的质子化单一同位素质量(MH+)。
根据第二替代实施方案，步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与分析的金黄色葡萄球菌菌群的agr系统(“附属基因调节子”)的功能异常关联在一起的步骤。
根据第三替代实施方案，分析的金黄色葡萄球菌菌群来自于患者的生物样品，并且步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与对所述患者作出已知与agr系统功能异常有关的临床诊断关联在一起的步骤。
根据第四替代实施方案，分析的金黄色葡萄球菌菌群来自于患者的生物样品，并且步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与患者患有慢性感染的诊断关联在一起的步骤。基于临床生物学标准定义慢性感染，其是指在多达6个月前分离出具有与研究过程中的分离菌株相同的抗菌谱的金黄色葡萄球菌菌株。作为此类慢性感染的实例，可以提及骨关节感染、慢性糖尿病足感染、可植入血管设备上的感染。
根据第五替代实施方案，步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与将分析的金黄色葡萄球菌菌群分类为具有表现出糖肽敏感性降低的风险(即GISA)关联在一起的步骤。
可以应用本发明的方法的样品可以是生物来源的，特别是动物或人类来源的。其可以对应于生物流体样品(例如全血、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、有机分泌物)，对应于组织样品或对应于分离的细胞。该样品可以原样使用，或在研究前可以根据本领域技术人员已知的方法施以富集或培养类型的制备。
在本发明的范围内，待研究的样品对应于包含菌群的细胞培养基，不对应于在提取或提纯步骤后获得的一种或多种蛋白质。优选地，研究的样品含有菌群，即其含有至少10个细菌。
检测尤其可以由来源于生物样品的细菌培养物的肉汤或由血液培养物进行。通常，质谱获自从琼脂糖上的细菌培养物获得的样品。
细胞培养物直接悬浮在基质中或悬浮在基质上。此类技术被称为对全细胞的质谱法(WC-MS，“全细胞质谱法”)，并可以在没有任何事先的、乏味的和耗时的提取程序的情况下进行。该技术过去已经被广泛用于细菌鉴定，但是考虑到样品的复杂性，其在蛋白质鉴定中的应用极为有限。在大多数情况下，指定对应于通过WC-MS获得的表达谱(profile)的蛋白质是未知或不明确的。仅通过比较蛋白质表达谱进行细菌鉴定，而不知道这些表达谱的蛋白质组成(即峰与蛋白质之间的对应关系)(Welker和Moore2011)。但是，某些作者已经提出使用这种方法学检测生物标志物和/或在细菌致病机制中所涉及的毒力因子(Bizzini和Greub2010)。对于金黄色葡萄球菌而言，某些作者已经表示，有可能将MSSA与MRSA区分开。但是，所用的菌株收集物有限(n＝10个菌株)，并需要使用初步程序来制备样品(即化学和机械提取)(Edwards-Jones,Claydon等人,2000)。其它作者已经指出有可能检测金黄色葡萄球菌的PVL(Bittar,Ouchenane等人,2009)。但是，这些结果证明是非特异性的，并可能反映属于分析菌株收集物的相同克隆(Dauwalder,Carbonnelle等人,2010；Szabados,Becker等人,2011)。
在本发明的范围内，发明人由此以完全预料不到的方式证明，在获得的质谱上存在具有m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰以及不存在位于3005±5Th和位于3035±5Th的峰可以分别与存在和不存在溶血素δ或其变体相关联，并因此有可能作出临床诊断。
优选地，在本发明的方法的范围内，不考虑应用的替代方案，有利地是，对含有10至109个细菌、优选105至106个细菌的细菌群的样品实施质谱法。如果将施以质谱法的样品沉积在标准琼脂糖培养基上以便在35±2℃下孵育18至48小时后生长金黄色葡萄球菌，则细菌数量将与菌落形成单位(CFU)的计数同化。
以一般方式，在本发明的范围内可以使用任何采用测量飞行时间的基质辅助解吸-离子化质谱法。
根据一个具体实施方案，使用的质谱法使基质辅助解吸和离子化/飞行时间(MALDI-TOF)质谱法(MS)，其特别具有相对简单应用的优点。
根据另一具体实施方案，使用的质谱法是MALDI-TOF-TOF串联MS，其根据飞行时间具有两次连续的分离，并且特别具有特异性极佳的优点。
在其离子化之前，样品优选与基质接触。
所用基质有利地含有选自3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(即芥子酸或白芥子酸)；α-氰基-4-羟基肉桂酸(即α-氰基、α-基质或CHCA)，阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸(即DHB)中的化合物。
存在几种可以在本发明范围内用于使样品与基质接触的沉积技术：在干基质层上沉积，所谓“薄层”沉积；用基质液滴沉积，所谓“干液滴”沉积；在基质层上沉积，随后添加基质液滴，所谓“夹心(Sandwich)”沉积。
通常，基质是光敏性的并在样品存在下结晶，同时保持分子的完整性。此类基质，尤其是适于MS MALDI-TOF的，是公知的，并选自：3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸；α-氰基-4-羟基肉桂酸，阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸。许多其它化合物是本领域技术人员已知的。甚至存在液体基质，其既不会在大气压下结晶，甚至也不会在真空中结晶(Tholey和Heinzle2006)。可以使用允许样品分子在激光束作用下离子化的任何其它化合物。值得注意的是，靶标，即样品沉积在其上的载体，可以直接起到基质的作用，类似“纳米辅助激光解吸/离子化”(NALDI)或“硅上解吸/离子化”(DIOS)技术的情况。激光束可以具有促进基质升华或蒸发的任何类型的波长。优选使用紫外或甚至红外波长。
在基质中，将此类化合物溶解，最通常使用水，优选具有“超纯”质量的水，或溶于水/有机溶剂混合物中。作为常规使用的有机溶剂的实例，可以提及丙酮、乙腈、甲醇或乙醇，有时可以加入三氟乙酸(TFA)。基质实例例如由含20mg/mL芥子酸的乙腈/水/TFA的50/50/0.1(v/v)混合物组成。有机溶剂使样品中存在的疏水性分子溶解在该溶液中，而水允许亲水性分子溶解。诸如TFA的酸的存在通过捕获质子(H+)促进样品分子的离子化。
优选地，将样品沉积在称为靶标的载体上，最通常以斑点的形式。可以将基质直接沉积在样品上并随后与样品混合。
任选地，本发明的方法在步骤b)之前进一步包括使样品分子被吸附在其上或其中的基质结晶的步骤。
通常，结晶基质通过使其中或其上沉积有样品分子的基质干燥来获得。
根据一个具体实施方案，与样品接触的基质相当于沉积在靶标上的适于MALDI MS的基质，并且该方法在步骤b)之前包括获得样品分子被吸附在其上或其中的基质的结晶。在这种情况下，基质优选含有选自3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸中的化合物。
可以预先将样品在肉汤中或在琼脂糖上培养以使其富含金黄色葡萄球菌细菌。此类培养基琼脂糖或肉汤是本领域人员公知的。例如，可以提及含有(马或羊)血的琼脂糖；哥伦比亚琼脂糖；“巧克力”琼脂糖；来自bioMerieux的用于寻找金黄色葡萄球菌的ChromID显色琼脂糖等等。在琼脂糖上的富集是特别有利的，因为有可能获得可以沉积在靶标上的金黄色葡萄球菌的纯菌落。随后例如通过将样品留置在例如17至30℃的温度下、尤其是在室温(22℃)下几分钟(例如5分钟至2小时)，从而将基质中存在的溶剂蒸发。溶剂蒸发允许样品分布于其中的基质结晶。接着，对放置在结晶基质内的样品施以温和离子化。优选用发射337.1nm的UV光束的氮激光器实现这种离子化。
在离子化过程中，通过激光对样品施以激发。基质晶体随后吸收光子能量，该能量的释放造成基质升华、样品解吸和出现处于被描述为等离子体的状态的材料。在这种等离子体内，基质与样品分子之间发生电荷交换。例如，质子可以从基质中脱离并转移至样品的蛋白质和转移至样品的肽。该步骤允许温和离子化生物分子，而不会增加它们的破坏程度。样品由此释放不同大小的离子。后者随后通过电场加速并在减压管(称为飞行管)中自由飞行。在离子化过程中和在加速生成的离子的过程中施加的压力通常为10-6至10-9毫巴(mbar)。最小的离子随后将比较大的离子更快速地“行进”，由此能够将它们分离。检测器位于飞行管末端。使用离子所花费的飞行时间(或TOF)来计算它们的质量。由此，获得质谱，代表根据撞击检测器的分子的m/z比对应于具有相同质荷比(m/z)的离子化分子的数量的信号强度。质荷比(m/z)以Th(Thomsons)表示。一旦被引入到质谱仪中，非常快速地获得样品的质谱，通常在不到一分钟的时间内。
可以在MALDI-TOF MS之前通过测试或同时借助于MALDI-TOF MS谱来确定分析的样品实际含有金黄色葡萄球菌细菌的事实。在此情况下，将总MALDI-TOF MS谱(其通常包含70至200个峰)与光谱数据库进行比较，其提供确定分析的细菌群是否实际对应于金黄色葡萄球菌的可能性。这种比较基于使用不同的算法(这取决于供应商)，并由此实现细菌鉴定(Cherkaoui,Hibbs等人,2010；Welker和Moore2011)。
上文详细描述的所有实施方案均适用，而不考虑使用的质谱技术，特别是MALDI-TOF或MALDI-TOF-TOF类型。
当所用质谱法是MALDI-TOF MS时，步骤g)的确定优选从获得的质谱上存在m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035±5Th的峰来直接推断出。
当所用的质谱法是MALDI-TOF-TOF MS时，在步骤d)中优选使离子化分子)在第一减压管中运动，选择具有m/z等于3005±5Th的质量和/或具有m/z等于3035±5Th的质量的离子，这些离子化分子在它们碎片化(例如通过碰撞)后再次被加速，使碎片化的或未碎片化的离子化分子在第二管中自由运动。
采用MALDI-TOF-TOF MS，步骤g)的确定优选由下列y和b离子碎片中存在至少5种碎片、优选至少10种碎片来间接地推断：
-对于3005±5Th处的峰，具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2005.148、2118.232、2219.280、2306.312、2419.396、2532.480、2647.507、2775.565、2846.603和2976.635，公差为±1.5Th；以及具有以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1029.516、1144.543、1257.627、1356.695、1484.790、1670.870、1783.954、1897.038、2012.065、2113.112、2212.181、2326.224、2454.319、2601.387、2702.435、2830.530和2958.625，公差为±1.5Th，和/或
-对于3035±5Th处的峰，具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2035.159、2148.243、2249.290、2336.322、2449.406、2562.491、2677.517、2805.576、2876.613和3006.646，公差为±1.5Th；以及具有以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1059.526、1174.553、1287.638、1386.706、1514.801、1700.880、1813.964、1927.048、2042.075、2143.123、2242.191、2356.234、2484.329、2631.398、2732.445、2860.540和2988.635，公差为±1.5Th。
根据本发明可以使用的MALDI-TOF质谱法可以特别包括下列连续步骤以获得质谱：
-将待研究的样品放置在基质表面或基质中，所述基质适合于根据飞行时间的基质辅助解吸-离子化质谱法，
-获得其上或其中吸附有样品分子的基质的结晶，
-借助激光束将结晶的基质/样品混合物离子化，
-借助电势差加速获得的离子化分子，
-使加速的离子化分子在减压管中自由运动，
-在管出口处检测离子化分子，以便测量它们通过减压管所花费的时间并获得对应于给定时刻下到达检测器的离子化分子的数量的信号，
-计算所检测的分子的质荷比(m/z)，以便根据所检测的分子的m/z比获得对应于具有相同质荷比(m/z)的离子化分子的数量的信号。
通常，考虑到所用质谱仪的初步校准，以关联离子化分子的质荷比(m/z)与减压管中的飞行时间的方程式形式获得m/z比的计算。
可以在本发明范围内使用的MALDI-TOF MS是基于暴露于电场的具有不同电荷与不同质量的离子由A点行进至B点的时间的测量。该行进时间的测量取决于离子的质量和电荷，由此允许其分离(Welker和Moore2011)。
可以在本发明范围内使用的MALDI-TOF-TOF方法可以特别包括下列步骤以便获得质谱：
-将待研究的样品放置在适于MALDI-TOF-TOF MS的基质表面或基质中，
-使在其上或其中吸附有样品分子的基质结晶，
-借助激光束将结晶的基质/样品混合物离子化，
-借助电势差加速获得的离子化分子，
-使加速的离子化分子在第一减压管中自由运动，
-在通过第一管后，选择具有待碎片化的分子离子的质量的离子化分子，并除去所有其它离子，例如借助于静电偏转器，
-使离子化分子碎片化，任选借助于惰性气体来进行，
-例如借助电势栅格再次提高电势以便加速离子化分子，以便向碎片离子和向前体离子提供不同的动能，
-使碎片化或未碎片化的离子化分子在第二减压管中自由运动，
-在该管出口处检测离子化分子，以便测量它们通过减压管所花费的时间并获得对应于给定时刻下到达检测器的离子化分子的数量的信号，
-计算所检测的分子的质荷比(m/z)，以便根据所检测的分子的m/z比获得对应于具有相同质荷比的离子化分子(m/z)的数量的信号。
通常，考虑到所用质谱仪的初步校准，以关联离子化分子的质荷比(m/z)与减压管中的飞行时间的方程式形式计算m/z比。前体离子的质量可用于实现这种校准。
任何类型的MALDI-TOF或MALDI-TOF/TOF质谱仪可用于产生质谱。此类光谱仪包括：
i)用于离子化样品/基质混合物的离子化源(通常为UV激光器)；
ii)通过施加电势差的使离子化分子加速的加速器，
iii)加速的离子化分子在其中运动的减压管，
iv)用于根据它们的质荷比(m/z)分离形成的分子离子的质量分析仪；
v)用于测量由分子离子直接产生的信号的检测器。
MALDI-TOF-TOF质谱仪与MALDI-TOF质谱仪相同，区别仅在于减压管被分为位于彼此延伸部的两个部分(在本文中也称为第一减压管和第二减压管)。这种几何形状允许两次连续地根据飞行时间分离分子离子：第一减压管允许选择将在该管的第二部分中分离为碎片的分子离子。碎片指的是通过破碎所选分子离子获得的任何分子结构。
可以在初始离子化过程中或在位于管的上述两部分之间的碰撞室中获得离子的碎片化。在初始离子化过程中，可以直接由被分子吸收的激光束能量进行碎片化，或者通过分子等离子体中的中性或离子化分子之间的碰撞进行碎片化。如果在加速离子的阶段之前发生碎片化，碎片根据它们各自的质量移动。如果碎片化发生在加速阶段，所谓亚稳离子的分离较差。如果碎片化在初始加速后发生，碎片离子及其离子化的母体分体(前体离子)具有相同的动能并以相同的速度移动。后一种类型的碎片化，称之为源后碎片化，用于MALDI-TOF-TOF MS技术。该管的第一部分(或在本文中还被称为第一减压管)可能选择包含感兴趣的前体离子质量并受到质量差(mass delta,delta demasse)的限制的质量窗。前体离子及其碎片随后在减压管的两部分之间再次被加速。离子随后根据其质量获得动能。它们最终根据其各自的质量移动到减压管的第二部分(或在本文中还被称为第二减压管)中。由此可能检测给定的前体离子生成的全部碎片。
这种方法的一个替代方案包括在减压管的两部分之间的碰撞室中加入惰性气体，如氩气。离子化分子随后在与惰性气体碰撞时发生碎片化。它们随后可以如前所述被加速和分离。
MALDI TOF/TOF MS优选地在肽键附近使蛋白质碎片化，根据通常命名法(Paizs和Suhai2005)其基本上生成类型b和类型y的离子。其它碎片也是可能的，亚铵离子、碎片a等等。
本领域技术人员习惯使用碎片峰生成关于蛋白质的氨基酸序列的信息并试图鉴定该蛋白质序列。他/她为此特别使用诸如来自Matrix Science(伦敦，英国)的Mascot的软件包。
由此，SEQ ID NO.1的溶血素δ将主要导致：
●具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2005.148、2118.232、2219.280、2306.312、2419.396、2532.480、2647.507、2775.565、2846.603和2976.635；
●具有以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1029.516、1144.543、1257.627、1356.695、1484.790、1670.870、1783.954、1897.038、2012.065、2113.112、2212.181、2326.224、2454.319、2601.387、2702.435、2830.530和2958.625。
而且，SEQ ID NO.2的溶血素δG10S将主要导致：
●具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2035.159、2148.243、2249.290、2336.322、2449.406、2562.491、2677.517、2805.576、2876.613和3006.646；
●和具有以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1059.526、1174.553、1287.638、1386.706、1514.801、1700.880、1813.964、1927.048、2042.075、2143.123、2242.191、2356.234、2484.329、2631.398、2732.445、2860.540和2988.635。
结合附图，该实施例在下文中阐述本发明，但是不具有限制性。
图1描述了溶血素δ的一级序列(Fitton,Dell等人,1980)。
图2显示了采用MALDI TOF MS检测来自金黄色葡萄球菌的同基因菌株的溶血素δ。
图3研究了培养期(18至48小时)对采用MALDI TOF MS检测3种同基因菌株和2种临床菌株的溶血素δ的作用。
图4显示了采用MALDI TOF MS检测来自金黄色葡萄球菌的临床菌株的溶血素δ及其变体G10S。
实施例
1.设备
●基质
使用即用型α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质(代号411071，bioMérieux,Marcy l’Etoile,法国)。
●靶标和内部对照物
使用一次性靶标Vitek MS(代号410893bioMérieux,Marcy l’Etoile,法国)。在每次分析时使用ATCC8739大肠杆菌(Escherichia coli)菌株以便允许校准并检查质谱仪的校准的有效性。
●沉积物类型
金黄色葡萄球菌菌株以菌落尖端(colony spike，pointe de colonie)的薄涂片形式(薄层形式的涂片)沉积。该涂片在室温下干燥5至15分钟。随后沉积一微升CHCA基质并随后在室温下干燥大约5至15分钟。
MALDI TOF质谱仪
使用MALDI TOF类型质谱仪，型号Axima来自Shimadzu,Champs sur Marne,法国。
●在MALDI TOF质谱仪上分析过程中使用的参数设定
在分析金黄色葡萄球菌菌株的过程中，使用质谱仪的下列调节参数：
-质量的检测范围：2000-20000Th
-激光功率：80伏
-激光频率：50赫兹
-激光类型：N2
-质谱仪模式：线性，正离子
-提取功率：8330Th
-激活的“自检(self-quality，auto qualité)”模式
-最小强度：10mV
-最小信噪比：10
-最小可接受分辨率：300
-击中次数：5击中/峰(profiles,profils)
-每谱图峰数量：100
●软件包
借助Sirweb-Maldi-版本11软件包(I2A,Peyrols,法国)或Target版本1.12软件包(bioMérieux,Marcy l’Etoile,法国)进行板计划(plateplans,les plans de plaque)。质谱仪通过版本2.8.4.20081127软件包(Shimadzu,Champs sur Marne,法国)驱动。
2.方法学
●分析前参数
在有氧气氛、35±2℃下在含有马血的琼脂糖(TSH,代号43061，bioMérieux,Marcy l’Etoile,法国)上传代培养18至24小时后进行菌株分析。
使用由聚乙二醇PEG(3000)组成的质谱法校准标准品在2800至3200m/z范围内进行质谱仪的初始校准(除了用于细菌鉴定的校准之外)。
●分析参数
根据细菌鉴定过程中常规使用的“涂片技术”由菌落尖端在一次性靶标上生成沉积物。
在室温下干燥5-15分钟。
在之前的沉积物上添加1μL CHCA基质。
干燥5-15分钟。
通过Sirweb-Maldi-或Target软件包生成“板计划”。
采用MALDI TOF MS通过控制质谱仪Axima的软件包启动分析。
3.结果
a.检测的验证
i.使用金黄色葡萄球菌的同基因菌株
对通过agr基因座的等位置换获得的agr/rnaIII/hld系统的等基因菌株的分析有可能证实具有功能性agr系统的菌株在3005±5Th处存在峰。相反，除突变的agr系统之外与先前的亲本菌株相同的等基因菌株在3005±5Th处没有任何峰。受试RN6390菌株具有功能性agr系统，并且是溶血素δ的一个产生者；菌株LUG950衍生自RN6390菌株，其中编码RNAIII的基因是无效的：该菌株对合成溶血素δ是缺陷型的；RN6911菌株是通过完全删除RN6390菌株的agr基因座(RNA II和RNA III)获得的菌株：该菌株对合成溶血素δ是缺陷型的。表I和图2概括了获得的结果。图2显示了用三种受试菌株获得的包含2800至3200之间的m/z比的WC MALDI-TOF MS质谱。
表I：采用WC-MALDI TOF MS以及通过对同基因菌株收集物研究在琼脂糖培养基中的溶血来检测溶血素δ
ii.中间重复性和精密度数据
为了能够在日常实践中使用这种检测而不需要过于严格的培养条件，建立中间重复性和精密度数据。为此，使用先前描述的三种同基因菌株(即RN6390；LUG950和RN6911)和两种临床菌株，其中一种表达溶血素δ(即BE10461395)，另一种不表达(即BE10481354)。这些菌株在含有马血的琼脂糖(TSH，代号43061,bioMérieux,Marcy l’Etoile,法国)上培养18、24和48小时。随后用WC-MS MALDI TOF MS一式两份测试这些菌株。在每种情况下，在所有培养时间中，在产生溶血素δ的所有菌株中均检测到3005±5Th处的峰，并证明在具有agr系统功能异常的菌株中不存在该峰(图3)。
iii.培养基对溶血素δ的检测的影响
还评价了培养基的影响。在有氧条件、35±2℃下将5种相同的菌株(3种同基因菌株和2种临床菌株，一种表达溶血素δ，另一种不表达)在5种不同的培养基上培养24小时：含有马血的琼脂糖(TSH，代号43061，bioMérieux，Marcy l’Etoile，法国)；哥伦比亚琼脂糖(COS，代号43041，bioMérieux，Marcyl’Etoile，法国)；“巧克力”琼脂糖(PVX，代号43101，bioMérieux，Marcy l’Etoile，法国)；琼脂糖P(GP，Bacto-PeptoneBecton Dickinson，Pont de Claix，法国)；和用于搜寻金黄色葡萄球菌的显色琼脂糖(ChromID代号43371，bioMérieux，Marcy l’Etoile，法国)。如显示在表II中那样，这些不同的培养条件对采用WC-MALDI TOF MS借助于3005±5Th处的峰检测溶血素δ不具有任何影响。
表II：培养条件对溶血素δ的检测的影响
+：检测到3005±5Th处的峰。-：在3005±5Th处不存在任何峰。
iv.来自“Centre de Biologie et Pathologie Est des Hospices Civils de Lyon”的微生物学实验室的临床菌株收集物的前瞻性分析
为了研究agr系统功能异常(通过不存在3005±5Th的峰来体现)的临床影响，在“Centre de Biologie et Pathologie Est”(CPBE)des Hospices Civils de Lyon(HCL)的细菌学实验室中在2010年11月至2011年3月间前瞻性地收集了168例分离株(isolates)的收集物。其中，139例(82.7％)在WC-MALDI TOF MS中具有3005±5Th处的峰；12例(7.2％)具有3035±5Th处的峰并且不具有3005±5Th处的峰；最后17例菌株(10.1％)没有显示出在3005±5Th处的任何峰或在3035±5Th处的任何峰。为了证实通过第二方法学获得的结果，在含血琼脂糖上进行溶血测试。所述17例菌株没有显示出在3005±5Th处和在3035±5Th处的任何峰，并且没有表现出任何溶血。相反，不具有在3005±5Th处的任何峰但是具有在3035±5Th处的峰的10例菌株具有阳性溶血测试结果。最后，通过对具有3005±5Th处的峰的139例菌株中随机抽取的5例进行溶血测试检测溶血素δ被证明为阳性。为了解释与在3035±5Th处具有峰而在3005±5Th处不具有任何峰相关的溶血的存在，将编码溶血素δ的基因hld测序。对于这10例菌株，检测到在位置10用丝氨酸取代甘氨酸的突变(即G10S)，这解释了通过MALDI TOF MS测得的质量的变化(图4)。在图4中示出了包含2800至3200的m/z比的WC-MALDI TOF MS谱的菌株中，菌株BE10461395和BE11033028产生野生形式的溶血素δ(δ+)；菌株BE10505040和BE11044293产生具有G10S突变的溶血素δ(δ+G10S)；菌株BE11065397和BE10482354缺少溶血素δ(δ-)。
v.MALDI TOF/TOF分析
在9例菌株上进行通过“MALDI-TOF/飞行时间”质谱法(MALDITOF-TOF MS)的分析：3例早先描述的同基因菌株(即RN6390；LUG950和RN6911)，2例既不具有3005±5Th处的峰也不具有3035±5Th处的峰的非溶血性临床菌株，2例显示出3005±5Th处的峰的溶血性临床菌株；以及两例具有3035±5Th处的峰但是不具有任何3005±5Th处的峰的溶血性临床菌株。
由此，以MALDI-TOF-TOF模式分析该RN6390菌株在3005±5Th处的峰有可能检测到具有以下质量的溶血素δ的碎片：147.252、201.359、275.471、330.459、376.514、446.482、523.633、559.574、651.7、672.606、757.71、765.841、864.832、965.922、1080.95、1194.071、1307.149、1356.133、1493.23、1621.321、1672.21、1720.294、1785.044、1833.275、1948.428、2005.551、2119.576、2219.583、2307.544、2420.56、2533.786、2600.009、2602.657、2647.743、2774.373、2776.851和2975.308Th。这些碎片分别对应于序列SEQ ID NO.1的溶血素δ的离子y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8、y9、y10、y11、y12、y13、y14、y15、y16、y17、y18、y19、y20、y21、y22、y23、y24、y26、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b13、b15、b16和b23，公差为±1.5Th。由此检测到超过5个属于序列SEQ ID NO.1的溶血素δ的碎片。
而且，以MALDI-TOF-TOF模式分析BE10505040菌株在3035±5Th处的峰有可能检测到具有以下质量的溶血素δG10S的碎片：275.408、330.363、376.414、446.463、523.39、559.462、651.572、757.505、765.682、860.673、864.661、965.714、1080.77、1175.788、1193.829、1306.922、1493.064、1621.166、1701.34、1720.251、1814.587、1833.381、1948.485、2035.545、2148.557、2249.99、2336.585、2449.681、2562.833、2677.454和2677.935Th。这些碎片分别对应于序列SEQ ID NO.2的溶血素δG10S的离子y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8、y9、y10、y11、y12、y13、y14、y15、y16、y17、y18、y19、y20、y21、y22、y23、b3、b4、b5、b7、b8、b11、b15和b16，公差为±1.5Th。由此检测到超过5个属于序列SEQ ID NO.2的溶血素δ的碎片。
相反，对菌株LUG950的峰3053±5Th的MALDI-TOF-TOF分析不允许检测到对应于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的质量碎片。仅检测到下列质量峰：72.826、96.485、128.727、214.235、242.298、263.249、267.247、285.276、362.359、476.458、1206.984和1848.786Th。
在每种情况下，通过MALDI TOF-TOF质谱法进行的分析和在数据库(Matrix Science Ltd，伦敦，UK)中的检索证实了先前获得的全部结果，特别是3035±5Th处的峰与突变形式的溶血素δG10S的对应关系。
这些实施例有可能表明MALDI-TOF模式尽管应用更为简单，但导致与特异性更高的MALDI-TOF-TOF模式相同的鉴定。
获得的全部结果总结在表III中。
表III：在168例临床菌株中通过MALDI TOF质谱法检测溶血素δ以及与溶血协同作用扩散实验和通过MALDI TOF/TOF质谱法检测的相关性
最后，为了防止由于包含属于相同克隆的菌株所造成的任何偏差，用基因芯片(Alere,法国)分析缺少溶血素δ的17例菌株，表明它们属于4个克隆群并属于3个不同的基因池。
vi.与感染的长期性的关联
在收集169例隔离株的收集物的同时，收集关于金黄色葡萄球菌感染或定殖的急性与慢性性质的临床信息。基于临床生物学标准定义慢性感染，其包括在高达6个月之前发现分离出具有与研究过程中的分离菌株相同的抗菌谱的金黄色葡萄球菌菌株。在所有其它情况下，感染或定殖被归类为急性。此外，还收集了时常被发现与慢性感染相关的可植入设备(导管、骨关节或血管假体)的存在(Hawkins,Huang等人,2007)。
对于慢性感染过程中分离的34例菌株，11例不产生任何溶血素δ，而在急性感染过程中分离的134例中有6例，在单变量分析中证实了缺乏溶血素δ与慢性感染之间的显著的统计关系(p＝0.001)。同样，多变量统计分析发现了在缺少溶血素δ和感染长期性之间的这种关系，对于MSSA(p＝0.023)，对于MRSA(p＝0.082)。相反，未发现在检测溶血素不存在与可植入设备的存在之间的关联(p＝0.470)。
vii.与GISA的关联性
采用表型方法对前瞻性收集的168例菌株进行GISA的寻找。5例菌株被证实为GISA，且这5例菌株种的4例不具有在3005±5Th处和3035±5Th处的的任何峰(δ-)。考虑到在该研究中获得的GISA菌株数量较少，对于它们的溶血素δ生产率，对被“Centre National de Référence des Staphylocoques”完全表征的28例GISA菌株的收集物进行分析。28例中的9例菌株是δ-，而来自临床研究的163例非GISA菌株中有13例，再次证实了agr系统功能异常与GISA耐药表型之间的关联性(p＝0.001)。
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Claims (14)

1.通过质谱技术研究含有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌群的样品的方法，包括以下步骤：
a)使样品与介质接触，以通过激光束的作用使样品中存在的分子离子化，
b)用激光束离子化样品中存在的分子，
c)通过电势差加速获得的离子化分子，
d)使加速的离子化分子在至少一个减压管中自由运动，
e)检测至少一部分已自由运动的加速的离子化分子，以便测量它们穿过至少一个减压管所花费的时间并获得对应于给定时刻下检测到的离子化分子的数量的信号，
f)计算所检测的分子的质荷比(m/z)，以便根据所检测的分子的m/z比获得对应于具有相同质荷比(m/z)的离子化分子的数量的信号，
g)直接或间接地确定在步骤b)中获得的离子化分子中是否存在质荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的离子化分子，
h)根据步骤g)中获得的结果作出相应的判断。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与分析的金黄色葡萄球菌菌群不存在溶血素δ及其变体G10S关联在一起的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与分析的金黄色葡萄球菌菌群的agr(“附属基因调节子”)系统的功能异常关联在一起的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分析的金黄色葡萄球菌菌群来自于患者的生物样品，以及步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与对所述患者作出已知与agr系统功能异常相关的临床诊断关联在一起的步骤。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：分析的金黄色葡萄球菌菌落来自于患者的生物样品，以及步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与患者患有慢性感染的诊断关联在一起的步骤。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：步骤h)对应于将不存在m/z等于3005±5Th的离子化分子和m/z等于3035±5Th的离子化分子与将分析的金黄色葡萄球菌菌群分类为具有表现出糖肽敏感性降低的风险(即GISA)关联在一起的步骤。
7.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：对含有10至109个细菌、优选105至106个细菌的细菌群的样品实施质谱法。
8.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所用质谱法是采用基质辅助解吸离子化并测量飞行时间(MALDI-TOF)的质谱法(MS)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤g)的确定由在获得的质谱上存在m/z值等于3005±5Th或等于3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035±5Th的峰直接推断出。
10.根据权利要求1至7之一所述的方法，其特征在于：所用的质谱法是MALDI TOF/TOF质谱法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：在步骤d)中，使离子化分子在第一减压管中运动，选择m/z等于3005±5Th和/或m/z等于3035±5Th的离子，这些离子化分子在其碎片化后再次被加速，并且使碎片化的或未碎片化的离子化分子在第二管中自由运动。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：步骤g)的确定由在下列y和b离子碎片中存在至少5种碎片间接推断出：
-对于3005±5Th处的峰，具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2005.148、2118.232、2219.280、2306.312、2419.396、2532.480、2647.507、2775.565、2846.603和2976.635；以及以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1029.516、1144.543、1257.627、1356.695、1484.790、1670.870、1783.954、1897.038、2012.065、2113.112、2212.181、2326.224、2454.319、2601.387、2702.435、2830.530和2958.625，公差为±1.5Th，和/或
-对于3035±5Th处的峰，具有以下质量的y离子碎片：147.113、275.208、376.255、523.324、651.419、765.462、864.530、965.578、1080.605、1193.689、1306.773、1492.852、1620.947、1720.016、1833.100、1948.127、2035.159、2148.243、2249.290、2336.322、2449.406、2562.491、2677.517、2805.576、2876.613和3006.646；以及以下质量的b离子碎片：131.040、202.077、330.136、445.163、558.247、671.331、758.363、859.410、972.494、1059.526、1174.553、1287.638、1386.706、1514.801、1700.880、1813.964、1927.048、2042.075、2143.123、2242.191、2356.234、2484.329、2631.398、2732.445、2860.540和2988.635，公差为±1.5Th。
13.根据权利要求1至12之一所述的方法，其特征在于：与样品接触的介质相当于沉积在靶标上的适合于MALDI MS的基质，以及所述方法包括在步骤b)之前获得其上或其中吸附有样品分子的基质的结晶。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述基质含有选自3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸中的化合物。
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